CN108484725A - 一种区分检测pcv2野毒抗体与疫苗抗体的多肽及其在elisa检测试剂盒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的多肽，包括SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4多肽序列所示的一条或两条多肽。本发明还公开了上述多肽与多糖载体的偶联多肽、多肽的制备方法，含有所述多肽的ELISA检测试剂盒及其制备方法。本发明所述的区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的ELISA检测试剂盒通过血清学检测就可以判断待检猪场中是否存在圆环野毒感染的风险，当断奶仔猪未经PCV2疫苗免疫前，如果检测发现PCV2抗体呈阳性，且在PCV2疫苗免疫后此抗体水平逐渐降低，而疫苗抗体的水平逐渐升高，说明此仔猪有圆环病毒野毒感染的风险或是母猪有圆环病毒野毒感染，通过母源抗体传递给仔猪。

Description

一种区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的多肽及其在ELISA 检测试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域，更具体地说，涉及一种区分检测PCV2 野毒抗体与疫苗抗体的多肽及其在ELISA检测试剂盒中的应用。
背景技术
猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)为圆环病毒科圆环病毒属病毒，是已知的最小动物病毒之一。PCV病毒包括PCV-1和PCV-2 两种血清型，一般认为PCV1无致病性，广泛存在于猪源细胞及正常猪体内各组织中；PCV-2具有致病性，能引起猪的多系统功能障碍疾病，如断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)猪呼吸道疾病综合征 (PRDC)猪皮炎与肾病综合征(PDNS)仔猪先天性震颤(CT)以及猪繁殖系统障碍等多种疾病。
根据对PCV-2毒株的序列分析结果，将PCV-2病毒分离株分为 PCV-2a～PCV-2e共5个亚型，当前世界范围内PCV-2优势亚型已从 PCV-2a转变为PCV-2b，即PCV-2b为主要流行亚型。相关研究表明，猪感染圆环病毒后容易产生免疫抑制，可影响其他疫苗的免疫效果，如干扰猪瘟疫苗的免疫应答，抑制伪狂犬疫苗的体液应答等，且感染圆环病毒的猪，因免疫系统受抑制容易继发其他感染，临床中圆环与猪瘟蓝耳或伪狂犬病毒混合感染的病例多见。
目前对猪圆环病毒临床无有效地治疗手段，疫苗免疫仍然是该病防控的首选。据童光志2012研究调查表明，目前规模化猪场圆环临床发病率明显减少，但是圆环阳性场明显增多，说明中国猪场普遍感染圆环病毒且圆环灭活疫苗免疫效果不好。
抗体检测可以作为评估疫苗免疫效果的有效手段，但由于我国猪场中普遍感染圆环野毒，而圆环野毒也可刺激猪的免疫系统产生抗体，因此单纯的通过抗体检测来评价圆环疫苗的免疫效果是没有实际意义价值的，而目前已有的PCV-2抗体检测方法中缺乏可以区分野毒感染和疫苗免疫抗体的鉴别手段，因此，筛选可以区分圆环野毒与疫苗毒的抗原表位，构建可以区分圆环野毒抗体与疫苗抗体的ELISA 检测方法具有十分重要的临床意义。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种区分检测 PCV2野毒抗体与疫苗抗体的多肽，具有特异性好，敏感性高等优点。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的多肽，包括以下多肽序列一条或两条序列：
SEQ ID NO.1：Phe-Ser-Tyr-His-Ser-Arg-Tyr-Phe-Thr-Pro-Lys-Pro –Val-Leu-Asp-Ser-Thr；
SEQ ID NO.2：Ser-Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp -Tyr-Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg；
SEQ ID NO.3：Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp-Tyr -Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu-Arg-Leu-Glu；
SEQ ID NO.4：Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu。
本发明的另一目的在于提供一种用于区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的偶联多肽。
具体方案如下：一种用于区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的偶联多肽，其特征在于，包括以下序列中的一条或两条序列的多肽和与所述多肽偶联的多糖载体，
SEQ ID NO.1：Phe-Ser-Tyr-His-Ser-Arg-Tyr-Phe-Thr-Pro-Lys-Pro –Val-Leu-Asp-Ser-Thr；
SEQ ID NO.2：Ser-Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp -Tyr-Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg；
SEQ ID NO.3：Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp-Tyr -Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu-Arg-Leu-Glu；
SEQ ID NO.4：Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu。
作为进一步的方案，本发明所述的多糖载体为活化葡聚糖、壳聚糖、壳多糖中的一种。
本发明还提供了一种区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的多肽的合成方法，包括以下步骤：
(1)载体树脂溶涨：将Rink Amide-MBHA树脂放入反应管中，加DCM氮气鼓泡振荡，使载体树脂溶胀以提高氨基酸与载体树脂的结合效率；
(2)氨基酸与树脂载体结合：通过沙芯抽滤掉DCM，加入过量的Fmoc-L-Ile-OH氨基酸、HBTU，再加入过量的DIEA，最后加入DMF溶解，氮气鼓泡室温反应；
(3)脱保护：抽滤掉DMF，加20％哌啶DMF溶液，室温下震荡反应，抽滤掉哌啶后，再一次20％哌啶DMF溶液，室温反应；
(4)检测：抽滤掉哌啶溶液，取十几粒树脂，将取出的树脂用乙醇滤三次，加入茚三酮、KCN、苯酚溶液各1滴，105℃-110℃加热至变深蓝色即为阳性，说明氨基酸已与树脂载体成功链接；
(5)洗涤：将反应管中的载体树脂依次用DMF、甲醇、DCM 洗涤，将载体树脂上残余的哌啶洗掉；
(6)缩合：在载体树脂中加入保护氨基酸Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、HBTU，并用少量DMF溶解，立刻加入过量的N-甲基吗啉，氮气鼓泡室温反应；
(7)洗涤：将反应管中的载体树脂用DMF洗两次甲醇洗两次， DCM洗两次，将未参与反应的原料和缩合剂洗掉。
(8)连接：重复上述步骤(1)-步骤(6)的操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；
(9)脱保护：最后一个氨基酸连接后，脱保护，然后将反应管中的载体树脂依次用DMF、甲醇、DCM洗涤，将树脂载体中的哌啶洗掉，然后将树脂载体倒出来，烘干；
(10)切割：分别加入94％切割液TFA、2.5％水；2.5％的 EDT，1％的TIS(TFA-H2O-EDT-TIS)，恒温摇床震荡120分钟，从树脂上切割多肽；
(11)吹干洗涤：将切割液用氮气尽量吹干，再用乙醚洗6次，然后常温挥干，得到粗产物；
(12)多肽纯化及冻干：用HPLC纯化多肽，最后将纯化后的溶液冻干，得到成品；
(13)保存：将白色粉末状的多肽，密封包装，-20℃保存。
本发明还提供了一种用于区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的ELISA检测试剂盒，该试剂盒操作简便，特异性好，敏感性高，有效区分检测猪血清中的PCV2疫苗抗体与野毒抗体。
具体方案如下：一种区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的 ELISA检测试剂盒，包括本发明所述的偶联多肽，所述偶联多肽包括以下序列中的一条或两条序列的多肽和与所述多肽偶联的多糖载体，
SEQ ID NO.1：Phe-Ser-Tyr-His-Ser-Arg-Tyr-Phe-Thr-Pro-Lys-Pro -Val-Leu-Asp-Ser-Thr；
SEQ ID NO.2：Ser-Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp -Tyr-Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg；
SEQ ID NO.3：Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp-Tyr -Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu-Arg-Leu-Glu；
SEQ ID NO.4：Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu。
作为进一步的方案，本发明所述的区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的ELISA检测试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、抗体稀释液、酶标二抗、显色液、洗涤液和终止液。
作为进一步的方案，本发明所述的阴性对照为用抗体稀释液1:40 倍稀释的猪圆环病毒2型阴性血清；所述的阳性对照为用抗体稀释液1:40倍稀释的猪圆环病毒2型阳性血清；所述的酶标二抗为用抗体稀释液按1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪酶标抗体；所述的显色液为0.02M的TMB溶液与0.05M的柠檬酸缓冲液按1:50 的比例混合；所述的洗涤液为PBST缓冲液；所述终止液为2M的浓硫酸溶液。
作为进一步的方案，本发明所述的抗体稀释液由75～95％作为溶剂体系的1×PBS缓冲液、0.1～8％的牛血清白蛋白、0.01～0.5％的硫柳汞钠、0.05～5％的抗凝剂、0.1～15％的非常规性饲养动物血清以及0.05～2％的青链霉素双抗组成。进一步的，所述抗凝剂为肝素或乙二胺四乙酸二钠；所述非常规性饲养动物血清为骆驼、驼鹿、羊驼、马、鸵鸟、鸽、牦牛等动物血清中的一种或两种混合。
本发明还提供了一种区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的 ELISA检测试剂盒的制备方法，包括
多肽的合成及纯化步骤：采用固相多肽合成法，并通过高效液相色谱和质谱分析合成多肽序列，获得如序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示的多肽；
载体活化步骤：用新配制的NaIO4溶液溶解多糖载体，避光低速搅拌使之充分活化，然后装入透析袋中用PBS透析，收集透析袋内的活化产物，冻干保存备用；
多肽偶联步骤：室温下将上述多肽中的一条或任意两条序列与活化后的多糖载体溶解于的醋酸钠中，避光反应，再加入NaCNBH3，4℃反应过夜，次日加入乙醇胺封闭活化的基团，室温继续反应，将反应物用PBS溶液透析后，收集透析袋内的偶联多肽；
抗原包被板制备步骤：取上述偶联多肽用碳酸盐包被液稀释至 1-5μg/mL，100μL/孔包被酶标板，37℃孵育1h后，4℃包被12h，次日用PBST洗涤液洗涤后拍干，然后用封闭液封闭，用PBST洗涤液洗涤后拍干，得到抗原包被板；
试剂盒的组装步骤：抗原包被板与阴性对照、阳性对照、抗体稀释液、酶标二抗、显色液、洗涤液和终止液组装成试剂盒。
作为进一步的方案，上述制备方法所述的多肽偶联步骤中，用 PBS溶液透析40-50h，透析温度为4℃，并置于磁力搅拌器上连续搅拌。
作为进一步的方案，上述制备方法所述的抗原包被板制备步骤中，所述封闭液为含有10％羊血清的PBS溶液或含有20％PEG的PBS 溶液，封闭时间为37℃1-2h。
相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
1.本发明所述的多肽，具有特异性好，敏感性高等优点，用于 ELISA检测试剂盒，可以有效区分圆环病毒2型野毒抗体与疫苗毒的抗体；
2.本发明所述的区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的ELISA 检测试剂盒通过血清学检测就可以判断待检猪场中是否存在圆环野毒感染的风险，当断奶仔猪未经PCV2疫苗免疫前，如果检测发现 PCV2抗体呈阳性，且在PCV2疫苗免疫后此抗体水平逐渐降低，而疫苗抗体的水平逐渐升高，说明此仔猪有圆环病毒野毒感染的风险或是母猪有圆环病毒野毒感染，通过母源抗体传递给仔猪。
附图说明
图1为PCV2抗原检测电泳结果图；其中1-3泳道表示其他健康猪14W血清样品；4-7泳道表示1、2号猪14W血清样品(各重复两孔)；8-9泳道表示1、2号猪3W血清样品；10泳道表示PCV2阴性对照；11泳道表示PCV2阳性对照；M.DM-2000Marker；
图2为PCV2疫苗免疫前后两种ELISA方法检测血清抗体水平比较图。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：
一种区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的多肽，包括以下多肽序列一条或两条序列：
SEQ ID NO.1：Phe-Ser-Tyr-His-Ser-Arg-Tyr-Phe-Thr-Pro-Lys-Pro –Val-Leu-Asp-Ser-Thr；
SEQ ID NO.2：Ser-Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp -Tyr-Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg；
SEQ ID NO.3：Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp-Tyr -Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu-Arg-Leu-Glu；
SEQ ID NO.4：Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu。
本发明的另一目的在于提供一种用于区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的偶联多肽。
具体方案如下：一种用于区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的偶联多肽，包括以下序列中的一条或两条序列的多肽和与所述多肽偶联的多糖载体，
SEQ ID NO.1：Phe-Ser-Tyr-His-Ser-Arg-Tyr-Phe-Thr-Pro-Lys-Pro –Val-Leu-Asp-Ser-Thr；
SEQ ID NO.2：Ser-Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp -Tyr-Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg；
SEQ ID NO.3：Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp-Tyr -Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu-Arg-Leu-Glu；
SEQ ID NO.4：Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu。
在本发明中，合成得到的多肽与多糖载体的偶联增加其方向性，从而增加多肽抗原的反应原性。作为进一步的方案，本发明所述的多糖载体为活化葡聚糖、壳聚糖、壳多糖中的一种。其中偶联效果最佳的是采用活化后的葡聚糖，因为活化后的葡聚糖中含有的活性醛基官能团，可以通过N端氨基与多肽偶联。
所述区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的多肽序列可以通过筛选获得，具体的筛选过程中应用生物信息学软件DNA Star/protean /Jameson-Wolf分析预测蛋白序列中的抗原决定簇位置，在线的 ProtScale-Hphob/Kyte&Doolittle工具分析氨基酸序列的疏水性， TMHMM工具分析序列的跨膜区域，以及结合序列中氨基酸的电荷特性等多方面结果进行序列的分析比对，筛选出可区分圆环病毒2型野毒与疫苗毒的多肽序列4条，送由专业生物公司进行多肽的合成及纯化。
本发明还提供了一种区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的多肽的合成方法，包括以下步骤：
(1)载体树脂溶涨：将Rink Amide-MBHA树脂放入反应管中，加DCM氮气鼓泡振荡，使载体树脂溶胀以提高氨基酸与载体树脂的结合效率；
(2)氨基酸与树脂载体结合：通过沙芯抽滤掉DCM，加入过量的Fmoc-L-Ile-OH氨基酸、HBTU，再加入过量的DIEA，最后加入 DMF溶解，氮气鼓泡室温反应；
(3)脱保护：抽滤掉DMF，加20％哌啶DMF溶液，室温下震荡反应，抽滤掉哌啶后，再一次20％哌啶DMF溶液，室温反应；
(4)检测：抽滤掉哌啶溶液，取十几粒树脂，将取出的树脂用乙醇滤三次，加入茚三酮、KCN、苯酚溶液各1滴，105℃-110℃加热至变深蓝色即为阳性，说明氨基酸已与树脂载体成功链接；
(5)洗涤：将反应管中的载体树脂依次用DMF、甲醇、DCM 洗涤，将载体树脂上残余的哌啶洗掉；
(6)缩合：在载体树脂中加入保护氨基酸 Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、HBTU，并用少量DMF溶解，立刻加入过量的N-甲基吗啉，氮气鼓泡室温反应；
(7)洗涤：将反应管中的载体树脂用DMF洗两次甲醇洗两次， DCM洗两次，将未参与反应的原料和缩合剂洗掉。
(8)连接：重复上述步骤(1)-步骤(6)的操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；
(9)脱保护：最后一个氨基酸连接后，脱保护，然后将反应管中的载体树脂依次用DMF、甲醇、DCM洗涤，将树脂载体中的哌啶洗掉，然后将树脂载体倒出来，烘干；
(10)切割：分别加入94％切割液TFA、2.5％水；2.5％的 EDT，1％的TIS(TFA-H2O-EDT-TIS)，恒温摇床震荡120分钟，从树脂上切割多肽；
(11)吹干洗涤：将切割液用氮气尽量吹干，再用乙醚洗6次，然后常温挥干，得到粗产物；
(12)多肽纯化及冻干：用HPLC纯化多肽，最后将纯化后的溶液冻干，得到成品；
(13)保存：将白色粉末状的多肽，密封包装，-20℃保存。
本发明的还提供一种用于区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的ELISA检测试剂盒，该试剂盒操作简便，特异性好，敏感性高，有效区分检测猪血清中的PCV2疫苗抗体与野毒抗体。
具体方案如下：一种区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的 ELISA检测试剂盒，包括本发明所述的偶联多肽，所述偶联多肽包括以下序列中的一条或两条序列的多肽和与所述多肽偶联的多糖载体，
SEQ ID NO.1：Phe-Ser-Tyr-His-Ser-Arg-Tyr-Phe-Thr-Pro-Lys-Pro -Val-Leu-Asp-Ser-Thr；
SEQ ID NO.2：Ser-Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp -Tyr-Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg；
SEQ ID NO.3：Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp-Tyr -Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu-Arg-Leu-Glu；
SEQ ID NO.4：Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu。
作为进一步的方案，本发明所述的区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的ELISA检测试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、抗体稀释液、酶标二抗、显色液、洗涤液和终止液。
作为进一步的方案，本发明所述的阴性对照为用抗体稀释液1:40 倍稀释的猪圆环病毒2型阴性血清；所述的阳性对照为用抗体稀释液1:40倍稀释的猪圆环病毒2型阳性血清；所述的酶标二抗为用抗体稀释液按1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪酶标抗体；所述的显色液为0.02M的TMB溶液与0.05M的柠檬酸缓冲液按1:50 的比例混合；所述的洗涤液为PBST缓冲液；所述终止液为2M的浓硫酸溶液。
作为进一步的方案，本发明所述的抗体稀释液由75～95％作为溶剂体系的1×PBS缓冲液、0.1～8％的牛血清白蛋白、0.01～0.5％的硫柳汞钠、0.05～5％的抗凝剂、0.1～15％的非常规性饲养动物血清以及0.05～2％的青链霉素双抗组成。进一步的，所述抗凝剂为肝素或乙二胺四乙酸二钠；所述非常规性饲养动物血清为骆驼、驼鹿、羊驼、马、鸵鸟、鸽、牦牛等动物血清中的一种或两种混合。
本发明还提供了一种区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的 ELISA检测试剂盒的制备方法，包括
多肽的合成及纯化步骤：采用固相多肽合成法，并通过高效液相色谱和质谱分析合成多肽序列，获得如序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示的多肽；
载体活化步骤：用新配制的NaIO4溶液溶解多糖载体，避光低速搅拌使之充分活化，然后装入透析袋中用PBS透析，收集透析袋内的活化产物，冻干保存备用；
多肽偶联步骤：室温下将上述多肽中的一条或任意两条序列与活化后的多糖载体溶解于的醋酸钠中，避光反应，再加入NaCNBH3，4℃反应过夜，次日加入乙醇胺封闭活化的基团，室温继续反应，将反应物用PBS溶液透析后，收集透析袋内的偶联多肽；
抗原包被板制备步骤：取上述偶联多肽用碳酸盐包被液稀释至 1-5μg/mL，100μL/孔包被酶标板，37℃孵育1h后，4℃包被12h，次日用PBST洗涤液洗涤后拍干，然后用封闭液封闭，用PBST洗涤液洗涤后拍干，得到抗原包被板；
试剂盒的组装步骤：将抗原包被板与阴性对照、阳性对照、抗体稀释液、酶标二抗、显色液、洗涤液和终止液组装成试剂盒。
作为进一步的方案，上述制备方法所述的多肽偶联步骤中，用 PBS溶液透析40-50h，透析温度为4℃，并置于磁力搅拌器上连续搅拌。
作为进一步的方案，上述制备方法所述的抗原包被板制备步骤中，所述封闭液为含有10％羊血清的PBS溶液或含有20％PEG的PBS 溶液，封闭时间为37℃1-2h。
在上述制备方法中，具体的，区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的ELISA检测试剂盒制备方法如下：
多肽的合成及纯化步骤：
(1)载体树脂溶涨：将Rink Amide-MBHA树脂放入反应管中，加DCM(15mL/g)氮气鼓泡振荡30min，使载体树脂溶胀以利于提高氨基酸与载体树脂的结合效率；
(2)氨基酸与树脂载体结合：通过沙芯抽滤掉DCM，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Ile-OH氨基酸，3倍量HBTU，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，氮气鼓泡室温反应30分钟；
(3)脱保护：抽滤掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15mL/g)，室温下震荡反应5分钟，抽滤掉哌啶后，再一次20％哌啶DMF溶液 (15mL/g)，室温反应15分钟；20％的哌啶的作用是去除Fmoc保护基，将NH2游离出来，为接下一个氨基酸做准备；
(4)检测：抽滤掉哌啶溶液，取十几粒树脂，将取出的树脂用乙醇滤三次，加入茚三酮、KCN、苯酚溶液各1滴，105℃-110℃加热5分钟变深蓝色即为阳性，说明氨基酸已与树脂载体成功链接；
(5)洗涤：将反应管中的载体树脂用DMF洗两次、甲醇洗两次、DCM洗两次，将载体树脂上残余的哌啶洗掉；
(6)缩合：保护氨基酸Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH加入量为载体树脂的活性位点的3倍当量，HBTU为3倍过量，均用尽量少的DMF 溶解(以树脂载体在反应管中可以被氮气鼓起为准)，加入反应管，立刻加入N-甲基吗啉(NMM)10倍过量，氮气鼓泡室温反应30分钟；
(7)洗涤：将反应管中的载体树脂用DMF洗两次甲醇洗两次，DCM洗两次，将未参与反应的原料和缩合剂洗掉；
(8)连接：重复2.1.2-2.1.6操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；
(9)脱保护：最后一个氨基酸连接后，脱保护，按照下列方法洗树脂：将反应管中的载体树脂用DMF洗两次、甲醇洗两次、DCM 洗两次，将树脂载体中的哌啶洗掉，然后将树脂载体倒出来，烘干；
(10)切割：分别加入94.5％切割液TFA(10mL/g树脂)、2.5％水；2.5％的EDT，1％的TIS(TFA-H2O-EDT-TIS)，恒温摇床震荡 120分钟，从树脂上切割多肽；
(11)吹干洗涤：将切割液用氮气尽量吹干，再用乙醚洗6次，然后常温挥干，得到粗产物；
(12)多肽纯化及冻干：用HPLC纯化多肽，最后将纯化后的溶液冻干，得到成品；
(13)鉴定：分别取少量的成品多肽，做MS的分子量鉴定和 HPLC分析的纯度鉴定，得到如序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示的多肽；
(14)保存：将白色粉末状的多肽，密封包装，-20℃保存；
载体活化步骤：将新配制5mg/mL的NaIO4溶液10mL溶解葡聚糖(1％)，避光低速搅拌反应30min使之充分活化，然后装入透析袋(MW:3500)中用PBS透析2h，收集透析袋内的活化葡聚糖产物， 1mL/管分装，-80℃预冻后于冻干机内冻干24小时，-20℃保存备用；
多肽偶联步骤：室温下将1mg的多肽与4mg活化的葡聚糖溶解于1mL的醋酸钠(0.1M，pH6.0)中，避光反应1h，再加入10mg的 NaCNBH3，4℃反应过夜；次日加入0.25mL乙醇胺(1M，pH6.5) 封闭活化的基团，室温继续反应2小时；将反应物用250mL的PBS 溶液透析48h(透析温度：4℃，容器：500mL烧杯内置磁力搅拌子，置于磁力搅拌器上连续搅拌)，然后收集透析袋内的偶联多肽，-20℃保存备用；
抗原包被板制备步骤：取偶联好的PCV2多肽抗原用0.05M碳酸盐包被液稀释至1-5μg/mL，100μL/孔包被酶标板，37℃孵育1h后， 4℃包被12h；次日用PBST洗涤液300μL/孔洗涤，洗涤3次后拍干，然后用含有10％羊血清的PBS或含有20％PEG的PBS溶液作为封闭液37℃封闭为1h，用PBST洗涤液300μL/孔洗涤，洗涤3次后拍干， 4℃保存备用；
试剂盒的组装步骤：将抗原包被板与阴性对照、阳性对照、抗体稀释液、酶标二抗、显色液、洗涤液和终止液组装成试剂盒；其中所述阴性对照为用抗体稀释液1:40倍稀释的猪圆环病毒2型阴性血清；所述阳性对照为用抗体稀释液1:40倍稀释的猪圆环病毒2型阳性血清；所述酶标二抗为用抗体稀释液按1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪酶标抗体；所述抗体稀释液为含有0.5％的牛血清白蛋白(BSA)、0.01％的硫柳汞钠、0.05％的乙二胺四乙酸二钠(EDTA 四乙酸二)、2％的马血清以及0.05％的青链霉素双抗的PBS缓冲液；所述显色液为0.02M的TMB溶液与0.05M的柠檬酸缓冲液按1:50 的比例混合；所述洗涤液为PBST缓冲液；所述终止液为2M的浓硫酸溶液。
采用本发明所述的区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的ELISA 检测试剂盒检测血清样本的具体步骤如下：
(1)加血清样本：按1:40稀释待检样本血清和标准阴、阳性血清，100μL/孔，于室温孵育30分钟后，用洗涤液250μL/孔，连续洗涤3次后拍干；
(2)加酶标抗体：加入4000倍稀释的HRP标记山羊抗猪抗体， 100μL/孔，室温孵育30分钟，用洗涤液250μL/孔，连续洗涤3次后拍干；
(3)显色：加入底物显色液100μL加入底孔，室温避光显色10 分钟；
(4)反应终止：加入终止液50μL每孔，终止反应，于10分钟内读取酶标仪OD450nm读数。
本发明中还包括了对ELISA检测试剂盒的条件进行优化，具体方案如下。
1.确定血清(一抗)的最佳稀释倍数
试验方法：
(1)包被：抗原用包被液稀释后，100μL抗孔，加入96孔聚苯乙烯酶联反应板，4℃包被过夜，每孔加300μL洗涤液，洗涤3次后甩干；
(2)封闭：每孔加封闭液150μL，37℃封闭1h，甩干，每孔加 300μL洗涤液进行洗涤，洗3次；
(3)加样：血清用抗体稀释液稀释，每孔加入100μL，25℃孵育 30min，甩干，每孔加300μL洗涤液进行洗涤，洗3次；
(4)加HRP标记的羊抗猪抗体：HRP标记的羊抗猪抗体用抗体稀释液稀释，100μL/孔，25℃作用30min，洗涤同上；
(5)加显色液：每孔加入新配制的显色液100μL，室温避光显色 10min；
(6)加入终止液：每孔加入50μL终止液终止反应；
(8)测OD值：自动酶联检测仪测定各孔OD450nm值；根据测定阴、阳性结果计算S/N值，即阳性样品的平均OD450与阴性样品平均 OD450的比值。
结果：
1)以P2多肽抗原包被酶标板，包被浓度分别为5μg/mL、1 μg/mL、0.5μg/mL和0.1μg/mL，固定血清稀释倍数为1:40，按上述步骤进行检测，检测结果见表1。
表1多肽抗原和HRP浓度的筛选
由表1结果可见，取S/N最大值时的多肽抗原包被浓度和HRP 稀释浓度为最佳工作浓度，即多肽抗原包被浓度为1μg/mL，HRP稀释度为1:8000。
2)以1μg/mL包被P2多肽，血清的反应浓度设置1:20、1:40、 1:80、1:160四个稀释度，HRP稀释度为1:8000，按上述步骤进行检测，检测结果见表2。
表2血清稀释度检测结果
由表2结果可见，血清1:80倍稀释时S/N值最大，因此选取1:80 作为血清的最佳稀释倍数。
3)临界值的判定：Cut-off值(COV)＝阴性对照平均值*2.1(当阴性OD450值＜0.08时，以0.08计)。
效果与性能检测
1.区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的ELISA检测试剂盒的特异性检验
用CSFV、PRRSV、PRV gE、PRV gB、PEDV、FMDV-O、PCV2 等的阳性血清进行检测，交叉反应结果表明，除PCV2阳性血清为阳性反应外，其他几种猪病毒参考血清均为阴性，证明该方法特异性的检测PCV2抗体，与其他几种病毒无血清交叉反应，结果参见图1。
2.区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的ELISA检测试剂盒的敏感性检验
将临床收集的不同抗体效价的两份PCV2阳性血清与PCV2标准阳性血清同时进行不同浓度的稀释(1:80、1:160、1:320、1:640)，按照实施例1中检测步骤进行检测，测定检测方法的最低检测稀释倍数，从而确定检测方法的敏感性，检测结果见表3。
表3检测方法敏感性检验结果
由表3结果可见，阳性血清1在1:320倍稀释时为阳性，1:640 倍稀释时为阴性，阳性血清2和标准阳性血清在1:640倍稀释时仍为阳性，因此确定本检测方法的最低检测敏感度为1:320。
3.区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的ELISA检测试剂盒检测样本的检测效果验证
试验动物的选取及样品采集：在阳西某猪场选取临床表现PDNS 或PMWS症状的3周龄(3W)仔猪两头，编号1号、2号；用5mL 无菌注射器采集血清3-4mL，分离血清，-20℃保存待检；4周龄(4W) 时免疫金宇生物猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗(CP08株) 1mL/头份，7W时加强免疫1次。免疫后10周(即猪只为14W)采血，分离血清，-20℃保存；待检。
试验方法：用纯化表达Cap蛋白作为包被抗原1:1000倍稀释后包被酶标板进行检测，分别对3W和14W的1、2号猪的血清样品进行检测，同时设立阴、阳性对照；基本检测条件为：血清稀释倍数为 1:50，二抗稀释倍数为1:4000，孵育时间均为室温30min，底物避光显色10min后终止反应，450nm读数。
PCR检测结果：经PCV2特异性引物PCR检测发现，1、2号猪 3W时血清样品检测为PCV2抗原阳性，目的条带大小在400bp左右，为PCV2特异性条带；到14W时血清中的PCV2抗原检测结果为阴性，说明猪血清中无PCV2抗原，且1、2号猪为健康状态，临床未表现PCV2相关发病症状。结果见图2。
ELISA检测结果:将3W、14W采集的1、2号猪的血清样品分别用构建的PCV2Cap蛋白ELISA方法(适用于PCV2疫苗抗体水平评估)和PCV2多肽ELISA方法(适用于PCV2野毒抗体检测)进行检测，每个样品平行检测3孔。
结果显示，3W时两种方法检测的血清抗体水平均为阳性，且呈现较高水平，此时的猪只为断奶仔猪，其体内的抗体多数为母源抗体。多肽ELISA抗体结果呈较高阳性，说明此断奶有PCV2野毒感染风险，其体内的野毒抗体来源于母源抗体或是外源的PCV2野毒感染而产生。14W时，即免疫后10W时再次检测发现，Cap蛋白ELISA方法检测的抗体水平仍呈现较高水平，说明4W疫苗免疫后产生了有效地保护性抗体，临床观察发现，此时猪只为健康状态，未见发病症状，而多肽ELISA检测结果发现，其抗体水平已降至阴性，这说明猪只体内的PCV2野毒抗原已被疫苗免疫后产生的抗体逐渐中和，至14W 检测时猪只体内已不存在PCV2野毒感染，因此其野毒抗体检测结果也为阴性，这一结果与14W时PCR检测的PCV2抗原阴性结果一致。
上述试验结果表明，本发明中构建的PCV2多肽ELISA方法可用于检测PCV2野毒抗体，从而为临床中评估猪群是否存在圆环病毒野毒感染风险提供有效的检测工具。
对本领域的技术人员来说，可如以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 广东海大畜牧兽医研究院有限公司
<120> 一种区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的多肽及其在ELISA检测试剂盒中的应用
<130> 广东海大畜牧兽医研究院有限公司
<141> 2018-03-16
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial
<400> 1
Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser
1 5 10 15
Thr
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<400> 1
Ser Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Glu Pro
1 5 10 15
Asn Asn Lys Arg
20
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> artificial
<400> 1
Ser Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Glu Pro
1 5 10 15
Asn Asn Lys Arg Asn Glu Leu Trp Leu Arg Leu Glu
20 25
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial
<400> 1
Glu Pro Asn Asn Lys Arg Asn Glu Leu Trp Leu
1 5 10

Claims (10)

1.一种区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的多肽，其特征在于，包括以下多肽序列一条或两条序列：
SEQ ID NO.1：Phe-Ser-Tyr-His-Ser-Arg-Tyr-Phe-Thr-Pro-Lys-Pro–Val-Leu-Asp-Ser-Thr；
SEQ ID NO.2：Ser-Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp-Tyr-Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg；
SEQ ID NO.3：Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp-Tyr-Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu-Arg-Leu-Glu；
SEQ ID NO.4：Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu。
2.一种用于区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的偶联多肽，其特征在于，包括以下序列中的一条或两条序列的多肽和与所述多肽偶联的多糖载体，
SEQ ID NO.1：Phe-Ser-Tyr-His-Ser-Arg-Tyr-Phe-Thr-Pro-Lys-Pro–Val-Leu-Asp-Ser-Thr；
SEQ ID NO.2：Ser-Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp-Tyr-Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg；
SEQ ID NO.3：Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp-Tyr-Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu-Arg-Leu-Glu；
SEQ ID NO.4：Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu。
3.如权利要求2所述的偶联多肽，其特征在于，所述多糖载体为活化葡聚糖、壳聚糖、壳多糖中的一种。
4.一种如权利要求1所述的多肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)载体树脂溶涨：将Rink Amide-MBHA树脂放入反应管中，加DCM氮气鼓泡振荡，使载体树脂溶胀以提高氨基酸与载体树脂的结合效率；
(2)氨基酸与树脂载体结合：通过沙芯抽滤掉DCM，加入过量的Fmoc-L-Ile-OH氨基酸、HBTU，再加入过量的DIEA，最后加入DMF溶解，氮气鼓泡室温反应；
(3)脱保护：抽滤掉DMF，加20％哌啶DMF溶液，室温下震荡反应，抽滤掉哌啶后，再一次20％哌啶DMF溶液，室温反应；
(4)检测：抽滤掉哌啶溶液，取十几粒树脂，将取出的树脂用乙醇滤三次，加入茚三酮、KCN、苯酚溶液各1滴，105℃-110℃加热至变深蓝色即为阳性，说明氨基酸已与树脂载体成功链接；
(5)洗涤：将反应管中的载体树脂依次用DMF、甲醇、DCM洗涤，将载体树脂上残余的哌啶洗掉；
(6)缩合：在载体树脂中加入保护氨基酸Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、HBTU，并用少量DMF溶解，立刻加入过量的N-甲基吗啉，氮气鼓泡室温反应；
(7)洗涤：将反应管中的载体树脂用DMF洗两次甲醇洗两次，DCM洗两次，将未参与反应的原料和缩合剂洗掉。
(8)连接：重复上述步骤(1)-步骤(6)的操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；
(9)脱保护：最后一个氨基酸连接后，脱保护，然后将反应管中的载体树脂依次用DMF、甲醇、DCM洗涤，将树脂载体中的哌啶洗掉，然后将树脂载体倒出来，烘干；
(10)切割：分别加入94％切割液TFA、2.5％水；2.5％的EDT，1％的TIS，恒温摇床震荡120分钟，从树脂上切割多肽；
(11)吹干洗涤：将切割液用氮气尽量吹干，再用乙醚洗6次，然后常温挥干，得到粗产物；
(12)多肽纯化及冻干：用HPLC纯化多肽，最后将纯化后的溶液冻干，得到成品；
(13)保存：将白色粉末状的多肽，密封包装，-20℃保存。
5.一种区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2所述的偶联多肽，所述偶联多肽包括以下序列中的一条或两条序列的多肽和与所述多肽偶联的多糖载体，
SEQ ID NO.1：Phe-Ser-Tyr-His-Ser-Arg-Tyr-Phe-Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr；
SEQ ID NO.2：Ser-Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp-Tyr-Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg；
SEQ ID NO.3：Thr-Pro-Lys-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Thr-Ile-Asp-Tyr-Phe-Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu-Arg-Leu-Glu；
SEQ ID NO.4：Glu-Pro-Asn-Asn-Lys-Arg-Asn-Glu-Leu-Trp-Leu。
6.如权利要求5所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照、阳性对照、抗体稀释液、酶标二抗、显色液、洗涤液和终止液。
7.如权利要求6所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为用抗体稀释液1:40倍稀释的猪圆环病毒2型阴性血清；所述阳性对照为用抗体稀释液1:40倍稀释的猪圆环病毒2型阳性血清；所述酶标二抗为用抗体稀释液按1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪酶标抗体；所述显色液为0.02M的TMB溶液与0.05M的柠檬酸缓冲液按1:50的比例混合；所述洗涤液为PBST缓冲液；所述终止液为2M的浓硫酸溶液。
8.一种如权利要求5所述的区分检测PCV2野毒抗体与疫苗抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括
多肽的合成及纯化步骤：采用固相多肽合成法，并通过高效液相色谱和质谱分析合成多肽序列，获得如序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示的多肽；
载体活化步骤：用新配制的NaIO4溶液溶解多糖载体，避光低速搅拌使之充分活化，然后装入透析袋中用PBS透析，收集透析袋内的活化产物，冻干保存备用；
多肽偶联步骤：室温下将上述多肽中的一条或任意两条序列与活化后的多糖载体溶解于的醋酸钠中，避光反应，再加入NaCNBH3，4℃反应过夜，次日加入乙醇胺封闭活化的基团，室温继续反应，将反应物用PBS溶液透析后，收集透析袋内的偶联多肽；
抗原包被板制备步骤：取上述偶联多肽用碳酸盐包被液稀释至1-5μg/mL，100μL/孔包被酶标板，37℃孵育1h后，4℃包被12h，次日用PBST洗涤液洗涤后拍干，然后用封闭液封闭，用PBST洗涤液洗涤后拍干，得到抗原包被板；
试剂盒的组装步骤：抗原包被板与阴性对照、阳性对照、抗体稀释液、酶标二抗、显色液、洗涤液和终止液组装成试剂盒。
9.如权利要求8所述的ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，多肽偶联步骤中，用PBS溶液透析40-50h，透析温度为4℃，并置于磁力搅拌器上连续搅拌。
10.如权利要求8所述的ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，抗原包被板制备步骤中，所述封闭液为含有10％羊血清的PBS溶液或含有20％PEG的PBS溶液，封闭时间为37℃1-2h。
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