CN110862436A - 一种高效表达非洲猪瘟ep153r蛋白的cho细胞株及其构建方法 - Google Patents

一种高效表达非洲猪瘟ep153r蛋白的cho细胞株及其构建方法 Download PDF

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ep153r
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兰青
陈小娟
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Abstract

本发明涉及一种高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株及其构建方法，属于生物技术及兽用生物制品技术领域。所述CHO细胞株中插入了EP153R蛋白的核酸序列，其基因序列如SEQ ID No.1所示。本发明设计的非洲猪瘟EP153R蛋白细胞株，表达量高，易于纯化，可用于鉴别诊断，为生产非洲猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

Description

一种高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株及其构建 方法
技术领域
本发明属于生物技术及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)，是由非洲猪瘟病毒ASFV引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，其常表现出全身出血、呼吸障碍和神经症状等临床症状，具有病程时间短、高病死率等特征，在家猪中导致的死亡率接近100％，因此我国将其列为一类传染病，同时该病也是世界动物卫生组织(OIE)的法定报告动物疫病之一。本病自1909年在肯尼亚首次报道，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，但在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行。2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2017年3月，俄罗斯远东地区伊尔库茨克州发生非洲猪瘟疫情，疫情发生地距离我国较近。2018年8月2日，经中国动物卫生与流行病学中心诊断，沈阳市疑似发生中国第一例非洲猪瘟疫情。非洲猪瘟的传入和疫情的出现，对我国养猪生产已构成严重威胁，带来了巨大的经济损失，高度重视非洲猪瘟的防控对于保障生猪产业的健康发展极其重要。
非洲猪瘟(ASF)的病原是非洲猪瘟病毒(ASFV)，病毒主要的靶细胞是单核细胞和肺泡巨噬细胞。软蜱(钝缘蜱)是该病毒主要的传播媒介和贮藏宿主。ASFV主要以家猪/猪、家猪/软蜱/野猪、家猪/软蜱三种方式循环传播。ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。病毒粒子直径约为200nm，呈正二十面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。ASFV基因组为线性双链DNA分子，约为170～193kb。基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区。不同的毒株因基因组可变区长度不同而导致其基因组大小存在差异。非洲猪瘟病毒基因组共有150多个开放阅读框，共编码100多种多肽，编码151～167种蛋白质，成熟的病毒粒子包含54种结构蛋白；可根据p72和CD2V分别进行基因型和血清型分析。其中EP153R基因全长474bp，编码含有153～163个氨基酸的凝集素类膜蛋白，与一些C型凝集素分子的N-端结构域具有同源性，包含N-糖基化位点、磷酸化作用位点、酰化作用位点、中央跨膜区、C型动物凝集结构域(C-type lectin)、细胞附着序列。EP153R在病毒感染期间的早期和晚期均表达，为病毒在细胞增殖的非必需蛋白。EP153R是非洲猪瘟蛋白中仅有的糖基化蛋白之一，在病毒的逃逸机制中存在重要的意义。据报道，EP153R基因可诱导或保持病毒CD2同源物与其相应受体的结合；EP153R蛋白为多功能蛋白，C型动物凝集结构域对MHC-I类抗原表达具有抑制作用，能够调控细胞凋亡，且参与ASFV感染细胞后的血细胞吸附过程。EP153R基因的存在使病毒感染或星形孢菌素处理Vero细胞中P53蛋白的转录活性降低，是第一个描述具有抗凋亡特性的C型动物凝集素。EP153R是和ASFV外膜蛋白CD2V相连的膜蛋白，参与了CD2V的血吸附，EP153R和CD2V具有保护抗原性。EP153R抑制宿主细胞p53的反式活性，降低p53下游凋亡因子的产生，从而抑制细胞凋亡。抑制MHC I类分子的表达，主要通过抑制MHC-I从内质网到细胞膜的胞外分泌过程，而不是影响MHC-I的表达及成熟过程，达到免疫逃逸的目的。缺失EP153R后病毒在细胞中的增殖不受到影响，但ASFV感染细胞所导致的血细胞吸附现象基本消失。
目前还没有针对非洲猪瘟的疫苗，如何阻断病毒在家猪中的传播，防止病毒在机体内的逃逸，对防御非洲猪瘟具有重大意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明专利设计了一种能够在CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细胞中高效表达的非洲猪瘟EP153R蛋白，针对CHO细胞株偏爱的密码子优化后，其核酸序列如SEQ ID No.1所示，蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
同时，本发明将上述优化后的EP153R蛋白的基因序列插入到了传统CHO细胞株中，构建了能够高效表达该非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株，该细胞株命名为CHO-EP153R，分类命名为中国仓鼠卵巢细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月6日，保藏号为CGMCCNo.18850。
该高效表达该非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株的构建方法是基于电穿孔法使用上述经优化后EPR153R蛋白的重组质粒转染宿主CHO细胞株，并对转染后的宿主CHO细胞进行克隆培养、筛选。
其中重组质粒转染宿主CHO细胞株的步骤为：
A、培养基准备：配制含10％dFBS的CSC-03单克隆培养基，配置完毕后置于37℃培养箱预热；
B、宿主细胞准备：用Countstar自动细胞计数仪记录宿主细胞CHO活细胞密度以及细胞活率，按照6000cells/well量取细胞，离心去除上清，并使用5mL电转培养基CD-pro清洗两次细胞，第二次清洗后使用600μL电转培养基将细胞重悬，待用；
C、取200μg EP153R蛋白的质粒加入到使用电转培养基重悬的细胞中；
D、设定电穿孔仪的电转程序为320V，900uF，∞，4mm；
E、将已溶解所需质粒的电转培养基重悬细胞转入电穿孔仪的电转杯，静置2min开始电转，并记录电转时长及电压；
F、电转完成后立即取出，并加入到预先准备好的含10％dFBS的单克隆培养基中，吹吸混匀；
G、吹吸混匀的电转细胞液，按照100μL/well的体积比将细胞液铺到96孔板中，将96孔板置于37℃，含5％CO2的培养箱中培养。
转染完成的CHO细胞株的筛选的方法为：将电转染后24小时的96孔板中的CHO细胞液添加蛋氨酸亚氨基代砜进行处理；培养20天左右，将细胞株转移到24孔板中进行培养，培养基为含有5％dFBS的单克隆培养基；培养3天后扩出一副板24well板，37℃，5％CO2条件下静置7天后，取其上清液进行检测，使用WB检测方式筛选阳性细胞株，即转染成功的细胞株，将筛选的细胞株转移至6孔板中进行培养，培养基为无dFBS的单克隆培养基；培养3天后转移至摇瓶培养，培养基为无dFBS的CHO-K1培养基，培养三天；将培养后的细胞进行扩增加料，细胞活率60％左右时，收集上清，纯化，再进一步筛选得到最佳的已插入EP153R蛋白的CHO细胞株。
同时本发明设计了上述非洲猪瘟EP153R蛋白在制备诊断非洲猪瘟的制品中的应用以及其在制备非洲猪瘟亚单位疫苗中的应用。
本发明的表达非洲猪瘟EP153R蛋白细胞株，表达量高，易于纯化，可用于鉴别诊断，为生产非洲猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
本发明以NCBI官网记录的2018年分离的沈阳毒株EP153R蛋白序列为基础，进行CHO细胞株偏爱的密码子优化后，构建到P1020载体上，并转染宿主CHO细胞，通过CHO细胞表达系统高效表达重组EP153R蛋白，该蛋白为鉴别诊断以及后期的亚单位疫苗奠定基础。
本发明所应用的方法可以采用基因工程技术领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本发明。
实施例1
表达优化后EP153R蛋白基因的重组质粒的构建
1.1 EP153R蛋白基因序列的优化
对EP153R基因的结构域进行分析后，发现EP153R核苷酸序列中存在很多稀有密码子，进行CHO细胞株偏爱的密码子优化，构建到P1020载体上，从而能够在CHO细胞中高效表达重组EP153R蛋白。为了蛋白的纯化以及后期检测的方便，将C端加入10个His氨基酸。
优化后的EP153R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，优化修饰后EP153R蛋白的氨基酸的序列为SEQ ID NO.2，能更好的表达出抗原位点。
1.2 EP153R重组质粒的构建
以NCBI官网记录的2018年分离的沈阳毒株EP153R蛋白序列为基础，进行CHO细胞株偏爱的密码子优化，构建PMV-EP153R质粒，再使用P1020载体，重组构建了P1020-EP153R-10His质粒。
1.2.1酶切反应
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为10μL，加样如下表所示：
加样成分名称 加样量
PMV-EP153R 5μg
酶HindⅢ 0.5μL
酶EcoRⅠ 0.5μL
10×buffercutsmart 1μL
ddH2O 补至10μL
(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于37℃恒温水浴锅中，酶切过夜。
1.2.2双酶切胶回收。取出上述双酶切产物，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段。
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管)加入500μL平衡液，12,000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量，并记录数值。
(3)向步骤(2)中的1.5mL离心管中加入等体积溶液PC buffer，50℃水浴放置10min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
(4)将步骤(3)所得溶液加入吸附柱CB2中，静置2min，12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
(5)向吸附柱中CB2中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
(6)重复步骤(5)。
(7)将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm，离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干。
(8)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μLddH2O，静置10min，12,000rpm，离心2min，收集DNA溶液。
(9)将步骤(8)中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。
1.2.3连接反应
(1)标记需要用到的200μL离心管。
(2)在标记完整的200μL管中按照下表的20μL反应体系进行加样：
加样成分名称 加样量
线性化载体 1μL
插入DNA片段 7.5μL
T4ligase 0.5μL
10×buffer 1μL
(3)完成加样后，用移液器轻轻吹打几次混匀各组分。
(4)将200μL离心管置于PCR仪中16℃连接3h。
(5)步骤(4)的反应产物可直接进行转化实验，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
1.2.4转化反应
(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞DH5α中，并吹打混匀，冰浴30min。
(2)步骤(1)完成后，取出样品管，置于42℃水浴45s，然后立即冰浴90s。
(3)步骤(2)完成后，取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入200μL LB液体培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm，培养45min。
(4)制备转化平板，依据质粒抗性制备转化用LB氨苄抗性平板。
(5)涂板：吸取已转化的感受态细胞加到LB氨苄抗性平板中，均匀涂开。
(6)将步骤(5)平板倒置于生化恒温培养箱中，37℃培养15h。
(7)观察记录转化结果。
1.2.5质粒抽提与酶切鉴定
1.2.5.1质粒抽提
(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。
(2)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(3)取5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm，离心1min，尽量吸取上清。
(4)向步骤(3)中的离心管中加入250μL质粒提取试剂P1 buffer，彻底悬浮菌体。
(5)向步骤(4)溶液中加入250μL P2 buffer，立即温和颠倒离心管6-8次混匀。室温静置2-4min。
(6)向步骤(5)溶液中加入350μL P3 buffer，立即温和颠倒离心管6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。12,000rpm，离心10min。
(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱CP3中心，12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱CP3放入收集管中。
(8)向吸附柱中心加入600μL漂洗液PW，12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱CP3放入收集管中。
(9)重复操作步骤(8)。
(10)将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm，室温离心2min。
(11)将吸附柱CP3放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入50μLddH2O，室温静置10min，12,000rpm，离心2min，4℃保存管中DNA溶液。
1.2.5.2酶切鉴定
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为20μL，加样如下表所示：
加样成分名称 加样量
质粒 5μg
酶HindⅢ 0.5μL
酶EcoRⅠ 0.5μL
10×buffer cutsmart 2μL
ddH2O 补至20μL
(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于37℃恒温水浴锅中，酶切过夜。
(3)电泳验证。取出上述双酶切产物，进行琼脂糖凝胶电泳验证。
实施例2
2.1材料来源
在本发明中用于转染的质粒为重组构建的P1020-EP153R-10His质粒。P1020-EP153R-10His含有如SEQ ID NO.1所示的EP153R蛋白的核酸序列，与用于识别转染后EP153R蛋白表达与否的筛选抗性标记。
CHO细胞由北京鼎持生物有限公司从ATCC引进，引进时间：2018年5月1日，ATCC编号：CCL61。本细胞经在北京鼎持生物有限公司扩增培养后建立了细胞库，细胞库的编号为：BJDC-201800010。
实施例中用到的实验材料与试剂如表1所示
表1实验材料与试剂
Figure BDA0002312388380000071
2.2 P1020-EP153R-10His的提取
质粒大提试剂盒购自天根生化科技有限公司。以NCBI官网记录的2018年分离的沈阳毒株EP153R蛋白序列为基础，进行CHO偏爱的密码子优化构建PMV-EP153R质粒，再使用P1020载体，重组构建的P1020-EP153R-10His质粒后。使用质粒小提试剂盒提取质粒，并由擎科生物工程有限公司测序并返回测序结果，确认无误后进行后续实验。
2.3基于电穿孔法进行质粒转染
A、培养基准备：配置含10％dFBS的CSC-03培养基1L，配置完毕后至于培养箱中进行预热，培养箱的温度设置为37℃。
B、宿主细胞准备：接种初始细胞浓度为0.5×106cells/ml的CHO细胞株(由ATCC驯化)于125ml三角摇瓶中，悬浮培养3天；用Countstar自动细胞计数仪记录宿主细胞CHO活细胞密度以及细胞活率，按照1.0×107cells总量取细胞，离心去上清，离心条件为800r/m，离心5min；再使用5mL CD-Pro培养基清洗两次去除上清液的细胞，第二次清洗后使用600μLCD-Pro培养基将细胞进行重悬，待用；
C、量取200μg EP153R蛋白的质粒(溶于CD-Pro培养基中)加入到使用CD-Pro培养基重悬的细胞液中，室温下孵育5分钟；
D、设定电穿孔仪的电转程序为320V，900uF，∞，4mm；；
E、将已溶有质粒的CD-Pro培养基重悬细胞液转入到电转杯中，静置2min开始电转，记录电转的时长和电压；
F、电转完成后将电转杯中的细胞液加入到已配置好的含10％dFBS的CSC-03培养基中，吹吸混匀。
G、吹吸混匀的电转细胞液，按照100μL/well的体积比将细胞液铺到96孔板中，将96孔板置于37℃，含5％CO2的培养箱中培养
2.4进行细胞株筛选
将电转染后24小时的96孔板中的CHO细胞液添加MSX(蛋氨酸亚氨基代砜)进行处理，加入量为30～50μmol；培养20天左右，将细胞株转移到24孔板中进行培养，培养基为含有5％dFBS的单克隆培养基；培养3天后扩出一副板24well板，37℃，5％CO2条件下静置7天后，取其上清液进行检测，使用WB检测方式筛选阳性细胞株，即转染成功的细胞株，将筛选的细胞株转移至6孔板中进行培养，培养基为无dFBS的单克隆培养基；培养3天后转移至摇瓶培养，培养基为无dFBS的CHO-K1+15umMSX培养基，培养三天；此培养过程同时完成了细胞株的筛选和细胞株对无血清培养基的适应培养过程，此过程如表2所示。
表2无血清适应过程
Figure BDA0002312388380000091
对筛选出的细胞株进行扩增，第4天开始加料，细胞活率60％左右时，12,000rmp，离心15min，收集上清，取1ml上清液进行检测，使用WB检测方式筛选产量高的阳性细胞株，即转染成功的细胞株，上清液采用镍柱纯化His标签的方式，再进一步筛选得到最佳的已插入EP153R蛋白的CHO细胞株。
实施例3
蛋白纯化
重组EP153R蛋白的层析纯化
(1)将收集的EP153R上清液，用GE的Ni Sepharose excel介质进行亲和层析。收集的上清5000rpm离心5min，作为上样液。
(2)用5倍柱体积的蒸馏水清洗介质。
(3)用5倍柱体积的平衡缓冲液清洗介质。
(4)上样，柱子每毫升可挂4mg蛋白。
(5)用20倍柱体积的洗涤缓冲液清洗介质。
(6)用5倍柱体积的洗脱缓冲液将蛋白洗脱。
上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。
序列表
<110> 浙江鼎持生物制品有限公司 北京鼎持生物技术有限公司
<120> 一种高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株及其构建方法
<130> LP19091238
<141> 2019-12-11
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 579
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
aagcttgcca ccatggagtg gtcttgggtg ttcctgttct tcctgagcgt gacaacagga 60
gtgcattcat tctccaacaa gaagtacatc ggcctgatca acaagaagga gggcctgaag 120
aagaagatcg acgactactc catcctgatc atcggcatcc tgatcggcac caacatcctg 180
tccctgatca tcaacatcat cggcgagatc aacaagccca tctgctacca gaacgacgac 240
aagatcttct actgccccaa ggactgggtg ggctacaaca acgtgtgcta ctacttcggc 300
aacgaggaga agaactacaa caacgcctcc aactactgca agcagctgaa ctccaccctg 360
accaacaaca acaccatcct ggtgaacctg accaagaccc tgaacctgac caagacctac 420
aaccacgagt ccaactactg ggtgaactac tccctgatca agaacgagtc cgtgctgttg 480
agggattccg gctactacaa gaagcagaag cacgtgtccc tgctgtacat ctgctccaag 540
caccaccacc atcaccacca ccatcaccac taagaattc 579
<210> 2
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Lys Leu Ala Thr Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser
1 5 10 15
Val Thr Thr Gly Val His Ser Phe Ser Asn Lys Lys Tyr Ile Gly Leu
20 25 30
Ile Asn Lys Lys Glu Gly Leu Lys Lys Lys Ile Asp Asp Tyr Ser Ile
35 40 45
Leu Ile Ile Gly Ile Leu Ile Gly Thr Asn Ile Leu Ser Leu Ile Ile
50 55 60
Asn Ile Ile Gly Glu Ile Asn Lys Pro Ile Cys Tyr Gln Asn Asp Asp
65 70 75 80
Lys Ile Phe Tyr Cys Pro Lys Asp Trp Val Gly Tyr Asn Asn Val Cys
85 90 95
Tyr Tyr Phe Gly Asn Glu Glu Lys Asn Tyr Asn Asn Ala Ser Asn Tyr
100 105 110
Cys Lys Gln Leu Asn Ser Thr Leu Thr Asn Asn Asn Thr Ile Leu Val
115 120 125
Asn Leu Thr Lys Thr Leu Asn Leu Thr Lys Thr Tyr Asn His Glu Ser
130 135 140
Asn Tyr Trp Val Asn Tyr Ser Leu Ile Lys Asn Glu Ser Val Leu Leu
145 150 155 160
Arg Asp Ser Gly Tyr Tyr Lys Lys Gln Lys His Val Ser Leu Leu Tyr
165 170 175
Ile Cys Ser Lys His His His His His His His His His His Glu Phe
180 185 190

Claims (5)

1.一种非洲猪瘟EP153R蛋白，其特征在于，所述的EP153R蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，其基因的核酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株，其特征在于，所述CHO细胞株中插入了权利要求1所述的非洲猪瘟EP153R蛋白的核酸序列，该细胞株命名为CHO-EP153R，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年11月6日，保藏号为CGMCC No.18850。
3.如权利要求2所述高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法为基于电穿孔法使用权利要求1所述EPR153R蛋白的重组质粒转染宿主CHO细胞株，并对转染后的宿主CHO细胞进行克隆培养、筛选。
4.根据权利要求3所述的高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞的构建方法，其特征在于，重组质粒转染宿主CHO细胞株包括以下步骤，
A、培养基准备：配制含10％dFBS的CSC-03单克隆培养基，配置完毕后置于37℃培养箱预热；
B、宿主细胞准备：用Countstar自动细胞计数仪记录宿主细胞CHO活细胞密度以及细胞活率，按照6000cells/well量取细胞，离心去除上清，并使用5mL电转培养基CD-pro清洗两次细胞，第二次清洗后使用600μL电转培养基将细胞重悬，待用；
C、取200μg EP153R蛋白的质粒加入到使用电转培养基重悬的细胞中；
D、设定电穿孔仪的电转程序为320V，900uF，∞，4mm；
E、将已溶解所需质粒的电转培养基重悬细胞转入电穿孔仪的电转杯，静置2min开始电转，并记录电转时长及电压；
F、电转完成后立即取出，并加入到预先准备好的含10％dFBS的单克隆培养基中，
吹吸混匀；
G、吹吸混匀的电转细胞液，按照100μL/well的体积比将细胞液铺到96孔板中，将96孔板置于37℃，含5％CO2的培养箱中培养。
5.根据权利要求4所述的高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞的构建方法，其特征在于，所述筛选的方法为将电转染后24小时的96孔板中的CHO细胞液添加蛋氨酸亚氨基代砜进行处理；培养20天左右，将细胞株转移到24孔板中进行培养，培养基为含有5％dFBS的单克隆培养基；培养3天后扩出一副板24well板，37℃，5％CO2条件下静置7天后，取其上清液进行检测，使用WB检测方式筛选阳性细胞株，即转染成功的细胞株，将筛选的细胞株转移至6孔板中进行培养，培养基为无dFBS的单克隆培养基；培养3天后转移至摇瓶培养，培养基为无dFBS的CHO-K1培养基，培养三天；将培养后的细胞进行扩增加料，细胞活率60％左右时，收集上清，纯化，再进一步筛选得到最佳的已插入EP153R蛋白的CHO细胞株。
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