CN102268079A - 猪瘟病毒csfv e2蛋白配体表位多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及猪瘟病毒CSFVE2蛋白配体表位多肽及其应用，多肽氨基酸序列为VHASDERLGPMPCRPKEIGSSAGPVRKTSCTFNYAKTGKNKYYEPRDSYF，其分子量为5.73kDa；并以PK-15细胞为靶细胞，通过CSFV的感染、收获，测定了CSFV的TCID50和感染比，进行合成多肽与靶细胞的结合试验、病毒阻断试验和多肽阻断CSFV感染靶细胞的试验，筛选的特异性结合靶细胞能够抑制病毒感染配体表位多肽，对CSFV的配体表位进行了精确定位。本发明的多肽SE24能够抑制CSFV感染PK-15细胞，随着多肽浓度的增加PK-15细胞的感染率降低，当多肽浓度为0.2mmol/L时能够完全抑制CSFV感染PK-15靶细胞。本发明为进一步从病毒配体和病毒受体相互作用方面进行病毒配体表位的研究提供了理论依据。
Description
技术领域
本发明属于分子病理学与免疫学技术领域，具体涉及猪瘟病毒CSFV E2蛋白配体表位多肽及其应用。
背景技术
CSF是由CSFV引起的猪的一种高度接触性传染病，给养猪业造成严重的经济损失。CSFV属于黄病毒科、瘟病毒属成员之一。在病毒感染过程中，细胞膜上的受体与病毒配体结合是介导病毒侵入宿主细胞的关键因素，也是病毒能否感染细胞的关键。因此，研究病毒受体和病毒配体之间的相互作用成为目前病毒致病机制研究的热点问题之一，因为以其中的任何一个为药物靶点都可以阻断病毒与靶细胞的结合，从而抑制病毒的感染。关于CSFV配体的研究，已证实Erns蛋白参与了病毒的早期吸附，E1和E2蛋白形成的异源二聚体可以介导CSFV侵入宿主细胞，并且此异源二聚体还起到使哺乳动物细胞融合的作用。但是，究竟这三种蛋白的哪些氨基酸序列作为病毒配体与病毒受体结合，目前还没有详细的报道。
近年来，一大批病毒的受体被相继分离和鉴定，研究病毒受体的方法有：病毒铺敷蛋白印迹技术、单克隆抗体法、免疫共沉淀、筛选易感细胞cDNA文库鉴别病毒受体克隆表达技术、噬菌体表面展示技术、酵母双杂交技术和亲和层析法等。
病毒与宿主细胞的结合实质上是病毒受体与病毒配体的结合，所以对病毒配体与病毒受体结合方式及位点的研究可以从分子水平上揭示病毒的感染机制，并对病毒性疾病的诊断、预防和治疗都有着重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题：本发明提供了CSFV结合靶细胞的一条线性配体表位多肽的氨基酸序列，该配体表位多肽能够抑制CSFV感染PK-15细胞，随多肽浓度的增加感染率降低，并且得到能够完全抑制病毒感染靶细胞的多肽浓度；
还提供了细胞免疫化学染色鉴定多肽SE24与PK-15细胞的结合效率及多肽SE24抑制CSFV感染PK-15靶细胞的方法。
本发明的技术方案：
本发明利用生物信息学技术，分析了CSFV E2蛋白氨基酸序列的一级结构，设计并合成了CSFV E2蛋白上的1条多肽。以PK-15细胞为靶细胞，通过CSFV的感染、收获，测定了CSFV的TCID50和感染比(MOI)，进行合成多肽与靶细胞的结合试验、病毒阻断试验和多肽阻断CSFV感染靶细胞的试验，筛选的特异性结合靶细胞能够抑制病毒感染配体表位多肽，对CSFV的配体表位进行了精确定位。
猪瘟病毒CSFV E2蛋白配体表位多肽，其氨基酸序列为：VHASDERLGPMPCRPKEIGSSAGPVRKTSCTFNYAKTGKNKYYEPRDSYF。
所述的CSFV E2蛋白配体表位多肽为线性配体结合表位。
所述的CSFV E2蛋白配体表位多肽，用Sulfo-NHS-Biotin标记的多肽SE24与PK-15细胞结合时，二者摩尔比为1:1～1：4，多肽SE24的浓度为0.025~0.2mmol/L。
所述多肽完全抑制CSFV感染PK-15靶细胞时的多肽浓度为0.2mmol/L。
所述的CSFV E2蛋白配体表位多肽鉴定该多肽与PK-15细胞结合效率的方法，包括以下步骤：
（1）培养PK-15细胞，于37℃、5%的CO2培养箱中培养24h，直至细胞铺满96孔的细胞培养板；
（2）倾去培养上清液，将培养好的单层细胞用预冷的PBS洗涤3次，在培养板上分别依次加入浓度为0.2mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L 和0.025mmol/L 的Biotin标记的多肽Biotin-SE24，100μL/孔，每个浓度重复做3次，4℃孵育1h，同时设6孔不加Biotin标记的多肽Biotin-SE24的正常细胞做对照实验，用Biotin标记的BSA做无关多肽对照实验；
（3）洗涤，用预冷的PBS洗涤细胞3次，洗去未结合的多肽，中止多肽结合试验；
（4）固定，加入0.3%的 H2O2甲醇溶液50μL/孔，4℃固定10min，倾去上清液，用PBST洗涤3次；
（5）封闭，加入含10%脱脂奶粉的PBST 缓冲液，200μL/孔，在37℃封闭1h，倾去上清液，用PBST洗涤3次；
（6）加入Avidin-HRP和HRP的标记抗生物素蛋白，50μL/孔，用含10%脱脂奶粉的PBST缓冲液进行1:500的稀释，在37℃作用1h；倾去上清液，用PBST洗涤3次；
（7）用AEC显色试剂盒显色，根据试剂盒的说明操作，在显微镜下观察试验结果，并记录染色细胞数目。
利用CSFV E2蛋白配体表位多肽鉴定该多肽抑制CSFV感染PK-15靶细胞的方法，包括以下步骤：
（1）培养PK-15细胞，于37℃、5%的CO2培养箱中培养24h，直至PK-15细胞铺满96孔细胞培养板；
（2）加多肽SE24，倾去培养上清液，用预冷的PBS洗涤细胞一次，在96孔细胞培养板上依次加入浓度为0.2mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L、0.025mmol/L、0.0125mmol/L、0.00625mmol/L的多肽SE24，100μL/孔，每个浓度重复做3次，稀释液为10% 的DMEM，设3孔BSA作为无关多肽对照和3孔空白对照，37℃作用1h；
（3）倾去含有多肽的上清液，加病毒CSFV，每孔加入10倍的TCID50 CSFV感染细胞，100μL/孔，其中空白对照只加细胞维持液，37℃作用1h；
（4）用10% 的DMEM培养基洗涤细胞3次，加入5%的DMEM维持培养基，100μL/孔，37℃继续培养24～48 h；
（5）细胞免疫化学染色，统计感染细胞数量，并分析试验结果。
所述细胞免疫化学染色的步骤为：
a. 洗涤，倾去细胞培养上清液，用PBST洗涤3次，每次孵育3 min；
b. 固定，用含0.3% H2O2的甲醛溶液固定，50μL/孔，4℃固定10min，用PBST洗涤3次，每次孵育3min；
c. 封闭，用10%的脱脂奶粉封闭，200μL/孔，37℃封闭1h，用PBST洗涤3次，每次孵育3min；
d. 加一抗，加入1: 200倍稀释的兔抗CSFV高免血清，稀释液为PBS溶液，50μL/孔，37℃作用30min，用PBST洗涤3次，每次孵育3 min；
e. 加二抗，加入1:40倍稀释的HRP-山羊抗兔IgG，稀释液为10%的脱脂奶粉，50μL/孔，37℃作用1h，用PBST洗涤3次，每次孵育3 min；
f. AEC显色试剂盒显色，根据试剂盒说明操作，在显微镜下观察实验结果，并记录染色细胞数目。
所述的CSFV E2蛋白配体表位多肽在抑制CSFV感染PK-15细胞中的应用。
本发明的积极有益效果：
1、本发明提供了CSFV结合靶细胞的一条线性配体表位多肽SE24，该表位多肽位于E2蛋白上，其分子量为5.73kDa。
2、本发明的配体表位多肽SE24能够抑制CSFV感染PK-15细胞，并且随着多肽浓度的增加，PK-15细胞的感染率降低，具有剂量依赖性，并得出多肽浓度为0.2mmol/L时能够完全抑制CSFV感染PK-15靶细胞的结论。
3、本发明采用的细胞免疫化学染色鉴定多肽SE24与PK-15细胞的结合效率及多肽SE24抑制CSFV感染PK-15靶细胞的方法，该方法特异、敏感、经济易操作。
4、本发明为进一步从病毒配体和病毒受体相互作用方面进行病毒配体表位的研究，为进一步揭示CSFV的感染机制，以及抗病毒药物筛选和新型疫苗的研制提供了理论依据。
附图说明
图1 实施例2中0.2mmol/L的Biotin-SE24结合PK-15细胞的结果(100×)。
图2 实施例2中0.1mmol/L的Biotin-SE24结合PK-15细胞的结果(100×)。
图3 实施例2中0.05mmol/L的Biotin-SE24结合PK-15细胞的结果(100×)。
图4 实施例2中0.025mmol/L的Biotin-SE24结合PK-15细胞的结果(100×)。
图5 实施例2中Biotin-BSA结合PK-15细胞的结果(100×)。
图6 实施例2中正常的PK-15细胞(100×)。
图7 实施例3中Biotin-SE24多肽结合PK-15细胞的流式细胞分析的散点图。
图8 实施例3中Biotin-SE24多肽结合PK-15细胞的流式细胞分析的集合图。
图9 实施例3中Biotin-BSA结合PK-15细胞流式细胞分析的散点图。
图10 实施例3中Biotin-BSA结合PK-15细胞流式细胞分析的集合图。
图11 实施例3中CSFV阻断SE24多肽结合PK-15细胞流式细胞分析的散点图。
图12 实施例3中CSFV阻断SE24多肽结合PK-15细胞流式细胞分析的集合图。
图13 实施例3中Biotin-SE24结合试验和阻断试验的流式细胞术的叠加图。
图14 实施例3中Biotin-SE24结合试验和阻断试验的流式细胞术的三维图。
图15 实施例4中0.2mmol/L的SE24多肽抑制CSFV感染PK-15细胞的结果(200×)。
图16 实施例4中0.1mmol/L的SE24多肽抑制CSFV感染PK-15细胞的结果(200×)。
图17 实施例4中0.05mmol/L的SE24多肽抑制CSFV感染PK-15细胞的结果(200×)。
图18 实施例4中0.025mmol/L的SE24多肽抑制CSFV感染PK-15细胞的结果(200×)。
图19 实施例4中0.0125mmol/L的SE24多肽抑制CSFV感染PK-15细胞的结果(200×)。
图20 实施例4中0.00625mmol/L的SE24多肽抑制CSFV感染PK-15细胞的结果(200×)。
图21 实施例4中BSA抑制CSFV感染PK-15细胞的结果(200×)。
图22 实施例4中正常的PK-15细胞(200×)。
图23 实施例4中不同浓度的SE24多肽抑制CSFV感染PK-15细胞的感染抑制曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来进一步详细说明本发明。本发明中若没有特别说明外，其中的百分比均指重量百分比。
实施例1、CSFV E2蛋白多肽的设计、合成及Sulfo-NHS-Biotin标记多肽
1. 1 多肽的设计
利用DNASIS（Ver. 2.5）软件将CSFV E2蛋白的氨基酸序列进行分析，设计1条多肽，其中包含E2蛋白的部分氨基酸序列，且多肽N端均添加Cys，以便用SMCC双功能试剂与载体偶联。用peptide程序分析合成难度；设计合成（裂解）程序；编辑肽链；计算并配制溶液、试剂；启动合成程序。
1.2 多肽的合成
利用Symphony 12通道多肽合成仪在Fmoc-氨基酸-王树脂(Fmoc-Amino Acids attached to Wang Resin, 上海吉尔)上以固相多肽合成方法(solid-phase peptide synthesis)合成多肽，多肽合成按标准操作规程进行。基本合成过程为：执行Std_sw 程序进行C末端氨基酸王树脂溶涨 →执行Std程序（或Std_db程序）：*加20% piperidine脱Fmoc保护 → 用DMF洗树脂 → *加下一位Fmoc保护氨基酸和活化剂HBTU进行酰化反应 → *用Kaiser法或TNBS法检测酰化反应的完成情况 → *DMF洗树脂 → 重复执行Std程序（或Std_db程序），在树脂上连接下一位氨基酸（重复带*步骤），直到该多肽序列合成完成。根据组成肽链氨基酸不同选取适当的裂解试剂，执行Std_clv程序，用TFA法裂解肽链与树脂的连接 →冷乙醚离心沉淀法回收TFA裂解多肽 → Sephadex G-25脱盐纯化 → MS和HPLC分析鉴定和纯化多肽。其中，多肽裂解反应完成后，应用冷乙醚离心沉淀法从TFA裂解多肽收集液中回收合成肽产物。将收集管中的收集液蒸发30～60min，过滤除掉杂质。向收集液中加入3倍收集液体积的冷乙醚（4℃），盖好收集管盖，颠倒混匀，冰浴10分钟，3000r/m，离心10min，弃上清，留沉淀。重新用新鲜的冷乙醚重悬沉淀（旋涡震荡），重复以上操作3次。收集沉淀物，即为粗品合成肽。粗品合成肽经过G25脱盐纯化，再经制备型HPLC纯化后，冷冻干燥，-20℃保存备用。合成多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
1.3 Sulfo-NHS-Biotin标记多肽
（1）将Sulfo-NHS-Biotin和多肽从-20℃取出，放置使之恢复室温；
（2）称量4.4mg的Sulfo-NHS-Biotin，溶于1mL的双蒸水中，充分混匀，配制成10mmol/L的Sulfo-NHS-Biotin溶液；
（3）称量多肽2mg，分别溶于50μL DMSO中配制成40mg/mL的储存液；
（4）取出80μL Sulfo-NHS-Biotin分别与50μL的多肽溶液充分混合（连接时多肽与Sulfo-NHS-Biotin的摩尔比是1: 2），室温作用30min，4℃过夜孵育Biotin-SE24多肽；
（5）以10%的 DMEM调整Biotin-SE24多肽浓度至1mg/mL，混匀后，小剂量分装用于PK-15细胞结合试验。
实施例2、细胞免疫化学染色鉴定Biotin-SE24多肽与PK-15细胞的结合试验
（1）培养PK-15细胞，于37℃、5%的CO2培养箱中培养24h后，待细胞铺满96孔细胞培养板；
（2）倾去培养上清，培养好的单层细胞用预冷的PBS洗涤3次，在培养板上分别依次加入浓度0.2mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L 和0.025mmol/L的Biotin标记的多肽Biotin-SE24，100μL/孔，每一个稀释度做3个重复，4℃孵育1h，使Biotin标记的多肽与PK-15细胞充分结合，设6孔不加Biotin标记多肽的正常细胞做对照，Biotin标记BSA为无关多肽对照；
（3）用预冷的PBS轻柔的洗涤细胞3次，洗去未结合的多肽，中止多肽结合试验；
（4）固定，加入0.3%的 H2O2甲醇溶液50μL/孔，4℃固定10min，倾去上清，PBST轻柔洗涤3次；
（5）封闭，加入10%脱脂奶粉PBST 200μL/孔，37℃封闭1h，倾去上清，PBST轻柔洗涤3次；
（6）加Avidin-HRP，加入HRP标记抗生物素蛋白50μL/孔，1:500稀释，稀释液为10%脱脂奶粉PBST，37℃作用1h；倾去上清，PBST轻柔洗涤3次；
（7）AEC试剂盒显色，依次取试剂盒中的A、B和C液各一滴于1mL DDW中，充分混匀，50μL/孔，室温作用10min，显微镜下观察试验结果，并计数染色细胞，记录结果。参见图1～图6。
图1～图6表明：Biotin标记SE24多肽能与PK-15细胞结合，并且SE24多肽主要结合到PK-15细胞的细胞膜上，结合效率随SE24浓度的增加而提高，而BSA不能结合PK-15细胞。
实施例 3、用流式细胞术分析Biotin-SE24多肽结合试验和病毒阻断试验
用PK-15细胞同时进行以下试验。试验分为3组，试验A组：Biotin标记多肽结合PK-15细胞试验；试验B组：Biotin-BSA结合PK-15细胞试验，作为阴性对照；试验C组：CSFV封闭PK-15细胞结合位点后，再进行Biotin标记多肽结合PK-15细胞试验，作为病毒阻断试验。具体试验步骤如下：
（1）培养PK-15细胞，待培养24h后，细胞长成单层；
（2）预冷PBS洗涤细胞3次，用胰酶消化细胞，约20min，用10ml移液器将细胞从细胞瓶中吹下，混匀，减少细胞大团块，1500r/m离心5min，弃去细胞上清；
（3）加入新的预冷PBS，将细胞重悬，使细胞的浓度在106个/mL；
（4）加病毒，仅试验C组需此步骤，试验A和B组加病毒，加入200μL CSFV，（TCID50为10-3.5），混匀，0℃结合1h；
（5）1500r/m，4℃离心5min，离心去除未结合的CSFV，倾去上清，加入1mL的洗液（10mL预冷PBS加0.5mL胎牛血清与200μL 10% NaN3），用预冷洗液洗涤细胞，1500r/m，4℃离心5min，沉淀细胞，弃去上清；
（6）在试验A组中加入Biotin标记的多肽50μL，试验B组中加入Biotin-BSA 200μL，与PK-15细胞0℃结合30min；
（7）1500r/m，4℃离心5min，离心去除未结合的Biotin标记多肽和Biotin-BSA，倾去上清，加入1mL洗液，洗涤吹匀细胞，1500r/m，4℃离心5min，沉淀细胞，弃去上清；
（8）加入FITC标记的Avidin，1:50倍稀释，试验A、B和C组中各加入100μL，0℃结合30min；
（9）1500r/m，4℃离心5min，倾去上清，加入1mL的洗液，吹匀细胞，1500r/m，4℃离心5min，沉淀细胞，倾去上清；
（10）用0.5mL预冷的PBS将PK-15细胞重新悬浮，混匀，400目尼龙网过滤，通过流式细胞术检测多肽结合PK-15细胞与病毒阻断情况，每组试验样品计数10000个细胞。参见表1、图7～图14。
表1 流式细胞术结合和阻断试验数据分析（mean±SD）
| 结合试验 | 阻断试验 | Mean±SD | |
| 阳性细胞数（%） | 51 | 39.4 | 45.2±0.082** |
| 平均荧光强度 | 23.77 | 20.07 | 21.92±2.616** |
注：“**”表示比较差异极显著（P≤0.01）。
表1中数值经T检验分析，P（0.0074）≤0.01，表明比较差异极显著，说明CSFV能够阻断SE24多肽结合PK-15细胞。
图7～图10表明：SE24结合PK-15细胞的阳性细胞数为51.0%，平均荧光强度为23.77；无关多肽Biotin-BSA结合PK-15细胞的阳性细胞数为14.7%，平均荧光强度为17.58。说明SE24多肽能够结合PK-15细胞，而阴性对照无关多肽BSA不能与PK-15细胞结合。
图11和图12中CSFV阻断SE24结合PK-15试验结果显示：经CSFV阻断后SE24结合PK-15细胞的阳性细胞数为39.4%，平均荧光强度为20.70，与SE24结合PK-15细胞试验结果相比，阳性细胞数降低了11.6%，平均荧光强度降低了3.07。
图13和图14表明：SE24多肽能与PK-15细胞结合，CSFV可以阻断SE24结合PK-15细胞，且CSFV和多肽在与PK-15细胞的结合位点上具有竞争性，并说明SE24多肽是CSFV上的关键位点。
图13~图14中，1：Biotin-BSA无关多肽对照曲线；2：Boitin-SE24多肽结合PK-15细胞曲线；3：CSFV阻断SE24多肽结合PK-15细胞曲线。
实施例4、细胞免疫化学染色鉴定SE24多肽抑制CSFV感染PK-15细胞的试验
（1）培养PK-15细胞，37℃ CO2培养箱中培养24h，待细胞铺满96孔细胞培养板；
（2）加多肽，倾去培养上清，用预冷的PBS洗涤细胞一次，在96孔细胞培养板上依次加入浓度从0.2mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L、0.025mmol/L、0.0125mmol/L、0.00625mmol/L的多肽SE24，100μL/孔，每个浓度做3个重复，稀释液为10% DMEM，设3孔BSA作为无关多肽对照和3孔空白对照，37℃作用1h；
（3）倾去含有多肽的上清，加病毒，每孔加入10×TCID50 CSFV感染细胞，100μL/孔，其中其中空白对照只加细胞维持液， 37℃作用1h；
（4）用新鲜10% DMEM培养基洗涤细胞3次，加入5% DMEM维持培养基，100μL/孔，37℃继续培养24～48 h；
（5）细胞免疫化学染色，统计感染的细胞数量，分析试验结果，方法如下：
a. 倾去细胞培养上清，PBST洗涤3次，每次孵育3 min；
b. 固定，用0.3% H2O2甲醛溶液固定，50μL/孔，4℃固定10min，PBST洗涤3次，每次孵育3min；
c. 封闭，用10%脱脂奶粉封闭，200μL/孔，37℃封闭1h，PBST洗涤3次，每次孵育3min；
d. 加一抗，加入兔抗CSFV高免血清（1: 200倍稀释），稀释液为PBS溶液，50μL/孔，37℃作用30min，PBST洗涤3次，每次孵育3 min；
e. 加二抗，加入HRP-山羊抗兔IgG（1:40倍稀释），稀释液为10%脱脂奶粉，50μL/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次，每次孵育3 min；
f. AEC试剂盒显色，根据试剂盒的说明书，取A、B和C液各一滴于1mL 双蒸水中，充分混合，以防结晶出现，50μL/孔，10 min作用在显微镜下观察结果。参见表2、图15～图23。
表2 不同浓度的SE24多肽抑制CSFV感染PK-15细胞的感染率
| SE24浓度（mmol/L） | 0.2 | 0.1 | 0.05 | 0.025 | 0.0125 | 0.00625 |
| 感染细胞数 | 0 | 260 | 385 | 575 | 685 | 870 |
| 感染率（%） | 0 | 0.37 | 0.55 | 0.82 | 0.98 | 1.24 |
从表2可看出：在0.2mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L、0.025mmol/L、0.0125mmol/L、0.00625mmol/L浓度下感染的PK-15细胞数分别是0、260、385、575、685、870个，每孔细胞总数为7.0×104个；对应上述浓度下的感染率分别为0%、0.37%、0.55%、0.82%、0.98%、1.24%。
图15～图22表明：SE24多肽在0.2mmol/L时可以完全抑制CSFV感染PK-15细胞，细胞板上的PK-15细胞全部不感染，无细胞染色，细胞颜色较浅；随着SE24多肽浓度的降低，感染的PK-15细胞数量呈增多趋势；作为无关多肽对照，BSA在任何浓度时都不能抑制CSFV感染PK-15细胞，细胞全部染色，颜色较深；而阴性对照，正常PK-15细胞未染色，染色较浅。随着多肽浓度的降低，被染色细胞数量增多。图中箭头所示颜色较深细胞为染色细胞。
图23为实施4中不同浓度的多肽SE24抑制CSFV感染PK-15细胞的感染抑制曲线。结果显示：随着多肽SE24浓度的增加，细胞感染率下降，在浓度为0.2mmol/L时无PK-15细胞感染，说明浓度为0.2mmol/L 的SE24多肽可以完全抑制CSFV感染PK-15细胞。
SEQUENCE LISTING
<110> 新乡学院
<120> 猪瘟病毒CSFV E2蛋白配体表位多肽及其应用
<130> 生物信息学技术
<160> 1
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys
1 5 10 15
Glu Ile Gly Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe
20 25 30
Asn Tyr Ala Lys Thr Gly Lys Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser
35 40 45
Tyr Phe
50
Claims (8)
1.猪瘟病毒CSFV E2蛋白配体表位多肽，其特征是：所述表位多肽的氨基酸序列为VHASDERLGPMPCRPKEIGSSAGPVRKTSCTFNYAKTGKNKYYEPRDSYF。
2.权利要求1所述的CSFV E2蛋白配体表位多肽为线性配体结合表位。
3. 权利要求1所述的CSFV E2蛋白配体表位多肽，其特征是：用Sulfo-NHS-Biotin标记的多肽SE24与猪肾细胞PK-15细胞结合时，二者摩尔比为1:1～1：4，多肽SE24的浓度为0.025~0.2mmol/L。
4.权利要求3所述的CSFV E2蛋白配体表位多肽，其特征是：所述多肽完全抑制CSFV感染PK-15靶细胞时的多肽浓度为0.2mmol/L。
5.利用权利要求1所述的CSFV E2蛋白配体表位多肽鉴定该多肽与PK-15细胞结合效率的方法，其特征是：该方法包括以下步骤：
（1）培养PK-15细胞，于37℃、5%的CO2培养箱中培养24h，直至细胞铺满96孔的细胞培养板；
（2）倾去培养上清液，将培养好的单层细胞用预冷的PBS洗涤3次，在培养板上分别依次加入浓度为0.2mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L 和0.025mmol/L 的Biotin标记的多肽Biotin-SE24，100μL/孔，每个浓度重复做3次，4℃孵育1h，同时设6孔不加Biotin标记的多肽Biotin-SE24的正常细胞做对照实验，用Biotin标记的BSA做无关多肽对照实验；
（3）洗涤，用预冷的PBS洗涤细胞3次，洗去未结合的多肽，中止多肽结合试验；
（4）固定，加入0.3%的 H2O2甲醇溶液50μL/孔，4℃固定10min，倾去上清液，用PBST洗涤3次；
（5）封闭，加入含10%脱脂奶粉的PBST 缓冲液，200μL/孔，在37℃封闭1h，倾去上清液，用PBST洗涤3次；
（6）加入Avidin-HRP和HRP的标记抗生物素蛋白，50μL/孔，用含10%脱脂奶粉的PBST缓冲液进行1:500的稀释，在37℃作用1h；倾去上清液，用PBST洗涤3次；
（7）用AEC显色试剂盒显色，根据试剂盒的说明操作，在显微镜下观察试验结果，并记录染色细胞数目。
6.利用权利要求1所述的CSFV E2蛋白配体表位多肽鉴定该多肽抑制CSFV感染PK-15靶细胞的方法，其特征是：该方法包括以下步骤：
（1）培养PK-15细胞，于37℃、5%的CO2培养箱中培养24h，直至PK-15细胞铺满96孔细胞培养板；
（2）加多肽SE24，倾去培养上清液，用预冷的PBS洗涤细胞一次，在96孔细胞培养板上依次加入浓度为0.2mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L、0.025mmol/L、0.0125mmol/L、0.00625mmol/L的多肽SE24，100μL/孔，每个浓度重复做3次，稀释液为10% 的DMEM，设3孔BSA作为无关多肽对照和3孔空白对照，37℃作用1h；
（3）倾去含有多肽的上清液，加病毒CSFV，每孔加入10倍的TCID50 CSFV感染细胞，100μL/孔，其中空白对照只加细胞维持液，37℃作用1h；
（4）用10% 的DMEM培养基洗涤细胞3次，加入5%的DMEM维持培养基，100μL/孔，37℃继续培养24～48 h；
（5）细胞免疫化学染色，统计感染细胞数量，并分析试验结果。
7.权利要求6所述的方法，其特征是：所述细胞免疫化学染色的步骤为：
a. 洗涤，倾去细胞培养上清液，用PBST洗涤3次，每次孵育3 min；
b. 固定，用含0.3% H2O2的甲醛溶液固定，50μL/孔，4℃固定10min，用PBST洗涤3次，每次孵育3min；
c. 封闭，用10%的脱脂奶粉封闭，200μL/孔，37℃封闭1h，用PBST洗涤3次，每次孵育3min；
d. 加一抗，加入1: 200倍稀释的兔抗CSFV高免血清，稀释液为PBS溶液，50μL/孔，37℃作用30min，用PBST洗涤3次，每次孵育3 min；
e. 加二抗，加入1:40倍稀释的HRP-山羊抗兔IgG，稀释液为10%的脱脂奶粉，50μL/孔，37℃作用1h，用PBST洗涤3次，每次孵育3 min；
f. AEC显色试剂盒显色，根据试剂盒说明操作，在显微镜下观察实验结果，并记录染色细胞数目。
8.权利要求1所述的CSFV E2蛋白配体表位多肽在抑制CSFV感染PK-15细胞中的应用。
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| 《江苏农业科学》 20101231 宁红梅 "猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2研究进展" 第341页-第342页 1-8 , 第6期 * |
| 宁红梅: ""猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2研究进展"", 《江苏农业科学》, no. 6, 31 December 2010 (2010-12-31), pages 341 - 342 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106866799A (zh) * | 2017-04-01 | 2017-06-20 | 河南科技学院 | 猪瘟病毒配体表位多肽se241及其应用 |
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| CN108383895A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-08-10 | 河南省农业科学院 | 一条可与猪瘟病毒e2蛋白结合的亲和肽及其应用 |
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| CN102268079B (zh) | 2013-04-03 |
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