CN103739717A - 一种抗猪2型圆环病毒病的重组蛋白亚单位疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗猪2型圆环病毒病的重组亚单位疫苗，该疫苗是具有较高免疫原性的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白（flagellin）和猪2型圆环病毒Cap蛋白的融合蛋白。本发明通过将人工编码的Flagellin-ORF2、Flagellin-ΔORF2基因融合克隆进pFastBac表达载体，同ORF2、ΔORF2重组克隆（pFastBac载体）一起转染Sf9细胞，利用杆状病毒系统表达四个融合蛋白，并通过间接免疫荧光（IFA）和Western-blot进行鉴定。通过上述系统获得重组杆状病毒的周期短，且表达的flagellin+Cap融合蛋白具有较高的免疫保护力。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种抗猪2型圆环病毒病的亚单位疫苗。
背景技术
猪圆环病毒于1974年首次在猪肾细胞系PK15细胞中发现，并被认为具非致病性。1991年在加拿大猪群中发现称之为断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的病，发现其主要是由一种致病性猪圆环病毒引起，被国际分类学会划分为PCV2，而非致病性的猪圆环病毒划分为PCV1。PCV2属圆环病毒科圆环病毒属，其基因组由一环状单链DNA组成，是迄今发现的最小的一种动物病毒。PCV2含有2个主要阅读框ORF1和ORF2，其中ORF1负责编码与病毒复制相关的蛋白（Rep），而ORF2编码病毒的结构蛋白Cap蛋白。PCV2感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪呼吸疾病综合征（PRDC）、猪皮肤和肾病综合征（PDNS）等多种疾病（总称为猪圆环病毒病，PCVD）。研究表明，该病毒在猪的淋巴系统增殖，可引起免疫细胞凋亡，造成免疫抑制，导致机体抵抗力下降，诱发多种病毒和细菌的混合感染和继发感染,给养猪业造成巨大的经济损失，已引起世界各地广泛重视。
目前防控猪2型圆环病毒病的主要方法是接种疫苗，生产中使用的疫苗主要是PCV2全病毒灭活疫苗、PCV1-PCV2嵌合病毒灭活疫苗以及杆状病毒表达PCV2基因工程疫苗。这些疫苗对防制猪2型圆环病毒病有一定的效果，但该病仍然严重发生和流行，说明仅能产生体液免疫应答能力的灭活疫苗和常规的基因工程亚单位疫苗不能很好地控制猪圆环病毒病。猪2型圆环病毒导致B淋巴细胞和T淋巴细胞的减少甚至缺失而引起免疫抑制，因此仅能产生体液免疫应答的灭活疫苗和亚单位疫苗不能产生理想的免疫效果，研究表明，目前使用的商品疫苗均不能刺激机体产生细胞免疫应答导致防控PCV2感染的效果不理想，因此如何开发出能同时激活体液和细胞免疫应答是PCV2疫苗研究的方向。病原感染宿主引起致病是通过病原与宿主相互作用表现出来的，TLR受体在强毒力病原致病或减毒疫苗产生免疫应答方面起重要作用。鞭毛蛋白，是一种TLR5配体，能显著增强抗原的免疫原性与保护性。研究表明，将西尼罗病毒囊膜蛋白与鞭毛蛋白融合制成疫苗免疫能产生抗病毒攻击的中和抗体与保护性抗体，而单独的亚单位抗原免疫不能产生合适的保护性抗体应答。为此，PCV2的免疫原性蛋白ORF2基因与鞭毛蛋白基因连接，并于杆状病毒中表达，开发出良好免疫效力的新型亚单位疫苗，用于猪圆环病毒病的有效防控具有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的一个目的是提供一种高免疫原性且没有安全隐患的抗猪2型圆环病毒病的亚单位疫苗，所述的高免疫原性的亚单位疫苗保护性抗原是鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白（flagellin）和猪2型圆环病毒Cap蛋白的融合蛋白。
本发明的另一个目的是提供上述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白（flagellin）和猪2型圆环病毒Cap蛋白的融合蛋白的制备方法。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明首先提供了一种融合蛋白，其为猪2型圆环病毒Cap蛋白与消除毒力的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合蛋白。该融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO.2所示，编码上述flagellin+Cap融合蛋白的基因，其核苷酸序列见SEQ ID NO.1，该基因用Flagellin-ORF2表示。
此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞等等。
本发明还进一步提供所述flagellin+Cap融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：
人工合成编码所述融合蛋白的基因，连接到pFastBac-HA质粒，得到重组载体pFastBacHA-flagellin+ORF2，转化E.coli DH10Bac感受态细胞，然后利用其含有细菌Tn7转座系统，将该基因转座至杆状病毒穿梭载体bacmid中，得到重组质粒Bacmid-flagellin+ORF2，将其转染昆虫Sf9细胞，获得重组杆状病毒，并以昆虫Sf9细胞为寄主细胞培养病毒，采用Ni-NAT亲和层析法纯化带有His标签的目的蛋白。
本发明提供的flagellin+Cap融合蛋白中的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白（flagellin）作为TLR5的识别受体，可诱导产生天然免疫应答。鞭毛蛋白还可以通过自身激发先天性免疫系统产生应答，以启动增强特异性免疫系统对其他与鞭毛蛋白相连接的抗原产生特异性的应答，发挥较强的免疫佐剂作用，而且可以在粘膜表面诱导以Th2型免疫反应并且伴有IgA的分泌。本发明提供的融合蛋白中的Cap蛋白是ORF2阅读框编码的PCV2结构蛋白。此蛋白具有良好的免疫原性，是PCV2的保护性抗原，其诱导的中和抗体能保护宿主不受PCV2的感染。可见，本发明提供的融合蛋白，鞭毛蛋白作为佐剂增强了Cap蛋白的免疫应答，具有更好的保护作用。另外，本发明研究意外发现，删除核定位信号的Cap蛋白（ΔORF2）比原蛋白具有更强的免疫原性，然而将flagellin+Cap融合表达与将flagellin+ΔORF2融合表达相比，前者却表现出更佳的免疫保护力。
本发明是通过真核表达系统中Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白与猪2型圆环病毒Cap蛋白进行融合表达，表达融合蛋白的周期短，其表达产物具有与天然产物相似的理化和生物学特性，能对蛋白质进行正确的翻译后加工修饰，表达稳定，而且表达产量高，且该融合蛋白具有良好的免疫原性，对实验动物进行强毒攻击后有较好的免疫保护力。本发明的鞭毛蛋白是经过改造后的鞭毛蛋白，其中去掉了鞭毛蛋白毒力的部分，消除了鞭毛蛋白毒力的影响，因此通过本发明提供的表达系统能获得没有毒副作用的且具有免疫学活性的表达产物，对抗猪2型圆病毒新型疫苗的开发具有重要的意义。
附图说明
图1是目的基因扩增结果，其中1～3分别是ΔORF2，Flagellin-ΔORF2，Flagellin-ORF2的扩增条带；M是DL2000Marker。
图2是目的基因扩增到DH5α鉴定结果，其中1、2是pFastBac-ΔORF2，3、4是pFastBac-Flagellin-ΔORF2，5是pFastBac-Flagellin-ORF2基因条带；M是DL2000Marker。
图3是阳性重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞后，提取质粒PCR鉴定结果，其中，1～6分别是ΔORF2、Flagellin-ΔORF2、Flagellin-ORF2、pFastBac-ΔORF2、pFastBac-Flagellin-ΔORF2和pFastBac-Flagellin-ORF2；M是DL2000Marker。
图4是重组杆状病毒转染Sf9细胞结果，其中，（1）是转染后Sf9细胞，（2）是Bacmid空载体，（3）正常Sf9细胞。
图5是转染Sf9细胞沉淀进行Western-blot结果，其中，1～3分别是Bac-flagellin-ORF2、Bac-flagellin-ΔORF2和Bac-ΔORF2；M是7-175KDmarker。
图6是IFA检测重组质粒转染Sf9细胞结果，其中1～5分别是Bac-ΔORF2转染Sf9细胞、Bac-Flagellin-ΔORF2转染Sf9细胞、Bac-Flagellin-ORF2转染细胞、Bacmid空质粒对照和正常Sf9细胞IFA检测结果。
图7是SDS鉴定蛋白纯化结果，其中，1～4分别是Bac-ΔORF2、Bac-ORF2、Bac-flagellin-ΔORF2和Bac-flagellin-ORF2组纯化条带；M是7-175KDmarker。
图8是Western-blot鉴定纯化蛋白结果，1～4分别是Bac-ΔORF2，Bac-ORF2，Bac-flagellin-ΔORF2，Bac-flagellin-ORF2组纯化条带；M是7-175KD marker。
图9是ELISA检测免疫后小鼠血清内抗体水平图，其中（1）免疫剂量为2μg的小鼠血清内抗体水平，（2）免疫剂量为10μg的小鼠血清内抗体水平。
图10是ELISA检测攻毒后小鼠血清内抗体水平图，其中（1）免疫剂量）免疫剂量为2μg的小鼠攻毒后血清内抗体水平，（2）免疫剂量为10μg的小鼠攻毒后血清内抗体水平。
图11是小鼠血清内中和抗体水平。
图12是免疫组和对照组小鼠攻毒后，肝脏与肾脏免疫组织化学观察图，其中，（A）：空白对照肝组织，（B）：Bac-flagellin-ORF2免疫攻击组小鼠肝组织，（C）：Bac-ORF2免疫攻击组小鼠肝组织，（D）：空白对照攻击组小鼠肝组织，（E）：空白对照肾组织，（F）：Bac-flagellin-ORF2免疫攻击组小鼠肾组织，（G）：Bac-ORF2免疫攻击组小鼠肾组织，（H）：空白对照攻击组小鼠肾组织。
具体实施方式
以下实施例用于对本发明的进一步说明，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
实施例1猪2型圆环病毒Cap蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白在昆虫Sf9细胞中的融合表达
1.1构建重组载体
1.1.1ΔORF2、Flagellin-ORF2和Flagellin-ΔORF2基因的PCR扩增：
人工合成的ΔORF2基因，其是删除核定位信号的编码Cap蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；人工合成的Flagellin-ORF2基因核酸序列见SEQ IDNo.1；Flagellin-ΔORF2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
ΔORF2基因的上下游引物，分别是：
上游引物（P1）：CCCTCGAGGAATGGCATCTTCAACACCCG
下游引物（P2）：CCCAAGCTTGGAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAA；
Flagellin-ORF2和Flagellin-ΔORF2的上下游引物分别是：
上游引物（P3）：CCCTCGAGGATGACGTATCCAAGGAGGCG
下游引物（P4）：CCTCGAGGATGGCACAAGTAATCAACAC
其中P1、P3、P4包含XhoI酶切位点，见下划线，P2包含HindIII酶切位点，见下划线，通过对PCR反应条件和试剂优化后建立20μl的反应体系，见表1：
表1：PCR反应具体物质的量
| 模板 | 0.2μl |
| Taq聚合酶 | 0.2μl |
| 5×Taq Buffer | 4μl |
| dNTP Mixture | 2μl |
| 上游引物 | 1μl |
| 下游引物 | 1μl |
| 灭菌蒸馏水 | 11.6μl |
扩增程序为：95℃变性5min，94℃30s，退火30s，72℃延伸30s至1.5min，循环30次，72℃10min。回收、纯化PCR产物。
取5μl PCR产物加入适量Loading Buffer进行1%的琼脂糖凝胶电泳，用标准分子量作对照，确定产物的大小，结果见图1，结果表明扩增后的ΔORF2、Flagellin-ΔORF2、Flagellin-ORF2基因片段，大小分别为576bp、1386bp、1501bp，如图所示，扩增结果与预期一致。
1.1.2pFastBac HA重组质粒的构建与鉴定
用限制性内切酶XhoI和HindIII对纯化后的PCR产物和载体pFastBac HA进行双酶切，22℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞。挑取PCR鉴定阳性的单菌落摇菌，提取质粒，进行双酶切鉴定并测序，结果见图2，结果显示重组载体构建成功。
1.2重组杆状病毒的构建
提取阳性pFastBac HA重组质粒，转化DH10Bac感受态细胞，经过蓝白斑筛选出白色单菌落，用M13公用引物（5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’和5’-AGCGGATAACAATTTCACAGG-3’）和特异性引物（见1.1.1）PCR鉴定得到阳性重组Bacmid质粒，结果见图3，结果表明用特异性引物扩增得到576bp、1386bp、1501bp的条带，用M13通用引物扩增分别得到3006bp、3816bp、3931bp的条带，与预期结果一致。
其中，用M13引物进行扩增是由于Bacmid分子量大，不具有单一酶切位点，用酶切鉴定有困难，为进一步验证Bacmid中的外源基因的正确性，用M13引物进行PCR反应来确证扩增片断的大小。反应程序为：94℃变性15min；94℃1min，55℃1min，72℃5min，共35个循环，然后72℃延伸10min。
大提质粒，具体操作参见
II Reagent转染试剂盒说明，然后转染Sf9细胞，并设置Bacmid空质粒和Sf9空细胞对照，结果见图4。
1.3融合蛋白的表达鉴定
1.3.1Western blot
用转染后出现病变的细胞常规制备样品，进行12%SDS-PAGE分离蛋白，将蛋白转移至NC膜，5%脱脂奶封闭，加入适当稀释的His单抗反应2h，PBST洗膜3次，加入1:8000稀释的HRP标记羊抗小鼠二抗反应2h，PBST洗膜3次，DAB显色，结果如图5所示。
上述结果表明：ΔORF2、Flagellin-ΔORF2和Flagellin-ORF2三个重组Bacmid质粒均在Sf9细胞中表达了融合蛋白，在NC膜上分别显示25KD、60KD和66KD大小的三条带。
1.3.2IFA
sf9细胞于96孔板中长成单层后，接种重组杆状病毒，72h后用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定过夜。第二天吸出固定液，用PBST洗涤3次，加入5%脱脂奶室温封闭2h，用1:30000稀释的Monoclonal Anti-his作一抗，37℃孵育1h，PBS洗3次，加入抗鼠的荧光标记IgG二抗，37℃孵育1h，PBS洗3次后，在荧光显微镜下观察，结果如图6所示。
结果表明：转染三种Bacmid重组质粒的的Sf9细胞均出现绿色荧光，而Bacmid空载体对照和空细胞对照未见荧光。
1.3.3融合蛋白的纯化与鉴定
杆状昆虫病毒系统感染对数期生长的Sf9细胞，48h后收集细胞，按照Ni-NAT亲和层析法变性纯化蛋白，具体操作参见试剂盒的说明，并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化效果，结果见图7和8。经此方法鉴定后的变性蛋白可经透析复性可得到可溶性蛋白。
结果表明：从SDS蛋白胶上可以看出纯化后的蛋白条带单一，大小分别为25KD、31KD、60KD和66KD，与预期一致；而且通过Western blot经ECL显色后在目的带处有明显的单一的反应条带。最后通过透析复性得到可溶性蛋白。
实施例2猪2型圆环病毒Cap蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白融合表达产物的免疫原性研究
2.1间接ELISA检测血清IgG抗体水平
将小鼠分为10组，其中5组分别免疫2μg的PBS、Bac-ΔORF2重组蛋白、Bac-ORF2重组蛋白、Bac-Flagellin-ΔORF2重组蛋白、Bac-Flagellin-ORF2重组蛋白；另外5组分别免疫10μg的PBS、Bac-ΔORF2重组蛋白、Bac-ORF2重组蛋白、Bac-Flagellin-ΔORF2重组蛋白、Bac-Flagellin-ORF2重组蛋白。免疫后每周尾部采血，检测其血清抗体水平。
以纯化的Bac-ΔORF2融合蛋白包被ELISA板，将上述初免后第7、14、21、28天和攻毒后（PI）第7、14、21天采集的小鼠血清均按1:50稀释后作为一抗，用HRP标记山羊抗小鼠抗体作为二抗，TMB显色后读取OD450nm数值。上述各组初免后，血清中抗体水平结果见图9。从图中可以看出免疫重组杆状病毒表达蛋白组的小鼠抗体水平明显高于PBS对照组，其中Bac-flagellin-ORF2组小鼠产生的IgG抗体水平最高。
上述各组小鼠在二免后第三周开始攻毒猪2型圆环病毒细胞毒液，每周尾部采血，检测其血清中抗体水平，攻毒后21天处死小鼠，小鼠体内血清抗体水平，结果见图10。从图中可以看出免疫剂量为10μg的重组杆状病毒表达蛋白组的小鼠抗体水平在开始攻毒后抗体水平缓慢上升，而攻毒对照组则迅速上升，在攻毒21天时，其小鼠体内的抗体水平只有Bac-Flagellin-ORF2重组蛋白组还要高于攻毒对照组，可见Bac-Flagellin-ORF2重组蛋白组具有良好的免疫原性。而免疫剂量为10μg的重组杆状病毒表达蛋白组的小鼠抗体水平在攻毒后始终高于攻毒对照组的抗体水平，可见该剂量下的Bac-Flagellin-ORF2重组蛋白具有非常高效的免疫效应。
2.2IFA检测血清中和抗体水平
将上述初免后第7、14、21、28天的小鼠血清灭活后，按2倍倍比稀释加入等体积的PCV2细胞毒液（200TCID50），反应1h后感染PK15细胞，72h后固定细胞并进行间接免疫荧光试验检测血清中和抗体滴度，以70%以上的PK15细胞出现荧光时血清的最大稀释度作为血清的中和抗体滴度。结果如图11所示，初免后7-21天，四组免疫组小鼠血清中和抗体的水平都逐渐升高，而在第28天，Bac-ΔORF2和Bac-ORF2组中和抗体水平开始下降，Bac-flagellin-ORF2组水平基本没变，只有Bac-flagellin-ORF2组中和抗体水平上升并达到1:32。
2.3免疫后攻击小鼠的免疫保护效果
非免疫空白对照组小鼠在PCV2攻击后主要表现淋巴细胞减少、缺失，嗜中性细胞浸润等，Bac-ORF2、Bac-ΔORF2和Bac-Flagellin-ΔORF2免疫组小鼠组织有一定程度或轻度的病理变化，而Bac-flagellin-ORF2免疫组攻击后没有明显的病理变化。使用抗PCV2ORF2蛋白抗体进行免疫组织化学染色，可以观察到非免疫空白对照组小鼠组织中大量的PCV2阳性信号，空白对照组小鼠组织没有PCV2阳性信号，Bac-ORF2、Bac-ΔORF2和Bac-Flagellin-ΔORF2免疫组小鼠攻击后仍有较多的PCV2病毒复制，但在Bac-flagellin-ORF2免疫组攻击后PCV2阳性信号显著减少，结果见图12，表明该Bac-flagellin-ORF2免疫组表现更好的免疫攻击保护效果。
Claims (8)
1.一种融合蛋白，其为猪2型圆环病毒Cap蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.编码权利要求1所述融合蛋白的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.一种表达载体，其含有权利要求3或4所述的基因。
6.一种细胞系，其含有权利要求5所述的表达载体。
7.一种抗猪2型圆环病毒病的重组亚单位疫苗，其特征在于，其保护性抗原是权利要求1所述的融合蛋白。
8.制备权利要求1所述融合蛋白的方法，其包括以下步骤：人工合成编码权利要求1所述蛋白的基因，连接到pFastBac-HA质粒，得到重组载体pFastBacHA-flagellin+ORF2，转化E.coli DH10Bac感受态细胞，然后利用其含有细菌Tn7转座系统，将该基因转座至杆状病毒穿梭载体bacmid中，得到重组质粒Bacmid-flagellin+ORF2，将其转染昆虫Sf9细胞，获得重组杆状病毒，并以昆虫Sf9细胞为寄主细胞培养病毒，采用Ni-NAT亲和层析法纯化带有His标签的目的蛋白。
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