CN114317571A

CN114317571A - 一种病毒样颗粒及其制备方法和应用

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Publication number: CN114317571A
Application number: CN202111641645.XA
Authority: CN
Inventors: 郭慧琛; 孙世琪; 董虎; 穆素雨; 白满元; 何融泽; 张韵; 吴金恩; 丁耀忠; 冯霞; 尹双辉
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2022-04-12
Also published as: WO2023125739A1; ZA202209860B

Abstract

本发明提供了一种病毒样颗粒及其制备方法和应用，属于农业科学畜牧兽医科学技术领域。本发明以小泛素样修饰蛋白作为标签蛋白促进病毒结构蛋白VP0、VP1和VP3的正确折叠，同时保证了蛋白的结构稳定性，实现结构蛋白的大量表达，经过3种结构蛋白体外自组装后，获得大量的与天然病毒性能相似的病毒样颗粒。经过免疫原性检测，本发明制备的病毒样颗粒具有较高的免疫原性，可作为储备疫苗，在防控猪水泡病或口蹄疫病毒传播中应用。

Description

一种病毒样颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于农业科学畜牧兽医科学技术领域，具体涉及一种病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

随着国际间的交流与合作日渐频繁，当今世界日渐成为一个“地球村”。在这种大环境中，如非典型性肺炎(2002年)，新型冠状病毒(2019年)等疫病很容易发展成全球性大流行。我国作为养猪大国，猪、牛、羊等家畜疫病防控责任重大，为避免其他疫区和国家疫病传入，或旧病新发，对邻近周边国家流行性疾病进行研究和疫苗研发势在必行。口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)主要有7种血清型，目前我国主要以A型、O型FMD流行为主，近年来，南非型(SAT)FMD不仅对撒哈拉以南非洲国家造成经济损失，已逐渐传入欧洲等国威胁当地畜牧业发展。猪水泡病(Swine vesicular disease virus，SVDV)是一种猪传染性病毒性疾病。它会引起水泡性病变，与观察到的口蹄疫难以区分。感染SVDV可在1天内导致病毒血症，并可在猪接触受感染的猪或受病毒污染的环境后2天出现临床症状。感染后3～5小时，用免疫组织化学方法可以检测到病毒。对该病毒的理化分析表明，它不同于口蹄疫、水泡性口炎和水泡性疹病毒，与小核糖核酸科肠道病毒属的病毒非常相似。在“地球村”式的国际交流大背景下，预防疫病传入或储备性疫苗的研发必不可少。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是近年来新出现的一种基因工程亚单位形式，其优点包括不含病毒复制所必须的遗传物质，生物安全性优越；可以模拟病毒的天然结构而使构象依赖型抗原表位得以正确呈现；能像自然病毒粒子一样与细胞表面受体结合进入细胞，从而诱导较强的免疫反应；在不影响VLPs结构的基础上可以根据需要插入或删除某些氨基酸序列，对其进行人工改造，从而实现对多种病毒同时免疫的多效性特点等。因此，VLPs作为疫苗，被认为是目前能够替代全病毒疫苗的最佳候选疫苗形式。然而目前还未有关于制备病毒样颗粒的方法的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种病毒样颗粒及其制备方法和应用，具有产量高、免疫原性好的优点。

本发明提供了一种病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

1)将病毒结构蛋白基因VP0基因、VP1基因和VP3基因分别与小泛素样修饰蛋白基因序列融合，所得融合基因分别克隆至pET-28a载体中，得到pET/VP0-VP1和pET/VP3；

所述病毒包括猪水泡病病毒和/或南非型口蹄疫病毒；

2)将步骤1)中所述pET/VP3中卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因，得到pETa/VP3；

3)将步骤1)中所述pET/VP0-VP1和步骤2)中所述pETa/VP3共转化至原核表达系统中，经重组表达，分离得到3种小泛素化修饰蛋白酶酶切融合蛋白；

4)将步骤3)中所述3种小泛素化修饰蛋白酶酶切融合蛋白分别去除小泛素化修饰标签蛋白，收集得到VP0、VP1和VP3重组蛋白，经体外组装，得到病毒样颗粒。

优选的，步骤1)中小泛素样修饰蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，步骤1)中所述pET-28a载体的多克隆位点为Sal I/BamH I和Hind III/Xho I酶切位点。

本发明提供了所述制备方法制备得到的病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由病毒结构蛋白VP1、VP0和VP3组成。

优选的，所述病毒为猪水泡病病毒时，VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。

优选的，所述病毒为南非型口蹄疫病毒；

所述南非型口蹄疫病毒包括以下一种或几种血清型的口蹄疫病毒：SAT1型口蹄疫病毒、SAT2型口蹄疫病毒和SAT3型口蹄疫病毒；

优选的，所述SAT1型口蹄疫病毒VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；

所述SAT2型口蹄疫病毒VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；

所述SAT3型口蹄疫病毒VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示；VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示；VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示。

本发明提供了所述病毒样颗粒在制备防控病毒病的疫苗中的应用，所述病毒病包括猪水泡病和/或口蹄疫。

本发明提供了一种用于防控病毒病的病毒样颗粒疫苗，包括所述病毒样颗粒和佐剂。

本发明提供的病毒样颗粒的制备方法，以小泛素样修饰蛋白作为标签蛋白促进猪水泡病病毒结构蛋白VP0、VP1和VP3的正确折叠，同时保证了蛋白的结构稳定性，实现结构蛋白的大量表达，经过3种结构蛋白体外自组装后，获得大量的与天然猪水泡病病毒性能相似的病毒样颗粒。经过免疫原性检测，本发明制备的病毒样颗粒具有较高的免疫原性，可作为储备疫苗，在防控猪水泡病病毒传播中应用。

附图说明

图1为SVDV重组衣壳蛋白的SDS-PAGE检测结果，泳道1：融合标签蛋白，泳道2：SVDV衣壳蛋白；

图2为文献报道的SVDV重组毒电镜照片(a)，本发明制备的SVDV病毒样颗粒的电镜照片(b)；

图3为本发明制备的SVDV病毒样颗粒的粒径分布情况；

图4为采用IFA法鉴定病毒样颗粒的荧光信号图片；

图5为SVDV病毒样颗粒免疫猪血清ELISA抗体水平检测结果；

图6为SAT1、SAT2、SAT3型口蹄疫衣壳蛋白的SDS-PAGE检测结果；

图7为本发明制备的SAT型口蹄疫病毒样颗粒的粒径分布情况；

图8为本发明制备的SAT型口蹄疫病毒样颗粒的电镜照片；

图9为采用IFA检测本发明制备的SAT型口蹄疫病毒样颗粒豚鼠免疫血清抗体。

具体实施方式

本发明提供了一种病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

1)将病毒结构蛋白基因VP0基因、VP1基因和VP3基因分别与小泛素样修饰蛋白基因融合，所得融合基因克隆至pET-28a载体中，得到pET/VP0-VP1和pET/VP3；

所述病毒包括猪水泡病病毒和/或南非型口蹄疫病毒；

2)将所述pET/VP3中卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因，得到pETa/VP3；

3)将步骤1)所述pET/VP0-VP1和步骤3)所述pETa/VP3共转化至原核表达系统中，经重组表达，分离得到3种小泛素化修饰蛋白酶酶切融合蛋白；

本发明将病毒结构蛋白基因VP0基因、VP1基因和VP3基因分别与小泛素样修饰蛋白序列融合，分别克隆至pET-28a载体中，得到pET/VP0-VP1和pET/VP3；所述病毒包括猪水泡病病毒和/或南非型口蹄疫病毒。

在本发明中，所述融合优选为无缝融合，以小泛素样修饰蛋白基因序列-结构蛋白基因的顺序形成融合基因。小泛素样修饰蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，小泛素样修饰蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示。pET-28a载体的多克隆位点优选为Sal I/BamH I(VP0或VP3)和Hind III/Xho I(VP1)酶切位点。本发明对所述克隆方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的克隆方法即可。克隆后，得到的载体进行验证。本发明对所述载体的验证方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组载体的验证方法即可。本发明对pET-28a载体的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的pET-28a载体即可。在本发明实施例中，所述pET-28a载体购自擎科生物科技有限公司。

在本发明中，VP0基因和VP3基因在pET-28a载体中的多克隆位点优选为Sal I/BamH I，VP1基因片段在pET-28a载体中的多克隆位点优选为Hind III/Xho I。本发明对所述克隆的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的隆的方法即可。克隆后，优选对获得的载体进行验证。本发明对所述载体的验证方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组载体的验证方法即可。

得到pET/VP3后，本发明将所述pET/VP3中卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因，得到载体pETa/VP3。

在本发明中，将所述pET/VP3中卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因的方法优选如下：设计2对同源重组引物，其中氨苄青霉素抗性基因引物：F：CAGTAATACAAGGGGTGTTATGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGG(SEQ ID NO:14)；R：ATCCGCTCATGAATTAATTCTTAATGAGTATTCAACATTTCCGTG(SEQ ID NO:15)；PET28a线性化引物：F：CGGAAATGTTGAATACTCATTAAGAATTAATTCATGAGCGGATAC(SEQ ID NO:16)，R：CCTCACTGATTAAGCATTGGTAACATAACACCCCTTGTATTACTG(SEQ ID NO:17)。替换抗性基因作用是进行双抗性筛选，确保衣壳蛋白VP0、VP1、VP3均一表达。

得到pET/VP0-VP1和pETa/VP3后，本发明将所述pET/VP0-VP1和所述pETa/VP3共转化至原核表达系统中，经重组表达，分离得到3种小泛素化修饰蛋白酶酶切融合蛋白。

本发明对所述原核表达系统没有特殊限制，采用本领域所熟知的原核表达系统的方法即可，例如本发明实施例中，所述原核表达系统为BL21(DE3)。所述共转化时，所述pET/VP0-VP1和pETa/VP3的拷贝数比优选为1～3：1～3，更优选为1.5：1。所述重组表达的方法，优选将转化后的原核表达系统分别经卡那霉素和氨苄青霉素筛选阳性克隆，挑取阳性克隆进行双抗培养。培养后的两种菌液混合后进行高密度发酵培养和诱导表达。所述培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述培养的振荡速度优选为800rpm。所述诱导表达前菌液的OD_600nm为40左右时进入诱导表达。所述诱导表达的温度有选为20～37℃，更优选为30℃。所述诱导表达时IPTG的终浓度优选为1mM。所述分离优选离心菌体、破碎菌体细胞，收集上清与Ni-NTAHis·Bind Resins混合，洗脱后得到小泛素化修饰蛋白酶融合表达蛋白。

得到小泛素化修饰蛋白酶酶切融合表达蛋白后，本发明将所述3种小泛素化修饰蛋白酶酶切去除小泛素化修饰标签蛋白，收集得到VP0、VP1和VP3重组蛋白，经体外组装，得到病毒样颗粒。

在本发明中，去除小泛素化修饰标签蛋白的方法优选包括用小泛素化修饰蛋白酶酶切。所述酶切的体系优选为每1mg所述融合蛋白与100ml酶切缓冲液混合。酶切后溶液优选采用HisTrap HP色谱柱去除小泛素化修饰标签蛋白。所述洗脱用溶液的成分优选为20mMTris-HCl，300mM NaCl，pH8.0。所述体外组装时，VP0、VP1和VP3重组蛋白的质量比为1:1:1。所用组装缓冲液成分优选为20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0。所述体外组装的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。所述体外组装的时间优选为10～14h，更优选为12h。体外组装结束后，优选采用超滤管浓缩组装后溶液，收集截留物。超滤管的截留分子量优选为100KD。

在本发明中，采用蔗糖密度梯度分离，分离病毒样颗粒：将1.0ml含病毒样颗粒的液体(突变和未突变)置于15％～45％浓度的蔗糖梯度顶层，以38000rpm、4℃离心3.5h。收集20层的样本用于检测。将收集的样本用连续进样的方法在紫外检测仪(259nm)检测，取第13管样本进行DLS检测，得到病毒样颗粒的粒径大小。

本发明提供的所述制备方法制备得到的病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由猪水泡病病毒结构蛋白VP1、VP0和VP3组成，直径主要分布在20～30nm之间，形态完整，大小和自然的病毒粒子相似。所述病毒为猪水泡病病毒时，VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。所述病毒为南非型口蹄疫病毒；所述南非型口蹄疫病毒包括以下一种或几种血清型的口蹄疫病毒：SAT1型口蹄疫病毒、SAT2型口蹄疫病毒和SAT3型口蹄疫病毒。所述SAT1型口蹄疫病毒VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；VP3的氨基酸序列如SEQID NO:23所示；所述SAT2型口蹄疫病毒VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；所述SAT3型口蹄疫病毒VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示；VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示；VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示。

鉴于病毒样颗粒具有较高的免疫原性，本发明提供了所述病毒样颗粒在制备防控病毒病的疫苗中的应用。所述病毒病优选包括口蹄疫或猪水泡病。

本发明提供了一种用于防控病毒病的病毒样颗粒疫苗，包括所述病毒样颗粒和佐剂。所述佐剂的含量优选为50％V/V。猪水泡病毒样颗粒抗原含量为100μg/头份。本发明对所述疫苗的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的疫苗的制备方法即可。所述疫苗用于各病毒的免疫原性检测。所述病毒病优选包括口蹄疫或猪水泡病。

下面结合实施例对本发明提供的一种病毒样颗粒及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)融合小泛素化修饰蛋白的猪水泡病毒VP0、VP1、VP3基因的重组载体构建：

a.根据已公布的SVDV的序列(GenBank登陆号：D16364.1)，参考Hoover等的方法(Hoover DM1,Lubkowski J.DNAWorks:an automated method for designingoligonucleotides for PCR-based gene synthesis.Nucl.Acids Res.(2002)30(10):e43.)进行密码子优化。由金斯瑞公司将SVDV结构蛋白VP0基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)、VP1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)、VP3基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)分别与小泛素化修饰蛋白基因(SEQ ID NO:1)无缝融合，分别经Sal I/BamH I，Hind III/Xho I内切酶克隆至pET-28a载体中，得到pET/VP0-VP1和pET/VP3；

(2)SVDV抗原蛋白的表达及纯化：

a.将构建的pET/VP0-VP1和pETa/VP3质粒共转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，经氨苄青霉素和卡那霉素双抗性筛选获得单菌落。挑取单克隆至双抗性的LB培养集中，于37℃、230rpm培养12h，分装后加入甘油LB培养基于-80℃冷冻保存，获得种子库。

b.将步骤a中含SVDV质粒的菌种接种50ml含卡那霉素和氨苄青霉素双抗性LB培养基中,于37℃、230rpm培养12h后，转接入500ml含相同抗性的LB培养基中，37℃培养制备发酵用种子。

c.使用30L发酵罐，配制10L培养基于发酵罐中，121℃，灭菌30min后，待培养基温度降至37℃将500ml种子接入发酵罐中，待菌液浓度达到OD₆₀₀值约为40左右时，加入0.5gIPTG诱导培养6h后终止培养，离心收集菌体。

d.冰浴裂解溶液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM咪唑，pH7.4)重悬菌体，高压均质机以1000bar压力破碎4次，10,000×g离心30min，取上清，弃沉淀，上清进行色谱纯化，目标蛋白经SDS-PAGE电泳检测，-70℃保存(图1)。

(3)SVDV病毒样颗粒的体外组装

a.小泛素化修饰蛋白酶酶切融合蛋白，按照如下方法和比例进行：1mg上述纯化的融合蛋白，100mL酶切缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0,0.2％Igepal(NP-40)，1mM DTT)，10μL小泛素化修饰蛋白酶(1U/μL)，37℃酶切30min。将酶切混合物通过HisTrapHP除去小泛素化修饰标签蛋白，收集含有VP0、VP1和VP3的流穿液在组装缓冲液(20mMTris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0)中，4℃过夜组装VLPs，样品经SDS-PAGE电泳检测(图1)。

b.将1ml上述制备的含病毒样颗粒的样品置于15％～45％线性蔗糖梯度顶层，以38000rpm、4℃离心3.5h，收集20份样品，500μl/份，然后用连续进样的方法经紫外检测仪(280nm)检测，并绘制图谱，随后取峰值样本进行DLS进行水和粒径大小的检测。结果如图3所示，本发明制备的病毒样颗粒的粒径主要分布在10～30nm。

c.将步骤b中的峰值样品10μL加到200目的铜网上，室温吸附10min，用滤纸吸干铜网上剩余的液体后用3％的磷钨酸染色，用Hitachi，H-7100FA透射电镜观察VLPs形态。如图2所示，在此条件下组装的病毒样颗粒直径主要分布在20～30nm之间(图2b)，其形态，大小与文献中报道的SVDV重组毒大小相似(图2a)。

实施例2

SVDV病毒样颗粒免疫原性分析

选取SVDV，FMDV，SVA抗体为阴性的20kg左右的健康猪8头，随机分成3组，实验组3头/组，对照组2头，其中，1组为本发明实施例1制备的猪水泡病毒样颗粒疫苗免疫组，2组为猪水泡病毒VP1蛋白免疫组，3组为PBS对照组。100μg抗原与等体积的206佐剂乳化后颈部肌肉注射免疫，采集免疫前、免疫后第7天，14天，21天，28天血液，并分离血清。

由于国内无SVDV阳性血清以及抗原，本发明采用IFA法鉴定是否产生抗VP1的特异性抗体。具体操作如下：通过基因合成的方法，将SVDVVP1衣壳蛋白基因合成到pCMV-N-Flag载体中，命名为pCMV-N-Flag-VP1。随后将质粒转染进入BHK细胞，36h后收取细胞样品，经4％多聚甲醛(PFA)室温固定15min；PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗3遍；0.1％TritonX-100(PBS+0.1％TritonX-100)室温处理细胞15min，以破坏细胞膜；PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗3遍；5％NBS(PBS+5％NBS)37℃恒温培养箱中孵育1h，以封闭非特异性结合；稀释于5％NBS中的一抗(1：100或1:200，具体稀释浓度待摸索)孵育细胞(一抗使用SVDVVLPs多抗)，37℃下处理1h(或4℃过夜)；PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗5遍；稀释于5％NBS中的荧光标记二抗(1：400或1:500，具体稀释浓度待摸索)孵育细胞(抗小鼠的FITC抗体)，37℃1h(或4℃过夜)；PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗5遍；荧光显微镜下观察荧光强度。

具体检测结果如图4。转染pCMV-N-Flag-VP1(含SVDVVP1基因)质粒的细胞有明显的荧光信号，说明SVDV VLPs免疫猪产生了SVDV特异性的抗体。

采用仕诺达生物公司生产的猪水疱病病毒抗体ELISA检测试剂盒进行抗体水平检测。结果见图5所示：病毒样颗粒免疫组猪血清抗体水平显著高于VP1蛋白免疫组，且在免疫后28天抗体水平最高。该结果表明，衣壳蛋白的组装更有利于抗原递呈，增强免疫反应。

实施例3

SAT1、SAT2、SAT3型口蹄疫病毒样颗粒的制备方法

(1)根据已公布的SAT(1、2、3)型口蹄疫病毒的序列(GenBank登陆号：SAT1：KR108962.1；SAT2：AJ251473；SAT3:MK415736.1)，对结构蛋白基因VP0，VP3和VP1分别进行密码子优化。

按照实施例1记载的方法融合小泛素化修饰蛋白的3种口蹄疫病毒VP0、VP1、VP3基因的重组载体构建。

SAT1、SAT2、SAT3型口蹄疫VP0、VP1、VP3的核苷酸序列分别如下：

SAT1型口蹄疫的VP0核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；

SAT1型口蹄疫的VP1核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；

SAT1型口蹄疫的VP3核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示；

SAT2型口蹄疫的VP0核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示；

SAT2型口蹄疫的VP1核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示；

SAT2型口蹄疫的VP3核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示；

SAT3型口蹄疫的VP0核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示；

SAT3型口蹄疫的VP1核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示；

SAT3型口蹄疫的VP3核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示。

(2)SAT1、SAT2、SAT3型口蹄疫衣壳蛋白的表达及纯化

a.分别将SAT口蹄疫的表达载pET/VP0-VP1和pETa/VP3质粒共转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，经氨苄青霉素和卡那霉素双抗性筛选获得单菌落。挑取单克隆至双抗性的LB培养集中，于37℃、230rpm培养12h，分装后加入甘油LB培养基于-80℃冷冻保存，获得SAT1，SAT2，SAT3甘油菌种子库。

b.将步骤a中含SAT质粒的菌种接种50ml含卡那霉素和氨苄青霉素双抗性LB培养基中,于37℃、230rpm培养12h后，转接入500ml含相同抗性的LB培养基中，37℃培养制备发酵用种子。

d.冰浴裂解溶液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM咪唑，pH7.4)重悬菌体，高压均质机以1000bar压力破碎4次，10,000×g离心30min，取上清，弃沉淀，上清进行色谱纯化，目标蛋白经SDS-PAGE电泳检测，-70℃保存。

(3)SAT1、SAT2、SAT3型口蹄疫病毒样颗粒的体外组装

a.小泛素化修饰蛋白酶酶切融合蛋白，按照如下方法和比例进行：1mg上述纯化的融合蛋白，100mL酶切缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0,0.2％Igepal(NP-40)，1mM DTT)，10μL小泛素化修饰蛋白酶(1U/μL)，37℃酶切30min。将酶切混合物通过HisTrapHP除去小泛素化修饰标签蛋白，收集含有VP0、VP1和VP3的流穿液在组装缓冲液(20mMTris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0)中，4℃过夜组装VLPs，样品经SDS-PAGE电泳检测(图6)。

b.将1ml上述制备的含病毒样颗粒的样品置于15％～45％线性蔗糖梯度顶层，以38000rpm、4℃离心3.5h，收集20份样品，500μl/份，然后用连续进样的方法经紫外检测仪(280nm)检测，并绘制图谱，随后取峰值样本进行DLS进行水和粒径大小的检测。结果如图7所示，本发明制备的病毒样颗粒的粒径主要分布在10～30nm。

c.将步骤b中的峰值样品10μL加到200目的铜网上，室温吸附10min，用滤纸吸干铜网上剩余的液体后用3％的磷钨酸染色，用Hitachi,H-7100FA透射电镜观察VLPs形态。如图8所示，在此条件下组装的病毒样颗粒直径主要分布在20～30nm之间。

(4)SAT1、SAT2、SAT3型口蹄疫病毒样颗粒免疫小鼠血清鉴定

(a)将获得的SAT1、SAT2、SAT3 FMDVVLPs免疫Babl/c小鼠，并在两周后加强免疫，采集免疫后28天的小鼠血液，分离血清冻存于-20℃冰箱备用，分别命名为SAT1、SAT2、SAT3型FMDV VLPs多抗。

(b)由于国内无SAT1、SAT2、SAT3型口蹄疫病原，采用IFA法鉴定是否产生特异性抗体。具体操作如下：通过基因合成的方法，将SAT1、SAT2、SAT3型FMDV的VP1衣壳蛋白基因合成到pCMV-N-Flag载体中，命名为pCMV-N-Flag-VP1。随后将质粒转染进入BHK细胞，36h后收取细胞样品，经4％多聚甲醛(PFA)室温固定15min；PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗3遍；0.1％TritonX-100(PBS+0.1％TritonX-100)室温处理细胞15min，以破坏细胞膜；PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗3遍；5％NBS(PBS+5％NBS)37℃恒温培养箱中孵育1h，以封闭非特异性结合；稀释于5％NBS中的一抗(1：100或1:200，具体稀释浓度待摸索)孵育细胞(一抗使用SAT1、SAT2、SAT3FMDV VLPs多抗)，37℃下处理1h(或4℃过夜)；PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗5遍；稀释于5％NBS中的荧光标记二抗(1：400或1:500，具体稀释浓度待摸索)孵育细胞(抗小鼠的FITC抗体)，37℃1h(或4℃过夜)；PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗5遍；之后再在荧光显微镜下观察荧光数量。

结果如图9所示。结果表明：分别转染pCMV-N-Flag-VP1(含SAT1或SAT2或SAT3FMDVVP1基因)质粒的细胞都有明显的荧光信号，说明对应VLPs免疫猪分别产生了SAT1、SAT2、SAT3型FMDV特异性的抗体。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种病毒样颗粒及其制备方法和应用

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 291

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggtcatc accatcatca tcattctgac gaaaagaagg gaggtgagac cgagcacatc 60

aacctgaagg tcctcggcca ggacaacgcc gtcgtccagt tcaagatcaa gaagcacaca 120

cccttgagga agctgatgaa cgcctactgc gaccgtgccg gactctccat gcaggtggtg 180

cgcttccgtt tcgacggaca gcccatcaac gagaacgaca ctccgacctc gctggagatg 240

gaggagggcg acaccatcga ggtttaccag cagcagactg gtggcgctcc a 291

<210> 2

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggagctc aggtgtcaac acaaaagacc ggtgctcatg agaccagctt gagtgcagcg 60

ggcaactcag tcattcatta cacaaacata aactactaca aggatgctgc ttcaaattca 120

gcaaatagac aagacttcgc acaggacccg gggaagttca ccgaacctgt gaaagacatc 180

atggtcaaat ctatgcctgc cctcaattcc ccatcagcag aggagtgtgg ctacagcgac 240

agggtaagat ccatcacctt agggaattca accataacaa ctcaagaatg tgcaaacgtg 300

gtggttggat atggggtgtg gccaacttac ttgaaggatg aagaggcaac agcagaggat 360

caacccactc aaccagatgt ggccacgtgc aggttttaca cgctcgaatc tgtgatgtgg 420

caacagagtt caccaggctg gtggtggaag ttccctgacg cgttgtccaa catggggcta 480

tttgggcaaa atatgcagta ccactacctt gggagagccg ggtacacgat acacgtgcag 540

tgcaacgcgt ccaaatttca ccaagggtgt ctgctggtgg tatgtgtgcc agaagcagaa 600

atggggtgtg ccacgttggc caataagcct gacccaaaaa gcctgagtaa aggggaaata 660

gccaacatgt ttgaatccca aaactccacc ggggaaacgg ccgtgcaagc taatgtgatc 720

aatgctggca tgggtgttgg tgttggtaat ctaactatct tcccccatca gtggatcaac 780

ttgcgcacta acaacagcgc tacgattgtc atgccatata taaacagcgt gcccatggac 840

aacatgttca gacacaacaa ttttacactc atggccatcc cgttcgcccc actgagctac 900

agcacagggg ctaccacgta cgtaccaatc actgtgacag tggcgccaat gtgcgctgaa 960

tataatgggc tgcgtctagc cggtaaacaa 990

<210> 3

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggcccccag gagaggtgat ggaaagagcc attgcccgcg tcgctgatac tactgggagc 60

ggaccagtta actcggaatc cattccagct ctaaccgccg cagagacagg gcacacgtca 120

caagttgtac catcagacac aatgcaaact aggcacgtga agaattacca ttcaaggtca 180

gagtcgacag tggagaactt cctgtgcaga tctgcatgcg ttttctacac cacatacaag 240

aaccatgact ctgatggcga caacttcgcc tactgggtga tcaacacacg gcaagttgct 300

caactgcgtc ggaagctcga aatgttcacg tacgcaagat ttgatctgga gttgaccttc 360

gtgatcacta gcactcagga acagtccacc gttcaaggtc aagatacacc agtgctcacc 420

caccaaataa tgtatgtacc tccaggtggc ccagtgccca caaaggtaaa cagctacagc 480

tggcaaacgt ccaccaaccc gagtgtgttc tggacggaag ggagcgcacc gcctcgaatg 540

tcgataccat tcattggcat aggcaacgca tacagcatgt tctatgacgg gtgggccagg 600

tttgacaagc aagggacata cggcatcagc acactaaaca acatggggac actatatatg 660

agacatgtga atgatggggg tcccggtccc attgtgagca cagtacgaat ttacttcaag 720

ccaaagcacg tcaaaacgtg ggtcccaaga ccgcccagac tatgtcaata tcaaaaggct 780

ggcaacgtga attttaaacc cactggtgtg actgagggta ggacagatat aacaaccatg 840

aaaaccact 849

<210> 4

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtttaccaa cgctgtcgac acccgggagc aaccagtttc tcacgtccga tgacttccag 60

tcaccatcag ccatgccaca attcgatgtc actcctgaga tggatattcc aggacaagtc 120

aacaacttga tggagattgc agaagtagat tctgtggtgc cagtaaacaa cacagaaggg 180

aaagtgatgt caattgaggc gtaccagata cctgtgcaat cgaatccaac caacggttct 240

caggtttttg ggttcccatt gaccccaggg gccaatagtg tgttaaacag gactttgctg 300

ggagaaatct taaactacta tgcccattgg tcaggcagca tcaaactaac atttatgttt 360

tgcgggtcag cgatggctac aggaaaattc ttactggcat actcaccacc gggagctggg 420

gcaccgacca cacgcaagga ggcgatgcta ggtactcacg tgatctggga tgtgggtcta 480

caatcgagct gcgtattgtg tataccatgg attagtcaaa cgcactacag gtatgtagta 540

atggatgaat acaccgctgg tggatacata acatgctggt atcaaacaaa tattgtggtg 600

cctgcagatg cacagagtga ctgtaagatc ttgtgttttg tgtcggcatg taacgatttt 660

tcagttagga tgctcaagga cacacccttt ataaaacagg ataatttctt ccaa 714

<210> 5

<211> 752

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caacctccac ccacacaacc aacacccaga acaatgactg gttctccaaa cttgccagct 60

ctgctttcag cggtcttttc ggcgctctgc tagccgacaa gaagactgag gaaaccacac 120

tcctcgagga tcgcatcctc acgaccagtc acggcacaac cacctcgacc acacaaagtt 180

cagtgggcat aacctacggt tacgccgact cggaccgttt cctccccggc ccaaacacca 240

acgggctgga gacacgtgtg gaacaagcag agaggttttt caaacacaaa ttatttgatt 300

ggacacttga acaacgattt ggaacaacac acgttttgga actgcccaca gaccacaaag 360

gcatctatgg acaacttgtt gactcccact catacattcg caatgggtgg gacgttgagg 420

tctccgcgac cgcaacgcag ttcaacgggg gctgcctcct ggtagcgatg gtgcccgaat 480

tgtgcaaact gtcggaaaga gagaaatacc aactcactct cttccctcat caatttctca 540

acccaaggac caacaccacg gcacacatcc aggtacccta cctgggcgtg gatcgccacg 600

accaaggaac acgccacaaa gcgtggaccc tggttgtcat ggtggtggca ccctacacaa 660

acgatcagac gattggctcg aacaaagccg aggtgtacgt gaacattgct cccacaaacg 720

tttacgtcgc cggtgagaag cccgcaaaac ag 752

<210> 6

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accacatccg ctggcgaagg agcggagcct gtcacgactg atgcttccca acacggaggc 60

gacagacgga caactcgtag gcatcacact gatgtgagct tcttgctcga ccggttcaca 120

ctggttggta aaacacagga caacaaactg acactagacc tgctccaaac caaggaaaaa 180

gcactggttg gcgcaatcct gcgcgcagcc acgtactact tctctgactt ggaggttgcg 240

tgtgtgggtg acaacaaatg ggtcggctgg actcccaacg gagctccaga acttgcggaa 300

gtgggcgaca acccagtcgt cttttccaaa ggtagaacca cccgttttgc actgccctac 360

accgctccac acaggtgctt ggcgacagcc tacaacggtg actgcaagta caaacccact 420

ggcacagctc cacgcgaaaa cattcgtgga gacctcgcaa ctctcgcggc gaggattgca 480

agtgagacac acattccaac caccttcaac tatggcagga tttacacaga cactgaggtc 540

gacgtgtacg tcaggatgaa gcgcgcggag ctctactgcc cgcgacccgt tctcacgcac 600

tacgaccacg gtggcaggga tcgctacaga actgcgataa ccaaacctgt caaacag 657

<210> 7

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcattctcc ccgtggccgt ctccaatggc tatggtggct tccaaaatac agatcccaaa 60

acatcggacc ccgtatacgg gcacgtgtac aacccggctc gcaccggcct acctgggagg 120

ttcacaaacc tcttggatgt ggctgaagcg tgccctacac tgcttgactt caacggagtt 180

ccgtacgtga ccacccaggc aaactctgga tctaaagtgt taacttgttt tgatttggct 240

tttggtcaca aaaatttgaa aaatacattt atgtctggtc ttgcccagta ctacacccag 300

tacagtggca cactcaacct gcacttcatg tacacaggcc caaccaacaa caaggctaag 360

tacatggtgg cctacatccc acctgggaca caccctctcc cggaaacacc ggagatggcg 420

tcccactgtt accacgccga gtgggacaca ggcctgaact caaccttcac attcaccgtg 480

ccgtacgtgt cggctgccga cttcgcgtac acctactctg acgagcctga acaggcttcg 540

gttcagggtt gggtgggcgt ataccaggtg actgacacac acgagaagga cggtgcagtt 600

gttgtgtccg tcagtgctgg acccgacttc gagttcagga tgcccatcag cccctcgcgc 660

cag 663

<210> 8

<211> 912

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcgcaggtc aatccagtcc ggcaacgggc tcgcagaacc aaagcggcaa cacgggctct 60

atcatcaata actactacat gcagcaatat cagaacagta tggataccca actgggtgac 120

aacgcgatta gtggcggttc caatgaaggc tcaacggaca ccacgtcgac gcataccaac 180

aatacccaga acaatgattg gttctccaaa ctggcgcaat cagccatctc gggcctgttt 240

ggtgcactgc tggctgacaa aaagaccgaa gaaaccacgc tgctggaaga tcgtattctg 300

accacgcgcc acggtaccac gaccagtacg acccagagct ctgtgggcat cacctatggt 360

tacgcggata gcgactcttt tcgtagcggc ccgaatacgt ctggtctgga aacccgtgtt 420

gaacaagccg aacgcttttt caaagaaaag ctgttcgatt ggacgagtga caaaccgttt 480

ggtaccctgt atgtgctgga actgccgcgt gatcataaag gcatttacgg caagctgacg 540

gactcctata cctacatgcg caacggctgg gatgtccaag tgagcgccac gtctacccaa 600

ttcaatggcg gttgcctgct ggttgcgatg gttccggaac tgtgtagcct gaaagcccgt 660

gaagaatatc agctgaccct gtacccgcat caatttatca acccgcgcac caatacgacc 720

gcacacctgc aggtcccgta tctgggcgtg aaccgtcatg atcagggtaa acgccaccaa 780

agttggtccc tggtggttat ggtgctgacc ccgccgacga ccgaagcaca gatgaatagc 840

ggtaccgttg aagtctatgc gaacattgcc ccgaccaatg tgtacgttgc gggtgaactg 900

ccgggcaaac ag 912

<210> 9

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgacgacca gcgcaggtga aggtgccgaa gttgtcacga ccgatccgac gacccatggc 60

ggtaaagtta cgaccccgcg tcgcgtgcac accgatgttg ccttcctgct ggaccgtagc 120

acgcatgtgc acaccaataa gaccacattt gaggttgatc tgatggacac caaagaaaag 180

gcactggttg gtgctatcct gcgctctgcg acctattact tctgcgatct ggaagttgcc 240

tgtgtcggca aacataagca cgtgttttgg cagccgaacg gtgcgccgcg tacgacccaa 300

ctgggtgata atccgatggt ttacagccgt aacaatgtca cgcgcttcgc gattccgttt 360

accgccccgc atcgcctgct gtctaccgtt tataacggtg aatgcgaata caccaaaacg 420

gtgaccgcca tccgtggcga tcgcgaagtt ctggcacaga aatattcatc ggctaagcac 480

agtctgccgt ccacgtttaa tttcggcttt gtgaccgcag ataaaccggt tgacgtctat 540

taccgtatga agcgcgctga actgtattgt ccgcgcgcgc tgctgccggc ctatacgcac 600

gcaggtcggg accgctttga tgctccgatt ggtgtggaga aacaactgct g 651

<210> 10

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtatcgtcc cggtggcatg cgctgatggc tatggcggtt ttcaaaacac cgatccgaag 60

tctgcggacc cgatttatgg tcatgtttac aacccgtcac gtaatgactg ccacggccgc 120

ttctcgaatc tgctggatgt cgcggaagcc tgtccgaccc tgctggattt tgacggcaaa 180

ccgtatgtcg tgaccaaaaa caatggtgat aaggttatgg cggccttcga cgtcgccttt 240

acgcataaag tgcacaagaa cacctatctg gcaggcctgg ctgattatta cacccagtac 300

tcaggttcgc tgaattatca tttcatgtac acgggcccga cccatcacaa agcaaagttt 360

atggtcgctt atgtgccgcc gggcatcgaa gttgaagaac tgccgaaaac cccggaagac 420

gcagctcatt gttaccacag tgaatgggat acgggtctga actccaattt taccttcgcg 480

gtgccgtatc tgagttccgg cgatttttca tacacgcata ccgacacgcc ggcaatggct 540

acgaccaacg gttgggttgt cgtgctgcag gtcaccgata cgcactcggc agaagcggcc 600

gttgtcgtga gcgtgtctgc tggcccggat ctggaatttc gtttcccgat tgacccggtg 660

cgtcag 666

<210> 11

<211> 915

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgggcgcag gccagtcctc accggccaca gggtctcaga atcaatctgg caacactggt 60

agcataatta acaactacta catgcaacag taccaaaact ccatggacac ccaactcgga 120

gacaacgcca tctccggtgg gtcaaatgag ggatcgaccg acaccacgtc gacccacacc 180

aacaacaccc aaaacaatga ctggttctcc aaattggcac aatctgccat ctcagggctt 240

ttcggagccc ttttggcaga caaaaagacc gaagagacaa ctcttctgga ggaccggatc 300

ctcaccacac gccacaacac aaccacctcc acaacacaaa gttctgttgg cgtgacatac 360

ggttacgctt cggctgaccg tttcttgcct ggaccaaaca ccagcgggct tgagacacgc 420

gtcgaacaag ctgagagatt cttcaaggag aaactcttta cttggactgc atctcaggaa 480

tacgcacatg tgcacctgtt ggaactgcca gtggaccaca aaggcatcta cggtgccatg 540

ctggccagcc acacatacgt gcgcaatggc tgggacgtgc aggtttcagc aaccagcacg 600

caattcaacg gcggcaccct tcttgtcgcc atggtccctg agctacacaa attggacaag 660

cgtgacgttt cacaactcac acttttcccg caccagttca tcaacccacg caccaacacc 720

accgcccaca ttgtggtgcc ttacgtgggt gtcaacaggc acgatcaggc aaagatgcac 780

aaagcatgga cacttgtggt agcagtgctt gcaccgctca ccacctccaa catgggacag 840

gacaacgttg aggtgtatgc gaacatcgca ccgacaaacg tttacgtagc cggtgagagg 900

ccaacaaagc agtaa 915

<210> 12

<211> 969

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgggtcatc accatcatca tcacgggtcg gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca 60

gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct 120

tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc 180

gctaaaagac agggtaagga aatggactcc ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt 240

caagctgatc aggcccctga agatttggac atggaggata acgatattat tgaggctcac 300

cgcgaacaga ttggaggtac aaccagtgca ggtgagggtg gtgatattgt gacagcagac 360

gtcaccacac acggcgggac cgtggactcc ccacgacgcc aacacaccaa cgtggagttc 420

ctgctggaca ggttcacaca cattggtcaa atcaccaact caaaaacaat tgacctcatg 480

gacacgaaag aacacacgtt ggtgggcgca atcctgcgct cagctacgta ctacttttgt 540

gaccttgaag ttgctgtctt aggcacaggg caatggaccg gatgggttcc caacggttgc 600

ccgcacaccg aacgcgtgga ggacaaccca gttgttcacg cgaaaaacgg tgtcgcccgt 660

ttcgccctgc cttacacagc accacacagt gttcttgcaa cagtctacaa tggcaactgc 720

aaatactcca aaacccaaca cgtcacatca cgtcgcggtg atctggcgac gctacaacaa 780

cgtgttgaga atgaaaccac aagatgcagg cccacgacat tcaacttcgg gagattgttg 840

tgtgacaccg gtgaggtcta ctaccggatg aagagagccg agctgtactg ccctcgaccc 900

ctgaaggtaa gatacactca caccaccgac cggtacaaga ccaagctgga ggcacctgat 960

aaacaataa 969

<210> 13

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggcattgtcc ctgtggcctg ccacgacggt tatggtggtt tccagaacac tgatcccaag 60

accgcagacc caatctacgg tctggtgtcc aacccaccac gcacggcgtt tcccggcagg 120

ttcaccaatc tgctggacgt cgctgaggcg tgtccaacct tcctggactt tgacggtaca 180

ccttacgtca ggaccggaca caacagtgga agcaaaacac tggcccacat tgacttggct 240

tttggacaca agagttttaa gaacacttac ttggctggac tcgctcagta ctacgcccag 300

tacagtggat ctcttaacct gcatttcatg tacactggtc ccacgcaatc gaaggcacgc 360

ttcatggttg cgtacatacc accagggact gaacccgtcc ccaaaactcc tgaggaggca 420

gcacactgtt accactcaga gtgggacact ggactgaact ccaagttcac gttcacggtt 480

ccgtacatgt cagcagcaga ttttgcctac acatactgtg atgagcccga acaggcctcc 540

gcacagggat gggtgacact gtaccagatt acagacacac atgaccctga ctcagcggtg 600

cttgtctcgg tcagcgctgg cgctgacctt gagtttcggc tcccaataaa ccctgcaaca 660

cagtaa 666

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cagtaataca aggggtgtta tgttaccaat gcttaatcag tgagg 45

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atccgctcat gaattaattc ttaatgagta ttcaacattt ccgtg 45

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cggaaatgtt gaatactcat taagaattaa ttcatgagcg gatac 45

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cctcactgat taagcattgg taacataaca ccccttgtat tactg 45

<210> 18

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Thr Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ala Ala Gly Asn Ser Val Ile His Tyr Thr Asn Ile Asn Tyr Tyr

20 25 30

Lys Asp Ala Ala Ser Asn Ser Ala Asn Arg Gln Asp Phe Ala Gln Asp

35 40 45

Pro Gly Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Ile Met Val Lys Ser Met

50 55 60

Pro Ala Leu Asn Ser Pro Ser Ala Glu Glu Cys Gly Tyr Ser Asp Arg

65 70 75 80

Val Arg Ser Ile Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Cys

85 90 95

Ala Asn Val Val Val Gly Tyr Gly Val Trp Pro Thr Tyr Leu Lys Asp

100 105 110

Glu Glu Ala Thr Ala Glu Asp Gln Pro Thr Gln Pro Asp Val Ala Thr

115 120 125

Cys Arg Phe Tyr Thr Leu Glu Ser Val Met Trp Gln Gln Ser Ser Pro

130 135 140

Gly Trp Trp Trp Lys Phe Pro Asp Ala Leu Ser Asn Met Gly Leu Phe

145 150 155 160

Gly Gln Asn Met Gln Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ala Gly Tyr Thr Ile

165 170 175

His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Cys Leu Leu Val

180 185 190

Val Cys Val Pro Glu Ala Glu Met Gly Cys Ala Thr Leu Ala Asn Lys

195 200 205

Pro Asp Pro Lys Ser Leu Ser Lys Gly Glu Ile Ala Asn Met Phe Glu

210 215 220

Ser Gln Asn Ser Thr Gly Glu Thr Ala Val Gln Ala Asn Val Ile Asn

225 230 235 240

Ala Gly Met Gly Val Gly Val Gly Asn Leu Thr Ile Phe Pro His Gln

245 250 255

Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile Val Met Pro Tyr

260 265 270

Ile Asn Ser Val Pro Met Asp Asn Met Phe Arg His Asn Asn Phe Thr

275 280 285

Leu Met Ala Ile Pro Phe Ala Pro Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Thr

290 295 300

Thr Tyr Val Pro Ile Thr Val Thr Val Ala Pro Met Cys Ala Glu Tyr

305 310 315 320

Asn Gly Leu Arg Leu Ala Gly Lys Gln

325

<210> 19

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gly Pro Pro Gly Glu Val Met Glu Arg Ala Ile Ala Arg Val Ala Asp

1 5 10 15

Thr Thr Gly Ser Gly Pro Val Asn Ser Glu Ser Ile Pro Ala Leu Thr

20 25 30

Ala Ala Glu Thr Gly His Thr Ser Gln Val Val Pro Ser Asp Thr Met

35 40 45

Gln Thr Arg His Val Lys Asn Tyr His Ser Arg Ser Glu Ser Thr Val

50 55 60

Glu Asn Phe Leu Cys Arg Ser Ala Cys Val Phe Tyr Thr Thr Tyr Lys

65 70 75 80

Asn His Asp Ser Asp Gly Asp Asn Phe Ala Tyr Trp Val Ile Asn Thr

85 90 95

Arg Gln Val Ala Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Met Phe Thr Tyr Ala

100 105 110

Arg Phe Asp Leu Glu Leu Thr Phe Val Ile Thr Ser Thr Gln Glu Gln

115 120 125

Ser Thr Val Gln Gly Gln Asp Thr Pro Val Leu Thr His Gln Ile Met

130 135 140

Tyr Val Pro Pro Gly Gly Pro Val Pro Thr Lys Val Asn Ser Tyr Ser

145 150 155 160

Trp Gln Thr Ser Thr Asn Pro Ser Val Phe Trp Thr Glu Gly Ser Ala

165 170 175

Pro Pro Arg Met Ser Ile Pro Phe Ile Gly Ile Gly Asn Ala Tyr Ser

180 185 190

Met Phe Tyr Asp Gly Trp Ala Arg Phe Asp Lys Gln Gly Thr Tyr Gly

195 200 205

Ile Ser Thr Leu Asn Asn Met Gly Thr Leu Tyr Met Arg His Val Asn

210 215 220

Asp Gly Gly Pro Gly Pro Ile Val Ser Thr Val Arg Ile Tyr Phe Lys

225 230 235 240

Pro Lys His Val Lys Thr Trp Val Pro Arg Pro Pro Arg Leu Cys Gln

245 250 255

Tyr Gln Lys Ala Gly Asn Val Asn Phe Lys Pro Thr Gly Val Thr Glu

260 265 270

Gly Arg Thr Asp Ile Thr Thr Met Lys Thr Thr

275 280

<210> 20

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Gly Leu Pro Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ser Asn Gln Phe Leu Thr Ser

1 5 10 15

Asp Asp Phe Gln Ser Pro Ser Ala Met Pro Gln Phe Asp Val Thr Pro

20 25 30

Glu Met Asp Ile Pro Gly Gln Val Asn Asn Leu Met Glu Ile Ala Glu

35 40 45

Val Asp Ser Val Val Pro Val Asn Asn Thr Glu Gly Lys Val Met Ser

50 55 60

Ile Glu Ala Tyr Gln Ile Pro Val Gln Ser Asn Pro Thr Asn Gly Ser

65 70 75 80

Gln Val Phe Gly Phe Pro Leu Thr Pro Gly Ala Asn Ser Val Leu Asn

85 90 95

Arg Thr Leu Leu Gly Glu Ile Leu Asn Tyr Tyr Ala His Trp Ser Gly

100 105 110

Ser Ile Lys Leu Thr Phe Met Phe Cys Gly Ser Ala Met Ala Thr Gly

115 120 125

Lys Phe Leu Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Gly Ala Gly Ala Pro Thr Thr

130 135 140

Arg Lys Glu Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp Val Gly Leu

145 150 155 160

Gln Ser Ser Cys Val Leu Cys Ile Pro Trp Ile Ser Gln Thr His Tyr

165 170 175

Arg Tyr Val Val Met Asp Glu Tyr Thr Ala Gly Gly Tyr Ile Thr Cys

180 185 190

Trp Tyr Gln Thr Asn Ile Val Val Pro Ala Asp Ala Gln Ser Asp Cys

195 200 205

Lys Ile Leu Cys Phe Val Ser Ala Cys Asn Asp Phe Ser Val Arg Met

210 215 220

Leu Lys Asp Thr Pro Phe Ile Lys Gln Asp Asn Phe Phe Gln

225 230 235

<210> 21

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly

1 5 10 15

Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn

20 25 30

Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn

35 40 45

Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Asn Asn Thr Gln Asn

50 55 60

Asn Asp Trp Phe Ser Gln Leu Ala Gln Ser Ala Phe Ser Gly Leu Val

65 70 75 80

Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu

85 90 95

Asp Arg Ile Leu Thr Thr Ser His Gly Thr Thr Thr Ser Thr Thr Gln

100 105 110

Ser Ser Val Gly Ile Thr Tyr Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Tyr Tyr Met

115 120 125

Pro Gly Pro Asn Thr Asn Gly Leu Glu Thr Arg Val Glu Gln Ala Glu

130 135 140

Arg Phe Phe Lys His Lys Leu Phe Asp Trp Thr Leu Asp Gln Gln Phe

145 150 155 160

Gly Thr Thr His Val Leu Glu Leu Pro Thr Asp His Lys Gly Ile Tyr

165 170 175

Gly Gln Leu Val Asp Ser His Ser Tyr Ile Arg Asn Gly Trp Asp Val

180 185 190

Glu Val Ser Ala Thr Ala Thr Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val

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Ala Met Val Pro Glu Leu Cys Lys Leu Ser Asp Arg Glu Lys Tyr Gln

210 215 220

Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Leu Asn Pro Arg Thr Asn Thr Thr

225 230 235 240

Ala His Ile Gln Val Pro Tyr Leu Gly Val Asp Arg His Asp Gln Gly

245 250 255

Thr Arg His Lys Ala Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Tyr

260 265 270

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275 280 285

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<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Thr Thr Ser Ala Gly Glu Gly Ala Glu Pro Val Thr Thr Asp Ala Ser

1 5 10 15

Gln His Gly Gly Asp Arg Arg Thr Thr Arg Arg His His Thr Asp Val

20 25 30

Ser Phe Leu Leu Asp Arg Phe Thr Leu Val Gly Lys Thr Gln Asp Asn

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Thr Thr Arg Phe Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Cys Leu Ala

115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Ser Glu Thr His Ile Pro Thr Thr Phe Asn Tyr Gly Arg Ile Tyr Thr

165 170 175

Asp Thr Glu Val Asp Val Tyr Val Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr

180 185 190

Cys Pro Arg Pro Val Leu Thr His Tyr Asp His Gly Gly Arg Asp Arg

195 200 205

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210 215

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<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Gly Ile Leu Pro Val Ala Val Ser Asn Gly Tyr Gly Gly Phe Gln Asn

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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130 135 140

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180 185 190

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195 200 205

Asp Phe Glu Phe Arg Met Pro Ile Ser Pro Ser Arg Gln

210 215 220

<210> 24

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

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1 5 10 15

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Gly Thr Leu Tyr Val Leu Glu Leu Pro Arg Asp His Lys Gly Ile Tyr

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Gly Lys Leu Thr Asp Ser Tyr Thr Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val

180 185 190

Gln Val Ser Ala Thr Ser Thr Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val

195 200 205

Ala Met Val Pro Glu Leu Cys Ser Leu Lys Ala Arg Glu Glu Tyr Gln

210 215 220

Leu Thr Leu Tyr Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Thr Thr

225 230 235 240

Ala His Leu Gln Val Pro Tyr Leu Gly Val Asn Arg His Asp Gln Gly

245 250 255

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260 265 270

Thr Thr Glu Ala Gln Met Asn Ser Gly Thr Val Glu Val Tyr Ala Asn

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<210> 25

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

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Leu Pro Ser Thr Phe Asn Phe Gly Phe Val Thr Ala Asp Lys Pro Val

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Leu Leu Pro Ala Tyr Thr His Ala Gly Arg Asp Arg Phe Asp Ala Pro

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Ile Gly Val Glu Lys Gln Leu Leu

210 215

<210> 26

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Gly Ile Val Pro Val Ala Cys Ala Asp Gly Tyr Gly Gly Phe Gln Asn

1 5 10 15

Thr Asp Pro Lys Ser Ala Asp Pro Ile Tyr Gly His Val Tyr Asn Pro

20 25 30

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Glu Ala Cys Pro Thr Leu Leu Asp Phe Asp Gly Lys Pro Tyr Val Val

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180 185 190

Asp Thr His Ser Ala Glu Ala Ala Val Val Val Ser Val Ser Ala Gly

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Pro Asp Leu Glu Phe Arg Phe Pro Ile Asp Pro Val Arg Gln

210 215 220

<210> 27

<211> 303

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly

1 5 10 15

Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn

20 25 30

Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn

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Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Asn Asn Thr Gln Asn

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Arg Phe Phe Lys Glu Lys Leu Phe Thr Trp Thr Ala Ser Gln Glu Tyr

145 150 155 160

Ala His Val His Leu Leu Glu Leu Pro Val Asp His Lys Gly Ile Tyr

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Gly Ala Met Leu Ala Ser His Thr Tyr Val Arg Asn Gly Trp Asp Val

180 185 190

Gln Val Ser Ala Thr Ser Thr Gln Phe Asn Gly Gly Thr Leu Leu Val

195 200 205

Ala Met Val Pro Glu Leu His Lys Leu Asp Lys Arg Asp Val Ser Gln

210 215 220

Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Thr Thr

225 230 235 240

Ala His Ile Val Val Pro Tyr Val Gly Val Asn Arg His Asp Gln Ala

245 250 255

Lys Met His Lys Ala Trp Thr Leu Val Val Ala Val Leu Ala Pro Leu

260 265 270

Thr Thr Ser Asn Met Gly Gln Asp Asn Val Glu Val Tyr Ala Asn Ile

275 280 285

Ala Pro Thr Asn Val Tyr Val Ala Gly Glu Arg Pro Thr Lys Gln

290 295 300

<210> 28

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Thr Thr Ser Ala Gly Glu Gly Gly Asp Ile Val Thr Ala Asp Val Thr

1 5 10 15

Thr His Gly Gly Thr Val Asp Ser Pro Arg Arg Gln His Thr Asn Val

20 25 30

Glu Phe Leu Leu Asp Arg Phe Thr His Ile Gly Gln Ile Thr Asn Ser

35 40 45

Lys Thr Ile Asp Leu Met Asp Thr Lys Glu His Thr Leu Val Gly Ala

50 55 60

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65 70 75 80

Leu Gly Thr Gly Gln Trp Thr Gly Trp Val Pro Asn Gly Cys Pro His

85 90 95

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100 105 110

Ala Arg Phe Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Ser Val Leu Ala Thr

115 120 125

Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ser Lys Thr Gln His Val Thr Ser

130 135 140

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Thr Arg Cys Arg Pro Thr Thr Phe Asn Phe Gly Arg Leu Leu Cys Asp

165 170 175

Thr Gly Glu Val Tyr Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro

180 185 190

Arg Pro Leu Lys Val Arg Tyr Thr His Thr Thr Asp Arg Tyr Lys Thr

195 200 205

Lys Leu Glu Ala Pro Asp Lys Gln

210 215

<210> 29

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Gly Ile Val Pro Val Ala Cys His Asp Gly Tyr Gly Gly Phe Gln Asn

1 5 10 15

Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Ile Tyr Gly Leu Val Ser Asn Pro

20 25 30

Pro Arg Thr Ala Phe Pro Gly Arg Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val Ala

35 40 45

Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Asp Phe Asp Gly Thr Pro Tyr Val Arg

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Gly Pro Thr Gln Ser Lys Ala Arg Phe Met Val Ala Tyr Ile Pro Pro

115 120 125

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130 135 140

His Ser Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Thr Val

145 150 155 160

Pro Tyr Met Ser Ala Ala Asp Phe Ala Tyr Thr Tyr Cys Asp Glu Pro

165 170 175

Glu Gln Ala Ser Ala Gln Gly Trp Val Thr Leu Tyr Gln Ile Thr Asp

180 185 190

Thr His Asp Pro Asp Ser Ala Val Leu Val Ser Val Ser Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Leu Glu Phe Arg Leu Pro Ile Asn Pro Ala Thr Gln

210 215 220

<210> 30

<211> 97

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Met Gly His His His His His His Ser Asp Glu Lys Lys Gly Gly Glu

1 5 10 15

Thr Glu His Ile Asn Leu Lys Val Leu Gly Gln Asp Asn Ala Val Val

20 25 30

Gln Phe Lys Ile Lys Lys His Thr Pro Leu Arg Lys Leu Met Asn Ala

35 40 45

Tyr Cys Asp Arg Ala Gly Leu Ser Met Gln Val Val Arg Phe Arg Phe

50 55 60

Asp Gly Gln Pro Ile Asn Glu Asn Asp Thr Pro Thr Ser Leu Glu Met

65 70 75 80

Glu Glu Gly Asp Thr Ile Glu Val Tyr Gln Gln Gln Thr Gly Gly Ala

85 90 95

Pro

Claims

1.一种病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述病毒包括猪水泡病病毒和/或南非型口蹄疫病毒；

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)中小泛素样修饰蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)中所述pET-28a载体的多克隆位点为SalI/BamHI和/或HindIII/Xho I酶切位点。

4.权利要求1～3任意一项所述制备方法制备得到的病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由病毒结构蛋白VP1、VP0和VP3组成。

5.根据权利要求4所述病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒为猪水泡病病毒时，VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。

6.根据权利要求4所述病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒为南非型口蹄疫病毒；

所述南非型口蹄疫病毒包括以下一种或几种血清型的口蹄疫病毒：SAT1型口蹄疫病毒、SAT2型口蹄疫病毒和SAT3型口蹄疫病毒。

7.根据权利要求6所述病毒样颗粒，其特征在于，所述SAT1型口蹄疫病毒的VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；

所述SAT2型口蹄疫病毒VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。

8.根据权利要求6所述病毒样颗粒，其特征在于，所述SAT3型口蹄疫病毒VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示；VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示；VP3的氨基酸序列如SEQID NO:29所示。

9.权利要求5～8任意一项所述病毒样颗粒在制备防控病毒病疫苗中的应用；所述病毒病包括猪水泡病和/或口蹄疫。

10.一种用于防控病毒病的病毒样颗粒疫苗，其特征在于，包括权利要求5～8任意一项所述病毒样颗粒和佐剂。