CN105658660A - Pcv2 orf2蛋白变体和由其组成的病毒样颗粒 - Google Patents
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Abstract
公开了用于控制不同PCV2亚型的PCV2感染的疫苗接种方法。具体地,将PCV2亚型B(PCV2B)ORF2蛋白或包含PCV2B?ORF2蛋白的免疫原性组合物用在以下方法中:治疗或预防相同PCV2B和/或不同亚型的PCV2的感染;减轻、预防或治疗由相同PCV2B或不同亚型的PCV2的感染造成的临床征象;和/或预防或治疗由相同PCV2B和/或不同亚型的PCV2造成的疾病的感染。本发明尤其涉及PCV2亚型B(PCV2B)ORF2蛋白,其特征在于,它们在BC环中含有至少一个突变,使得表达的蛋白优选地与不含有这样的突变的PCV2?ORF2蛋白相比以更高的量表达。
Description
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背景技术
猪圆环病毒2型(PCV2)是一种小型(直径17-22nm)、二十面体、无包膜的DNA病毒,其含有单链环状基因组。PCV2与猪圆环病毒1型(PCV-1)共享大约80%序列相同性。但是,与通常无毒的PCV1不同,被PCV2感染的猪表现出通常被称作断奶后多系统消耗综合征(PMWS)的综合征。PMWS的临床特征在于消瘦、皮肤苍白、生长迟滞、呼吸窘迫、腹泻、黄疸(icterus)和黄疸病(jaundice)。在一些被感染的猪中,会出现所有征象的组合,而其它猪仅具有这些临床征象中的一种或两种。在尸检中,显微镜可见和肉眼可见的损伤也会出现在多个组织和器官上,其中淋巴样器官是损伤的最常见部位。已观察到PCV2核酸或抗原的量与显微镜可见的淋巴样损伤的严重程度之间的强关联。受PCV2感染的猪的死亡率可能接近80%。除PMWS外,PCV2已经与数种其它感染有关,所述其它感染包括伪狂犬病、猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)、格拉瑟氏病(Glasser’sdisease)、链球菌性脑膜炎、沙门氏菌病、断奶后大肠杆菌病、饮食性肝功能病和化脓性支气管肺炎。
目前,已知PCV2的三种亚型(PCV2a、PCV2b和PCV2c),它们根据PCV2基因型的统一命名法来分类(Segales,J.等人,2008,PCV-2genotype定义andnomenclature,VetRec162:867-8)。已经提出另外两种亚型(PCV2d和PCV2e)(Wang等人.VirusRes.2009145(1):151-6),但是,以后证实它们属于PCV2a和PCV2b簇(Cortey等人.VetMicrobiol.2011149(3-4):522-32011)。根据PCV2基因型的该统一命名法,使用orf2基因来执行pcv-2的基因分型,其中所述基因分型是基于这样的核苷酸位点的比例:在所述核苷酸位点处,两个对比的序列是不同的(p距离)。通过将核苷酸差异的数目除以对比的核苷酸的总数,得到该值(Kumar等人.2001Bioinformatics17,1244-1245),随后,p距离/频率直方图的构建能够确定区分不同基因型的潜在截止值(Rogers和Harpending1992MolecularBiologyandEvolution9,552-569;Biagini等人.1999JournalofGeneralVirology80,419-424)。使用该方法,当它们之间的遗传距离是0·035时,将orf2pcv-2序列分配至不同的基因型。
US2011/0305725A1描述了一项研究,其设计成在猪中试验新疫苗制剂以评估它对猪圆环病毒和猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)的效力。在该研究过程中,观察到,对照组和接种疫苗组中的几只猪表现出PMWS的临床征象。然后证实,这些猪在攻击之前暴露于环境PCV2。得自这些猪的血液和组织样品的分子分析揭示,它们携带与用于攻击的病毒株不同的2B型病毒株(US2011/0305725A1的段落)。
WO2011116094A2公开了嵌合的猪圆环病毒感染性DNA克隆和活减毒嵌合病毒,其具有PCV2b亚型的PCV2和整合进非致病性PCV1病毒基因组中的PCV2b亚型的衣壳基因,其中所述减毒的嵌合病毒可以用作活疫苗、以及灭活的(杀死的)疫苗。
WO2013030320A1涉及合成的圆环病毒型衣壳蛋白和使用所述蛋白治疗和/或预防哺乳动物中的PCV2相关疾病的方法。根据WO2013030320A1设计了两个序列,其中一个序列用尤其下述优化进一步修饰:
-消除在氨基酸位置165处的潜在切割位点。
-在位置200引入突变。
-在位置161做出替换。
-在位置170做出替换。
-在位置225的S残基用D替换。
-在位置143做出替换。
-在序列的N-端做出两个替换(位置13和20)。
但是,由于在实践中发现野生型PCV2bORF2蛋白的表达是不足的,且需要其它浓缩步骤才能得到可用于制备亚单位疫苗的病毒样颗粒(VLP),需要天然存在的PCV2bORF2蛋白序列的容易修饰来增强表达效力和增加VLP的生产,由此允许有效的PCV2亚单位疫苗的快速且容易的生产。
说明书和在权利要求书中表征的实施方案达到了以上技术问题的解决方案。
因而,本发明在它的不同的方面根据权利要求来实现。
附图说明
图1-PCV2a和PCV2bORF2氨基酸序列之间的主要氨基酸变化。
图2-PCV2bORF2的杆状病毒收获上清液的评价。泳道1=CircoflexWSV(PCV2aORF2),泳道2=PCV2bORF2BDHSFCO,泳道4=PCV2bORF2BDHR63T,泳道5=PCV2bORF2BDHR63K。
图3-PCV2bORF2的100,000g沉淀物的评价。泳道1=PCV2bORF2BDH,泳道2=PCV2bORF2BDHR63K,泳道3=PCV2bORF2BDHR63T,泳道4=CircoflexWSV(PCV2aORF2)。
图4-蔗糖梯度级分的SDS-PAGE分离。F1-F12=级分1-12。
图5A和图5B-通过EM证实VLP形成。
图6-PCV2bORF2突变构建体评价的结果。SFCO=为草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)优化的密码子。天然PCV2bORF2BDH和R63K构建体没有进行VLP检查或定量,因为同时发现了R63T构建体。
图7A和7B-PCV2bORF2突变构建体评价的结果。SFCO=为草地贪夜蛾优化的密码子。将ORF2突变构建体的VPL定量表示为μg/ml。
图8-PCV2bORF2野生型和突变型氨基酸序列的比对,其中命名为SEQIDNO:5和SEQIDNO:2的序列为PCV2bORF2野生型序列,且命名为SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的序列为突变型序列,且其中SEQIDNO:3对应于野生型PCV2aORF2蛋白的序列。在命名为SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的序列中:“X”(在位置8、53、57、68、89、90、121、134、169、190、215和234)是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的任意氨基酸残基;“X”(在位置63)是选自A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W和Y的任意氨基酸残基;且“x”(在位置210)是选自D和E的任意氨基酸残基。
具体实施方式
本发明是基于以下惊人发现:PCV2亚型b(PCV2b)ORF2蛋白的氨基酸序列中的单个突变足以显著地增加VLP生产水平,由此能够快速地生产有效的PCV2亚单位疫苗。
在本发明的基础工作中,将PCV2a和PCV2bORF2序列之间的主要氨基酸差异的位置鉴别为潜在突变位置。
在该背景下,鉴别出PCV2bORF2蛋白的典型的六个氨基酸位置,即
-在氨基酸位置59处的精氨酸残基或赖氨酸残基,
-在氨基酸位置63处的精氨酸残基或赖氨酸残基,
-在氨基酸位置88处的脯氨酸残基,
-在氨基酸位置151处的苏氨酸残基,
-在氨基酸位置206处的异亮氨酸残基,且
-在氨基酸位置232处的天冬酰胺残基。
如本文中所述的,氨基酸位置的编号参考全长野生型PCV2ORF2蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:2或SEQIDNO:5)。因此,如本文中提及的氨基位置的编号是参考具有234或233个氨基酸残基(包括在(N-端)氨基酸位置1处的甲硫氨酸残基)的野生型PCV2ORF2蛋白序列。
因而,在本发明的上下文中使用的短语“其中氨基酸位置的编号参考野生型PCV2ORF2蛋白的氨基酸序列”涉及天然存在的PCV2ORF2蛋白的序列,如在SEQIDNO:2或SEQIDNO:5中示例性地阐述的。
PCV2bORF2蛋白的典型的六个氨基酸位置的突变出乎意料地显示,在PCV2ORF2蛋白的BC环的氨基酸序列内的位置的一个突变(即在位置63处的精氨酸残基或赖氨酸残基的置换)与不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白相比足以显著地增加PCV2ORF2蛋白的表达。
在一个方面,本发明因而涉及选自以下(a)、(b)和(c)的多肽:(a)PCV2ORF2蛋白,其具有:在氨基酸位置59处的精氨酸残基或赖氨酸残基,和/或在氨基酸位置88处的脯氨酸残基,和/或在氨基酸位置151处的苏氨酸残基,和/或在氨基酸位置206处的异亮氨酸残基,和/或在氨基酸位置232处的天冬酰胺残基,且具有在氨基酸位置63处的除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基,其中氨基酸位置的编号参考野生型PCV2ORF2蛋白的氨基酸序列;(b)PCV2ORF2蛋白,其特征在于,它(i)在BC环中含有至少一个突变和(ii)优选地与不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白相比以显著更高的量表达;和(c)(a)和(b)的组合。
优选地,所述多肽(其在下文中也被称作“本发明的多肽”)是分离的多肽。
具体地,本发明的多肽是非天然存在的多肽。
根据第一方面(a),本发明的多肽因而是这样的PCV2ORF2蛋白,其具有1、2、3、4或5个选自以下的氨基酸残基(在括号中是单字母代码):在氨基酸位置59处的精氨酸残基(R)或赖氨酸残基(K),在氨基酸位置88处的脯氨酸残基(P),在氨基酸位置151处的苏氨酸残基(T),在氨基酸位置206处的异亮氨酸残基(I),和在氨基酸位置232处的天冬酰胺残基(N),且具有在氨基酸位置63处的除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基。
具体地,在位置63处的除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基是天然存在的、优选地遗传学编码的、除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基。
随后,也使用以下缩写:
“R59”作为代表“在氨基酸位置59处的精氨酸残基”的缩写,
“K59”作为代表“在氨基酸位置59处的赖氨酸残基”的缩写,
“P88”作为代表“在氨基酸位置88处的脯氨酸残基”的缩写,
“T151”作为代表“在氨基酸位置151处的苏氨酸残基”的缩写,
“I206”作为代表“在氨基酸位置206处的异亮氨酸残基”的缩写,
“N232”作为代表“在氨基酸位置232处的天冬酰胺残基”的缩写。
优选地,根据方面(a)的多肽因而是这样的PCV2ORF2蛋白,其
具有P88,
或者具有T151,
或者具有I206,
或者具有N232,
或者具有R59或K59,
或者具有P88和T151,
或者具有P88和I206,
或者具有P88和N232,
或者具有P88和R59或K59,
或者具有T151和I206,
或者具有T151和N232,
或者具有T151和R59或K59,
或者具有I206和N232,
或者具有I206和R59或K59,
或者具有N232和R59或K59,
或者具有P88和T151和I206,
或者具有P88和T151和N232,
或者具有P88和T151和R59或K59,
或者具有P88和I206和N232,
或者具有P88和I206和R59或K59,
或者具有P88和N232和R59或K59,
或者具有T151和I206和N232,
或者具有T151和I206和R59或K59,
或者具有T151和N232和R59或K59,
或者具有I206和N232和R59或K59,
或者具有P88和T151和I206和N232,
或者具有P88和T151和I206和R59或K59,
或者具有P88和T151和N232和R59或K59,
或者具有P88和I206和N232和R59或K59,
或者具有T151和I206和N232和R59或K59,
或者具有P88和T151和I206和N232和R59或K59。
更优选地,根据方面(a)的多肽因此选自:
具有P88的PCV2ORF2蛋白,
具有T151的PCV2ORF2蛋白,
具有I206的PCV2ORF2蛋白,
具有N232的PCV2ORF2蛋白,
具有R59的PCV2ORF2蛋白,
具有K59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和T151的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和I206的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和N232的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和R59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和K59的PCV2ORF2蛋白,
具有T151和I206的PCV2ORF2蛋白,
具有T151和N232的PCV2ORF2蛋白,
具有T151和R59的PCV2ORF2蛋白,
具有T151和K59的PCV2ORF2蛋白,
具有I206和N232的PCV2ORF2蛋白,
具有I206和R59的PCV2ORF2蛋白,
具有I206和K59的PCV2ORF2蛋白,
具有N232和R59的PCV2ORF2蛋白,
具有N232和K59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和T151和I206的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和T151和N232的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和T151和R59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和T151和K59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和I206和N232的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和I206和R59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和I206和K59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和N232和R59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和N232和K59的PCV2ORF2蛋白,
具有T151和I206和N232的PCV2ORF2蛋白,
具有T151和I206和R59的PCV2ORF2蛋白,
具有T151和I206和K59的PCV2ORF2蛋白,
具有T151和N232和R59的PCV2ORF2蛋白,
具有T151和N232和K59的PCV2ORF2蛋白,
具有I206和N232和R59的PCV2ORF2蛋白,
具有I206和N232和K59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和T151和I206和N232的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和T151和I206和R59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和T151和I206和K59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和T151和N232和R59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和T151和N232和K59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和I206和N232和R59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和I206和N232和K59的PCV2ORF2蛋白,
具有T151和I206和N232和R59的PCV2ORF2蛋白,
具有T151和I206和N232和K59的PCV2ORF2蛋白,
具有P88和T151和I206和N232和R59的PCV2ORF2蛋白,和
具有P88和T151和I206和N232和K59的PCV2ORF2蛋白。
根据第二方面(b),本发明的多肽具体地是PCV2ORF2蛋白,其特征在于,它(i)在BC环中含有至少一个突变和(ii)尤其在杆状病毒表达系统中与不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白相比以显著更高的量表达,优选地以高至少2倍的量,更优选地以高至少3倍的量,更优选地以高至少5倍的量,更优选地以高至少8倍的量表达,其中所述不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白优选地具有除了所述BC环中的至少一个突变以外与本发明的多肽相同的氨基酸序列。
因而特别理解,根据本发明的该方面对比其表达的两种PCV2ORF2蛋白的氨基酸序列除了所述BC环中的至少一个突变以外是相同的。
在本发明的上下文中,术语“BC环”具体地表示位于折叠成β折叠二级结构的前两个N-端氨基酸段中的PCV2ORF2氨基酸序列部分,如在Khayat等人.JVirol85:7856-62(2011)(其通过引用并入本文)公开的PCV2ORF2蛋白的晶体结构中所见。具体地,Khayat等人将连接β条带BC、DE、FG和HI的环描述为4-9个氨基酸残基长,并将环BC和HI描述为限定从PCV衣壳表面伸出最远且装饰5倍轴的旋钮样突出物。
为了确定在BC环中含有至少一个突变的PCV2ORF2蛋白与不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白相比是否以更高的量表达,优选地使用如在下文实施例1中描述的方法。
因而,在一个实施例中,为了确定在BC环中含有至少一个突变的PCV2ORF2蛋白与不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白相比是否以更高的量表达,在包括下述步骤的方法中使用杆状病毒表达系统:用杆状病毒以0.1的靶MOI感染Sf+细胞,允许所述感染进行5-7天,通过在20000g离心20min以除去细胞碎片和不溶性蛋白进行收获,将收获上清液进行0.2μm过滤,并使用α-PCV2抗体通过蛋白质印迹直接评价PCV2ORF2表达。
优选地,所述方法进一步包括制备要用于以0.1的靶MOI感染Sf+细胞的步骤的杆状病毒,且具体地进一步包括下述步骤中的一个或多个:将编码在BC环中含有至少一个突变的PCV2ORF2蛋白的编码序列克隆进杆状病毒转移载体中,将编码不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白的编码序列克隆进杆状病毒转移载体中,将包括编码在BC环中含有至少一个突变的PCV2ORF2蛋白的编码序列的所述杆状病毒转移载体与杆状病毒DNA在Sf9细胞中共转染,将包括编码不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白的编码序列的所述杆状病毒转移载体与杆状病毒DNA在Sf9细胞中共转染。
更优选地,所述方法另外还包括下述步骤中的一个或多个:通过IFA检查得到的重组杆状病毒对PCV2ORF2蛋白的表达,在Sf+细胞上制备每种重组杆状病毒的扩增储液,通过TCID50方法滴定所述扩增储液以确定杆状病毒滴度。
具体地,在相同的和/或可比较的环境条件下,优选地在杆状病毒表达系统中,本发明的多肽,其为在环中含有至少一个突变的PCV2ORF2蛋白,与不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白相比以更高的量表达。
更具体地,所述不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白是野生型PCV2ORF2蛋白。
优选地,根据本发明的BC环中的至少一个突变是在氨基酸位置58-66的区域中的至少一个突变,且具体地包括在氨基酸位置60-66的区域中1-7个氨基酸残基的缺失、置换和/或添加或者由在氨基酸位置60-66的区域中1-7个氨基酸残基的缺失、置换和/或添加组成。
更优选地,所述BC环中的至少一个突变是在氨基酸位置63处的一个氨基酸残基的缺失、置换和/或添加,其中除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基对在氨基酸位置63处的氨基酸残基的置换是最优选的。
更优选地,除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基对在氨基酸位置63处的氨基酸残基的置换是由天然存在的、优选地遗传学编码的、除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基实现的置换。
在SEQIDNO:10-45中阐述了根据本发明的BC环的优选序列,其包括除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基对在氨基酸位置63处的氨基酸残基的置换。
因而,具体地,根据本发明的BC环中的至少一个突变包含或者是除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基对在氨基酸位置63处的精氨酸残基或赖氨酸残基的置换。
因而,如本文中所述的不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白优选地具有在氨基酸位置63处的精氨酸残基或赖氨酸残基,其然后根据本发明的该优选实施方案被置换,由此产生根据本发明的多肽。
最优选地,本发明的多肽包含选自SEQIDNO:10-45的序列,其中所述序列具体地位于本发明的多肽的序列的氨基酸位置58-66。
根据第三方面(c),本发明的多肽是如本文中所述的根据方面(a)和方面(b)的PCV2ORF2蛋白的任意组合,且因而是这样的任意PCV2ORF2蛋白,其具有:
-在氨基酸位置59处的精氨酸残基或赖氨酸残基,和/或
-在氨基酸位置88处的脯氨酸残基,和/或
-在氨基酸位置151处的苏氨酸残基,和/或
-在氨基酸位置206处的异亮氨酸残基,和/或
-在氨基酸位置232处的天冬酰胺残基,
且具有在氨基酸位置63处的除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基,其中氨基酸位置的编号参考野生型PCV2ORF2蛋白的氨基酸序列;且其特征在于,它(i)在BC环中含有至少一个突变和(ii)优选地与不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白相比以显著更高的量表达。
如在本发明的上下文中描述的,术语“除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的遗传学编码的氨基酸残基”具体地表示选自以下的氨基酸残基(在括号中是单字母代码):丙氨酸残基(A)、天冬氨酸残基(D)、天冬酰胺残基(N)、半胱氨酸残基(C)、谷氨酰胺残基(Q)、谷氨酸残基(E)、苯丙氨酸残基(F)、甘氨酸残基(G)、组氨酸残基(H)、异亮氨酸残基(I)、亮氨酸残基(L)、甲硫氨酸残基(M)、脯氨酸残基(P)、丝氨酸残基(S)、苏氨酸残基(T)、缬氨酸残基(V)、色氨酸残基(W)和酪氨酸残基(Y)。
更特别地,所述除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基选自:具有极性的、但是不带电荷的侧链的氨基酸残基,具有疏水侧链的氨基酸残基,和甘氨酸残基,其中优选地所述具有极性的、但是不带电荷的侧链的氨基酸残基选自:丝氨酸残基、苏氨酸残基、酪氨酸残基、天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基,和/或其中所述具有疏水侧链的氨基酸残基优选地选自:丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、苯丙氨酸残基和色氨酸残基。
最优选地,如在本发明的上下文中提及的,所述除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基选自丝氨酸残基和苏氨酸残基。
在另一个优选的方面,本发明的多肽是重组PCV2ORF2蛋白,诸如重组杆状病毒表达的PCV2ORF2蛋白。
本文中使用的术语“重组PCV2ORF2蛋白”具体地表示从重组DNA分子表达的蛋白分子,诸如通过重组DNA技术生产的多肽。这样的技术的一个例子包括这样的情况:当将编码表达的蛋白的DNA插入合适的表达载体(优选杆状病毒表达载体)中时,所述表达载体又用于转染(或在杆状病毒表达载体的情况下,感染)宿主细胞以产生由所述DNA编码的蛋白或多肽。本文中使用的术语“重组PCV2ORF2蛋白”因而尤其表示从重组DNA分子表达的蛋白分子。
根据一个特定实例,通过具有下述步骤的方法生产重组PCV2ORF2蛋白:将PCV2ORF2的基因克隆进杆状病毒转移载体中;使用所述转移载体通过同源重组在昆虫细胞中制备含有所述基因的重组杆状病毒;和然后在用所述重组杆状病毒感染期间在昆虫细胞中表达PCV2ORF2蛋白。
根据一个可选实例,在昆虫细胞中从重组表达质粒表达重组PCV2ORF2蛋白。在该替代实例的情况下,不需要杆状病毒。
进一步理解,术语“由序列组成的重组PCV2蛋白”具体地也涉及所述序列的任何共翻译修饰和/或翻译后修饰,所述修饰受在其中表达所述多肽的细胞影响。因而,如本文中所述的术语“由序列组成的重组PCV2ORF2蛋白”也涉及这样的序列:其具有由在其中表达所述多肽的细胞实现的一种或多种修饰,尤其是在蛋白生物合成和/或蛋白加工中实现的氨基酸残基的修饰,优选地选自糖基化、磷酸化和乙酰化。
优选地,用杆状病毒表达系统生产或得到根据本发明的重组PCV2ORF2蛋白,特别是在培养的昆虫细胞中。
在另一个优选的方面,本发明的多肽是PCV2b亚型(PCV2b)ORF2蛋白。
在另一个优选的方面,本发明的多肽是包含这样的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成的PCV2ORF2蛋白,所述氨基酸序列与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少90%、优选地至少92%、更优选地至少94%、甚至更优选地至少96%、更优选地至少98%或特别是100%序列相同性。
最优选地,本发明的多肽选自SEQIDNO:6-9的序列,它们也显示在图8中。因而,本发明的多肽优选地选自下述序列(i)-(iv):
(i)MTYPRRRXRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTXGYTXKRTTVXTPSWXVDMMRFNINDFLPPGGGSNPXXVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSXAVILDDNFVTKAXALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDXTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTXGNVDHVGLGTAFENSIYDQxYNIRXTMYVQFREFNLKDPPLNP(SEQIDNO:6),
(ii)MTYPRRRXRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTXGYTXKKTTVXTPSWXVDMMRFNINDFLPPGGGSNPXXVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSXAVILDDNFVTKAXALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDXTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTXGNVDHVGLGTAFENSIYDQxYNIRXTMYVQFREFNLKDPPLNP(SEQIDNO:7),
(iii)MTYPRRRXRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTXGYTXKRTTVXTPSWXVDMMRFNINDFLPPGGGSNPXXVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSXAVILDDNFVTKAXALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDXTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTXGNVDHVGLGTAFENSIYDQxYNIRXTMYVQFREFNLKDPPLNPX(SEQIDNO:8),
(iv)MTYPRRRXRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTXGYTXKKTTVXTPSWXVDMMRFNINDFLPPGGGSNPXXVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSXAVILDDNFVTKAXALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDXTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTXGNVDHVGLGTAFENSIYDQxYNIRXTMYVQFREFNLKDPPLNPX(SEQIDNO:9),
其中在所述序列(i)-(iv)中:
“X”是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的任意氨基酸残基;
“X”是选自A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W和Y的任意氨基酸残基;且
“x”是选自D和E的任意氨基酸残基。
为了解释性目的且在一个非限制性例子中,根据本发明的多肽是由以下序列组成的多肽:
MTYPRRRFRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTIGYTVKKTTVXTPSWNVDMMRFNINDFLPPGGGSNPLTVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVTKANALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDRTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTTGNVDHVGLGTAFENSIYDQDYNIRITMYVQFREFNLKDPPLNPK(SEQIDNO:46),
其中“X”是选自A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W和Y的任意氨基酸残基。
在本发明的另一个优选的方面,如本文中所述的野生型PCV2ORF2蛋白是在SEQIDNO:2中所述的蛋白。
根据另一个方面,本发明还提供了含有本发明的多肽的免疫原性组合物。
根据另一个优选的方面,本发明还提供了一种免疫原性组合物,其含有本发明的多肽和PCV2aORF-2多肽,其中所述PCV2aORF-2多肽优选地是与SEQIDNO:3的序列具有至少94%或优选地至少95%相同性的多肽。
根据另一个方面,本发明还提供了一种多核苷酸,其包含编码本发明的多肽的序列,其中所述根据本发明的多核苷酸优选地是分离的多核苷酸。
为了解释性目的和在一个非限制性实例中,根据本发明的多核苷酸是包含在SEQIDNO:4中所述的序列的多核苷酸。
本文描述的多核苷酸的生产是在本领域的技能内,且可以根据尤其在以下文献中描述的重组技术来进行:Sambrook等人,2001,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY;Amusable,等人,2003,CurrentProtocolsInMolecularBiology,GreenePublishingAssociates&WileyInterscience,NY;Innis等人(编),1995,PCRStrategies,AcademicPress,Inc.,SanDiego;和Erlich(编),1994,PCRTechnology,OxfordUniversityPress,NewYork,它们都通过引用并入本文。
本发明还具体地提供了一种杆状病毒,其含有包含编码本发明的多肽的序列的多核苷酸,其中所述根据本发明的杆状病毒优选地是分离的杆状病毒。
此外,本发明还提供了一种质粒,优选一种表达载体,其含有包含编码本发明的多肽的序列的多核苷酸,其中所述根据本发明的质粒具体地是分离的质粒。
本发明还提供了包含杆状病毒或质粒(优选表达载体)的细胞,所述杆状病毒含有包含编码本发明的多肽的序列的多核苷酸,所述质粒含有包含编码本发明的多肽的序列的多核苷酸,其中所述根据本发明的细胞优选地是分离的细胞。
在另一个方面,本发明也涉及本发明的多肽、根据本发明的杆状病毒、根据本发明的免疫原性组合物、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的质粒和/或根据本发明的细胞用于制备药物(优选疫苗)的用途。
在本上下文中,本发明还提供了产生本发明的多肽的方法,其中所述方法包括用本发明的杆状病毒感染细胞(优选昆虫细胞)的步骤。
此外,本发明还提供了产生本发明的多肽的方法,其中所述方法包括用根据本发明的质粒转染细胞的步骤。
本发明的多肽优选地以足够病毒样颗粒的稳定自装配的高量表达,它们然后可以用于单发(singleshot)疫苗接种,特别当它们被包含在免疫原性组合物中时,由此减少和预防由PCV2的感染(诸如PCV2b和/或PCV2a的感染)造成的临床征象。
本发明因而具体地进一步分别基于本发明的多肽或基于根据本发明的免疫原性组合物,其中所述本发明的多肽或所述包含本发明的多肽的免疫原性组合物可以用于特定目的。
在一个方面,本发明因而涉及本发明的多肽或包含本发明的多肽的免疫原性组合物,其用在用于以下目的的方法中:治疗或预防PCV2感染,减轻、预防或治疗由PCV2的感染造成的临床征象,或预防或治疗由PCV2的感染造成的疾病。
本发明还提供了用于以下目的的方法:治疗或预防PCV2感染,减轻、预防或治疗由PCV2的感染造成的临床征象,或预防或治疗由PCV2的感染造成的疾病,所述方法包括将本发明的多肽或包含本发明的多肽的免疫原性组合物施用给动物,特别是有此需要的动物。
本发明还提供了本发明的多肽或包含本发明的多肽的免疫原性组合物用于制备药物的用途,所述药物用于治疗或预防PCV2的感染,减轻、预防或治疗由PCV2的感染造成的临床征象,或治疗或预防由PCV2的感染造成的疾病。
在一个优选的方面,如本文中所述的PCV2的感染是PCV2b亚型(PCV2b)的感染和/或除了2b亚型以外的亚型的PCV2的感染。
本文中使用的术语“PCV2的感染”等同于术语“PCV2感染”。
具体地,如在本文中提及的除了2b亚型以外的亚型的PCV2的感染是PCV2a亚型(PCV2a)和/或PCV2c亚型(PCV2c)的感染,且优选地是PCV2a的感染。
如本文中所述的术语“PCV2b亚型(PCV2b)ORF2蛋白”涉及关于PCV2基因型定义的标准化命名法定义的PCV-2b的ORF2基因所编码的蛋白(Segales,J.等人,2008,PCV-2genotypedefinitionandnomenclature,VetRec162:867-8),其通过引用并入本文)。
根据另一个优选的方面,如本文中所述的除了2b亚型以外的亚型的PCV2的感染是以下PCV2的同时感染:(i)除了2b亚型以外的亚型的PCV2,和(ii)PCV2b,尤其是PCV2a和PCV2b的同时感染。
如本文中所述的术语“PCV2a”、“PCV2b”和“PCV2c”分别涉及分别根据关于PCV2基因型定义的标准化命名法的PCV-2a、PCV-2b和PCV-2c(Segales,J.等人,2008,PCV-2genotypedefinitionandnomenclature,VetRec162:867-8,其通过引用并入本文)。
具体地,如在本文中提及的PCV2b的感染是以下PCV2的感染:(i)PCV2,其包含与SEQIDNO:2的序列具有至少94%、优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%和最优选地至少99%相同性的多肽,或(ii)包含多核苷酸的PCV2,所述多核苷酸包含编码多肽的序列,所述多肽与SEQIDNO:2的序列具有至少94%、优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%和最优选地至少99%相同性。
特别理解,本文中使用的术语“与SEQIDNO:X的序列相同”分别等同于术语“在SEQIDNO:X的长度上与SEQIDNO:X的序列相同”或等同于术语“在SEQIDNO:X的整个长度上与SEQIDNO:X的序列相同”。在该背景下,“X”是选自1-3的任意整数,使得“SEQIDNO:X”代表在本文中提及的SEQIDNO中的任一个。
优选地,如本文中所述的PCV2a的感染是以下PCV2的感染:(i)PCV2,其包含与SEQIDNO:3的序列具有至少94%、优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%和最优选地至少99%相同性的多肽,或(ii)包含多核苷酸的PCV2,所述多核苷酸包含编码多肽的序列,所述多肽与SEQIDNO:3的序列具有至少94%、优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%和最优选地至少99%相同性。
优选地,在本发明的上下文中,PCV2感染的治疗或预防是基于或包含针对所述PCV2的免疫应答的诱导,或者由针对所述PCV2的免疫应答的诱导组成,如在本文中提及的临床征象选自淋巴耗竭、淋巴炎症、淋巴组织的PCV2抗原的阳性IHC、病毒血症、鼻脱落、发热、减小的平均日体重增加、肺部炎症、肺组织的PCV2抗原的阳性IHC,和/或如在本文中提及的疾病是PMWS。
具体地,在本发明的上下文中,除了2b以外的亚型的PCV2的感染的治疗或预防是基于或包含针对所述除了2b以外的亚型的PCV2的免疫应答的诱导或者针对所述除了2b以外的亚型的PCV2和PCV2b的免疫应答的同时诱导,或者由所述诱导或者同时诱导组成。
本文中使用的术语“预防”或“减轻”分别是指,但不限于,包括给动物施用被包括在本发明的组合物中的PCV2抗原(即本发明的多肽)的过程,其中所述PCV2抗原当施用给所述动物时在所述动物中引起或能够引起针对PCV2的免疫应答。总之,这样的治疗分别导致由PCV2造成的疾病的临床征象或与PCV2感染有关的临床征象的减轻。更具体地,本文中使用的术语“预防”或“阻止”通常是指这样的预防方法,其中在由PCV2造成的疾病过程的诱导或发作之前将动物暴露于本发明的免疫原性组合物。
在本文中,“与PCV2感染有关的临床征象的减轻”是指,但不限于,与野生型感染相比,减少组中受感染的对象的数目,减少或消除表现出感染的临床征象的对象的数目,或减轻在对象中存在的任何临床征象的严重程度。例如,它应当表示病原体载量的任何减小、病原体脱落、病原体传播的减小、或PCV2感染的任何临床征候迹象的减小。优选地,与没有接受所述组合物且可能变得受感染的对象相比,这些临床征象在接受本发明的组合物的对象中减小了至少10%。更优选地,临床征象在接受本发明的组合物的对象中减小了至少20%,优选地至少30%,更优选地至少40%,且甚至更优选地至少50%。
术语“病毒血症的减轻”是指,但不限于,进入动物血流中的PCV2病毒的减少,其中与没有接受所述组合物且可能变得受感染的对象相比,病毒血症水平(即,每mL血清的PCV2RNA拷贝的数目或每分升血清的噬斑形成集落的数目)在接受本发明的组合物的对象的血清中降低了至少50%。更优选地,病毒血症水平在接受本发明的组合物的对象中降低了至少90%,优选地至少99.9%,更优选地至少99.99%,且甚至更优选地至少99.999%。
本文中使用的术语“病毒血症”具体地理解为这样的病症:其中PCV2颗粒在动物的血流中繁殖和循环。
本文中使用的术语“动物”具体地涉及哺乳动物,优选地涉及猪(swine),更优选地涉及家猪(pig),最优选地涉及小猪。
根据本发明的一个特别优选的方面,本发明的多肽或根据本发明的免疫原性组合物仅施用一次。
优选地,在本发明的上下文中,分别要将或将本发明的多肽或根据本发明的免疫原性组合物施用给动物尤其仅一次,优选地施用给猪(swine),更优选地施用给家猪(pig),特别优选地施用给小猪。
本发明克服了现有技术中固有的问题,并提供了技术水平的显著进步。根据另一个方面,本发明也提供了一种用于在动物(优选具有抗-PCV2抗体的动物)中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象的方法,所述方法包括下述步骤:给需要这种治疗的动物施用有效量的本发明的多肽或根据本发明的免疫原性组合物。
本文中使用的术语“疫苗”或“免疫原性组合物”(两个术语同义地使用)表示含有本发明的多肽的任何药物组合物,所述组合物可以用于预防或治疗对象中的PCV2感染相关的疾病或病症。一种优选的免疫原性组合物可以诱导、刺激或增强针对PCV2的免疫应答。该术语因而包括如下所述的两种亚单位免疫原性组合物,以及含有完整的杀死的或减毒的和/或灭活的PCV2b突变体的组合物。
特别理解,如本文中所述的术语“PCV2b突变体”涉及包含本发明的多肽和/或根据本发明的多核苷酸的PCV2b突变体。
根据另一个方面,本发明也提供了一种用于在动物(优选具有抗-PCV2抗体、特别是母体衍生的抗-PCV2抗体的动物)中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象的方法,所述方法包括下述步骤:给需要这种治疗的动物施用有效量的本发明的多肽或包含本发明的多肽的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物是亚单位免疫原性组合物,含有完整的杀死的或减毒的和/或灭活的PCV2b的组合物。
本文中使用的术语“亚单位免疫原性组合物”表示这样的组合物:其含有至少一种从得自PCV2b突变体的抗原衍生出的或与得自PCV2b突变体的抗原同源的免疫原性多肽或抗原,但是并非所有这样的抗原。这样的组合物基本上不含有完整的PCV2b突变体。因而,从至少部分地纯化的或分级分离的(优选地基本上纯化的)得自PCV2b突变体的免疫原性多肽或其重组类似物制备“亚单位免疫原性组合物”。一种亚单位免疫原性组合物可以包含一种或多种目标亚单位抗原,其基本上不含有得自PCV2b突变体的其它抗原或多肽,或呈分级分离的形式。一种优选的免疫原性的亚单位组合物包含如本文中所述的本发明的多肽。
“免疫应答”是指但不限于在宿主中出现对目标组合物或疫苗的细胞的和/或抗体介导的免疫应答。通常,“免疫应答”包括但不限于下述效应中的一种或多种:产生或激活抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性的T细胞,它们特异性地针对目标组合物或疫苗中所含的一种或多种抗原。优选地,宿主会表现出治疗性或保护性免疫学(记忆)应答,从而增强对新感染的抵抗和/或减轻疾病的临床严重程度。这样的保护将由以下现象证实:与PCV2感染(特别是PCV2亚型b(PCV2b)的感染和/或除了亚型2b以外的亚型的PCV2的感染)有关的征象的数目或严重程度的减小或一种或多种所述征象的缺乏,病毒血症发作的延迟,病毒持久性的减弱,总病毒载量的减少和/或病毒排出的减少。
本文中使用的术语“抗原”表示引发如上所述的免疫学应答的氨基酸序列。
根据另一个方面,本文中使用的免疫原性组合物最优选地包含由根据本发明的多肽表达的本发明的多肽或其片段。本发明的一种优选的多肽是SEQIDNO:1的多肽。但是,本领域技术人员会理解,该序列可以在序列同源性方面变化多达1-5%且仍然保留使它可用于根据本发明的免疫原性组合物中的抗原特征。
如本领域已知的,“序列相同性”表示两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列(即参照序列和要与该参照序列对比的给定序列)之间的关系。在给定序列与参照序列已经最佳地比对以产生最高的序列相似性程度以后,通过将给定序列与参照序列进行对比来确定序列相同性,如通过这样的序列串之间的匹配来确定的。在这样的比对后,在逐个位置的基础上确定序列相同性,例如,如果在某个位置处核苷酸或氨基酸残基是相同的,则序列在该特定位置是“相同的”。然后将这样的位置相同性的总数除以参照序列中的核苷酸或残基的总数以得到序列相同性百分比。通过已知方法可以容易地计算序列相同性,所述已知方法包括、但不限于在以下文献中描述的那些方法:ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.N.,编,OxfordUniversityPress,NewYork(1988),Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,编,AcademicPress,NewYork(1993);ComputerAnalysisofSequenceData,PartI,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编,HumanaPress,NewJersey(1994);SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinge,G.,AcademicPress(1987);SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编,M.StocktonPress,NewYork(1991);和Carillo,H.,和Lipman,D.,SIAMJ.AppliedMath.,48:1073(1988),它们的教导通过引用并入本文。确定序列相同性的优选方法被设计成给出所试验的序列之间的最大匹配。确定序列相同性的方法被编入可公开得到的在其中确定给定序列之间的序列相同性的计算机程序中。这样的程序的例子包括、但不限于GCG程序包(Devereux,J.,等人,NucleicAcidsResearch,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Molec。Biol.,215:403-410(1990)。BLASTX程序可公开得自NCBI和其它来源(BLASTManual,Altschul,S.等人,NCVINLMNIHBethesda,MD20894,Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990),它们的教导通过引用并入本文)。这些程序利用默认间隙权重最佳地比对序列以产生给定序列与参照序列之间的最高序列相同性水平。作为示例,就包含相对于参照核苷酸序列具有至少例如85%、优选地90%、甚至更优选地95%“序列相同性”的核苷酸序列的多核苷酸而言,意味着除了给定多核苷酸序列可能包括至多15个、优选地至多10个、甚至更优选地至多5个点突变/参照核苷酸序列的每100个核苷酸外,该给定多核苷酸的核苷酸序列与参照序列是同一的。换而言之,在具有相对于参照核苷酸序列具有至少85%、优选地90%、甚至更优选地95%相同性的核苷酸序列的多核苷酸中,所述参照序列中至多15%、优选地10%、甚至更优选地5%的核苷酸可以被缺失或被另一种核苷酸置换,或参照序列中总核苷酸的至多15%、优选地10%、甚至更优选地5%的数目的核苷酸可以插入参照序列中。参照序列的这些突变可以发生在参照核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的任何地方,其个别地散布于参照序列的核苷酸之间或散布于参照序列内的一个或多个邻近组中。类似地,就包含相对于参照氨基酸序列具有至少例如85%、优选地90%、甚至更优选地95%序列相同性的给定氨基酸序列的多肽而言,意味着除给定多肽序列可能包含至多15个、优选地至多10个、甚至更优选地至多5个氨基酸改变/参照氨基酸序列的每100个氨基酸外,多肽的给定氨基酸序列与参照序列是同一的。换而言之,为获得与参照氨基酸序列具有至少85%、优选地90%、甚至更优选地95%序列相同性的给定多肽序列,参照序列中至多15%、优选地至多10%、甚至更优选地至多5%的氨基酸残基可以被缺失或被另一种核苷酸置换,或参照序列中氨基酸残基的总数的至多15%、优选地至多10%、甚至更优选地至多5%的数目的氨基酸可以插入参照序列中。参照序列的这些改变可能发生在参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置之间的任何地方,其个别地散布于参照序列的残基之间或散布于参照序列内的一个或多个邻近组中。优选地,不同一的残基位置因保守氨基酸置换而不同。但是,当确定序列相同性时,保守置换并不作为匹配包括在内。
本文中使用的“序列同源性”表示确定两个序列的相关性的方法。为了确定序列同源性,将两个或更多个序列最佳地比对,且如果必要的话引入间隙。但是,与“序列相同性”不同,在确定序列同源性时将保守氨基酸置换计数为匹配。换而言之,为了获得与参照序列具有95%序列同源性的多肽或多核苷酸,参照序列中85%、优选地90%、甚至更优选地95%的氨基酸残基或核苷酸必须匹配另一个氨基酸或核苷酸或者包含另一个氨基酸或核苷酸的保守置换,或参照序列中总氨基酸残基或核苷酸(不包括保守置换)的至多15%、优选地至多10%、甚至更优选地至多5%的数目的氨基酸或核苷酸可能插入参照序列中。优选地,同源序列包含至少50个、甚至更优选地至少100个、甚至更优选地至少250个和甚至更优选地至少500个核苷酸的片段。
“保守置换”表示氨基酸残基或核苷酸被另一个具有相似特征或特性(包括尺寸、疏水性等)的氨基酸残基或核苷酸置换,使得整体功能未显著改变。
“分离的”是指“通过人工”从它的天然状态改变,即,如果它天然存在,它已经从它的起始环境改变或移出,或二者。例如,天然存在于活生物体内的多核苷酸或多肽不是“分离的”,但是与它的天然状态的共存物质分离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”,如本文中所使用的术语。
因而,根据另一个方面,本发明也提供了一种用于在动物(优选具有抗-PCV2抗体、特别是母体衍生的抗-PCV2抗体的动物)中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象的方法,所述方法包括下述步骤:给需要这种治疗的动物施用有效量的本发明的多肽或包含本发明的多肽的免疫原性组合物,其中所述本发明的多肽是本文描述的那些中的任一种。优选地,本发明蛋白的多肽是:(i)包含SEQIDNO:1的序列或者由其组成的多肽;或者(ii)与(i)的多肽具有至少95%同源性的任意多肽。
根据另一个方面,本发明的多肽以有效诱导期望的免疫应答的蛋白包含水平提供在免疫原性组合物中,所述诱导期望的免疫应答即减少由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的一种或多种临床征象的发生,减轻所述一种或多种临床征象的严重程度,或防止或减少所述一种或多种临床征象。优选地,本发明的多肽的包含水平是至少0.2μg蛋白/ml最终的免疫原性组合物(μg/ml),更优选约0.2至约400μg/ml,更优选约0.3至约200μg/ml,甚至更优选约0.35至约100μg/ml,更优选约0.4至约50μg/ml,更优选约0.45至约30μg/ml,更优选约0.5至约18μg/ml,甚至更优选约0.6至约15μg/ml,甚至更优选约0.75至约8μg/ml,甚至更优选约1.0至约6μg/ml,更优选约1.3至约3.0μg/ml,甚至更优选约1.4至约2.5μg/ml,甚至更优选约1.5至约2.0μg/ml,和最优选约1.6μg/ml。
根据另一个方面,所述蛋白包含水平是至少0.2μg如上所述的PCV2bORF-2蛋白/剂最终的免疫原性组合物(μg/剂),更优选约0.2至约400μg/剂,更优选约0.3至约200μg/剂,甚至更优选约0.35至约100μg/剂,更优选约0.4至约50μg/剂,更优选约0.45至约30μg/剂,更优选约0.5至约18μg/剂,甚至更优选约0.6至约15μg/ml,甚至更优选约0.75至约8μg/剂,甚至更优选约1.0至约6μg/剂,更优选约1.3至约3.0μg/剂,甚至更优选约1.4至约2.5μg/剂,甚至更优选约1.5至约2.0μg/剂,和最优选约1.6μg/剂。并且,小于20μg/剂、优选地约0.5-18μg/剂的本发明的多肽的包含水平(抗原含量)适合于在年轻动物中和/或在PCV2抗体阳性的(特别是母体衍生的抗-PCV2抗体阳性的)动物中赋予免疫。因而,根据另一个方面,本发明也提供了一种在动物(优选具有抗-PCV2抗体、特别是母体衍生的抗-PCV2抗体的动物)中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象的方法,所述方法包括下述步骤:给需要这种治疗的该动物施用小于20μg/剂、优选约0.5-18μg/剂的本发明的多肽或包含本发明的多肽的免疫原性组合物。本发明的多肽是在该专利申请中描述的任一种。
在根据本发明的免疫原性组合物中使用的本发明的多肽可以以任意方式衍生出,所述方式包括分离和纯化本发明的多肽、标准的蛋白合成和重组方法学。用于得到本发明的多肽的优选方法提供在WO06/072065中,其教导和内容特此通过引用整体并入,因为已经令人惊讶地发现,其中描述的用于得到PCV2aORF-2多肽的方法可以相应地用于得到本发明的多肽。简而言之,用含有编码本发明的多肽的DNA编码序列的重组病毒载体感染敏感细胞,所述重组病毒表达本发明蛋白的多肽,并通过过滤从上清液回收表达的本发明的多肽,并通过任意常规方法灭活,优选地使用二乙烯亚胺二乙烯亚胺(binaryethylenimine),然后将其中和以停止灭活过程。
本文中使用的免疫原性组合物也表示这样的组合物,其包含i)上述任何本发明的多肽,优选地以上述浓度;和ii)至少一部分表达所述本发明多肽的病毒载体(优选重组杆状病毒)。此外,该免疫原性组合物可以包含i)上述任何本发明的多肽,优选地以上述浓度,ii)至少一部分表达所述本发明多肽的病毒载体(优选重组杆状病毒),和iii)一部分细胞培养物上清液。
因而,根据另一个方面,本发明也提供了一种在动物(优选具有抗-PCV2抗体、特别是母体衍生的抗-PCV2抗体的动物)中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象的方法,所述方法包括下述步骤:给需要这种治疗的动物施用有效量的本发明的多肽或包含本发明的多肽的免疫原性组合物,其中所述本发明的多肽是重组的、优选杆状病毒表达的、本发明的多肽。优选地,那些重组的或杆状病毒表达的本发明的多肽具有如上所述的序列。
本文中使用的免疫原性组合物也表示这样的组合物,其包含i)上述任何本发明的多肽,优选地以上述浓度,ii)至少一部分表达所述本发明多肽的病毒载体(优选重组杆状病毒),和iii)一部分细胞培养物;其中约90%的组分具有小于1μm的尺寸。
本文中使用的免疫原性组合物也表示这样的组合物,其包含i)上述任何本发明的多肽,优选地以上述浓度,ii)至少一部分表达所述本发明多肽的病毒载体,iii)一部分细胞培养物,iv)和用于灭活重组病毒载体的灭活剂,优选BEI,其中约90%的组分i)至iii)具有小于1μm的尺寸。优选地,BEI以有效地灭活杆状病毒的浓度存在,优选地以2至约8mMBEI的量,优选约5mMBEI。
本文中使用的免疫原性组合物也表示这样的组合物,其包含i)上述任何本发明的多肽,优选地以上述浓度,ii)至少一部分表达所述本发明多肽的病毒载体,iii)一部分细胞培养物,iv)用于灭活重组病毒载体的灭活剂,优选BEI,和v)用于停止由所述灭活剂介导的灭活的中和剂,其中约90%的组分i)至iii)具有小于1μm的尺寸。优选地,如果所述灭活剂是BEI,所述组合物包含与BEI相当的量的硫代硫酸钠。
将所述蛋白掺入可施用给易受PCV2感染的动物的组合物中。在优选形式中,所述组合物还可以包括本领域技术人员已知的额外组分(也参见Remington'sPharmaceuticalSciences.(1990).第18版,MackPubl.,Easton)。另外,所述组合物可以包括一种或多种兽医学可接受的载体。本文中使用的“兽医学可接受的载体”包括任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等。在一个优选的实施方案中,所述免疫原性组合物包含随同提供的本发明的多肽,优选地以上述浓度,将其与佐剂(优选卡波普(Carbopol))和生理盐水混合。
本领域技术人员会理解,本文所用的组合物可以包含已知的可注射的生理学上可接受的无菌溶液。为了制备用于胃肠外注射或输注的现成即可使用的溶液,水性等渗溶液(例如盐水或相应的血浆蛋白溶液)是容易得到的。另外,本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物可以包括稀释剂、等渗剂、稳定剂或佐剂。稀释剂可以包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂可以尤其包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱盐。
本文中使用的“佐剂”可以包括氢氧化铝和磷酸铝;皂苷,例如QuilA、QS-21(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL);油包水乳剂;水包油乳剂;水包油包水乳剂。所述乳剂可以尤其基于轻质液体石蜡油(欧洲药典类型);类异戊二烯油,诸如由烯烃(尤其是异丁烯或癸烯)的寡聚化产生的角鲨烷或角鲨烯油;含有直链烷基的酸或醇的酯,更具体地为植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯;支链脂肪酸或醇的酯,尤其是异硬脂酸酯。所述油与乳化剂组合使用以形成乳剂。所述乳化剂优选地是非离子型表面活性剂,具体地是脱水山梨糖醇的酯、二缩甘露醇的酯(例如失水甘露醇油酸酯)、二醇的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯(它们任选地乙氧基化),和聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段,具体地是普流尼克(Pluronic)产品,尤其是L121。参见Hunter等人,TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants(Stewart-Tull,D.E.S.编).JohnWileyandSons,NY,第51-94页(1995)和Todd等人,Vaccine15:564-570(1997)。
例如,可能使用在“VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach”(M.Powell和M.Newman编,PlenumPress,1995)的第147页上描述的SPT乳剂和在该书的第183页上描述的乳剂MF59。
佐剂的另一个例子是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物,其尤其与糖或多元醇的聚烯基醚交联。通过术语卡波姆(Pharmeuropa第8卷,第2期,1996年6月)已知这些化合物。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462,其描述了与聚羟基化的化合物交联的这类丙烯酸聚合物,所述聚羟基化的化合物具有至少3个(优选地不超过8个)羟基,至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂族残基替换。优选的残基是含有2-4个碳原子的那些,例如,乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团。所述不饱和残基自身可以含有其它取代基诸如甲基。在名称Carbopol(BFGoodrich,Ohio,USA)下出售的产品是特别合适的。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联。其中可以提及Carbopol974P、934P和971P。最优选的是使用Carbopol,尤其是使用Carbopol971P,优选地以约500μg至约5mg/剂的量使用,甚至更优选地以约750μg至约2.5mg/剂的量使用,且最优选地以约1mg/剂的量使用。
其它合适的佐剂尤其包括、但不限于RIBI佐剂系统(RibiInc.)、嵌段共聚物(CytRx,AtlantaGA)、SAF-M(Chiron,EmeryvilleCA)、单磷酰脂质A、阿夫立定脂质-胺佐剂、得自大肠杆菌(E.coli)(重组体或其它方式)的热不稳定的肠毒素、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰二肽。
优选地,所述佐剂以约100μg至约10mg/剂的量添加。甚至更优选地,所述佐剂以约100μg至约10mg/剂的量添加。甚至更优选地,所述佐剂以约500μg至约5mg/剂的量添加。甚至更优选地,所述佐剂以约750μg至约2.5mg/剂的量添加。最优选地,所述佐剂以约1mg/剂的量添加。
另外,所述组合物可以包括一种或多种药学上可接受的载体。本文中使用的“药学上可接受的载体”包括任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等。最优选地,由此提供的组合物含有从体外培养的细胞的上清液回收的本发明的多肽,其中所述细胞被含有编码本发明的多肽的DNA且表达所述本发明的多肽的重组病毒载体感染,且其中用约2至约8mMBEI、优选地用约5mMBEI(以灭活病毒载体)和等效浓度的中和剂(优选硫代硫酸钠溶液,终浓度为约2至约8mM,优选约5mM)处理所述细胞培养物。
本发明也涉及一种免疫原性组合物,其包含i)上述任何的本发明的多肽,优选地以上述浓度,ii)至少一部分表达所述本发明多肽的病毒载体,iii)一部分细胞培养物,iv)用于灭活重组病毒载体的灭活剂,优选BEI,和v)用于停止由所述灭活剂介导的灭活的中和剂,优选与BEI相当的量的硫代硫酸钠;和vi)合适的佐剂,优选上述量的Carbopol971;其中约90%的组分i)至iii)具有小于1μm的尺寸。根据另一个方面,该免疫原性组合物还包含药学上可接受的盐,优选生理上可接受的浓度的磷酸盐。优选地,将所述免疫原性组合物的pH调至生理pH,这是指在约6.5至7.5之间。
本文中使用的免疫原性组合物也表示这样的组合物,其每1ml包含:(i)至少1.6μg上述的本发明的多肽,优选地小于20μg,(ii)至少一部分表达所述本发明的多肽的杆状病毒,(iii)一部分细胞培养物,(iv)约2-8mMBEI,(v)与BEI相当的量的硫代硫酸钠;和(vi)约1mgCarbopol971,和(vii)生理上可接受的浓度的磷酸盐;其中约90%的组分(i)至(iii)具有小于1μm的尺寸,且将所述免疫原性组合物的pH调至约6.5-7.5。
所述免疫原性组合物可以进一步包括一种或多种其它免疫调节剂,例如,白介素、干扰素或其它细胞因子。所述免疫原性组合物还可以包括庆大霉素(Gentamicin)和硫柳汞(Merthiolate)。尽管技术人员可以容易地确定在本发明的上下文中有用的佐剂和添加剂的量和浓度,但是本发明预见到包含约50μg至约2000μg佐剂和优选约250μg/ml剂量的疫苗组合物的组合物。因而,本文中使用的免疫原性组合物也表示这样的组合物,其包含约1ug/ml至约60μg/ml的抗生素,且更优选地小于约30μg/ml的抗生素。
本文中使用的免疫原性组合物也表示这样的组合物,其包含(i)上述任何的本发明的多肽,优选地以上述浓度;(ii)至少一部分表达所述本发明多肽的病毒载体;(iii)一部分细胞培养物;(iv)用于灭活重组病毒载体的灭活剂,优选BEI;和(v)用于停止由所述灭活剂介导的灭活的中和剂,优选地与BEI相当的量的硫代硫酸钠;(vi)合适的佐剂,优选上述量的Carbopol971;(vii)药学上可接受的浓度的盐水缓冲液,优选磷酸盐的药学上可接受的浓度的盐水缓冲液;和(viii)抗-微生物活性剂;其中约90%的组分(i)至(iii)具有小于1μm的尺寸。
为了研究母体抗体对本发明的多肽的可能干扰,可以实施一项研究,其中在疫苗接种时确定研究动物的抗体滴度,随后将所述抗体滴度分成低、中和高抗体等级:<1:100的几何平均滴度视为低抗体滴度,1:100至1:1000的滴度视为中抗体滴度,且>1:1000的滴度视为高抗体滴度。该分组方式可与在Canadian现场研究中实施的分组方式相当,在Canadian现场研究中1:80的抗体滴度视为低,1:640的抗体滴度视为中,且>1:1280的抗体滴度视为高(Larochelle等人,2003,Can.J.Vet.Res.;67:114-120)。为了分析疫苗接种时低、中和高抗体滴度对病毒血症的影响,将接种疫苗的和安慰剂治疗的动物关于病毒血症的发作、终点、持续时间、阳性取样天数和病毒载量进行比较。抗-PCV2抗体、尤其是母体衍生的抗体的存在优选地对那些参数中的任一种没有显著影响。换而言之,本发明的多肽在预防和治疗动物的PCV2感染中或者在减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象中的效力,优选地不受疫苗接种当天抗-PCV2抗体的存在影响,优选地不受高达1:100、优选地超过1:100、甚至更优选地超过1:250、甚至更优选地超过1:500、甚至更优选地1:640、甚至更优选地超过1:750、最优选地超过1:1000的抗-PCV2抗体滴度影响。该效应可以在单发疫苗接种实验中证实,这意味着,本发明的多肽仅施用一次且没有本发明的多肽的任何后续施用。
用于检测和定量抗-PCV2抗体的方法是本领域众所周知的。例如,通过在Magar等人,2000,Can.J.VetRes.;64:184-186或Magar等人,2000,J.Comp.Pathol.;123:258-269中描述的间接免疫荧光法,可以执行PCV2抗体的检测和定量。用于定量抗-PCV2抗体的其它测定描述在Opriessnig等人,2006,37thAnnualMeetingoftheAmericanAssociationofSwineVeterinarians中。此外,本领域技术人员可以使用的间接免疫荧光测定包括以下步骤:将约20.000-60.000PK15或VIDOR1个细胞/孔接种到96孔板上;当单层是大约65-85%汇合时,用PCV2分离物感染细胞;将被感染的细胞温育48小时;除去培养基并用PBS洗涤细胞2次;抛弃洗涤缓冲液和用冷的50/50甲醇/丙酮固定剂(~100μl/孔)在约-20℃处理细胞约15min;抛弃固定剂并风干平板;制备猪血清样品在PBS中的系列稀释物和抗-PCV2阳性和阴性对照样品(阳性对照和阴性对照样品)的系列稀释物;将所述系列稀释物加入平板中并温育以允许抗体结合(如果存在于血清样品中的话)约1小时。在36.5±1℃,将平板用PBS洗涤3次并抛弃PBS;将平板用在PBS中1:100稀释的市售的山羊抗-猪FITC缀合物染色并温育约1小时。在36.5±1℃,从培养箱取出微量培养板,将缀合物抛弃,并将平板用PBS洗涤2次;使用UV显微术读出平板,并将各个孔报告为阳性或阴性,其中使用阳性对照和阴性对照样品来监测试验系统;并使用表现出特异性IFA反应性的最高稀释度和每个稀释度的阳性孔的数目计算血清抗体滴度,或使用适当的Reed-Muench公式计算50%端点。
这样的测定描述在WO2008/076915A2的实施例2中。
在有争议的结果和任何疑惑问题的情况下,如在本文中提及的抗-PCV2滴度表示通过该测定估计/可估计的那些。
因而,根据另一个方面,本发明提供了一种用于在动物(优选具有抗-PCV2抗体、特别是母源抗体的动物)中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象的方法,所述方法包括下述步骤:给需要这种治疗的该动物施用有效量的本发明的多肽,优选地小于20μg/剂,其中所述动物具有高达1:100、优选地超过1:100、甚至更优选地超过1:250、甚至更优选地超过1:500、甚至更优选地1:640、甚至更优选地超过1:750、最优选地超过1:1000的可检测的抗-PCV2抗体滴度。优选地,那些抗-PCV2抗体滴度在特定抗-PCV2免疫测定中是可检测的和可计量的,优选地在如上所述的测定中,如在WO2008/076915A2的实施例2中示例性地描述的。更优选地,那些抗-PCV-2抗体是母体衍生的抗体。最优选地,本发明的多肽仅施用一次,优选地以小于20μg/剂的剂量。
具有仅低滴度(<1:100)或中滴度(<1:1000)的母体衍生的抗-PCV2抗体的小猪不足以被保护免于在3周龄前发生的PCV2感染。因此,期望在生命的非常早期接种疫苗。在本发明的上下文中,在3周龄时或之前对动物的疫苗接种/处理是优选的。此外,不管现有初始抗体滴度的水平如何,超过1:1000的抗-PCV2抗体滴度优选地对PCV2疫苗的效力没有影响。例如,与未接种疫苗的对照动物相比,高滴度动物(>1:1000的抗-PCV2抗体滴度)的疫苗接种优选地导致更短的病毒血症持续时间、提前的病毒血症终点、更少的病毒血症取样天数和基因组等效物数/ml的总数的减小。在对比接种疫苗的“高”、“中”和“低滴度动物”后,关于PCV2病毒血症的不同参数优选地未观察到显著差异。还在有抗-PCV2抗体滴度存在下,用于疫苗接种的本发明的多肽优选地仍然显著减轻血液中的病毒血症(病毒血症的终点、病毒血症的持续时间、病毒载量)。优选地,当对比接种疫苗组的低和高滴度动物时,关于活体重未发现差异。此外,与具有初始高抗体滴度的、安慰剂治疗的动物相比,在疫苗接种/处理时具有高抗-PCV2抗体滴度(>1:1000)的接种疫苗的动物也优选地在病毒血症发作后显示显著更高的体重。结果,根据一个优选的方面,可能对1日龄或更大的动物用本发明的多肽实施疫苗接种/处理。但是,疫苗接种应当在前8周龄、优选地在前7周龄内实施。因此,根据另一个方面,本发明提供了一种在动物中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象的方法,所述方法包括下述步骤:在1日龄或稍后、优选地但不迟于8周龄给需要这种治疗的该动物施用有效量的本发明的多肽。根据一个优选的实施方案,在这样的动物中赋予免疫需要小于20μg/剂的本发明的多肽。根据一个更优选的实施方案,给需要这种治疗的动物仅施用一次本发明的多肽,优选地小于20μg/剂的本发明的多肽。
根据另一个更一般的方面,本发明提供了一种在年轻动物中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象的方法,所述方法包括下述步骤:给需要这种治疗的该动物施用有效量的本发明的多肽。
本文中使用的术语“年轻动物”.表示1-22日龄的动物。优选地,术语年轻动物是指1-20日龄的动物。更优选地,术语年轻动物是指1-15日龄的动物,甚至更优选为1-14日龄的动物,甚至更优选为1-12日龄的动物,甚至更优选为1-10日龄的动物,甚至更优选为1-8日龄的动物,甚至更优选为1-7日龄的动物,甚至更优选为1-6日龄的动物,甚至更优选为1-5日龄的动物,甚至更优选为1-4日龄的动物,甚至更优选为1-3日龄的动物,甚至更优选为1或2日龄的动物,最优选为1日龄的动物。因而,根据另一个方面,本发明提供了一种在年轻动物中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象的方法,所述方法包括下述步骤:将有效量的本发明的多肽施用给需要这种治疗的1-22日龄、优选1-20日龄、更优选1-15日龄、甚至更优选1-14日龄、甚至更优选1-12日龄、甚至更优选1-10日龄、甚至更优选1-8日龄、甚至更优选1-7日龄、甚至更优选1-6日龄、甚至更优选1-5日龄、甚至更优选1-4日龄、甚至更优选1-3日龄、甚至更优选1或2日龄、最优选1日龄的动物。例如,在19-22日龄的疫苗接种/处理优选地显示出高疫苗接种效力。此外,在12-18、优选12-14日龄的疫苗接种/处理优选地非常有效地减轻与PCV2感染有关的临床征象、减少总病毒载量、缩短病毒血症的持续时间、延迟病毒血症的发作、增加体重。此外,在1周龄的疫苗接种优选地非常有效地减轻与PCV2感染有关的临床征象、减少总病毒载量、缩短病毒血症的持续时间、延迟病毒血症的发作、增加体重。优选地,在那些年轻动物中赋予免疫需要小于20μg/剂的本发明的多肽。根据一个更优选的实施方案,给需要这种治疗的年轻动物仅施用一次本发明的多肽,优选地小于20μg。
由于PCV2在野外普遍存在,大部分年轻小猪就PCV2而言是血清阳性的。因而,根据另一个方面,本发明提供了一种在年轻动物(优选在疫苗接种当天具有抗-PCV2抗体的动物)中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象的方法,所述方法包括下述步骤:将有效量的本发明的多肽施用给需要这种治疗的1-22日龄、优选1-20日龄、更优选1-15日龄、甚至更优选1-14日龄、甚至更优选1-12日龄、甚至更优选1-10日龄、甚至更优选1-8日龄、甚至更优选1-7日龄、甚至更优选1-6日龄、甚至更优选1-5日龄、甚至更优选1-4日龄、甚至更优选1-3日龄、甚至更优选地在1或2日龄、最优选1日龄的动物。优选地,所述年轻动物在疫苗接种/处理当天具有高达1:100的可检测的抗-PCV2抗体滴度,优选地在疫苗接种/处理当天超过1:100、甚至更优选地超过1:250、甚至更优选地超过1:500、甚至更优选1:640、甚至更优选地超过1:750、最优选地超过1:1000。优选地,在那些年轻动物中赋予足够的免疫需要小于20μg/剂的本发明的多肽。根据更优选的实施方案,给需要这种治疗的年轻动物仅施用一次本发明的多肽,优选地小于20μg。
如上所述,用本发明的多肽对年轻动物的疫苗接种/处理优选地导致与未接种疫苗的对照动物相比病毒血症阶段的缩短。与相同物种的未接种疫苗的对照动物相比,平均缩短时间可以优选地是例如9.5天。因此,根据另一个方面,本发明也提供了一种在年轻动物中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象的方法,所述方法包括下述步骤:将有效量的本发明的多肽施用给需要这种治疗的该动物,其中所述治疗或预防导致与相同物种的未治疗的对照组的动物相比病毒血症阶段缩短了5天或更多天,优选6天或更多天,甚至更优选7天或更多天,甚至更优选8天或更多天,甚至更优选9天,甚至更优选10天,甚至更优选12天,甚至更优选14天,最优选地超过16天。在某些情况下,病毒血症阶段优选地缩短了超过20天。一般而言,年轻小猪的疫苗接种优选地导致降低的重量增加损失、较短的病毒血症持续时间、较早的病毒血症终点和较低的病毒载量。因此,根据另一个方面,本发明提供了一种在年轻动物中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象的方法,所述方法包括下述步骤:将有效量的本发明的多肽施用给需要这种治疗的该动物,其中所述PCV2感染的治疗或预防导致与相同物种的未治疗的对照组的动物相比选自以下的疫苗效力参数的改进:降低的重量增加损失、较短的病毒血症持续时间、较早的病毒血症终点、较低的病毒载量或它们的组合。优选地,遭受任何上述改进的疫苗效力参数需要小于20μg/剂的本发明的多肽。而且,这样的改进的疫苗效力参数通过仅一剂的单次施用来实现。
本文中使用的术语“有效量”是指、但不限于在给其施用所述有效剂量的本发明的多肽的动物中引起或能够引起免疫应答的、本发明的多肽的量。优选地,将有效量定义为本发明的多肽赋予至少10周免疫持续时间(DOI),优选至少12周(DOI),更优选至少15周(DOI),最优选至少20周(DOI)的量。
有效量取决于疫苗的成分和施用计划。通常,当将灭活病毒或经修饰的活病毒制品用在联合疫苗中时,疫苗的量含有约102.0至约109.0TCID50/剂,优选约103.0至约108.0TCID50/剂,更优选约104.0至约108.0TCID50/剂。具体地,当将经修饰的活PCV2用在疫苗中时,要给易受感染的动物施用的推荐剂量优选为约103.0TCID50(50%终点的组织培养物感染剂量)/剂至约106.0TCID50/剂,且更优选约104.0TCID50/剂至约105.0TCID50/剂。一般而言,当使用经纯化的抗原时,抗原的量将是0.2至5000微克之间和102.0至109.0TCID50之间,优选103.0至106.0TCID50之间,更优选104.0至105.0TCID50之间。
亚单位疫苗一般以至少0.2μg蛋白/剂的蛋白包含水平施用,优选约0.2至约400μg/剂,更优选约0.3至约200μg/剂,甚至更优选约0.35至约100μg/剂,更优选约0.4至约50μg/剂,更优选约0.45至约30μg/剂,更优选约0.5至约18μg/剂,更优选约0.6至约16μg/剂,甚至更优选约0.75至约8μg/剂,甚至更优选约1.0至约6μg/剂,更优选约1.3至约3.0μg/剂。
优选地,上文所述免疫原性组合物的预防应用可有效地减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象,优选地在年轻动物中和/或在治疗当天具有针对PCV2的被动免疫的动物中。具体地,如本文中所述的免疫原性组合物和尤其是包含本发明的多肽的组合物的预防应用优选地可有效减轻在治疗/疫苗接种当天被PCV2感染且具有母源抗-PCV-2抗体的动物中的淋巴结病、淋巴耗竭和/或多核/巨组织细胞。例如,发现如本文中所述的免疫原性组合物的预防应用可有效地减轻淋巴耗竭、淋巴炎症、淋巴组织的PCV2抗原的阳性IHC、病毒血症、鼻脱落、发热、减小的平均日体重增加、肺部炎症、肺组织的PCV2抗原的阳性IHC。
此外,如本文中所述的免疫原性组合物的预防应用优选地可有效减轻(1)伴有小叶间水肿的间质性肺炎,(2)皮肤苍白或黄疸,(3)具斑点萎缩性肝,(4)胃溃疡,(5)肾炎和(6)生殖障碍,例如流产、死产、干尸化等,(7)软膜(Pia)样损伤,一般被认为与胞内劳森氏菌(Lawsoniaintracellularis)感染(回肠炎)有关,(8)淋巴结病,(9)淋巴耗竭,和/或(10)多核/巨组织细胞,(11)猪皮炎和肾病综合症(PDNS),(12)PCVAD有关的死亡,(13)PCVAD有关的重量减轻,(14)降低的生长变异性,(15)降低的“侏儒”频率,(16)降低的与猪生殖和呼吸疾病综合症(PRRSV)的共感染。这样的免疫原性组合物还有效地改良经济上重要的生长参数诸如屠宰时间、屠体重量和瘦肉比。因而,本文中使用的术语“临床征象”是指,但不限于(1)伴有小叶间水肿的间质性肺炎,(2)皮肤苍白或黄疸,(3)有斑点的萎缩性肝,(4)胃溃疡,(5)肾炎和(6)生殖障碍,例如流产、死产、干尸化等,(7)软膜(Pia)样损伤,一般被认为与胞内劳森氏菌(Lawsoniaintracellularis)感染(回肠炎)有关,(8)淋巴结病,(9)淋巴耗竭和/或(10)多核/巨组织细胞(11)猪皮炎和肾病综合症(PDNS),(12)PCVAD有关的死亡,(13)PCVAD有关的重量减轻,(14)降低的生长变异性,(15)降低的“侏儒”频率,(16)降低的与猪生殖和呼吸疾病综合症(PRRSV)的共感染,(17)淋巴炎症,(18)淋巴组织的PCV2抗原的阳性IHC,(19)病毒血症,(20)鼻脱落,(21)发热,(22)减小的平均日体重增加,(23)肺部炎症,(24)肺组织的PCV2抗原的阳性IHC。此外,本文描述的免疫原性组合物会降低总圆环病毒载量,包括较迟发作、较短的持续时间、较早的病毒血症终点和降低的病毒载量和其在年轻动物(尤其是在疫苗接种当天具有抗-PCV2抗体的那些)中的免疫抑制影响,从而导致较高水平的总体疾病抗性和降低的PCV2有关的疾病和临床征象的发生率。
因而,根据另一个方面,本发明提供了一种在年轻动物中和/或在动物(优选具有抗-PCV2抗体的动物)中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象的方法,所述方法包括下述步骤:给需要这种治疗的动物施用有效量的本发明的多肽或包含本发明的多肽的免疫原性组合物,其中那些临床征象选自(1)伴有小叶间水肿的间质性肺炎,(2)皮肤苍白或黄疸,(3)有斑点的萎缩性肝,(4)胃溃疡,(5)肾炎和(6)生殖障碍,例如流产、死产、干尸化等,(7)软膜(Pia)样损伤,一般被认为与胞内劳森氏菌(Lawsoniaintracellularis)感染(回肠炎)有关,(8)淋巴结病,(9)淋巴耗竭和/或(10)多核/巨组织细胞(11),猪皮炎和肾病综合症(PDNS),(12)PCVAD有关的死亡,(13)PCVAD有关的重量减轻,(14)降低的生长变异性,(15)降低的“侏儒”频率,(16)降低的与猪生殖和呼吸疾病综合症(PRRSV)的共感染,(17)淋巴炎症,(18)淋巴组织的PCV2抗原的阳性IHC,(19)病毒血症,(20)鼻脱落,(21)发热,(22)减小的平均日体重增加,(23)肺部炎症,(24)肺组织的PCV2抗原的阳性IHC。根据另一个方面,本发明提供了一种在年轻动物中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象的方法,所述方法包括下述步骤:将有效量的本发明的多肽施用给需要这种治疗的该动物,其中那些临床征象选自(1)伴有小叶间水肿的间质性肺炎,(2)皮肤苍白或黄疸,(3)有斑点的萎缩性肝,(4)胃溃疡,(5)肾炎和(6)生殖障碍,例如流产、死产、干尸化等,(7)软膜(Pia)样损伤,一般被认为与胞内劳森氏菌(Lawsoniaintracellularis)感染(回肠炎)有关,(8)淋巴结病,(9)淋巴耗竭和/或(10)多核/巨组织细胞(11)猪皮炎和肾病综合症(PDNS),(12)PCVAD有关的死亡,(13)PCVAD有关的重量减轻,(14)降低的生长变异性,(15)降低的“侏儒”频率,(16)降低的与猪生殖和呼吸疾病综合症(PRRSV)的共感染,(17)淋巴炎症,(18)淋巴组织的PCV2抗原的阳性IHC,(19)病毒血症,(20)鼻脱落,(21)发热,(22)减小的平均日体重增加,(23)肺部炎症,(24)肺组织的PCV2抗原的阳性IHC。
根据本发明的组合物可以口服地、真皮内地、气管内地或阴道内地施用。所述组合物优选地可以肌肉内地或鼻内地施用,最优选地肌肉内地施用。在动物体内,可以证明经由静脉内或通过直接注射至靶组织来施用如上所述的药物组合物是有利的。对于全身施用,静脉内的、血管内的、肌肉内的、鼻内的、动脉内的、腹膜内的、口服的或鞘内的途径是优选的。更局部的施用可以皮下地、真皮内地、皮内地、贲门内地、叶内地(intralobally)、髓内地、肺内地或直接在要治疗的组织(结缔组织、骨组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织)中或附近实现。取决于治疗的期望持续时间和有效性,根据本发明的组合物可以施用一次或数次(还可以间歇地,例如以每日计持续数天、数周或数月)且以不同剂量施用。
优选地,将一剂如上所述的免疫原性组合物肌肉内地施用给有此需要的对象。根据另一个方面,将如本文中所述的本发明的多肽或包含任何这样的本发明的多肽的免疫原性组合物装入瓶中并以一(1)mL/剂施用。因而,根据另一个方面,本发明也提供了包含如本文中所述的本发明的多肽的1ml免疫原性组合物,其用于在年轻动物中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象,包括下述步骤:将有效量的本发明蛋白的多肽施用给需要这种治疗的该动物。根据另一个方面,本发明也提供了包含如本文中所述的本发明的多肽的1ml免疫原性组合物,其用于在动物(优选具有抗-PCV2抗体的动物)中治疗或预防PCV2感染或减轻由PCV2感染造成或与PCV2感染有关的临床征象,包括下述步骤:给需要这种治疗的动物施用有效量的本发明的多肽或包含本发明的多肽的免疫原性组合物。
根据另一个方面,将至少一剂如上所述的免疫原性组合物另外施用给有此需要的对象至少一次,其中第二次或任何另外施用是在初始或任何以前施用以后至少14天给予。优选地,所述免疫原性组合物与免疫刺激剂一起施用。优选地,所述免疫刺激剂施用至少两次。优选地,在免疫刺激剂的第一次与第二次或任何另外施用之间有至少3天,更优选地至少5天,甚至更优选地至少7天。优选地,所述免疫刺激剂在本文所提供的免疫原性组合物的初始施用以后至少10天、优选地15天、甚至更优选地20、甚至更优选地至少22天施用。一种优选的免疫刺激剂是例如钥孔戚血蓝素(KLH),优选地用不完全弗氏佐剂乳化(KLH/ICFA)。但是,同此应理解,还可以使用本领域技术人员已知的任何其它免疫刺激剂。本文中使用的术语“免疫刺激剂”是指可以触发免疫应答、优选地不引发或增加特异性免疫应答(例如针对特定病原体的免疫应答)的任何试剂或组合物。进一步指示以合适剂量施用免疫刺激剂。
优选实施方案的详细描述
以下实施例阐明了根据本发明的优选材料和规程。尽管与本文描述的那些类似或等效的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试中,但是现在描述优选的方法、装置和材料。但是,应当理解,这些实施例仅为例证而提供,且其中的任何内容都不应视为对本发明总范围的限制。
实施例1
材料和规程/突变体的设计
使用ClustalW方法,将在产品中包含的PCV2ORF2蛋白的PCV2aORF2氨基酸序列与PCV2bORF2BDH氨基酸序列和得自Genbank的许多其它公开的PCV2a和PCV2bORF2氨基酸序列进行比对。将在PCV2a和PCV2bORF2序列之间的主要氨基酸差异的位置鉴别为潜在突变位置(参见图1)。使用鉴别的主要氨基酸变化,制备了7种PCV2bORF2编码序列,它们用来自PCV2bORF2BDH的氨基酸交换来自PCV2aORF2的对应氨基酸。使用PCV2aORF2密码子编码突变氨基酸。下面详细描述了7种PCV2bORF2突变构建体:
1.PCV2bORF2BDHK59A
2.PCV2bORF2BDHR63T
3.PCV2bORF2BDHR63K
4.PCV2bORF2BDHSFCOP88KT151P**
5.PCV2bORF2BDHG191R
6.PCV2bORF2bBDHI206K
7.PCV2bORF2BDHN232E
除了通过合成的PCV2bORF2bBDHSFCO编码序列的定位诱变建立的第4号以外,在IntegratedDNATechnologies合成所有编码序列。
**SFCO=为针对草地贪夜蛾优化的密码子。通过初步序列评估在上述比对之前建立该构建体。在该序列评估中还鉴别出两个突变。
突变体PCV2bORF2杆状病毒的制备
将所述7种PCV2bORF2突变体编码序列中的每一种以及未突变的PCV2bORF2BDH编码序列克隆进杆状病毒转移载体pVL1393中,并与杆状病毒DNA一起共转染进Sf9细胞中。通过IFA检查每种得到的重组杆状病毒的PCV2bORF2表达。在Sf+细胞上制备每种重组杆状病毒的扩增储液,并通过TCID50方法进行滴定以确定杆状病毒滴度。
突变体PCV2bORF2杆状病毒的表达评价
通过以0.1的靶MOI感染Sf+细胞,评价每种重组杆状病毒的PCV2bORF2编码序列的表达。使感染进行5-7天,然后通过在20,000g离心20min以除去细胞碎片和不溶性蛋白进行收获。将收获上清液进行0.2μm过滤,并使用α-PCV2抗体通过蛋白质印迹直接评价PCV2bORF2表达(例如图2)。还针对大分子结构的存在来评价了收获上清液。简而言之,将每种收获上清液的样品在100,000g离心2小时。将得到的沉淀物再悬浮于小体积的TBS中,并通过SDS-PAGE分离。通过与PCV2aORF2的尺寸对比,在染色的凝胶中检测PCV2bORF2带(例如图3)。还通过在100,000g离心2小时以部分地纯化PCV2bORF2蛋白,在10%-60%不连续蔗糖梯度上分离再悬浮的沉淀物,用于定量和通过电子显微术(EM)实现的VLP证实(例如,图4)。
蔗糖梯度分离以后,将含有PCV2bORF2的级分合并,并通过相对于BSA标准曲线的SDS-PAGE凝胶密度测定法确定PCV2bORF2浓度。另外,将蔗糖梯度纯化的材料的样品进一步浓缩,并呈送用于使用磷酸钨酸作为负染色剂通过EM进行VLP证实(例如,图5)。
在图6中显示了PCV2bORF2BDH突变构建体的评价结果表。结果证实,在位置63从精氨酸至苏氨酸的单个氨基酸突变使Sf+细胞中PCV2bORF2BDH的表达增加了几乎10倍。单个R63T突变使Sf+细胞中的PCV2bORF2BDH表达增加至与PCV2aORF2类似的水平。PCV2bORF2BDH的氨基酸序列分析提示,BC环可能对胰蛋白酶-样蛋白酶的切割敏感。Khayat等人在2011年公开的结构数据提示,精氨酸63是在从ORF2蛋白形成的PCV2病毒衣壳向最远伸出的BC环上,从而使它对杆状病毒复制过程中Sf+细胞裂解以后释放的蛋白酶敏感。
除了在位置63处的苏氨酸置换以外,在本发明的另一个实施方案中,所述精氨酸被其它不带电荷的极性的氨基酸(包括丝氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)置换以得到相同的稳定效应。另外,非极性氨基酸(包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)也可以实现相同的作用。
实施例2
该研究证实了猪圆环病毒2型ORF2b疫苗的一个实施方案对PCV2a和/或PCV2b攻击的效力。将剖腹产术衍生的被剥夺初乳的(CDCD)小猪用在该研究中并分成两组:1)用实验性猪圆环病毒疫苗接种的猪,所述疫苗包括实施例1的PCV2bORF2R63T变体(灭活的杆状病毒载体),所述猪用有毒力的PCV2b激发,2)未接种疫苗的攻击对照猪,其用有毒力的PCV2b攻击。在第0天,给组1肌肉内地(IM)施用1mL疫苗,而组2(未接种疫苗的攻击对照猪)没有接受任何治疗。在第28天,将组1和2中的所有猪用有毒力的PCV2b1mL鼻内地(IN)和1mL肌肉内地以3.0Log10TCID50/mL的活病毒的近似剂量攻击。所有猪在第25和31天肌肉内地接受2.0mL在不完全弗氏佐剂中乳化的钥孔戚血蓝素(KLH/ICFA)。每天监测猪的临床征象,并定期抽血用于血清学试验。在第56天,将所有猪尸检,并将选择的组织收集和进行肉眼可见的病理学观察。
整体上,接种疫苗的动物与它们各自的攻击对照组相比表现出所有试验参数的下降。
实施例3
产生了在氨基酸位点63处的几个其它置换以对比PCV2bORFBDH天然株。在图7A和7B中显示了PCV2bORF2BDH突变构建体的评价结果。结果证实,除了在位置63处从精氨酸(R)至苏氨酸(T)的氨基酸突变以外,精氨酸(R)63至甘氨酸(G)、精氨酸(R)63至谷氨酰胺(Q)和精氨酸(R)63至天冬氨酸(D)会使Sf+细胞中的PCV2bORF2BDH的表达与野生型相比增加至少4倍。具体地,单个突变R63G和R63Q使Sf+细胞中的PCV2bORF2BDH表达增加至与PCV2aORF2类似的水平。
编码PCV2bORF2R63突变体的重组杆状病毒的制备
通过定位诱变制备了PCV2bORF2的编码序列在氨基酸位置63处的点突变。简而言之,使用表1中的引物对杆状病毒转移质粒pVL1393-PCV2bORF2进行定位诱变。将得到的杆状病毒转移载体测序以证实编码序列的适当突变,然后与线性化的杆状病毒DNA一起共转染进Sf9细胞中。5天后收获共转染物,并使用PCV2-特异性抗体通过IFA评价PCV2bORF2表达。在Sf9细胞上制备每种杆状病毒的扩增储液,并使用α-杆状病毒gp64单克隆抗体通过基于IFA的TCID50方法进行滴定。
表1.用于定位诱变的引物.
引物 | 序列 |
正向 | 5’-CTGTCAAGAAAACCACAGTCX1X2X3ACGCCCTCCTGGAATGTG-3’ |
反向 | 正向引物的反向补体 |
突变 | X1 | X2 | X3 |
R63D | G | A | C |
R63Q | C | A | G |
R63G | G | G | A |
R63L | T | T | G |
R63T | A | C | A |
PCV2bORF2VLP的表达和定量
将旋转烧瓶中的SF+细胞用重组杆状病毒以0.1的MOI感染,并在大约100rpm的恒定搅拌下在27℃温育。一旦SF+细胞生存力下降至30%以下或在感染后7天,就将被感染的培养物收获。将粗杆状病毒收获物在4℃在20,000g离心20分钟以沉淀细胞和不溶性碎片,然后进行0.2μm过滤。对澄清的杆状病毒收获流体(35mL)进行在4℃在100,000gRCF的离心2小时以沉淀PCV2bORF2VLP。将得到的沉淀物再悬浮于TBS中,并在10%-60%不连续蔗糖梯度上在4℃在100,000gRCF进一步分离2小时。将含有大部分PCV2bORF2(通过SDS-PAGE和使用α-PCV2抗体的蛋白质印迹确定)的级分合并,并通过密度测定法评价。简而言之,将合并的含有PCV2bORF2的级分通过SDS-PAGE进行分离,并用SIMPLYBLUETMSafeStain染色。使用AlphaView照相机和软件捕获凝胶图像并进行分析。使用在每个凝胶上包含的BSA标准曲线,计算PCV2bORF2带的质量。通过将PCV2bORF2带的质量除以在凝胶上加载的样品的总体积,计算合并物的PCV2bORF2浓度。通过将合并物中的PCV2bORF2浓度乘以合并物的体积并然后将结果除以离心所用的收获流体的起始体积,计算收获材料中的PCV2bORF2浓度。
实施例4
该研究评价了当在3周龄施用时猪圆环病毒2型ORF2b原型疫苗(包括重组杆状病毒表达的SEQIDNO:1的PCV2bORF2蛋白)对PCV2b攻击的效力。
将42头健康的CDCD猪(来自X窝中的每一窝的X头猪和来自X窝中的每一窝的X头猪)阻挡并圈养在6个围栏中。将一个围栏内的猪同样地随机化至5个治疗组之一:组1(严格阴性对照),由X头猪组成,且不接受治疗;组2(攻击对照,n=X),不接受治疗;组3(包含SEQIDNO:1的实验性PCV2b+Carbopol疫苗,n=X);组4(包含SEQIDNO:1的实验性PCV2b+ISA207VG疫苗,n=X)。在表2中提供了治疗组的概要。
表2:
在第0天,猪为24日龄,并给组3猪肌肉内地(IM)施用1mL剂量的疫苗。在第11天和第17天,所有猪肌肉内地(IM)接受2.0mL剂量的KLH/ICFA。在第14天,所有猪用大约5.0log10TCID50/mL的活的有毒力的PCV2b1.0mLIM在右颈中和1.0mL鼻内地攻击。每天检查猪的总体健康。在第-4、14、21、28、33和42天收集血液样品,并在除了第-4天以外的所有天通过定量实时聚合酶链式反应检验血清的PCV2病毒血症。在PCV2b攻击以后,接种疫苗的动物与未接种疫苗的动物相比显示出显著更低的病毒血症并减少至无临床征状。
在做出的发明和随同提供的实验数据的上下文中,尤其考虑以下内容:
-关于淋巴耗竭:为了支持“辅助预防淋巴耗竭”的证据,如果4个淋巴组织样品(扁桃体、TBLN、MLN或ILN)中的一个或多个在组织学上是淋巴耗竭阳性的,认为猪是阳性的;
-关于淋巴炎症:为了支持“辅助预防淋巴炎症”的证据,如果4个淋巴组织样品(扁桃体、TBLN、MLN或ILN)中的一个或多个在组织学上是淋巴炎症阳性的,认为猪是阳性的;
-关于淋巴定居:为了支持猪在病毒暴露后4周之前清除了感染的证据,如果4个淋巴组织样品(扁桃体、TBLN、MLN或ILN)中的一个或多个通过IHC证实是PCV2淋巴定居阳性的,认为猪是阳性的;
-关于病毒血症:为了支持“辅助预防病毒血症”的证据,如果血清rt-PCR检验是≥1.0x104PCV2基因组当量(线性较低水平),认为猪在取样当天是阳性的;和
-关于死亡:为了支持“辅助预防死亡”的证据,如果猪屈服于攻击(死亡或由于人道原因需要安乐死,具有与PCV2一致的可归因的临床征象、肉眼可见的损伤和/或组织学损伤),认为猪是死亡阳性的。
在序列表中:
SEQIDNO:1对应于包括置换R63T的SEQIDNO:2。
SEQIDNO:2对应于野生型PCV2bORF2蛋白的序列。
SEQIDNO:3对应于野生型PCV2aORF2蛋白的序列。
SEQIDNO:4对应于编码SEQIDNO:1的多核苷酸序列。
SEQIDNO:5对应于野生型PCV2bORF2蛋白的序列。
SEQIDNO:6对应于具有233个氨基酸残基的长度且具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基的本发明的多肽的序列。
SEQIDNO:7对应于具有233个氨基酸残基的长度且具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基的本发明的多肽的序列。
SEQIDNO:8对应于具有234个氨基酸残基的长度且具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基的本发明的多肽的序列。
SEQIDNO:9对应于具有234个氨基酸残基的长度且具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基的本发明的多肽的序列。
SEQIDNO:10对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的丙氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:11对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的半胱氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:12对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的天冬氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:13对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的谷氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:14对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的苯丙氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:15对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的甘氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:16对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的组氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:17对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的异亮氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:18对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的亮氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:19对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的甲硫氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:20对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的天冬酰胺残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:21对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的脯氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:22对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的谷氨酰胺残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:23对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的丝氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:24对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的苏氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:25对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的缬氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:26对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的色氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:27对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的酪氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:28对应于具有在氨基酸位置59处的精氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的丙氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:29对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的半胱氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:30对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的天冬氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:31对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的谷氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:32对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的苯丙氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:33对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的甘氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:34对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的组氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:35对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的异亮氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:36对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的亮氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:37对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的甲硫氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:38对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的天冬酰胺残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:39对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的脯氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:40对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的谷氨酰胺残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:41对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的丝氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:42对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的苏氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:43对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的缬氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:44对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的色氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:45对应于具有在氨基酸位置59处的赖氨酸残基且具有在氨基酸位置63处的酪氨酸残基的本发明的多肽的氨基酸位置58-66(在本文中也被称作“BC-环”)的序列。
SEQIDNO:46对应于具有234个氨基酸残基的长度且具有在氨基酸位置63处的苏氨酸残基的本发明的多肽的序列。
Claims (45)
1.选自以下(a)、(b)和(c)的多肽:
(a)PCV2ORF2蛋白,其具有
-在氨基酸位置59处的精氨酸残基或赖氨酸残基,和/或
-在氨基酸位置88处的脯氨酸残基,和/或
-在氨基酸位置151处的苏氨酸残基,和/或
-在氨基酸位置206处的异亮氨酸残基,和/或
-在氨基酸位置232处的天冬酰胺残基,
且具有在氨基酸位置63处的除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基,
其中氨基酸位置的编号参考野生型PCV2ORF2蛋白的氨基酸序列;
(b)PCV2ORF2蛋白,其特征在于,(i)在BC环中含有至少一个突变且(ii)优选地与不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白相比以更高的量表达;
(c)(a)和(b)的组合。
2.根据权利要求1所述的多肽,其中在(a)中,所述PCV2ORF2蛋白具有在氨基酸位置63处的天然存在的、优选地遗传学编码的氨基酸残基。
3.根据权利要求1或2所述的多肽,其中在(a)中,所述PCV2ORF2蛋白具有在氨基酸位置63处的选自以下的氨基酸残基:具有极性的、但是不带电荷的侧链的氨基酸残基,具有疏水侧链的氨基酸残基,和甘氨酸残基。
4.根据权利要求3所述的多肽,其中所述具有极性的、但是不带电荷的侧链的氨基酸残基选自丝氨酸残基、苏氨酸残基、酪氨酸残基、天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基,和/或其中所述具有疏水侧链的氨基酸残基选自丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、苯丙氨酸残基和色氨酸残基。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的多肽,其中在(a)中,所述PCV2ORF2蛋白具有在氨基酸位置63处的选自丝氨酸残基和苏氨酸残基的氨基酸残基。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的多肽,其中在(b)中,所述在BC环中含有至少一个突变的PCV2ORF2蛋白与不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白相比以更高的量、优选地以高至少2倍的量、更优选地以高至少3倍的量、更优选地以高至少5倍的量、更优选地以高至少8倍的量表达,和/或所述在BC环中含有至少一个突变的PCV2ORF2蛋白与所述不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白相比在杆状病毒表达系统中以更高的量表达,和/或其中所述不含有这样的突变的PCV2ORF2蛋白是野生型PCV2ORF2蛋白。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的多肽,其中在(b)中,所述BC环中的至少一个突变是在氨基酸位置58-66的区域中的至少一个突变,且其中氨基酸位置的编号参考野生型PCV2ORF2蛋白的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的多肽,其中在(b)中,所述BC环中的至少一个突变包含在氨基酸位置60-66的区域中的1-7个氨基酸残基的缺失、置换和/或添加或者由其组成,且其中氨基酸位置的编号参考野生型PCV2ORF2蛋白的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的多肽,其中在(b)中,所述BC环中的至少一个突变是在氨基酸位置63处的一个氨基酸残基的缺失、置换和/或添加,且其中氨基酸位置的编号参考野生型PCV2ORF2蛋白的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的多肽,其中在(b)中,所述BC环中的至少一个突变是除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基对在氨基酸位置63处的氨基酸残基的置换,且其中氨基酸位置的编号参考野生型PCV2ORF2蛋白的氨基酸序列。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的多肽,其中在(b)中,所述BC环中的至少一个突变是除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基对在氨基酸位置63处的精氨酸残基或赖氨酸残基的置换,和/或其中所述不含有这样的突变的PCV2ORF2具有在氨基酸位置63处的精氨酸残基或赖氨酸残基,且其中氨基酸位置的编号参考野生型PCV2ORF2蛋白的氨基酸序列。
12.根据权利要求10或11所述的多肽,其中所述除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基是天然存在的、优选地遗传学编码的、氨基酸残基。
13.根据权利要求10-12中的任一项所述的多肽,其中所述除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基选自:具有极性的、但是不带电荷的侧链的氨基酸残基,具有疏水侧链的氨基酸残基,和甘氨酸残基。
14.根据权利要求13所述的多肽,其中所述具有极性的、但是不带电荷的侧链的氨基酸残基选自丝氨酸残基、苏氨酸残基、酪氨酸残基、天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基,和/或其中所述具有疏水侧链的氨基酸残基选自丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、苯丙氨酸残基和色氨酸残基。
15.根据权利要求10-14中的任一项所述的多肽,其中所述除了精氨酸残基或赖氨酸残基以外的氨基酸残基选自丝氨酸残基和苏氨酸残基。
16.根据权利要求1-15中的任一项所述的多肽,其中所述多肽是重组PCV2ORF2蛋白,优选重组杆状病毒表达的PCV2ORF2蛋白。
17.根据权利要求1-16中的任一项所述的多肽,其中所述多肽是PCV2b亚型(PCV2b)ORF2蛋白。
18.根据权利要求1-17中的任一项所述的多肽,其中所述多肽是包含与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少90%序列相同性的氨基酸序列或由与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少90%序列相同性的氨基酸序列组成的PCV2ORF2蛋白。
19.根据权利要求1-18中的任一项所述的多肽,其中所述多肽选自SEQIDNO:6-9中所示的序列,和/或其中所述多肽包含选自SEQIDNO:10-45的序列。
20.根据权利要求1-19中的任一项所述的多肽,其中所述野生型PCV2ORF2蛋白是SEQIDNO:2中所示的蛋白。
21.一种免疫原性组合物,其含有任一项权利要求1-20所述的多肽,其中任选地所述免疫原性组合物还含有PCV2aORF-2多肽,其中所述PCV2aORF-2多肽优选地与SEQIDNO:3的序列具有至少94%或优选地至少95%相同性。
22.一种多核苷酸,其包含编码根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽的序列。
23.一种质粒,优选表达载体,其含有包含编码根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽的序列的多核苷酸。
24.一种含有质粒、优选表达载体的细胞,所述质粒含有包含编码根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽的序列的多核苷酸。
25.一种病毒样颗粒,其包含多个根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽。
26.一种杆状病毒,其含有包含编码根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽的序列的多核苷酸。
27.一种包含杆状病毒的细胞,优选昆虫细胞,所述杆状病毒含有包含编码根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽的序列的多核苷酸。
28.-根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽,
-根据权利要求21所述的免疫原性组合物,
-根据权利要求22所述的多核苷酸,
-根据权利要求25所述的病毒样颗粒,
-根据权利要求26所述的杆状病毒,
-根据权利要求23所述的质粒,和/或
-根据权利要求24或27所述的细胞
用于制备药物、优选疫苗的用途。
29.根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽或根据权利要求21所述的免疫原性组合物,其用在治疗或预防PCV2的感染、减轻、预防或治疗由PCV2的感染造成的临床征象、或预防或治疗由PCV2的感染造成的疾病的方法中。
30.用于根据权利要求25所述的用途的根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽或根据权利要求21所述的免疫原性组合物,其中所述PCV2感染是PCV2b亚型(PCV2b)的感染和/或除了2b亚型以外的亚型的PCV2的感染。
31.用于根据权利要求29或30所述的用途的根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽或根据权利要求21所述的免疫原性组合物,其中所述PCV2感染是除了2b亚型以外的亚型的PCV2的感染。
32.用于根据权利要求30所述的用途的根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽或根据权利要求21所述的免疫原性组合物,其中所述PCV2感染是(i)PCV2b和(ii)除了2b亚型以外的亚型的PCV2的同时感染。
33.用于根据权利要求30-32中的任一项所述的用途的根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽或根据权利要求21所述的免疫原性组合物,其中所述除了2b亚型以外的亚型的PCV2感染是PCV2a亚型(PCV2a)和/或PCV2c亚型(PCV2c)的感染。
34.用于根据权利要求30-33中的任一项所述的用途的根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽或根据权利要求21所述的免疫原性组合物,其中所述除了2b亚型以外的亚型的PCV2感染是PCV2a的感染。
35.用于根据权利要求29-34中的任一项所述的用途的根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽或根据权利要求21所述的免疫原性组合物,其中所述PCV2感染是(i)PCV2b和(ii)PCV2a的同时感染。
36.用于根据权利要求29-35中的任一项所述的用途的根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽或根据权利要求21所述的免疫原性组合物,其中所述PCV2b的感染是PCV2的感染,所述PCV2包含与SEQIDNO:2的序列具有至少94%或优选地至少95%相同性的多肽或包含含有编码与SEQIDNO:2的序列具有至少94%或优选地至少95%相同性的多肽的序列的多核苷酸。
37.用于根据权利要求23-35中的任一项所述的用途的根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽或根据权利要求21所述的免疫原性组合物,其中所述PCV2a的感染是PCV2的感染,所述PCV2包含与SEQIDNO:3的序列具有至少94%或优选地至少95%相同性的多肽或包含含有编码与SEQIDNO:3的序列具有至少94%或优选地至少95%相同性的多肽的序列的多核苷酸。
38.用于根据权利要求29-37中的任一项所述的用途的根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽或根据权利要求21所述的免疫原性组合物,其中所述PCV2的感染的治疗或预防是基于或包含针对所述PCV2的免疫应答的诱导,或者由所述诱导组成,所述临床征象选自淋巴耗竭、淋巴炎症、淋巴组织的PCV2抗原的阳性IHC、病毒血症、鼻脱落、发热、减小的平均日体重增加、肺部炎症、肺组织的PCV2抗原的阳性IHC,或所述疾病是PMWS。
39.用于根据权利要求30-38所述的用途的根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽或根据权利要求21所述的免疫原性组合物,其中所述除了2b以外的亚型的PCV2的感染的治疗或预防是基于或包含针对所述除了2b以外的亚型的PCV2的免疫应答的诱导或者针对所述除了2b以外的亚型的PCV2和PCV2b的免疫应答的同时诱导,或者由所述诱导组成。
40.一种用于治疗或预防PCV2的感染、减轻、预防或治疗由PCV2的感染造成的临床征象、或预防或治疗由PCV2的感染造成的疾病的方法,所述方法包括:将根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽或根据权利要求21所述的免疫原性组合物施用给动物,其中所述PCV2的感染优选地是根据权利要求30-38中的任一项所述的PCV2的感染。
41.根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽或根据权利要求21所述的免疫原性组合物用于制备药物的用途,所述药物用于治疗或预防PCV2的感染,用于减轻、预防或治疗由PCV2的感染造成的临床征象,或用于治疗或预防由PCV2的感染造成的疾病,其中所述PCV2的感染优选地是根据权利要求30-38中的任一项所述的PCV2的感染。
42.根据权利要求40所述的方法或根据权利要求41所述的用途,其中所述PCV2的感染的治疗或预防是基于或包含针对所述PCV2的免疫应答的诱导或者由所述诱导组成,或其中所述除了2a亚型以外的亚型的PCV2的感染的预防、减轻或治疗是基于或包含针对所述除了2a亚型以外的亚型的PCV2的免疫应答的诱导,或者针对所述除了a亚型以外的亚型的PCV2和PCV2a的免疫应答的同时诱导,或者由所述诱导组成,所述临床征象选自淋巴耗竭、淋巴炎症、淋巴组织的PCV2抗原的阳性IHC、病毒血症、鼻脱落、发热、减小的平均日体重增加、肺部炎症、肺组织的PCV2抗原的阳性IHC,或所述疾病是PMWS。
43.用于根据权利要求29-39中的任一项所述的用途、或根据权利要求40或42所述的方法、或根据权利要求41或42所述的用途的根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽或根据权利要求21所述的免疫原性组合物,其中所述多肽或所述免疫原性组合物仅施用一次。
44.一种产生根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽的方法,所述方法包括用根据权利要求23所述的质粒转染细胞。
45.一种产生根据权利要求1-20中的任一项所述的多肽的方法,所述方法包括用根据权利要求26所述的杆状病毒感染细胞,优选昆虫细胞。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: American Missouri Applicant after: Bollinger Ingham Animal Health USA Ltd. Address before: American Missouri Applicant before: BOEHRINGER INGELHEIM VETMED |
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CB02 | Change of applicant information | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: Georgia, USA Applicant after: Bollinger Ingham Animal Health USA Ltd. Address before: American Missouri Applicant before: Bollinger Ingham Animal Health USA Ltd. |