CN109867727A - 一种flagellin-fiber2融合蛋白、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种flagellin‑fiber2融合蛋白、其制备方法和应用，所述融合蛋白具有较高免疫保护性的禽4型腺病毒fiber2蛋白和鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合蛋白。制备方法是通过将人工编码的flagellin‑fiber2基因融合克隆进pFastBac‑HA表达载体，经基因转座形成重组的Bacmid，随后转染入Sf9昆虫细胞，利用杆状病毒系统表达这个融合蛋白，并通过间接免疫荧光IFA和Western blot进行鉴定。通过上述系统获得重组杆状病毒的周期短，将其flagellin‑fiber2融合蛋白免疫SPF鸡，结果显示杆状病毒系统表达的flagellin‑fiber2融合蛋白具有较高的免疫保护力。

Description

一种flagellin-fiber2融合蛋白、其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种禽4型腺病毒fiber2蛋白与鼠伤寒沙门氏菌flagellin蛋白的融合蛋白flagellin-fiber2，其制备方法和应用。

背景技术

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)是腺病毒科禽腺病毒属的成员，是DNA病毒，是禽类及野禽体内常见的传染病病原之一。FAdV可根据群特异性抗原分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个群。根据交叉中和试验的测定结果，可将Ⅰ群禽腺病毒其分为12个血清型，并且不同的血清型之间具有相同的群抗原。近几年，临床上由Ⅰ亚群禽腺病毒感染而引起鸡的包涵体肝炎(Inclusion body hepatitis，IBH)、心包积水综合征(Hydropericardium syndrome，HPS)等临床病例显著增多，其中以禽4型腺病毒感染数量居多，主要引起肉鸡、育雏和育成期蛋鸡发病，感染鸡呈急性发病，在不表现任何临床症状的情况下突然死亡，死亡率最高可达到80％。该病具有发病急，易于传播且传播速度快等特点，给养禽业造成巨大的经济损失，已引起世界各地广泛关注。

目前防控禽4型腺病毒病的主要方法是接种疫苗，生产中使用的疫苗主要是FAdV-4全病毒灭活疫苗。疫苗对防制禽4型腺病毒病有一定的效果，但该病仍然发生和流行，说明仅能产生体液免疫应答能力的灭活疫苗，不能很好地控制禽4型腺病毒病。体液免疫和细胞免疫在机体的免疫系统中起着重要的作用，而目前使用的灭活疫苗不能刺激机体产生细胞免疫应答，导致防控FAdV-4感染的效果不完美，因此，如何研制出能同时激活体液免疫和细胞免疫应答是FAdV-4疫苗研究的方向。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种flagellin-fiber2融合蛋白，其为具有良好免疫原性和反应性，且没有有安全隐患、并对禽4型腺病毒病具有高免疫保护效果的融合蛋白，上述的flagellin-fiber2融合蛋白是鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(flagellin)和禽4型腺病毒fiber2蛋白的融合蛋白。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种flagellin-fiber2融合蛋白，其为禽4型腺病毒fiber2蛋白与去除毒力的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白flagellin融合表达的蛋白。

如上所述的flagellin-fiber2融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种编码上述flagellin-fiber2融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；

或所述基因为编码如SEQ ID NO.1所示的氨基酸的基因序列进行的替换、添加、缺失一个或多个核苷酸，并具有与SEQ ID NO.1所示氨基酸有完整编码基因具有相同功能的核苷酸序列。

考虑到密码子的简并性，在不改变基因的编码区氨基酸序列的条件下，或在其非编码区且不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。经大量实验验证，最后将flagellin编码氨基酸的第190-416位氨基酸删除，利用GAPVDPASPW这个短肽序列将flagellin的1-189位和417-508位进行连接，构成重组蛋白中flagellin的序列，获得新的重组基因。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加、缺失一个或多个核苷酸，并具有与上述完整编码基因具有相同功能的核苷酸序列。

一种克隆载体或表达载体，所述克隆载体或表达载体含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

一种宿主细胞，所述宿主细胞含如上所述的克隆载体或表达载体。

一种如上所述flagellin-fiber2融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

S1、人工合成所述融合蛋白的基因，所述flagellin-fiber2融合蛋白的基因序列编码如SEQ ID NO.1所示的氨基酸；

S2、将所述融合蛋白的基因连接到pFastBac-HA质粒，得到重组载体pFastBac-HA-flagellin-fiber2；

S3、将所述重组载体pFastBac-HA-flagellin-fiber2转化E.coli DH10Bac感受态细胞，利用感受态细胞中的Tn7转座系统，将融合基因转座至杆状病毒穿梭载体Bacmid中，得到重组质粒Bacmid-flagellin-fiber2；

S4、将所述重组质粒Bacmid-flagellin-fiber2转染入Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒，并以Sf9昆虫细胞为宿主细胞培养病毒，采用Ni-NAT亲和层析法纯化带有His标签的目的蛋白。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S1中，所述flagellin-fiber2融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，将所述融合蛋白的基因连接到pFastBac-HA质粒的操作为：

S201、先采用如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述的引物扩增步骤(1)人工合成的所述融合蛋白的基因，纯化扩增产物；

S202、用限制性内切酶NotI和HindIII对载体pFastBac-HA和纯化后的PCR产物进行双酶切，16℃连接过夜，转化入DH5α感受态细胞，挑取PCR鉴定为阳性的单菌落摇菌提质粒，获得阳性pFastBac-HA重组质粒pFastBac-HA-flagellin-fiber2。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S3中，所述转化E.coli DH10Bac感受态细胞的鉴定，采用的引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S4中，所述目的蛋白的分子量为100kD。

如上所述flagellin-fiber2融合蛋白的应用，所述flagellin-fiber2融合蛋白用于制备防控禽4型腺病毒病的疫苗。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的flagellin-fiber2融合蛋白中的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(flagellin)作为TLR5的识别配体，诱导产生天然免疫应答。鞭毛蛋白可通过自身诱导的先天性免疫系统产生的应答来启动并增强特异性免疫系统对其它与鞭毛蛋白融合的蛋白抗原产生特异性的应答，发挥较强的免疫佐剂作用。本发明提供的融合蛋白中的fiber2蛋白是FAdV-4主要免疫原性结构蛋白，是FAdV-4的保护性抗原，其诱导的抗体能保护宿主不受FAdV-4的感染。可见，本发明提供的融合蛋白中鞭毛蛋白以佐剂的形式增强机体对fiber2蛋白的免疫应答，具有更好的保护作用。此外，本发明研究发现，利用杆状病毒表达系统表达的融合蛋白flagellin-fiber2表现出良好的免疫保护力。

本发明是通过杆状表达系统将鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白与禽4型腺病毒fiber2蛋白进行融合表达，由于利用的表达系统属于真核表达系统，因此表达产物具有与天然蛋白近似的理化和生物学特性，能进行蛋白翻译后的加工修饰，融合蛋白表达稳定且具有良好的免疫原性，对实验动物进行强毒攻击后有较好的免疫保护力。本发明提供的一种flagellin-fiber2融合蛋白，其具有良好免疫原性和反应性，对禽4型腺病毒感染的疾病具有高免疫保护效果，安全性高。

本发明还提供了flagellin-fiber2融合蛋白的氨基酸序列和基因编码序列信息，为稳定表达和增加表达产率提供了基础。附图说明

图1为目的基因扩增结果，其中1为阴性对照、2为flagellin-fiber2的扩增条带；M为DL5000Marker。图2为重组质粒中目的基因扩增的鉴定结果，其中，条带1-3分别是flagellin-fiber2三个克隆的扩增基因条带，4是阴性对照；M是DL5000Marker。

图3为阳性重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞后，提取质粒用M13引物扩增的PCR鉴定结果，其中，标注的条带1-6分别是Bacmid-flagellin-fiber2的六个克隆，7是阴性对照；M是DL5000 Marker。

图4为IFA检测重组质粒转染Sf9细胞结果，其中，图4(1)是Bacmid-flagellin-fiber2转染Sf9细胞，图4(2)是Bacmid空质粒对照转染Sf9细胞，图4(3)是正常Sf9细胞IFA检测结果。

图5是SDS–PAGE分析及融合蛋白纯化结果，其中，条带1-5分别是flagellin-fiber2融合蛋白在50mM咪唑、100mM咪唑、150mM咪唑、200mM咪唑和500mM咪唑的纯化条带，条带6是Sf9昆虫细胞中flagellin-fiber2融合蛋白的表达条带；M是10-170kD Marker。

图6为纯化的flagellin-fiber2融合蛋白的Western-blot鉴定结果，其中条带1-2是纯化的flagellin-fiber2融合蛋白条带；M是10-170kD Marker。

图7为各免疫处理组感染病毒后SPF鸡的存活数量。

图8为ELISA检测免疫和攻毒后SPF鸡血清内抗体水平，其中图8(1)为免疫后各组血清内抗体水平，图8(2)为攻毒后各组血清内抗体水平。

具体实施方式

本发明的发明人通过大量实验研究筛选，并经过验证，最后发现将FAdV-4的免疫原性蛋白fiber2基因与鞭毛蛋白基因flagellin连接，主要是该flagellin和fiber2的融合基因中flagellin基因位于fiber2基因的N端，并通过人工合成的方式将二者进行链接。并利用杆状病毒表达系统进行表达，研究其融合蛋白的免疫保护效果，发出具有优质的免疫效力的新型亚单位疫苗提供基础，并对其用于禽4型腺病毒病的有效防控具有重要意义。此外，通过对flagellin基因的序列分析，将其进行不同程度的缺失，发现试验中flagellin的截短序列可满足其生物功能。

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用主要试剂包括：PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara公司)；QIAquick PCRPurification Kit、Plasmid Mini Kit、QIAexpressNI-NTA Fast Start(Qiagen公司)；CellfectinⅡReagent、PROBOND PURIFICATION KIT、卡那霉素、庆大霉素、四环素、Bluo-gal、IPTG(Invitrogen公司)；Insect-Xpress培养基(Lonza公司)；Sf-900TM1.3x、4％Agarose Gel(GIBCO公司)。所用试剂如无特别说明，均可常规商业用试剂。

实施例1禽4型腺病毒fiber2蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白flagellin在Sf9昆虫细胞中的融合表达

1.1、构建重组载体

(1)flagellin-fiber2基因的PCR扩增：人工合成的flagellin-fiber2基因核酸序列见SEQ ID NO.2所示。

flagellin-fiber2上下游引物分别是：

上游引物(P1，SEQ ID NO.3)：CCGCGGCCGCTTATGGCACAAGTAATCAACA；

下游引物(P2，SEQ ID NO.4)：CGAAGCTTAATTACGGGAGGGAGGCCGCTGGA；

其中P1包含NotI酶切位点，见下划线，P2包含HindIII酶切位点，见下划线，通过对PCR反应条件和试剂优化后建立20μl的反应体系，见表1：

表1：PCR反应具体物质的用量

模板	2μl
		Taq聚合酶	0.2μl
5×Taq Buffer	4μl
		dNTP Mixture	2μl
上游引物	1μl
		下游引物	1μl
灭菌蒸馏水	9.8μl

PCR反应程序：95℃变性5min，94℃30s，54℃退火30s，72℃延伸2.5min，循环30次，72℃10min。回收、纯化PCR产物。

取6μl PCR产物加入适量Loading Buffer进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，用标准分子量作对照，确定产物的大小，电泳结果如图1所示，结果表明扩增后Flagellin-fiber2基因片段，大小为2250bp，如图中所示，扩增结果与预期一致。

(2)、pFastBac-HA重组质粒的构建与鉴定

用限制性内切酶NotI和HindIII对载体pFastBac-HA和纯化后的PCR产物进行双酶切，16℃连接过夜，转化入DH5α感受态细胞。挑取PCR鉴定为阳性的单菌落摇菌提质粒，进行PCR鉴定(步骤同(1)中叙述)，并送其产物到测序公司进行测序验证，结果见图2，图中，条带1-3分别是flagellin-fiber2三个克隆的扩增基因条带，4是阴性对照；M是DL5000Marker。结果显示重组载体构建成功。摇菌提质粒即获得阳性重组质粒pFastBac-HA-flagellin-fiber2。

1.2、重组杆状病毒的构建

将阳性重组质粒pFastBac-HA-flagellin-fiber2转化DH10Bac感受态细胞，具体操作为将pFastBac-HA-flagellin-fiber2加入DH10Bac感受态细胞中，冰浴30min后放入42℃水浴锅热激45s，再转入冰浴1min，向装有感受态细胞的管中加入900μl SOC培养基，37℃200rpm摇床振荡培养1h，取100μl混悬液涂细菌培养板(细菌培养板包括三种抗生素：卡那霉素、庆大霉素、四环素和两种化学试剂：100μg/ml Bluo-gal和40μg/ml IPTG)。经过蓝白斑筛选出白色单菌落，用M13公用引物(SEQ ID NO.5：5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’和SEQ ID NO.6：5’-AGCGGATAACAATTTCACAGG-3’)进行PCR鉴定得到阳性重组Bacmid质粒，结果如图3所示，其中，标记的条带1-6分别是Bacmid-flagellin-fiber2的六个克隆，7是阴性对照；M是DL5000Marker。结果表明用M13引物扩增得到4550bp的条带，与预期结果一致。用M13公用引物进行扩增鉴定是由于flagellin-fiber2基因已被感受态细胞中的转座系统转座形成重组的Bacmid质粒，用M13引物进行的反应程序为：94℃变性15min；94℃1min，55℃1min，72℃5min，共30个循环，然后72℃延伸10min。

大提质粒，具体操作参见II Reagent转染试剂盒说明，然后转染Sf9昆虫细胞，并设置Bacmid空质粒和Sf9空细胞对照。

1.3融合蛋白的表达鉴定

(1)、IFA

Sf9昆虫细胞于96孔板中长成单层后，接种1.2中构建的重组杆状病毒，72h后用PBS洗3次，4％多聚甲醛固定过夜。第二天吸出固定液，用PBST洗涤3次，加入5％脱脂奶室温封闭2h，用1:30稀释的Monoclonal Anti-his作一抗，37℃孵育2h，PBS洗3次，加入抗鼠的荧光标记IgG二抗，37℃孵育2h，PBS洗3次后，在荧光显微镜下观察，结果如图4所示，其中，图4(1)是Bacmid-flagellin-fiber2转染Sf9细胞，图4(2)是Bacmid空质粒对照转染Sf9细胞，图4(3)是正常Sf9细胞IFA检测结果。

结果表明：转染三种Bacmid重组质粒的的Sf9细胞均出现绿色荧光，而Bacmid空载体对照和空细胞对照未见荧光。

(2)、融合蛋白的纯化与鉴定

杆状病毒系统感染对数期生长的Sf9昆虫细胞，48h后收集细胞，按照Ni-NAT亲和层析法变性纯化蛋白，具体操作如下：

1 配制非变性结合缓冲液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液：用去离子水将5×Nativebuffer稀释为1×Native Buffer，向其中加入5mM咪唑，用1M HCl调pH为8.0，即为裂解缓冲液。1×Native Buffer，pH 8.0即为结合缓冲液。1×Native Buffer，pH 8.0中含有20mM咪唑即为洗涤缓冲液。1×Native Buffer，pH 8.0中分别含有50mM、100mM、150mM和250mM咪唑为梯度洗脱液。

2 收集细胞：4℃500g离心，上清为重组杆状病毒液，沉淀细胞备用。

3 用裂解缓冲液重悬细胞，8mL/g。

4 超声裂解细胞：超10s停20s，超声15min。

5 4℃3,000g离心30min，将上清转移到干净的离心管中。取100mL样品进行SDS及Western-Blotting鉴定。

6 取2mL Ni-NTA Agarose到柱子中，用6mL去离子水清洗。依靠重力作用滴下。

7 取6mL结合缓冲液清洗柱子，依靠重力作用滴下，重复一遍。

8 重组蛋白与Ni-NTA结合：将裂解液加入到Ni-NTA Agarose柱子中，依靠重力作用滴下。取100mL流川液进行SDS及Western-Blotting鉴定。

9 用20mL洗涤缓冲液清洗柱子，依靠重力作用滴下，取100mL流川液进行SDS及Western-Blotting鉴定。

10洗脱重组蛋白：由50mM咪唑、100mM咪唑、150mM咪唑、200mM咪唑和500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱重组蛋白，每个梯度5mL，依靠重力滴下。分别取各级洗脱液的流川液100mL进行SDS及Western-Blotting鉴定。，结果如图5和图6所示，其中，图5中，条带1-5分别是flagellin-fiber2融合蛋白在50mM咪唑、100mM咪唑、150mM咪唑、200mM咪唑和500mM咪唑的纯化条带，条带6是Sf9昆虫细胞中flagellin-fiber2融合蛋白的表达条带；M是10-170kDMarker。图6中，条带1-2是纯化的flagellin-fiber2融合蛋白条带；M是10-170kD Marker。经此方法鉴定后的变性蛋白可经透析复性得到带有His标签的可溶性目的蛋白。

结果表明：从SDS-PAGE的蛋白胶上可以看出纯化后的蛋白条带，大小分别为100kD，与预期一致；而且通过Western blot经ECL显色后在目的带处有明显的单一的反应条带，最后通过透析复性得到可溶性蛋白。

实施例2禽4型腺病毒fiber2蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白flagellin融合表达产物的免疫保护性研究

(1)免疫后攻击SPF鸡的免疫保护效果

将80只SPF鸡(由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供)随机平分为4组，分别为阳性攻毒组(接种FAdV-4组)、未攻毒组(未接种FAdV-4组)、20μg flagellin-fiber2重组蛋白免疫组、PBS接种组。FAdV-4由北京市农林科学院畜牧兽医研究所刘爵研究员课题组提供。SPF鸡在免疫后21天，4组的SPF鸡分别肌肉接种FAdV-4肝组织研磨病毒液(由北京农学院动物科技院实验室提供)，10^2.0EID₅₀/0.2ml，接种0.4ml/只。攻毒后，每天监测鸡的发病情况，对死亡鸡只进行剖检，并观察病理变化，结果如图7所示，其中横坐标的1-4分别是20μg flagellin-fiber2融合蛋白免疫组，PBS接种组，阳性攻毒组和未攻毒组，纵坐标为SPF鸡存活数量。

图7中结果显示免疫20μg的重组杆状病毒表达融合蛋白flagellin-fiber2组鸡只死亡1只，而PBS组和阳性对照组的鸡只全部死亡，未攻毒组鸡只全部存活，因为未攻毒组在实验中是作为阴性对照的，因此其不需要接种病毒，从而使得鸡只全部存活。结果表明20μgflagellin-fiber2融合蛋白免疫组的免疫保护效果很好。

(2)间接ELISA检测血清IgG抗体水平

将实验室前期纯化的fiber2蛋白(由北京市农林科学院畜牧兽医研究所刘爵研究员课题组提供)包被ELISA板，以最初免疫后第7、14、21天和攻毒后第7、14、21天采集的SPF鸡血清按1:200稀释后作为一抗，用HRP标记山羊抗鸡抗体作为二抗，TMB显色后读取OD450nm数值。上述各组免疫后不同时间点血清中抗体水平结果见图8。图中显示20μgflagellin-fiber2融合蛋白免疫组的抗体水平显著高于其它组。说明本发明制备的flagellin-fiber2融合蛋白具有较高的免疫保护性。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种flagellin-fiber2融合蛋白、其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 749

<212> PRT

<213> flagellin- fiber2融合蛋白(flagellin- fiber2)

<400> 1

Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn

1 5 10 15

Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu

20 25 30

Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln

35 40 45

Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala

50 55 60

Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly

65 70 75 80

Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala

85 90 95

Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile

100 105 110

Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly

115 120 125

Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu

130 135 140

Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu

145 150 155 160

Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Gly Ala Pro Val Asp Pro Ala

165 170 175

Ser Pro Trp Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala

180 185 190

Gln Val Asp Ala Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe

195 200 205

Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Ser Glu

210 215 220

Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn

225 230 235 240

Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala

245 250 255

Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg Met Leu

260 265 270

Arg Ala Pro Lys Arg Arg His Ser Glu Asn Gly Lys Pro Glu Thr Glu

275 280 285

Ala Gly Pro Ser Pro Ala Pro Ile Lys Arg Ala Lys Arg Met Val Arg

290 295 300

Ala Ser Gln Leu Asp Leu Val Tyr Pro Phe Asp Tyr Val Ala Asp Pro

305 310 315 320

Val Gly Gly Leu Asn Pro Pro Phe Leu Gly Gly Ser Gly Pro Leu Val

325 330 335

Asp Gln Gly Gly Gln Leu Thr Leu Asn Val Thr Asp Pro Ile Ile Ile

340 345 350

Lys Asn Arg Ser Val Asp Leu Ala His Asp Pro Ser Leu Asp Val Asn

355 360 365

Ala Gln Gly Gln Leu Ala Val Ala Val Asp Pro Glu Gly Ala Leu Asp

370 375 380

Ile Thr Pro Asp Gly Leu Asp Val Lys Val Asp Gly Val Thr Val Met

385 390 395 400

Val Asn Asp Asp Trp Glu Leu Ala Val Lys Val Asp Pro Ser Gly Gly

405 410 415

Leu Asp Ser Thr Ala Gly Gly Leu Gly Val Ser Val Asp Asp Thr Leu

420 425 430

Leu Val Asp Gln Gly Glu Leu Gly Val His Leu Asn Gln Gln Gly Pro

435 440 445

Ile Thr Ala Asp Ser Ser Gly Ile Asp Leu Glu Ile Asn Pro Asn Met

450 455 460

Phe Thr Val Asn Thr Ser Thr Gly Ser Gly Val Leu Glu Leu Asn Leu

465 470 475 480

Lys Ala Gln Gly Gly Ile Gln Ala Asp Ser Ser Gly Val Gly Val Ser

485 490 495

Val Asp Glu Ser Leu Gln Ile Val Asn Asn Thr Leu Glu Val Lys Pro

500 505 510

Asp Pro Ser Gly Pro Leu Thr Val Ser Ala Asn Gly Leu Gly Leu Lys

515 520 525

Tyr Asp Thr Asn Thr Leu Ala Val Thr Ala Gly Ala Leu Thr Val Val

530 535 540

Gly Gly Gly Ser Val Ser Thr Pro Ile Ala Thr Phe Val Ser Gly Ser

545 550 555 560

Pro Ser Leu Asn Thr Tyr Asn Ala Thr Thr Val Asn Ser Ser Ala Asn

565 570 575

Ala Phe Ser Cys Ala Tyr Tyr Leu Gln Gln Trp Asn Ile Gln Gly Leu

580 585 590

Leu Val Thr Ser Leu Tyr Leu Lys Leu Asp Ser Ala Thr Met Gly Asn

595 600 605

Arg Pro Gly Asp Leu Asn Ser Ala Asn Ala Lys Trp Phe Thr Phe Trp

610 615 620

Val Ser Ala Tyr Leu Gln Gln Cys Asn Pro Ser Gly Ile Gln Ala Gly

625 630 635 640

Thr Val Ser Pro Ser Thr Ala Thr Leu Thr Asp Phe Glu Pro Met Ala

645 650 655

Asn Arg Ser Val Thr Ser Pro Trp Thr Tyr Ser Ala Asn Gly Tyr Tyr

660 665 670

Glu Pro Ser Ile Gly Glu Phe Gln Val Phe Ser Pro Val Val Thr Gly

675 680 685

Ala Trp Asn Pro Gly Asn Ile Gly Ile Arg Val Leu Pro Val Pro Val

690 695 700

Ser Ala Ser Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Leu Cys Tyr Ser Leu Gln Cys

705 710 715 720

Thr Asn Ala Ser Ile Phe Asn Pro Asn Asn Ser Gly Thr Met Ile Val

725 730 735

Gly Pro Val Leu Tyr Ser Cys Pro Ala Ala Ser Leu Pro

740 745

<210> 2

<211> 2250

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcacaag taatcaacac taacagtctg tcgctgctga cccagaataa cctgaacaaa 60

tcccagtccg cactgggcac cgctatcgag cgtctgtctt ctggtctgcg tatcaacagc 120

gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt tcaccgcgaa catcaaaggt 180

ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc 240

gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgct 300

aacagcacca actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg 360

aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag 420

gacaacaccc tgaccatcca ggttggcgcc aacgacggtg aaactatcga tatcgatctg 480

aagcagatca actctcagac cctgggtggt gcaccggtag acccggcaag cccgtggacc 540

gaaaacccgc tgcagaaaat tgatgccgcg ctggcgcagg tggatgcgct gcgctctgat 600

ctgggtgcgg tacaaaaccg tttcaactct gctatcacca acctgggcaa taccgtaaac 660

aacctgtctg aagcgcgtag ccgtatcgaa gattccgact acgcgaccga agtttccaac 720

atgtctcgcg cgcagattct gcagcaggcc ggtacttccg ttctggcgca ggctaaccag 780

gtcccgcaga acgtgctgtc tctgttacgt atgctccggg cccctaaaag aagacattcc 840

gaaaacggga agcccgagac cgaagcggga ccttccccgg ctccaatcaa gcgcgccaaa 900

cgcatggtga gagcatccca gcttgacctg gtttatcctt tcgattacgt ggccgacccc 960

gtcggagggc tcaacccgcc ttttttggga ggctcaggac ccctagtgga ccagggcgga 1020

cagcttacgc tcaacgtcac cgatcccatc atcatcaaga acagatcggt ggacttggcc 1080

cacgacccca gtctcgatgt caacgcccaa ggtcaactgg cggtggccgt tgaccccgaa 1140

ggggccctgg acatcacccc cgatggactg gacgtcaagg tcgacggagt gaccgtaatg 1200

gtcaacgatg actgggaact ggccgtaaaa gtcgacccgt ccggcggatt ggattccacc 1260

gcgggtggac tgggggtcag cgtggacgac accttgctcg tggatcaggg agaactgggc 1320

gtacacctca accaacaagg acccatcact gccgatagca gtggtatcga cctcgagatc 1380

aatcctaaca tgttcacggt caacacctcg accggaagcg gagtgctgga actcaaccta 1440

aaagcgcagg gaggcatcca agccgacagt tcgggagtgg gcgtttccgt ggatgaaagc 1500

ctacagattg tcaacaacac tctggaagtg aaaccggatc ccagcggacc gcttacggtc 1560

tccgccaatg gcctagggct gaagtacgac actaataccc tagcggtgac cgcgggcgct 1620

ttaaccgtgg tcggaggggg gagcgtctcc acacccatcg ctacttttgt ctcgggaagt 1680

cccagcctca acacctacaa tgccacgacc gtcaattcca gcgcgaacgc cttctcttgc 1740

gcctactacc ttcaacagtg gaacatacag gggctccttg ttacctccct ctacttgaaa 1800

ttggacagcg ccaccatggg gaatcgccct ggggacctca actccgccaa tgccaaatgg 1860

ttcacctttt gggtgtccgc ctatctccag caatgcaacc cctccgggat tcaagcggga 1920

acggtcagcc cctccaccgc caccctcacg gactttgaac ccatggccaa taggagcgtg 1980

accagcccat ggacgtactc ggccaatgga tactatgaac catccatcgg ggaattccaa 2040

gtgttcagcc cggtggtaac aggtgcctgg aacccgggaa acatagggat ccgcgtcctc 2100

cccgtgccgg tttcggcctc cggagagcga tacacccttc tatgctatag tctgcagtgc 2160

acgaacgcga gcatttttaa tccaaacaac agcggaacca tgatcgtggg acccgtgctc 2220

tacagctgtc cagcggcctc cctcccgtaa 2250

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgcggccgc ttatggcaca agtaatcaac a 31

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgaagcttaa ttacgggagg gaggccgctg ga 32

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccagtcacg acgttgtaaa acg 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agcggataac aatttcacag g 21

Claims (10)

1.一种flagellin-fiber2融合蛋白，其特征在于，其为禽4型腺病毒fiber2蛋白与去除毒力的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白flagellin融合表达的蛋白。

2.根据权利要求1所述的flagellin-fiber2融合蛋白，其特征在于，所述flagellin-fiber2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种编码权利要求1或2所述的flagellin-fiber2融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

或所述基因为编码如SEQ ID NO.1所示的氨基酸的基因序列进行的替换、添加、缺失一个或多个核苷酸，并具有与SEQ ID NO.1所示氨基酸有完整编码基因具有相同功能的核苷酸序列。

4.一种克隆载体或表达载体，其特征在于，所述克隆载体含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

6.一种flagellin-fiber2融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

S1、人工合成flagellin-fiber2融合蛋白的基因，所述flagellin-fiber2融合蛋白的基因序列编码如SEQ ID NO.1所示的氨基酸；

S2、将所述融合蛋白的基因连接到pFastBac-HA质粒，得到重组载体pFastBac-HA-flagellin-fiber2；

S3、将所述重组载体pFastBac-HA-flagellin-fiber2转化E.coli DH10Bac感受态细胞，利用感受态细胞中Tn7转座系统，将融合基因转座至杆状病毒穿梭载体Bacmid中，得到重组质粒Bacmid-flagellin-fiber2；

S4、将所述重组质粒Bacmid-flagellin-fiber2转染入Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒，并以Sf9昆虫细胞为宿主细胞培养病毒，采用Ni-NAT亲和层析法纯化带有His标签的目的蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述flagellin-fiber2融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，将所述融合蛋白的基因连接到pFastBac-HA质粒的操作为：

S201、先采用如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述的引物扩增步骤(1)人工合成的所述融合蛋白的基因，纯化扩增产物；

S202、用限制性内切酶NotI和HindIII对载体pFastBac-HA和纯化后的PCR产物进行双酶切，16℃连接过夜，转化入DH5α感受态细胞，挑取PCR鉴定为阳性的单菌落摇菌提质粒，获得阳性pFastBac-HA重组质粒pFastBac-HA-flagellin-fiber2。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述转化E.coliDH10Bac感受态细胞的鉴定，采用的引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列；

在步骤S4中，所述目的蛋白的分子量为100kD。

10.一种根据权利要求1或2所述的flagellin-fiber2融合蛋白或权利要求6-9中任一项制备方法制备的flagellin-fiber2融合蛋白的应用，其特征在于，所述flagellin-fiber2融合蛋白用于制备防控禽4型腺病毒病的疫苗。