CN107619435B

CN107619435B - 一种猪瘟病毒e2蛋白的抗原表位、抗体的制备及应用

Info

Publication number: CN107619435B
Application number: CN201710855981.1A
Authority: CN
Inventors: 童光志; 李国新; 武吉强; 徐晶晶; 姜一峰; 高飞; 童武; 郑浩
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2037-09-19
Also published as: CN107619435A

Abstract

本发明公开了一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位、抗体的制备及其应用，所述抗原表位序列如SEQ ID NO.1所示，定位在105‑109AA。所述抗原表位可以与CSFV反应，而不与PK‑15细胞发生反应。所述抗原表位在猪瘟病毒抗体药物检测试剂中的应用，该应用使得猪瘟病毒抗体诊断抗原可以用普通化学合成方法制备，相比基因工程表达蛋白做为诊断抗原，合成抗原工艺简便，纯度更高。

Description

一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位、抗体的制备及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体涉及一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位、抗体的制备及应用。

背景技术

CSF是由CSFV引起的猪的一种高度接触性传染病，给养猪业造成严重的经济损失。CSFV属于黄病毒科、瘟病毒属成员之一。CSFV是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约12.3kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)。此ORF翻译成含3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、C、Erns(E0)、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中，除C、Erns、E1和E2为结构蛋白外.其余均为非结构蛋白。

E2为CSFV的另一囊膜糖蛋白，又称为gp55，是病毒主要的抗原蛋白，也是三个病毒糖蛋白中保守性最低、最易变异的分子。E2常以100kDa的同源二聚体及与E1形成75kDa的异源二聚体形式存在于病毒粒子及CSFV感染的细胞表面。E2可诱导产生CSFV的中和抗体，免疫猪可诱导产生对致死量CSFV的保护性免疫。E2的蛋白骨架由370个氨基酸(ORF编码的657-1062氨基酸残基)组成，并以其C端的40个疏水氨基酸锚定在膜上。由于糖基化程度不同，E2的分子量可为51-58kDa。E2的抗原决定区在其N端部分(ORF编码的第690-866氨基酸)，可分为2个独立的抗原结构单元，四个抗原结构域A、B、C、D。

在病毒感染过程中，细胞膜上的受体与病毒配体结合是介导病毒侵入宿主细胞的关键因素，也是病毒能否感染细胞的关键。因此，研究病毒受体和病毒配体之间的相互作用成为目前病毒致病机制研究的热点问题之一，因为以其中的任何一个为药物靶点都可以阻断病毒与靶细胞的结合，从而抑制病毒的感染。关于CSFV配体的研究，已证实Erns蛋白参与了病毒的早期吸附，E1和E2蛋白形成的异源二聚体可以介导CSFV侵入宿主细胞，并且此异源二聚体还起到使哺乳动物细胞融合的作用。但是，究竟这三种蛋白的哪些氨基酸序列作为病毒配体与病毒受体结合，目前还没有详细的报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供了猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位，所述抗原表位为：编码E2-6D11抗原表位的短肽，序列如SEQ ID NO.1：PFDTS所示，定位在105-109AA。所述抗原表位可以与CSFV反应，而不与PK-15细胞发生反应。

本发明还有一个目的是在于提供了一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位在猪瘟病毒抗体药物检测试剂中的应用，该应用使得猪瘟病毒抗体诊断抗原可以用普通化学合成方法制备，相比基因工程表达蛋白做为诊断抗原，合成抗原工艺简便，纯度更高。

本发明的另一个目的是在于提供了一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位模拟肽的制备方法，该方法优点是利用噬菌体随机肽库来筛选猪瘟E2单克隆抗体E2-6D11识别的表位，可以筛选出与原始序列不同但功能相似的构象表位抗原，即模拟表位抗原。

为了实现上述的目的，本发明通过以下技术措施实现.

一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位的制备方法，其步骤是：

A、利用分子生物学对E2主要抗原表位区域基因的扩增与重组质粒的构建。

B、将重组蛋白的诱导表达与纯化，

C、利用纯化蛋白进行小鼠免疫，获得杂交瘤细胞和单克隆抗体。

D、单克隆抗体的稳定性和特异性检测。

E、获得上述特异性单克隆抗体的抗原表位，并对其进行鉴定。

一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位在制备治疗或预防猪瘟病毒ELSIA抗体药物检测(试剂盒)中的应用，其步骤是：

1、以获得的抗原表位作为参考化学合成抗原。

2、以合成抗原制备试剂盒主要组分抗原包被板。

3、按常规方法制备试剂盒其他组分。

4、使用试剂盒检测血清中狂犬病病毒抗体。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、本发明的抗原表位是由针对猪瘟病毒石门株的特定单抗筛选而来，具有极高的特异性和稳定性。

2、与现有的灭活病毒抗原或基因表达抗原技术相比，生产过程中不涉及菌种和毒株，工艺安全有保障，不会对环境造成污染。

3、利用获得的抗原表位合成肽抗原与基因工程表达抗原相比，生产周期短，易纯化且纯度较高。

4、本发明适合大规模的临床血清检测，反应时间短，2小时即可出结果。

5、本发明试剂盒与其他病毒阳性血清无交叉反应，敏感性高，特异性好。

6、本发明试剂盒操作简便，与猪瘟病毒正向间接血凝试剂盒符合率高。

附图说明

图1为E2重组蛋白的表达与纯化，M：蛋白质分子量标准；1：IPTG诱导的pCold-E2转化菌裂解物沉淀；2：IPTG诱导的pCold-E2转化菌裂解物上清；3：IPTG诱导的纯化的pCold-E2蛋白；4：IPTG诱导的pCold-TF转化菌。

图2为IFA鉴定E2蛋白单克隆抗体的特异性。

图3为E2蛋白单抗的Western blot鉴定，1：CSFV感染的PK-15细胞；2：未感染的PK-15细胞；3：Marker。

图4为E2-6D11株单克隆抗体表位的鉴定结果，其中，(A)E2-6D11鉴定表位第1轮；(B)E2-6D11鉴定表位第2轮(C)E2-6D11鉴定表位第3轮

具体实施方式

实施例1：材料与方法

毒株、细胞和实验动物猪瘟病毒石门株、SP2/0骨髓瘤细胞、PK-15和Vero细胞均由中国农业科学院上海兽医研究所保存。细胞均在37℃、5％CO₂和10％FBS(FBS，Gibico，Shanghai，China)条件下培养。BALB/c雌性小鼠购自上海斯莱克实验动物公司。

载体、试剂和菌株pCold-TF载体，大肠杆菌BL21(DE3)购自Takara(上海)公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG和FITC标记的山羊抗鼠IgG购于Sigma(上海)公司；核酸内切酶EcoR I购自NEB(上海)公司。

实施例2：E2主要抗原表位的扩增、蛋白制备

E2主要抗原表位区域基因的扩增与重组质粒的构建

根据NCBI发表的CSFV E2基因序列，将E2基因的第1-537位核苷酸序列送公司(金唯智)优化合成，并将合成的E2基因与pCold-TF载体连接构建质粒，质粒测序正确后，阳性质粒命名为pCold-E2。

重组蛋白的诱导表达与纯化

将重组质粒pCold-E2转化到BL21(DE3)大肠杆菌中，37℃振荡培养至OD600值达到0.6～0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，16℃振荡24小时。收集菌体加入PBS进行超声裂解，加入5×SDS buffer煮沸10min后进行SDS-PAGE电泳，对SDS-PAGE蛋白胶进行考马斯亮蓝染色，观察蛋白表达情况，同时设置空载体表达组作为对照。之后将pCold-E2转化表达菌按1∶1000比例接种到4mL含100μg/mL Amp的LB培养基中，37℃、200r/min振荡培养12h。然后再按1∶100将复苏的菌液接种于100mL含100μg/mL Amp的LB培养液中，37℃、200r/min培养，至OD600达到0.6～0.8时停止，加入终浓度为1mmol/L IPTG，16℃诱导24h后，离心收集菌体。表达后的菌体进行超声破碎，差速离心后收集上清蛋白。采用Ni柱(Biotool)进行纯化，纯化的蛋白分装后保存于-80℃。

pCold-E2载体转化的表达菌E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后，收集菌体超声裂解进行SDS-PAGE凝胶检测。结果显示，与载体对照组相比，pCold-E2表达菌出现了相对分子量约为70kDa的目的条带，与重组蛋白大小相符。目的蛋白主要都在裂解物上清中。重组蛋白经Ni柱纯化后，电泳结果显示纯化目的蛋白纯度较高(图1)。

实施例3：单克隆抗体的制备

小鼠免疫

取100μg纯化蛋白与弗式完全佐剂1∶1混合乳化，接种6周龄健康雌性BALB/c小鼠，此后每隔2周用等量纯化蛋白与弗氏不完全佐剂乳化进行第二和第三次免疫，第三次免疫后第10天采血，测定ELISA抗体效价，效价在1∶10000以上的小鼠，在细胞融合前第3-4天经腹腔注射纯抗原200μg，进行加强免疫。

McAbs的制备

融合前1d取小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞，之后选取免疫效价最高的小鼠进行脾细胞与SP2/0细胞融合。将杂交瘤细胞培养在铺有饲养层细胞的96孔板里，在37℃、5％C02在HAT选择性培养基条件下培养。在杂交瘤细胞长满96孔板1/3～1/2面积时，通过间接ELISA以及IFA的方法检测以筛选阳性细胞克隆株。将筛选的阳性细胞克隆株经3～5轮细胞亚克隆之后，对能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养，液氮冻存。将筛选的杂交瘤细胞株连续传代20代，分别取第5、10、15和20代细胞上清液，用间接ELISA的方法进行检测，鉴定杂交瘤细胞分泌抗体稳定性。将液氮冻存的杂交瘤细胞复苏，取复苏细胞的细胞上清液，用间接ELISA和IFA的方法进行检测，鉴定杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。

实施例4：单克隆抗体的鉴定

间接免疫荧光试验检测单克隆抗体

将PK-15细胞铺在6孔板中，1MOI CSFV感染48h后，弃去上清后，用PBS洗3遍，用丙醇在-20℃固定细胞20分钟，5％BSA室温封闭1h，PBS洗板之后加入收集的杂交瘤细胞上清液，室温孵育1h。PBS洗3遍，避光加入FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶800PBS稀释)室温避光孵育1h。在荧光显微镜下观察荧光。以1MOI CSFV感染PK-15细胞48h，固定细胞进行间接免疫荧光试验，以检测单克隆抗体与不同毒株的特异性反应。结果显示，1株单克隆抗体6D11均能与CSFV反应，而不与PK-15细胞发生反应(图2)。

Western blot检测单克隆抗体

将CSFV病毒感染PK-15细胞，48h以后用细胞裂解液裂解细胞，收取细胞蛋白进行SDS-PAGE电泳。使用伯乐

SD cell system(BIO-RAD，USA)转印NC膜，5％脱脂奶粉室温封闭2h，用1∶500稀释的杂交瘤细胞上清4℃孵育10h，TBST洗膜3次后，20min/次。加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，室温反应1h，TBST洗膜后，经过发光，曝光，显影，定影之后扫描图片。

以1MOI CSFV株感染PK-15细胞48h，收集细胞后，用Western blot方法检测单克隆抗体E2-6D11与CSFV毒株的特异性反应。结果显示，单克隆抗体E2-6D11能与CSFV毒株发生特异性反应，在40kDa和80kDa大小处显示两条特异性条带，且PK-15细胞发生反应(图3)。

实施例5：E2单克隆抗体表位的鉴定

根据基因序列，设计15对引物(表1)，引物分别带有pCold-TF载体EcoR I酶切位点上游臂和下游臂，对E2基因进行截短，将扩增出的DNA片段连接到pCold-TF原核表达载体上，经测序正确后，转化到BL21(DE3)大肠杆菌中进行表达并诱导，将诱导表达的蛋白经SDS-PAGE分析，用单克隆抗体进行Western blot鉴定。

表1引物序列

注：小写部分是与pCold-TF进行同源重组的同源臂序列；大写部分是扩增E2片段的引物。

将截短的E2蛋白经过单克隆抗体Western blot鉴定，单克隆抗体6D11株针对的抗原表位定位在103-109AA和105-113AA(图4)，氨基酸序列分别为¹⁰³LCPFDTS¹⁰⁹和¹⁰⁵PFDTSPVVK¹¹³，因此E2-6D11株单克隆抗体针对的抗原表位定位在105-109AA，氨基酸序列为¹⁰⁵PFDTS¹⁰⁹。

实施例6：一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位在制备治疗或预防猪瘟病毒ELSIA抗体药物检测(试剂盒)中的应用，其步骤是：

A、猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒中的抗原包被板制备：

根据本发明SEQ ID NO：1所示的序列，利用本领域中常规的化学合成方法，制备纯度大于95％的短肽，此短肽即为检测抗原。将此抗原用碳酸盐缓冲液溶解并稀释至2μg/mL，然后按每孔100μL加入到96孔酶标板中，4℃放置过夜，使抗原吸附在酶标板中。第二天弃去孔中液体，每孔再加入150μL磷酸盐缓冲液(含0.5％BSA)，置37℃温箱中2小时、弃去孔中液体。拍干。

B、猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒其他组分制备：

试剂盒其他组分还包含酶标记物、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、洗涤液和终止液。酶标记物为羊抗猪二抗，样品稀释液为磷酸盐缓冲液，阳性对照为猪瘟病毒疫苗免疫的猪阳性对照血清，阴性对照为未免疫猪瘟病毒疫苗的健康猪阴性血清。洗涤液为含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液；显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有0.2mg/mL TMB pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。终止液为含0.25％体积比氢氟酸溶液。

C、猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒操作步骤：

1)从试剂盒中取出预包被有抗原的检测板，将稀释好的待检血清(1∶40稀释)100μL加入抗原包被板中，同时设阴、阳性对照孔，各设2孔，每孔100μL。

2)轻轻振匀孔中样品，置37℃温育60分钟。甩掉板孔中的溶液，加洗涤液200μL/孔，洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干。

3)每孔加酶标记物100μL，置37℃温育30分钟。洗涤5次，方法同步骤2。

4)每孔加显色液A、显色液B各50μL，混匀，室温(18～26℃)避光显色10分钟。每孔加终止液50μL，10分钟内用酶标仪测定每孔OD450nm读值。

本发明试剂盒判定标准为：试验成立条件是阴性对照孔平均OD450nm值与阳性对照孔平均OD450nm值之差大于或等于0.5。S＝样品孔OD450nm值，N＝阴性对照孔平均OD450nm值。若S/N比值大于2.1，样品判为猪瘟病毒抗体阳性。若S/N比值小于或等于2.1，样品判为猪瘟病毒抗体阴性。

D、猪瘟病毒ELSIA抗体检测试剂盒的应用：

1、特异性试验用猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒检测猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪口蹄疫(O型)、猪细小病毒、猪流感和猪繁殖与呼吸综合征等标准阳性血清和猪瘟病毒阴性血清，除猪瘟病毒标准阳性血清的S/N值显著大于2.1外，其余血清S/N值均小于2.1，符合阴性血清的判定标准，表明这种方法的特异性良好(见表2，其中所列数字为OD450nm值)。

表2 血清特异性检测

2、敏感性的检测用试剂盒检测不同稀释度的猪瘟病毒阳性血清，从表3中可以看出即使1280倍稀释的猪瘟病毒阳性血清，依然检测为阳性，说明试剂盒的敏感性很高。

表3 血清敏感性检测

3、重复性实验

利用优化后的条件建立的ELISA条件进行检测，获得的组间变异系数在1.24％～6.52％之间；获得组间变异系数在2.03％～5.95％之间，表明建立的ELISA具有良好的重复性。

综上，利用本发明制备所得的猪瘟病毒特异性表位建立的ELISA试剂盒检测猪瘟病毒具有特异性强、重复性好、灵敏度高的优点，可用于临床猪瘟病毒样本的检测。

应当理解，虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明内容作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之进行一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1：PFDTS所示。

2.一种抗原组合物，所述抗原组合物包含至少一种抗原，其中所述至少一种抗原包含权利要求1所述的抗原表位肽。

3.权利要求1所述的一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位肽或权利要求2所述的抗原组合物在制备检测猪瘟病毒ELISA抗体药物检测试剂盒中的应用。