CN112898435A

CN112898435A - 一种可溶性融合蛋白DT390-Cap及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112898435A
Application number: CN202110045755.3A
Authority: CN
Inventors: 范阔海
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2021-01-14
Filing date: 2021-01-14
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2041-01-14
Also published as: CN112898435B

Abstract

本发明属于生物技术制药工业中基因工程领域，具体是一种可溶性融合蛋白DT390‑Cap及其制备与应用；可溶性融合蛋白DT390‑Cap，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；可溶性融合蛋白DT390‑Cap，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示；本发明通过试验证明：在使用或不使用ISA201佐剂的情况下，和单独免疫接种Cap相比，融合蛋白DT390‑Cap免疫接种小鼠后诱导产生的抗Cap特异性抗体显著升高，且能有效抑制PCV2在小鼠肺、肝和胸腺中的增值。采用融合表达的方式，DT390能增强Cap的免疫原性和免疫效果，并为后继其他基因工程亚单位疫苗的研发提供一种新的设计模式。

Description

一种可溶性融合蛋白DT390-Cap及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术制药工业中基因工程领域，具体是一种可溶性融合蛋白DT390-Cap及其制备与应用。

背景技术

猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus-associated diseases，PCVAD）目前仍是对养猪业造成严重危害的疾病之一。猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是PCVAD的主要病原体。PCV2基因组包含两个主要的开放阅读框（Open readingframe，ORF），其中ORF2编码的衣壳蛋白（Cap）是主要结构蛋白，具有良好的免疫原性，能刺激动物机体产生针对PCV2的特异性免疫应答，是研发新型亚单位疫苗的主要靶蛋白。基于Cap研发的PCV2亚单位疫苗包括细菌载体疫苗，杆状病毒载体疫苗，酵母载体疫苗，活载体表达疫苗和DNA疫苗。相关的研究表明，PCV2亚单位疫苗对来自不同地区、不同基因型的PCV2感染具有良好的免疫保护力，既能诱导免疫仔猪产生针对PCV2的特异性体液免疫应答，又能诱导产生细胞免疫应答，能显著减轻病毒血症，减少鼻腔和排泄物中PCV2 的排出量，降低各组织器官中PCV2的病毒载量。然而，免疫原性低仍然是Cap亚单位疫苗的主要问题。

白喉毒素（Diphtheria toxin，DT）是由感染β噬菌体的白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）所产生的外毒素，分子大小为58.4 kDa，主要由三个彼此独立的结构域组成，从N端到C端依次为催化区（C区），跨膜转运区（T区）和细胞膜受体结合区（R区）。CRM197（Cross-reacting materials 197）是白喉毒素的一种无毒突变体，具有良好的安全性，其作为抗原的载体蛋白在疫苗的研发中得到了广泛应用。白喉毒素截短片段DT390是白喉毒素N端1-390个氨基酸，包括催化区和跨膜转运区。根据前期的研究发现，DT390与其他蛋白融合表达时，能够增强其他蛋白的免疫原性。

发明内容

本发明利用DT390和Cap的优点，提供了一种融合蛋白DT390-Cap的制备与应用；将DT390和Cap基因进行优化后串联，利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达了DT390-Cap融合蛋白，通过免疫接种试验和攻毒保护试验评价了DT390-Cap的免疫原性和免疫效果。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种可溶性融合蛋白DT390-Cap，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述可溶性融合蛋白DT390-Cap，在制备猪圆环病毒2型疫苗中的应用。

所述 DT390蛋白在制备基因工程亚单位疫苗中的应用。

本发明进一步提供了一种可溶性融合蛋白DT390-Cap的制备方法，包括以下步骤：

pwPICZalpha-DT390-Cap表达载体的构建：以pwPICZalpha-Cap作为模板，使用带有XhoI和NcoI位点的上游引物和带有EcoRI位点的下游引物进行PCR扩增；扩增产物进行XhoI和EcoRI双酶切后克隆到pwPICZalpha用于测序；经测序正确的扩增产物经NcoI和EcoRI双酶切后，克隆到含有DT390的pwPICZalpha-DT390中，构建得到pwPICZalpha-DT390-Cap；

融合蛋白DT390-Cap的表达：将上述步骤得到的线性化的pwPICZalpha-DT390-Cap电转化到巴斯德毕赤酵母菌株中，在含有100μg/ mL Zeocin的YPD琼脂平板筛选阳性克隆菌株；筛选到的阳性菌株经甲醇诱导表达后，离心收集上清液；

融合蛋白DT390-Cap的纯化与检测：通过Ni-Sepharose树脂和强阴离子交换树脂Poros 50HQ对上清液进行纯化，得到纯化后的融合蛋白DT390-Cap；通过SDS-PAGE和Western blot对纯化产物进行分析检测。

进一步的，上述方法中所用带有XhoI和NcoI位点的上游引物pCap-Nco为：5’ CCGCTC GAG CCA TGG GGT GGT GGT GGT TCT ACT TAC CCA AGA AGA AGA TAC AGA 3’，带有EcoRI位点的下游引物pCap-Eco为：5’ CCG GAA TTC TTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG TGGGTT CAA AGG TGG GTC CTT 3’。

本发明进一步提供了一种可溶性融合蛋白DT390-Cap，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

与现有技术相比本发明具有以下有益效果：

在使用或不使用ISA201佐剂的情况下，和单独免疫接种Cap相比，融合蛋白DT390-Cap免疫接种小鼠后诱导产生的抗Cap特异性抗体显著升高，且能有效抑制PCV2在小鼠肺、肝和胸腺中的增值。采用融合表达的方式，DT390能增强Cap的免疫原性和免疫效果，并为后继其他基因工程亚单位疫苗的研发提供一种新的设计模式。

附图说明

图1.是DT390-Cap的 SDS-PAGE分析图；图中 1：糖基化的Cap；2：糖基化的DT390-Cap；3：去糖基化Cap；4：去糖基化的DT390-Cap；5：蛋白marker。

图2.是DT390-Cap的Western blot分析图， A：抗6xHis标签mAb进行蛋白质印迹分析； B：使用抗-Cap多克隆抗体的蛋白质印迹分析，其中 1：DT390-Cap；2：Cap；3和6：蛋白marker；4：去糖基化的DT390-Cap；5：去糖基化的Cap；C：使用抗白喉毒素A亚基mAb的蛋白质印迹分析；其中 1：去糖基化的DT390-Cap；2：DT390-Cap；3：蛋白marker。

图3. 小鼠血清中抗Cap特异性抗体水平的检测图。

图4. 小鼠体内PCV2病毒载量的检测图；其中 A：肺；B：肝脏；C：胸腺。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

1. DT390-Cap的表达与纯化

以pwPICZalpha-Cap作为模板，使用带有XhoI和NcoI位点的引物pCap-Nco（5’ CCGCTC GAG CCA TGG GGT GGT GGT GGT TCT ACT TAC CCA AGA AGA AGA TAC AGA 3’）和带有EcoRI位点的引物pCap-Eco（5’ CCG GAA TTC TTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG TGG GTTCAA AGG TGG GTC CTT 3’）进行PCR扩增。扩增产物进行XhoI和EcoRI双酶切后克隆到pwPICZalpha用于测序。经测序正确的扩增产物经NcoI和EcoRI双酶切后，克隆到含有DT390的pwPICZalpha-DT390中，构建得到pwPICZalpha-DT390-Cap。将线性化的pwPICZalpha-DT390-Cap电转化到巴斯德毕赤酵母菌株中，在含有100μg/ mL Zeocin的YPD琼脂平板（1％酵母提取物，2％蛋白胨,1.5％琼脂，2％葡萄糖）筛选阳克隆菌株。筛选到的阳性菌株经甲醇诱导表达后，离心收集上清液，通过Ni-Sepharose树脂和强阴离子交换树脂Poros 50HQ对上清液进行纯化，SDS-PAGE和Western blot对纯化产物进行分析。由图1和图2可知，获得的产物为融合蛋白DT390-Cap。

2. DT390-Cap的免疫原性和免疫效果评价

2.1 试验分组及处理

将30只6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为6组：

1）PBS+ISA201作为阴性对照组（n =5），PBS和ISA201按体积比1:1混合后肌肉注射（50μL）；

2）Ingelvac CircoFLEX®疫苗作为阳性对照组（n=5），肌肉注射（1.8 µL/g，50μL）；

3）Cap组（n=5），肌肉注射Cap蛋白（165μg/kg，50μL）；

4）DT390-Cap组（n=5），肌肉注射DT390-Cap蛋白（400μg/ kg，50μL）；

5）Cap +ISA201组（n=5），Cap（165μg/ kg，25μL）和ISA201按体积比1:1混合肌肉注射；

6）DT390-Cap+ISA201组（n=5），DT390-Cap（400μg/ kg，25μL）和ISA201按体积比1:1混合肌肉注射。

在初次免疫的前3天和初次免疫后的第14、21、28和42天，眼眶静脉采血并分离血清，用于抗PCV2 Cap特异性抗体检测。在初次免疫的第28天，按照105.5 TCID50/μL的剂量，所有小鼠通过腹腔注射、皮下注射和滴鼻三种途径分别接种0.5 mL、0.3 mL和0.05 mL的PCV2病毒液。在初次免疫的第42天对所有小鼠实施安乐死，收集肺、肝和胸腺样品用于PCV2病毒载量的检测。

2.1小鼠血清中抗PCV2 Cap特异性抗体的检测

用包被缓冲液（pH=9.6）将Cap蛋白稀释至终浓度为2μg/ mL，按每孔100μL加入ELISA板中，4°C包被过夜，用含有0.05% Tween 20的PBST（pH=7.4）洗涤三次。用含1% BSA的PBST 37°C下封闭2h，PBST洗涤3次。将血清和含1% BSA的PBST按照1:800稀释后，每孔50μL加入ELISA板中，37℃下孵育1h，PBST洗涤3次。加入100μL山羊抗小鼠IgG抗体（1:5000），37°C孵育30min，PBST洗涤3次。加入100μL TMB，并37°C孵育15min，加入50μL 1N硫酸终止反应，酶标仪检测OD450吸光值。

由图3可知，在初次免疫的第21、28和42天，阳性对照组，DT390-cap组，Cap+ISA201组和DT390-Cap+ISA201组的抗PCV2 Cap特异性抗体显著升高。DT390-Cap+ISA201组的抗PCV2 Cap特异性抗体显著高于Cap+ISA201组和阳性对照组，DT390-Cap组的抗PCV2 Cap特异性抗体显著高于Cap组。结果表明，在使用或不使用ISA201佐剂的情况下，采用融合表达的方式，DT390均能有效提高Cap的免疫原性。

2.3 小鼠体内PCV2病毒载量的检测

在攻毒后第14 d，按照TIANamp Genomic DNA Kit 试剂盒说明书，取各处理组小鼠的肺，肝和胸腺组织提病毒DNA，按照反应体系20 μL：DNA≤100ng，10×SYBR Green qPCRMaster Mix with ROX 10 μL，F-Primer 1 μL，R-Primer 1 μL，加水补至20 μL。用ABI7500 Real-Time PCR系统，采用95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火延伸34 s，40个循环，再经过95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 15 s进行扩增反应。采用绝对荧光定量的方法检测各处理组小鼠肺、肝和胸腺中的病毒载量。

如图4所示，和PBS + ISA201阴性对照组相比，其余各组小鼠肺、肝和胸腺中的病毒载量显著降低。在肝和胸腺中，DT390-Cap+ISA201组的病毒载量显著低于Cap+ISA201组，DT390-Cap组的病毒载量显著低于Cap组（图4B-C）。结果表明，在使用或不使用ISA201佐剂的情况下，采用融合表达的方式，DT390均能增强Cap的免疫效果。

2.3 统计分析

使用GraphPad Prism 7.04软件（GraphPad Software，Inc.California，USA）进行统计分析，所有数据均以Mean±standard errors mean（SEM）表示。采用One-way ANOVA对各组数据差异进行分析，并采用Tukey多重比较检验进行各组变量之间的两两对比分析。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

<110>山西农业大学

<120>一种可溶性融合蛋白DT390-Cap及其制备方法与应用

<160>4

<210>1

<211>1866

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>可溶性融合蛋白DT390-Cap的碱基序列

<400>1

ATGGAAAACT TCGCATCCTA TCATGGCACT AAGCCAGGTT ACGTGGACTC CATCCAGAAG 60

GGTATTCAGA AGCCCAAGTC TGGAACTCAG GGTAATTATG ACGATGATTG GAAAGGCTTT 120

TACAGTACAG ACAATAAATA TGACGCCGCC GGTTATTCTG TTGATAATGA AAATCCTTTG 180

TCAGGTAAAG CTGGAGGAGT CGTCAAGGTT ACTTACCCCG GTCTTACAAA AGTCCTAGCT 240

TTGAAGGTGG ATAACGCTGA GACTATTAAG AAAGAATTAG GCTTGTCTCT AACTGAGCCC 300

CTGATGGAAC AAGTAGGAAC TGAGGAGTTT ATTAAGAGAT TTGGTGACGG AGCTTCAAGA 360

GTAGTGTTGT CACTTCCATT TGCCGAAGGA TCTTCTTCAG TAGAATATAT CAATAACTGG 420

GAACAGGCTA AAGCTTTGAG TGTGGAATTG GAAATTAACT TTGAAACCAG AGGTAAACGA 480

GGACAAGATG CTATGTATGA ATACATGGCC CAAGCCTGTG CCGGTAACAG AGTTAGACGT 540

TCTGTGGGCT CTTCACTGTC TTGTATTAAC TTAGACTGGG ACGTTATTAG AGATAAGACC 600

AAGACTAAGA TTGAAAGTTT AAAGGAGCAT GGTCCTATTA AGAATAAAAT GTCAGAATCA 660

CCTGCAAAGA CCGTGTCTGA GGAAAAGGCC AAGCAATATC TTGAGGAATT TCATCAAACC 720

GCATTGGAAC ATCCTGAGTT ATCCGAATTA AAGACAGTTA CGGGAACCAA CCCAGTTTTT 780

GCCGGTGCTA ATTACGCTGC TTGGGCCGTT AACGTCGCCC AAGTAATTGAC TCCGAGACT 840

GCTGATAATT TGGAGAAAAC CACGGCCGCC TTGTCAATTC TTCCTGGTAT TGGATCAGTG 900

ATGGGTATCG CTGACGGTGC TGTACACCAT AACACCGAAG AAATAGTAGC TCAATCTATT 960

GCCTTGTCTT CTTTGATGGT TGCCCAAGCC ATTCCTTTGG TTGGTGAGCT GGTAGATATT 1020

GGCTTTGCCG CTTACAATTT CGTGGAATCA ATTATTAACC TTTTTCAGGT TGTTCACAAC 1080

TCCTACAACA GGCCTGCTTA CTCACCAGGA CATAAGACCC AACCATTTCT TCCTTGGGGT 1140

GGTGGTGGTT CTACTTACCC AAGAAGAAGA TACAGAAGAA GAAGACACAG ACCAAGATCT 1200

CACTTGGGTC AAATTTTGAG AAGAAGACCA TGGTTGTTGC ACCCAAGACA CAGATACAGA 1260

TGGAGAAGAA AGAACGGTAT TTTCAACACT AGATTGTCTA GAACTTTCGG TTACACTATT 1320

AAGAGAACTA CTGTTAAGAC TCCATCTTGG GCTGTTGACA TGATGAGATT CAACATTAAC 1380

GACTTCTTGC CACCTGGTGG TGGTTCTAAC CCAAGATCTG TTCCATTCGA GTACTACAGA 1440

ATTAGAAAGG TTAAGGTTGA GTTCTGGCCA TGTTCTCCAA TTACTCAAGG TGACAGAGGT 1500

GTTGGTTCTT CTGCTGTTAT TTTGGACGAC AACTTCGTTA CTAAGGCTAC TGCTTTGACT 1560

TACGACCCAT ACGTTAACTA CTCTTCCAGA CACACTATTA CTCAACCATT CTCTTACCAC 1620

TCTAGATACT TCACTCCAAA GCCAGTTTTG GACTCTACTA TTGACTACTT CCAACCAAAC 1680

AACAAGAGAA ACCAATTGTG GTTGAGATTG CAAACTGCTG GTAACGTTGA CCACGTTGGT 1740

TTGGGTACTG CTTTCGAGAA CTCTATTTAC GACCAAGAGT ACAACATTAG AGTTACTATG 1800

TACGTTCAAT TCAGAGAGTT CAACTTGAAG GACCCACCTT TGAACCCACA CCACCACCAC 1860

CACCAC 1866

<210>2

<211>622

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>可溶性融合蛋白DT390-Cap的氨基酸序列

<400>2

MENFASYHGT KPGYVDSIQK GIQKPKSGTQ GNYDDDWKGF YSTDNKYDAA GYSVDNENPL 60

SGKAGGVVKV TYPGLTKVLA LKVDNAETIK KELGLSLTEP LMEQVGTEEF IKRFGDGASR 120

VVLSLPFAEG SSSVEYINNW EQAKALSVEL EINFETRGKR GQDAMYEYMA QACAGNRVRR 180

SVGSSLSCIN LDWDVIRDKT KTKIESLKEH GPIKNKMSES PAKTVSEEKA KQYLEEFHQT 240

ALEHPELSEL KTVTGTNPVF AGANYAAWAV NVAQVIDSET ADNLEKTTAA LSILPGIGSV 300

MGIADGAVHH NTEEIVAQSI ALSSLMVAQA IPLVGELVDI GFAAYNFVES IINLFQVVHN 360

SYNRPAYSPG HKTQPFLPWG GGGSTYPRRR YRRRRHRPRS HLGQILRRRP WLLHPRHRYR 420

WRRKNGIFNT RLSRTFGYTI KRTTVKTPSW AVDMMRFNIN DFLPPGGGSN PRSVPFEYYR 480

IRKVKVEFWP CSPITQGDRG VGSSAVILDD NFVTKATALT YDPYVNYSSR HTITQPFSYH 540

SRYFTPKPVL DSTIDYFQPN NKRNQLWLRL QTAGNVDHVG LGTAFENSIY DQEYNIRVTM 600

YVQFREFNLK DPPLNPHHHH HH 622

<210>3

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>带有XhoI和NcoI位点的上游引物pCap-Nco

<400>3

CCGCTCGAGC CATGGGGTGG TGGTGGTTCT ACTTACCCAA GAAGAAGATA CAGA 54

<210>4

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>带有EcoRI位点的下游引物pCap-Nco

<400>4

CCGGAATTCT TAGTGGTGGT GGTGGTGGTG TGGGTTCAAA GGTGGGTCCT T 51

Claims

1.一种可溶性融合蛋白DT390-Cap，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的一种可溶性融合蛋白DT390-Cap，在制备猪圆环病毒2型疫苗中的应用。

3.DT390蛋白在制备基因工程亚单位疫苗中的应用。

4.权利要求1所述的一种可溶性融合蛋白DT390-Cap的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

融合蛋白DT390-Cap的纯化与检测：通过Ni-Sepharose树脂和强阴离子交换树脂Poros50HQ对上清液进行纯化，得到纯化后的融合蛋白DT390-Cap；通过SDS-PAGE和Western blot对纯化产物进行分析检测。

5. 根据权利要求4所述的一种可溶性融合蛋白DT390-Cap的制备方法，其特征在于，带有XhoI和NcoI位点的上游引物pCap-Nco为：5’ CCG CTC GAG CCA TGG GGT GGT GGT GGTTCT ACT TAC CCA AGA AGA AGA TAC AGA 3’，带有EcoRI位点的下游引物pCap-Eco为：5’CCG GAA TTC TTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG TGG GTT CAA AGG TGG GTC CTT 3’。

6.一种可溶性融合蛋白DT390-Cap，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。