CN109195623A

CN109195623A - 嵌合型猪圆环病毒2型(pcv2)疫苗

Info

Publication number: CN109195623A
Application number: CN201780016007.4A
Authority: CN
Inventors: 孟祥金; 莎伦·R·马青格; 南森·M·比奇
Original assignee: Virginia Tech Intellectual Properties Inc
Current assignee: Virginia Tech Intellectual Properties Inc
Priority date: 2016-03-07
Filing date: 2017-03-03
Publication date: 2019-01-11
Also published as: KR20190017725A; EP3426293A4; US20190091320A1; WO2017187277A2; AU2017257302A1; EA201800494A1; MX2018010796A; JP2019507784A; EP3426293A2; WO2017187277A3; CA3016374A1; BR112018068078A2

Abstract

描述了提供对猪圆环病毒2型(PCV2)基因型的免疫力的疫苗组合物和方法，其包括施用包含来自多种PCV2基因型衣壳的抗原表位的重组PCV2衣壳多肽。在其他实施方案中，提供重组嵌合型猪圆环病毒作为疫苗，该重组嵌合型猪圆环病毒组合了猪圆环病毒1型(PCV1)的非致病性骨架与编码包含来自多种PCV2基因型衣壳的抗原表位的PCV2衣壳多肽的序列。

Description

嵌合型猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求基于2016年3月7日提交的美国临时申请序列号62/304596的优先权，其通过引用整体并入本文。

电子提交的序列表参考

以文本格式提供与本申请相关的序列表以代替纸质副本，并且通过引用并入本说明书。包含序列表的文本文件的名称为序列表.txt。该文本文件为42千字节，于2017年2月24日创建并通过EFS-Web以电子方式提交。

技术领域

本发明总体上涉及针对哺乳动物圆环病毒的预防性疫苗的组合物和方法，该哺乳动物圆环病毒在养猪场中引起相当高的死亡率和发病率。

背景技术

在不限制本发明范围的情况下，结合猪群体中圆环病毒诱导的发病率和死亡率描述其背景。猪圆环病毒(PCV)是一种小的、无包膜的、单链DNA病毒，属于圆环病毒科(Circoviridae)。PCV 1型(PCV1)最初在20世纪70年代被鉴定为猪肾细胞系PK-15的细胞培养污染物，后发现其在猪中是非致病性的。1997年，在断奶后不久的消瘦仔猪中鉴定了一种名为PCV 2型(PCV2)的致病变种。随着世界范围内发现更多的病例，PCV2被确定为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要致病因子，该PCVAD包括广泛的临床症状，如消瘦、生殖障碍、呼吸道症状、肠炎、以及猪皮炎和肾病综合症。

PCV2是迄今为止影响全球养猪业的最具经济破坏性的病毒病原体之一，而接种疫苗已成为减少与PCV2感染相关的经济损失的有效策略。目前，所有可商购的灭活疫苗或亚单位疫苗都靶向PCV2a亚型。然而，自2005年以来，新的亚型PCV2b已成为美国和其他国家中与PCVAD病例相关的最普遍的PCV2病毒株。此外，在全球接种疫苗的畜群中，新出现的PCV2d病毒株(之前称为“突变型PCV2b”)已在越来越多的病例中被发现，并且推测一些可能会克服疫苗的保护作用。直到最近，只有三种PCV2亚型被确认，包括PCV2a、PCV2b和PCV2c，最后一种在2000年前后在丹麦被发现，但并不十分普遍。虽然现在美国的大多数PCVAD病例与PCV2b相关，但自2012年被首次发现以来，新出现的PCV2d亚型(之前称为“突变型PCV2b”)在美国一直在缓慢增加并且现在比PCV2a更为普遍。参见Xiao CT,Halbur PG,Opriessnig T.的“Global molecular genetic analysis of porcine circovirus type 2(PCV2)sequences confirms the presence of four main PCV2genotypes and reveals arapid increase of PCV2d”J.Gen.Virol.96(2015)1830-1841。虽然PCV2d出现的确切原因尚不清楚，但在接种疫苗的畜群中常见，这表明对该新出现的病毒株的保护作用减弱。事实上，最近的一份报告已经证明了PCV2d亚型之间的遗传多样性日益增加，因为于1999年至2011年鉴定的大多数分离株可以归入“PCV2d-1”亚支，并且最近鉴定的来自2006年至2014年的大多数分离株与PCV2d-1亚支不同，且现被命名为“PCV2d-2”。参见Xiao等人(2015)，同上。此外，体外证据显示了PCV2亚型之间明显的抗原差异，该抗原差异可能有助于解释新病毒株的出现。因此，为了解决新出现的PCV2d以及目前在全球猪群中流行的占主导地位的PCV2b的问题，未来的疫苗策略应专注于通过靶向新出现的病毒株如PCV2d亚型和占主导地位的PCV2b亚型来扩大单一疫苗的保护作用。

从上述内容可以看出，本发明人认为需要新的疫苗来预防猪圆环病毒的爆发。本文提供了这种预防性疫苗。

发明内容

本发明提供了包含重组猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳多肽的疫苗组合物，该PCV2衣壳多肽包含来自多种PCV2基因型的衣壳的抗原表位。

在一个实施方案中，本发明提供了包含重组猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳多肽或其免疫原性衍生物的疫苗组合物，其中重组猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳多肽是不同于任何天然存在的PCV2衣壳多肽并且包含来自多种PCV2基因型的衍生于衣壳的氨基酸序列的嵌合氨基酸序列。

在一个实施方案中，该疫苗组合物包含重组PCV2衣壳多肽，该重组PCV2衣壳多肽选自命名为3cl.14(SEQ ID NO：8)、3cl.13(SEQ ID NO：4)、3cl.4_2(SEQ ID NO：2)、3cl.12_2(SEQ ID NO：6)的衣壳多肽。

在一个实施方案中，该重组PCV2衣壳多肽或其免疫原性衍生物包含来自PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e亲本基因型中的两种或多于两种的衍生于衣壳的氨基酸序列。

在一个实施方案中，该重组PCV2衣壳多肽及或其免疫原性衍生物与任何贡献的亲本基因型相差3至37个氨基酸。在一个实施方案中，免疫原性衍生物与任何亲本嵌合型衣壳多肽相差1至27个氨基酸。

在一个实施方案中，该重组PCV2衣壳多肽或其免疫原性衍生物包含至少PCV2c和PCV2d的衍生于衣壳的氨基酸序列。

在一个实施方案中，该PCV2衣壳多肽在细菌、酵母、哺乳动物、或昆虫细胞中表达。

在一个实施方案中，该重组PCV2衣壳多肽或其免疫原性衍生物由病毒载体编码。

在一个实施方案中，该疫苗组合物包含将猪圆环病毒1型(PCV1)的非致病性骨架与新型重组产生的猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳多肽结合的重组嵌合型猪圆环病毒，该PCV2衣壳多肽包含来自多种PCV2基因型的衣壳的抗原表位。

在一个实施方案中，该疫苗组合物包含重组嵌合型猪圆环病毒和PCV2衣壳多肽，该重组嵌合型猪圆环病毒包含编码猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳多肽而非PCV1的衣壳蛋白的重组猪圆环病毒1型(PCV1)，该PCV2衣壳多肽包含来自多种PCV2基因型的衣壳多肽的表位。在一个实施方案中，重组嵌合型猪圆环病毒被命名为PCV1_3cl.14且由SEQ ID NO：37编码。

在一个实施方案中，该PCV2衣壳多肽由DNA改组的PCV2衣壳基因序列编码。

在一个实施方案中，该PCV2衣壳多肽包含来自至少两种PCV2基因型的衣壳的抗原表位，该PCV2基因型选自PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和最近发现的且之前称为“PCV2e”的分歧PCV2a病毒。如本文所用，术语“分歧PCV2a病毒”和“PCV2e”可互换使用。在另一个实施方案中，PCV2衣壳多肽包含来自至少PCV2c和PCV2d病毒株的衣壳的抗原表位。

在一个实施方案中，疫苗是活疫苗、经修饰的活疫苗、灭活疫苗、减毒疫苗、或亚单位疫苗。在另一个实施方案中，疫苗组合物包含编码PCV2衣壳多肽的病毒载体。

在一个具体实施方案中，疫苗是灭活疫苗。在另一个具体的实施方案中，疫苗是亚单位疫苗或灭活的全病毒疫苗。

在一个方面，根据本发明的疫苗组合物还包含佐剂。在一个实施方案中，佐剂选自：水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂及其组合。在一个具体实施方案中，佐剂包含油乳剂，该油乳剂包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、角鲨烷、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯和缓冲盐溶液(SP-油)。在一个实施方案中，该组合物还包含药学上可接受的载体。

在另一个实施方案中，该疫苗组合物还包含至少一种额外的抗原。在某些实施方案中，至少一种额外的抗原保护性地抵御可以引起猪疾病的微生物。在另一个实施方案中，抗原包括一种或多于一种衍生于已知在猪中具有致病性的细菌、病毒、或寄生微生物的抗原。例如，细菌微生物可选自胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilllus pleuropneumoniae)；支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)；猪痢疾短螺旋体(Brachyspirahyodysenteriae)；布鲁氏菌病(猪布鲁氏菌(B.suis))；弯曲杆菌(Campylobacter spp.)；梭菌(Clostridium spp.)；大肠杆菌(Escherichia coli)；猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)；猪等孢球虫(Isospora suis)；胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)；钩端螺旋体(Leptospiraspp.)；单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinis)；猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynoviae)；絮状支原体(Mycoplasmaflocculare)；猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)；出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)；猪链球菌(Streptococcum suis)；葡萄球菌(Staphylococcusspp.)，包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)和猪葡萄球菌(S.hyicus)；沙门氏菌(Salmonellaspp.)，包括猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)和肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)；耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)；牛旋毛虫(Trichinella spiralis)；刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)以及小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)中的一种或多于一种。病毒微生物可以包括非洲猪瘟病毒、经典猪瘟病毒(CSF)、口蹄疫病毒(FMDV)、尼帕病毒(Nipah virus)、猪巨细胞病毒、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪肠道病毒、脑心肌炎病毒、猪生殖和呼吸道综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪呼吸道冠状病毒(PRVV)、假狂犬病病毒(PRV)又称猪疱疹病毒1型、轮状病毒、猪流感病毒(SIV)、细环病毒(TTV)、以及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。寄生微生物可以包括猪蛔虫(Ascaris suum)、结肠小袋纤毛虫(Balatidium coli)、刚地弓形虫(Toxiplasma gondii)、以及隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)。

在另一个实施方案中，提供了嵌合核酸分子，其具有衍生于多种PCV2基因型的DNA改组的PCV2衣壳基因序列或其编码PCV2衣壳多肽表位的衍生物。在一个实施方案中，这些嵌合核酸分子包含编码非致病性PCV1的核酸分子，该非致病性PCV1含有衍生于多种PCV2基因型的DNA改组的PCV2衣壳基因序列而非PCV1核酸分子的衣壳基因序列。在一个实施方案中，DNA改组的PCV2衣壳基因序列选自命名为3cl.14(SEQ ID NO：7)、3cl.13(SEQ ID NO：3)、3cl.4_2(SEQ ID NO：1)、3cl.12_2(SEQ ID NO：5)的衣壳基因序列。

在一些实施方案中，嵌合核酸分子包含在病毒载体中。实例包括但不限于杆状病毒(baculovirus)载体和副痘病毒(parapox)载体。

本文还提供了保护猪免受多种PCV2基因型感染的方法。该方法包括向猪施用免疫有效量的本文公开的疫苗组合物、嵌合核酸分子、或病毒载体。在多种实施方案中，该方法包括通过选自经胃肠道外、经鼻、皮内和经皮的一种或多于一种途径向猪施用疫苗组合物、嵌合核酸分子或病毒载体。在另一个实施方案中，疫苗组合物、嵌合核酸分子或病毒载体以单剂量施用。在另一个实施方案中，组合物与至少一种额外的抗原联合施用，该额外的抗原保护性地抵御可以引起猪疾病的微生物，其实施例如上所述。在另一个实施方案中，通过至少PCV2b和PCV2d保护猪免受感染。

附图说明

为了更完整地理解包括特征和优点在内的本发明，现在参考本发明的详细描述以及附图：

图1显示了在用实验方法感染了含有改组衣壳的嵌合型PCV2病毒或感染了PCV1-2a疫苗病毒的猪中的PCV2特异性抗体的血清转变结果。

图2显示了在用PCV1-3cl14病毒接种并用PCV2b或PCV2d-2攻击的猪中通过ELISA检测的PCV2特异性抗体的血清转变结果以及通过PCR检测的病毒血症结果。

图3描绘了来自五种亲本PCV2野生型病毒株的衣壳蛋白和本文公开的四种新型DNA改组衣壳蛋白的氨基酸序列比对。前五个序列代表亲本病毒株，而后四个序列代表DNA改组的PCV2衣壳。与共识序列不同的氨基酸以黑色显示。

图4描绘了来自不同亚型的所选PCV2病毒株的衣壳基因的系统发育树。使用邻接方法通过1000次自展重复构建系统发育树。每个主要分支上方的数字表示自展值。粗斜体序列名称代表用于本文公开的DNA改组的五种亲本病毒株的PCV2序列。

图5A至图5D比较了来自用实验方法接种了嵌合型病毒PCV2-3cl13、PCV2-3cl14、PCV2-3cl4_2和PCV2-3cl12_2、或具有改组衣壳基因的PCV1-2a的猪的血清中的四种PCV2野生型病毒株的50％中和抗体滴度。针对三种亲本PCV2病毒株，在感染后第56天收集的各个血清的体外50％中和测定：(图5A)PCV2a分离株、(图5B)PCV2d-1分离株、(图5C)PCV2b分离株、和(图5D)PCV2d-2分离株。计算得到NA滴度为血清样品的最高2倍稀释度(2ⁿ)，显示出在相同稀释度下与来自模拟接种的对照组(PBS)的血清样品相比，阳性荧光灶数量减少50％或更多。星号(*)表示使用单因素ANOVA分析得到p<0.05。

图6描绘了以实验方法接种嵌合型病毒PCV1-3cl14候选疫苗并用野生型病毒株PCV2b或PCV2d-2攻击的常规猪中的PCV2衣壳特异性抗体应答。在整个研究期间，绘制每个处理组的平均S/P比±SEM。病毒攻击发生在接种疫苗后第42天(dpv(疫苗接种后的天数))。0.2的S/P比处的虚线表示该测定中阳性样品的下端截止值。

图7A显示与仅被攻击的对照组相比，对来自用嵌合型PCV1-3cl14病毒接种的并随后用PCV2b攻击的猪的血清中的PCV2病毒DNA载量使用qPCR进行定量。图7B显示与仅被攻击的对照组相比，对来自用嵌合型PCV1-3cl14病毒接种的并随后用PCV2d-2攻击的猪的血清中的PCV2病毒DNA载量使用qPCR进行定量。在图7A和图7B中，绘制攻击后每个时间点的组平均值±SEM。测定的检测限为10^4.2拷贝/mL(即单位血清中的ORF1DNA拷贝数)，该拷贝数通过野生型PCV2b基因组的10¹至10¹⁰拷贝的标准曲线确定。(*)表示组间的统计学显著性(学生t检验，多次检验校正)。

图8A显示与仅被攻击的对照组相比，对来自用嵌合型PCV1-3cl14病毒接种的并用PCV2b攻击的猪的淋巴结中的PCV2病毒DNA载量使用qPCR进行定量。图8B显示与仅被攻击的对照组相比，对来自用嵌合型PCV1-3cl14病毒接种的并用PCV2d-2攻击的猪的淋巴结中的PCV2病毒DNA载量使用qPCR进行定量。在图8A和图8B中，绘制攻击后每个时间点的组的平均值±SEM。测定的检测限为10^7.1拷贝/mg(即单位组织中的ORF1病毒DNA拷贝数)，该单位组织中的ORF1病毒DNA拷贝数通过野生型PCV2b基因组的10¹至10¹⁰拷贝的标准曲线确定。星号(*)表示在该时间点的组间的统计学显著性(学生t检验，多重检验校正)。

图9A至图9F比较了用嵌合型PCV1-3cl.14病毒接种的并随后用PCV2b或PCV2d-2攻击的猪中的淋巴组织与仅被攻击的对照组的淋巴组织。图9A显示淋巴结中的淋巴细胞耗竭。图9B显示淋巴结中的组织细胞置换。图9C显示脾脏中的淋巴细胞耗竭。图9D显示脾脏中的组织细胞置换。图9E显示扁桃体中的淋巴细胞耗竭。图9F显示扁桃体中的组织细胞置换。图9A至图9F的每张图中，将被接种疫苗的和被攻击的动物(■)与仅被攻击的对照组的动物(○)的尸体剖检结果进行比较。个体动物评分由个体符号和组平均值±SEM表示。星号(*)表示组间的统计学显著性差异(学生t检验)。

图10A至图10C描绘了通过PCV2的免疫组织化学(IHC)定量淋巴组织中的PCV2病毒抗原。从用嵌合型PCV1-3cl14病毒接种的并随后用PCV2b或PCV2d-2攻击的猪获得组织，并与仅被攻击的对照组进行比较。图10A显示了针对淋巴结确定的PCV2病毒抗原评分，图10B显示了针对脾脏确定的PCV2病毒抗原评分，图10C显示了针对扁桃体确定的PCV2病毒抗原评分。图10A至图10C的每张图中，将被接种疫苗的和被攻击的动物(■)与仅被攻击的对照组的动物(○)的尸体剖检结果进行比较。个体动物评分由个体符号和组平均值±SEM表示。星号(*)表示组间的统计学显著性差异(学生t检验)。

图11显示了嵌合型PCV2-3cl.4_2病毒的衣壳蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：1)、多肽序列(SEQ ID NO：2)和核酸/氨基酸翻译的比对，而图12显示了PCV2-3cl.4_2病毒的全长核酸序列(SEQ ID NO：33)。

图13显示了嵌合型PCV2-3cl.13病毒的衣壳蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：3)、多肽序列(SEQ ID NO：4)和核酸/氨基酸翻译的比对，而图14显示了PCV2-3cl.13病毒的全长核酸序列(SEQ ID NO：34)。

图15显示了嵌合型PCV2-3cl.12_2病毒的衣壳蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：5)、多肽序列(SEQ ID NO：6)和核酸/氨基酸翻译的比对，而图16显示了PCV2-3cl.12_2病毒的全长核酸序列(SEQ ID NO：35)。

图17显示了嵌合型PCV2-3cl.14病毒的衣壳蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：7)、多肽序列(SEQ ID NO：8)和核酸/氨基酸翻译的比对，而图18显示了PCV2-3cl.14病毒的全长核酸序列(SEQ ID NO：36)。

图19显示了PCV1-3cl.14病毒的全长核酸序列(SEQ ID NO：37)，其中PCV2-3cl.14病毒的衣壳序列克隆到PCV1骨架上。

图20A至图20C显示了作为查询序列的PCV1_3cl.14全长与作为对象序列的PCV2_3cl.14全长之间的比对。嵌合型PCV2-3cl14的衣壳蛋白的序列用下划线和粗体表示。

图21显示了在GenBank AF264042中反映的PCV2a基因型病毒的衣壳蛋白的核酸(SEQ ID NO：9)/氨基酸翻译(SEQ ID NO:10)的比对。

图22显示了在GenBank GU799576中反映的PCV2b基因型病毒的衣壳蛋白的核酸(SEQ ID NO：11)/氨基酸翻译(SEQ ID NO:12)的比对。

图23显示了在GenBank AY181947中反映的PCV2d-1基因型病毒的衣壳蛋白的核酸(SEQ ID NO：13)/氨基酸翻译(SEQ ID NO:14)的比对。

图24显示了在GenBank EU148503中反映的PCV2c基因型病毒的衣壳蛋白的核酸(SEQ ID NO：15)/氨基酸翻译(SEQ ID NO:16)的比对。

图25显示了在GenBank EU524533中反映的PCV2e基因型病毒的衣壳蛋白的核酸(SEQ ID NO：17)/氨基酸翻译(SEQ ID NO:18)的比对。

具体实施方式

虽然下面详细讨论了本发明各种实施方案的进行和使用，但应该理解，本发明提供了许多可以在各种特定情况下使用的可适用的发明概念。这里讨论的具体实施方案仅说明进行和使用本发明的具体方式，并不限制本发明的范围。

本文提供了通过衣壳基因的DNA改组对代表PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和“PCV2e”亚型的遗传分歧PCV2病毒株进行分子育种以产生表现PCV2亚型之间遗传多样性的新型嵌合PCV2衣壳序列的公开内容。相信这是首次公开通过对属于不同亚型的5种分歧PCV2病毒株的衣壳基因进行改组来构建有效的嵌合型PCV2候选疫苗。

在一个实施方案中，当置于PCV2a骨架中时，嵌合型病毒(PCV2-3cl14)诱导针对不同PCV2亚型的高中和抗体滴度。在另一个实施方案中，通过将改组的3cl14衣壳克隆到非致病性PCV1的骨架中来产生候选疫苗(PCV1-3cl14)。疫苗功效研究表明，嵌合型病毒PCV1-3cl14诱导针对猪中PCV2b或PCV2d攻击的保护性免疫，因此代表了感染有可变PCV2病毒株的猪中新型疫苗的强力候选者。

为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。本文定义的术语具有本发明相关领域中普通技术人员通常理解的含义。要素前无数量词不旨在仅指单个实体，而是包括可以用于说明的具体实例的普遍类别。本文的术语用于描述本发明的具体实施方案，但除权利要求中所概述的以外，其使用不限定本发明。

如说明书和权利要求书中所使用的，要素前无数量词包括复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，术语“蛋白质抗原”包括多种蛋白质抗原及其混合物。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。

术语“抗原”是指可以在动物中刺激抗体或T细胞应答或两者的产生的化合物、组合物或免疫原性物质，其包括注射或吸收到动物体内的组合物。可以对整个分子或分子的一部分(例如表位或半抗原)产生免疫应答。

如本文所用，术语“表位”是指充当抗体或T细胞受体识别的结合位点的抗原的不连续部分。例如，表位可以指由抗体的互补决定区(CDR)识别的抗原决定簇。各结合抗体的结合表位的部位称为“互补位”。

B细胞表位可以是线性表位或构象表位且大多数强表位是构象表位。T细胞表位是线性表位。线性表位是位于较大蛋白质中的长度通常为5-20个氨基酸的连续的氨基酸序列。通常，强B细胞表位由天然蛋白质上的构象结构限定。形成构象表位的氨基酸可以是折叠的连续的氨基酸段，或者可以是不连续的，其中识别互补位的部位位于通过天然蛋白质结构的折叠聚集在一起的蛋白质的不同部分上。

由于衣壳蛋白组装成完整组装的病毒粒子颗粒而形成了独特的三级构象结构，病毒表位可以包括隐位(cryptotope)和新表位(neotope)，其中隐位是隐藏在组装病毒粒子中的表位且新表位是仅在完整的组装的病毒粒子中形成而不存在于其拆分部件的表位。本文使用的术语表位包括隐位和新表位。对于一个非限制性实例，如本文所用的“表位”是指PCV2ORF2改组的衣壳的区域且PCV2衣壳特异性抗体的互补位与该区域反应。

如本文所用，术语“模拟表位”是指大分子，通常来说是肽，其模拟表位的构象结构并与识别相应表位的抗体结合。因此，可以使用对给定表位具有特异性的抗体通过生物淘选噬菌体或噬菌粒展示文库来获得模拟表位。

如本文所定义的，“免疫原性组合物或免疫组合物”是指包含至少一种抗原的物质的组合物，该抗原在宿主中引发对感兴趣的组合物或疫苗的细胞的免疫应答和/或抗体介导的免疫应答。

如本文所用的术语“免疫应答”是指在动物中引发的应答。免疫应答可以指细胞免疫(CMI)或体液免疫或可能涉及两者。本发明还考虑了限于免疫系统的一部分的应答。通常，“免疫应答”包括但不限于以下一种或多于一种事件：特异性导向包含在感兴趣的组合物或疫苗中的抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生或活化。优选地，宿主将展示治疗性的或保护性的免疫应答，从而增强对新感染的抵抗力和/或降低疾病的临床严重度。通过被感染宿主通常显示的症状的减轻或缺乏、被感染宿主中更快的恢复时间和/或更低的病毒滴度来证明这种保护。

如本文所用，术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子以及其部分、片段、和衍生物，例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、Fsc、CDR区、或能够结合抗原或表位的抗体的任何部分，该能够结合抗原或表位的抗体包括具有双特异性的嵌合抗体或将源自抗体的抗原结合域与另一种多肽结合的嵌合抗体。如本文所用的术语“抗体”还包括具有重链抗体的单个单体可变抗体结构域(V_H)的单结构域抗体(sdAb)及其片段。缺乏可变轻链(V_L)结构域和恒定区轻链(C_L)结构域的sdAb天然存在于骆驼科动物(V_HH)和软骨鱼(V_NAR)中，并且有时被制药公司Ablynx称为“纳米抗体”，该公司最初开发出特异性结合美洲驼中sdAb的抗原。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从最初由单个B淋巴细胞克隆产生的基本上同质的抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。术语“单克隆抗体”包括由任何已知技术提供的衍生于单克隆抗体和各物种相应的单克隆抗体的嵌合抗体及其片段、部分、区域或衍生物，这些技术包括但不限于分子技术，包括噬菌体展示技术、亲和力成熟技术和定向诱变技术以及包括共价修饰和缀合的化学技术。

本文所用的“佐剂”是指由一种或多于一种增强对抗原的免疫应答的物质组成的组合物。佐剂如何起作用的机制尚不完全清楚。一些佐剂被认为通过缓慢释放抗原来增强免疫应答，而其他佐剂本身具有强免疫原性并被认为起到协同作用。

如本文所用，术语“多价”是指含有一种以上抗原的疫苗，无论是来自相同物种(即猪肺炎支原体的不同分离株)，还是来自不同物种(即来自溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahemolytica)和多杀巴斯德氏菌的分离株)、或指含有来自不同属的抗原的组合的疫苗(例如，包含来自多杀巴斯德氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)和梭菌的抗原的疫苗)。

本文所用的术语“猪”或“仔猪”是指猪源的动物。

如本文所用，术语“毒性(的)”是指分离物保留其在动物宿主中的感染性的能力。

“灭活疫苗”是指含有不再能够复制或生长的感染性生物或病原体的疫苗组合物。病原体可以是细菌、病毒、原生动物或真菌。灭活可以通过多种方法完成，包括冻融、化学处理(例如，用硫柳汞或福尔马林处理)、超声处理、辐射、加热或任何其它足以在保持生物体免疫原性的同时防止其复制或生长的常规方法。

如本文所用的术语“变体”是指编码具有一个或多于一个氨基酸变异如保守变异或其他微小修饰(例如，截短)使得相应的多肽与野生型多肽相比具有基本相同的功能的多肽或编码该多肽的核酸序列。

“保守变异”表示用另一种生物学上相似的残基置换氨基酸残基，或置换核酸序列中的核苷酸，使得编码的氨基酸残基不改变或变为另一种生物学上相似的残基。保守变异的实施例包括用一个疏水残基，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，置换另一个疏水残基，或置换一个极性残基，如精氨酸置换赖氨酸、谷氨酸置换天冬氨酸、或谷氨酰胺置换天冬酰胺等。术语“保守变异”还包括使用置换的氨基酸代替未被置换的亲本氨基酸，条件是置换的多肽产生的抗体也与未置换的多肽发生免疫反应。

如本文所用，术语“改组”是指不同PCV病毒株的衣壳基因片段之间的分子重组。可以通过几种目前已知的方法进行改组，其包括：PCR改组、交错延伸程序(StEP)、合成改组、渐进切割法产杂和酶技术(ITCHY)、和非同源随机重组(NRR)。无论如何进行改组，所得的分子因为由不同亲本DNA的重组片段组成而称为“嵌合体”。PCR改组通过如下步骤进行：片段化，例如用DNA酶消化，混合片段，通过无引物PCR进行扩增，然后使用对有待通过改组而重组的基因的末端区域具有特异性的引物进行扩增。最终的引物将包含能够克隆经改组的类似片段的限制性内切酶位点。Stemmer，W.P.C.“DNA shuffling by random fragmentationand reassembly:In vitro recombination for molecular evolution”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(22)(1994)10747–10,751中首先描述了这种方法。StEP方法通过重复的过早变性PCR延伸阶段来获得同源重组。部分聚合的基因可以转换模板，并且获得的全长嵌合体具有不同数量的交换。合成改组，也称为组合式PCR，其利用编码许多基因座处的遗传变异的寡核苷酸的重叠文库。合成改组可以产生相当大的变异。ITCHY涉及使用外切核酸酶来截短不同基因变体的混合物，然后进行平末端连接。NRR使用DNA酶进行片段化，然后进行平末端连接以产生不同的拓扑重排(缺失、插入和结构域重新排序)。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指用于包含可以注射到宿主中且没有副作用的疫苗抗原的流体载体。本领域已知的合适的药学上可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲溶液。载体可包括助剂，助剂包括但不限于稀释剂、稳定剂(糖和氨基酸)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂、黏度增强添加剂、着色剂等。

如本文所用，术语“疫苗组合物”包括在药学上可接受的载体中的至少一种抗原或免疫原，其可用于在宿主中诱导免疫应答。疫苗组合物可以按剂量施用并通过医学或兽医领域技术人员熟知的技术施用，同时考虑例如接受体动物的年龄、性别、体重、物种和状况、以及给药途径等因素。给药途径可以是经皮(通过皮内、经皮、皮下、肌内途径而穿过皮肤或通过口腔、鼻腔、肛门、阴道而穿过黏膜)或通过肠胃外途径(静脉内或腹膜内)。疫苗组合物可以单独施用，或者可以与其他治疗或疗法共同施用或按顺序施用。给药形式可包括混悬剂、糖浆剂或酏剂，以及用于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内给药(例如注射给药)的制剂，例如无菌混悬剂或乳剂。疫苗组合物可以以喷雾形式给药或混合于食物和/或水中或与合适的载体、稀释剂、或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合递送。该组合物可含有辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、凝胶化或黏度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，这取决于给药途径和所需制剂。可以参考标准制药文本，例如“Remington'sPharmaceutical Sciences”1990来制备合适的制剂，而无需过多的实验。

猪圆环病毒2型(PCV2)是在不受控制的情况下在全球养猪业中造成高经济损失的猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要致病因子。事实上，PCVAD可能是影响全球养猪业经济上最重要的疾病之一。以进行性消瘦、伴有组织细胞浸润的淋巴细胞消减的标志性组织学病变、以及病变中PCV2抗原或DNA的存在为特征的PCVAD是由PCV2感染引起的，然而与其他病原体共同感染通常是临床PCVAD全谱开发的必要条件。目前可商购的疫苗均以PCV2a亚型为靶标，该亚型在2005年之前是主要亚型，但是目前在全球猪群中流行的主要亚型是PCV2b，并且新出现的PCV2d亚型与接种疫苗的猪群中的PCVAD越来越相关。现在PCV2b已经超过PCV2a成为与养猪业中PCVAD损失相关的最普遍的病毒株。此外，最近报道了疫苗失效的证据，并且与PCV2d(或突变PCV2b)亚型的出现有关。因此，必须开发特别针对新出现的PCV2病毒株的下一代疫苗。

为此，本发明人通过DNA改组对来自不同PCV2亚型的衣壳基因进行分子育种，并开发基于非致病性PCV1骨架和分歧PCV2亚型的改组的衣壳基因的候选嵌合型病毒疫苗。在DNA改组方法中，使用来自四种已知PCV2亚型中的每一种以及来自现通常被认为是分歧PCV2a病毒株的“PCV2e”类型的五种基因上不同的衣壳序列。在被克隆和测序的超过50种改组的PCV2衣壳中，其中仅有四种在PK15细胞中拯救了感染性嵌合病毒，这表明小PCV2基因组不能支持衣壳基因内的大量强制随机重配。

具有通过DNA改组产生的改组PCV2衣壳的四种有活力的嵌合病毒含有来自全部五种基因上分歧的PCV2病毒株的抗原表位，但是改组的衣壳中的大多数变异性可以在PCV2c亲本病毒株中发现。基于系统发育分析，PCV2c亚型是迄今鉴定的与其余PCV2亚型分歧最大的病毒株。五种所选的亲本病毒株的比对显示PCV2c实际上确实含有基因上区别最大的氨基酸变异，但是这些氨基酸中的一些与亲本PCV2d病毒株重叠，该变异包括添加末端赖氨酸残基。PCV2c和PCV2d病毒株特有的氨基酸残基的存在表明，虽然PCV2c亚型与任何临床疾病无关，但该亚型可能有助于当前PCV2d亚型的进化出现。事实上，自PCV2c亚型于20世纪90年代初在丹麦被首次描述以来，其最近才首次从巴西的野猪中分离出来。野猪群还被其他三种PCV2亚型感染，这表明重组的可能性。因此，这些发现支持包含用于DNA改组的PCV2c，以增加所得候选疫苗对目前新出现和未来可能出现的PCV2病毒株的保护范围。

为了确定改组的嵌合病毒的体内感染性并筛选用于随后的攻击和功效研究的最佳嵌合体，在试验性研究中，用在PCV2a骨架中具有改组衣壳的四种嵌合型病毒中的每一种以及用嵌合型PCV1-2a疫苗病毒对常规猪进行实验性接种。结果显示，与嵌合型PCV1-2a病毒以及其他三种嵌合型病毒相比，嵌合型病毒PCV2-3cl.14诱导更高水平的中和抗体滴度。嵌合型病毒PCV2-3cl.14还诱导针对PCV2a和PCV2d-2病毒株的显著更高的中和抗体滴度。如图3所示，将改组衣壳3cl.14的氨基酸序列与其他三种改组衣壳的氨基酸序列及PCV1-2a的氨基酸序列进行比较，显示出三个具有不同氨基酸残基的区域。这些区域中的两个，即106至108位氨基酸和126位氨基酸，与之前鉴定的B细胞抗原表位重叠。另外，126位的突变对应于预测的B细胞和SLA-II类表位内的位置。有趣的是，3cl.13、3cl.4_2和3cl.12_2改组的衣壳均包含在PCV2d亲本病毒株中发现的衣壳C端的额外赖氨酸残基。该突变被认为在新出现的PCV2d病毒株的致病性和疫苗失效中起到作用，尽管迄今尚未报道该作用的直接证据。然而，3cl.14改组的衣壳序列不包含额外的赖氨酸，这表明它不是产生针对PCV2d-2病毒株的中和抗体的必需表位，因为PCV1-3cl.14在攻击和功效实验中保护性地抵御PCV2d-2感染。上述3cl.14衣壳序列的特性可能对猪中的交叉保护性中和抗体的产生是重要的。

基于诱导显著更高的交叉中和抗体滴度，随后挑选改组的3cl.14衣壳序列以产生嵌合型病毒PCV1-3cl.14候选疫苗。通过分别用PCV2b或PCV2d攻击接种疫苗的猪来评估作为潜在疫苗的PCV1-3cl.14嵌合型病毒的保护性功效。PCV2b是目前全世界感染猪的主要亚型，而PCV2d是新出现的亚型。我们之前证明了嵌合型PCV1-2a和PCV1-2b病毒在体内非致病性PCV1的基因组骨架中的减毒作用。与之前的报告一致，在整个研究期间，在接种疫苗的猪中检测不到PCV1-3cl.14病毒血症，并在用PCV2b或PCV2d攻击之前检测不到临床疾病(数据未显示)，但是通过PCV2衣壳抗体的血清转变证实了接种疫苗的猪的感染。

用嵌合型病毒PCV1-3cl.14候选疫苗进行疫苗接种导致了在病毒血症峰值时PCV2b或PCV2d病毒DNA载量的显著降低以及在研究结束时淋巴组织中病毒DNA载量的降低。此外，与模拟接种疫苗的对照组和被攻击的对照组相比，接种疫苗并随后用PCV2b攻击的组中的淋巴损伤也显著降低。虽然接种疫苗的动物在PCV2d攻击时没有显示出脾脏淋巴细胞耗尽以及脾脏和扁桃体组织细胞置换的显著降低，但它们确实显著降低了PCVAD评分的其余项，并减少了血清和淋巴结组织中的病毒DNA载量，这表明PCV1-3cl.14嵌合型病毒候选疫苗在常规猪中诱导针对PCV2b和PCV2d攻击的保护作用。

总之，这是通过改组属于不同亚型的5种分歧PCV2病毒株的衣壳基因而首次公开构建有活力的嵌合型PCV2候选疫苗。重要的是，用具有改组的衣壳基因的嵌合型病毒PCV1-3cl.14对猪进行疫苗接种诱导针对PCV2b和PCV2d攻击的保护性免疫，以支持这种用于商业疫苗的构建。

为了公开的完整性，包括了以下实施例以说明制备本发明组合物和复合物的方法以及呈现组合物的某些特征。这些实施例决不旨在限制本公开的范围或教导。

实施例1

嵌合型疫苗的产生和测试

在一个实施方案中，首先将改组的PCV2衣壳基因克隆到PCV2a的骨架中。总共四种嵌合病毒被发现在体外存活并随后用于感染猪以评估它们诱导针对不同PCV2亚型的交叉中和抗体的能力。一种嵌合病毒(PCV2-3cl.14)诱导针对不同的PCV2亚型更高的中和抗体滴度。通过将改组的3cl.14衣壳基因克隆到非致病性PCV1的基因组骨架中来产生候选疫苗(PCV1-3cl.14)。

在32只猪中进行的疫苗功效研究表明，嵌合病毒PCV1-3cl.14诱导针对用PCV2b或PCV2d攻击的保护性免疫。与模拟接种的猪相比，用PCV1-3cl.14接种并随后用PCV2b或PCV2d攻击的猪具有显著降低的显微病变和在血清和淋巴组织中更低的病毒DNA载量。嵌合PCV1-3cl.14病毒为通常感染可变PCV2病毒株的猪群提供了新的第二代PCV2疫苗的强有力的候选者。

细胞：先前通过对PK-15细胞(ATCC CCL-33)进行终点稀释产生不含PCV1污染物的PK-15细胞系的亚克隆。该亚克隆PK-15细胞系在补充有10％胎牛血清(FBS)和抗生素的最小必需培养基(MEM)中培养，并且被用于血清病毒中和测定以及被用以繁殖该研究的全部病毒原种。

来自五种不同PCV2亚型的衣壳基因的DNA改组：选择代表五种遗传多样化PCV2亚型中的每一种的衣壳基因序列用于DNA改组，包括PCV2a(病毒株40895，GenBank检索号AF264042，SEQ ID NO：9)、PCV2b(病毒株NC16845，检索号GU799576，SEQ ID NO：11)、PCV2c(检索号EU148503，SEQ ID NO：15)、PCV2d-1(检索号AY181947，SEQ ID NO：13)、和“PCV2e”(检索号EF524533，SEQ ID NO：17)。PCV2a和PCV2b病毒株从美国猪中分离出并且描述在Fenaux等人和Beach等人中，而PCV2c、PCV2d-1和“PCV2e”衣壳基因通过GenScript(Piscataway，NJ)合成。参见Fenaux M，Opriessnig T，Halbur PG，Elvinger F，Meng XJ.“Achimeric porcine circovirus(PCV)with the immunogenic capsid gene of thepathogenic PCV type 2(PCV2)cloned into the genomic backbone of thenonpathogenic PCV1induces protective immunity against PCV2infection in pigs”JVirol 78(2004)6297-6303，以及Beach NM，Ramamoorthy S，Opriessnig T，Wu SQ，MengXJ.“Novel chimeric porcine circovirus(PCV)with the capsid gene of theemerging PCV2b subtype cloned in the genomic backbone of the non-pathogenicPCV1is attenuated in vivo and induces protective and cross-protectiveimmunity against PCV2b and PCV2a subtypes in pigs”Vaccine 29(2010)221-232。

DNA改组用于对五种不同的PCV2衣壳基因进行改组，基本上如先前在Ni YY等人中对PRRSV所述的一样(参见Ni YY,Opriessnig T,Zhou L,Cao D，Huang YW,Halbur PG,MengXJ.“Attenuation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus bymolecular breeding of virus envelope genes from genetically divergentstrains”J Virol 87(2013)304-313)。简而言之，将来自五种PCV2病毒株中的每一种的衣壳基因DNA与总共5μg DNA以等摩尔量混合并稀释在50μl的50mM Tris-HCl(pH 7.4)和10mMMgCl₂中。将混合物与0.15U的DNA酶I(Sigma)在15℃下孵育3分钟。从2％琼脂糖凝胶中纯化大小为50bp至150bp的DNA片段，随后将该DNA片段加入到由1X Pfu缓冲液、0.2mM的各种脱氧核苷三磷酸(dNTP)和0.06U Pfu聚合酶组成的Pfu PCR混合物中。使用无引物的PCR程序(95℃4分钟；95℃30秒、60℃30秒、57℃30秒、54℃30秒、51℃30秒、48℃30秒、45℃30秒、42℃30秒、以及72℃2分钟，40个循环；以及最后，72℃7分钟)来重新组装经消化的DNA片段。随后，根据制造商的说明书(95℃4分钟；95℃30秒、50℃30秒、72℃30秒，10个循环；95℃30秒、54℃30秒、72℃30秒，25个循环；以及最后72℃7分钟)，使用Pfu Ultra II Hotstart PCRMaster Mix(Agilent Technologies)将与改组的PCV2衣壳区域侧翼结合的特异性引物UniRep-F和2aORF2-R(表1)用来扩增改组的PCV2衣壳。

表1:寡核苷酸引物

具有改组的PCV2衣壳基因的嵌合PCV2a病毒和PCV1病毒的感染性DNA克隆的构建：根据制造商的说明书，使用Zero PCR Cloning kit(Life Technologies，Carlsbad)将改组的衣壳基因产物文库克隆至平末端克隆载体pCR-Blunt II中。对所选的克隆进行测序并分析DNA改组效率，并且对含有来自全部5种PCV2亚型的区域的良好改组的衣壳基因进行扩增，随后通过融合PCR将其克隆至PCV2a病毒株40895的感染性DNA克隆骨架中，基本描述于Opriessnig T，Xiao CT，Gerber PF，Halbur PG，Matzinger SR，Meng XJ.“Mutant USA strain of porcine circovirus type 2(mPCV2)exhibits similarvirulence to the classical PCV2a and PCV2b strains in caesarean-derived,colostrum-deprived pigs”J Gen Virol 95(2014)2495-2503。

简而言之，使用引物UniRep-F和2aORF2-R(表1)对改组的PCV2衣壳进行扩增。对于PCV2a片段1和片段2，分别使用引物SacII-uni-F和UniRep-R与引物2aORF2F和SacII-uni-R两个片段中扩增PCV2a的感染性DNA克隆骨架序列(表1)，所述片段位于PCV2衣壳区域侧翼。使用ACCUZYME MIX^TM(Bioline)，以95℃10分钟，35个循环的95℃30秒、54℃30秒和68℃1.5分钟进行全部三个PCR反应。使用外部引物SacII-uni-F和2aORF2-R对PCV2片段1和改组的PCV2衣壳序列进行第一融合PCR。随后，使用外部引物SacII-uni-F和SacII-uni-R(表1)对第一融合PCR反应的产物和PCV2a片段2进行第二融合PCR反应。使用ACCUZYME MIX^TM以95℃10分钟，35个循环的95℃30秒、60℃30秒和68℃4分钟进行全部融合PCR反应。对含有各个单独的改组的PCV2衣壳的全长嵌合PCV2a进行扩增，并使用克隆试剂盒将其克隆至pCR-Blunt II TOPO质粒中，以产生具有改组的衣壳基因的嵌合PCV2a的感染性DNA克隆。

通过类似的融合PCR方案，将改组的PCV2衣壳3cl14(SEQ ID NO：7)克隆至非致病性PCV1的感染性DNA克隆骨架中，以产生候选疫苗PCV1-3cl14(SEQ ID NO：37)。简而言之，使用引物PCV1-BB-F和PCV1-DS-ORF2-R对改组的PCV2衣壳3cl14序列(表1)进行扩增。对于PCV1片段1和片段2，分别使用引物M13F(-20)和PCV-BB-R与引物PCV-DS-ORF2-F和M13R从含有PCV1的PBSK+质粒在两个片段中扩增感染性DNA克隆PCV1骨架序列(表1)，所述片段位于PCV1衣壳区域侧翼。使用 PCR Supermix(Thermo Scientific)在94℃持续3分钟，35个循环的94℃持续30秒，55℃持续30秒和68℃持续1分钟的条件下进行全部三个PCR反应。使用外部引物M13F和PCV1-DS-ORF2-R并用PCV1片段1和改组的PCV2衣壳3cl14片段进行第一次融合PCR(表1)。使用外部引物M13F和M13R(众所周知的可商购的pUC/M13测序引物)并用第一次融合PCR反应的产物和PCV1片段2进行第二次融合PCR反应。使用克隆试剂盒将含有改组的衣壳3cl14的全长嵌合型PCV1病毒克隆到pCR-BluntII TOPO中，以产生候选疫苗嵌合型PCV1病毒3cl14的感染性DNA克隆。

病毒原种的制备：PCV2b病毒株NC16845、美国PCV2d-2病毒株JX535296、和每种PCV2a衣壳改组的嵌合病毒的感染性病毒原种通过将来自各自的感染性DNA克隆的连环化(concatemerized)病毒基因组转染PK-15细胞来产生。简而言之，将各自的PCV2基因组通过SacII消化从pCR-Blunt II TOPO切下，进行连环化并转染至PK-15细胞中，通过免疫荧光测定(IFA)确定生存力和感染性。嵌合PCV1-2a和含有改组3cl14衣壳的嵌合PCV1(PCV1-3cl14)的病毒原种如上所述类似地进行制备，除了在进行连环化之前通过KpnI消化从pCR-Blunt II TOPO载体中切下病毒基因组。

PCV2衣壳改组的嵌合病毒的感染性和交叉中和活性的确定：为了初步鉴定具有针对不同PCV2亚型的改善的交叉中和活性的有活力的改组嵌合病毒，首先用有限数量的动物(n＝3)进行试验性猪感染研究。从商业农场购买总共十八(18)只、4周龄、杂交的常规猪，通过对选定批次的猪进行定期PCV2PCR来确定，已知其不含PRRSV和猪肺炎支原体、无活跃的PCV2传播。母猪的抗PCV2抗体的量低或者是血清反应阴性的，而选择了来自阴性母猪且没有交叉哺乳的幼崽。将仔猪随机分成6组(每组3只猪)且将每组猪分开饲养。在接种之前，对每只猪进行称重，抽血，并通过PCR和血清学确认其为PCV2阴性。用5ml(103.66TCID50/mL)的嵌合病毒PCV1-2a或四种PCV2衣壳改组的嵌合病毒(PCV2-3cl13、PCV2-3cl14、PCV2-3cl4-2或PCV2-3cl12-2)之一对五组进行肌内接种。一组用5mL的PBS缓冲液类似地进行模拟接种(图1)。每周收集血液，并对动物通过ELISA对PCV2抗体的血清转变和通过qPCR对PCV2感染的迹象进行监测。在感染后第五十六(56)天(dpi)对动物进行尸体剖检。将每周的血清样品用于对代表不同PCV2亚型的病毒株进行血清病毒中和试验。

血清病毒中和试验：通过IFA检测从感染猪收集的血清样品的针对野生型PCV2a、PCV2b、PCV2d-1和PCV2d-2病毒株的中和抗体滴度。简而言之，将血清样品在PBS中1:2连续稀释，并以等体积比分别与150TCID50的PCV2a、PCV2b、PCV2d-1或PCV2d-2病毒原种混合，并在37℃下孵育1小时。然后将血清-病毒混合物一式两份加入处于96孔板的PK-15细胞中。在37℃孵育72小时后，使用1:1000稀释的抗PCV2a的猪血清作为第一抗体和以1:50稀释的FITC-缀合的山羊抗猪IgG(KPL)作为第二抗体进行IFA。将50％血清中和抗体滴度确定为最高稀释度，在这一稀释度下，与来自PBS对照猪组的血清平均值相比，病毒滴度降低50％或更多。

常规猪中的疫苗接种功效和攻击研究：在PCV2a的骨架中含有改组的衣壳3cl14的嵌合病毒诱导了针对不同PCV2病毒株的显著更高的中和抗体应答。因此，随后将改组的衣壳序列3cl14克隆至非致病性PCV1的感染性DNA克隆骨架中，以产生作为候选疫苗的PCV1-3cl.14嵌合病毒。随后，进行猪攻击研究以评估候选PCV1-3cl.14嵌合病毒疫苗对目前主要传播的PCV2b以及新出现的PCV2d-2感染的功效。

简而言之，从商业农场购买总共三十二(32)只3周龄的杂交常规猪，已知其不含PRRSV和猪肺炎支原体且为PCV2阴性。该动物研究得到了Iowa State University IACUC以及Virginia IACUC的批准。将仔猪随机分成四组，每组八只猪。在接种之前，对每只猪进行称重，抽血，并确认其为PCV2阴性。用5ml候选PCV1-3cl.14嵌合病毒疫苗(每只猪103.7TCID50/mL)分别对第一(1)组猪和第二(2)组猪在颈部区域进行肌内(IM)疫苗接种。用5ml PBS缓冲液分别对第三(3)组猪和第四(4)组猪进行IM模拟接种(图2)。每天监测全部动物的临床症状，包括消瘦、呼吸窘迫和行为改变(例如嗜睡和食欲不振)。在接种之前收集血液样品，然后在疫苗接种后的四十二(42)天(dpv)内每周从每只猪收集。

在第四十二(42)dpv，用104.8TCID50的PCV2b NC16845病毒株分别对第一(1)组猪(接种疫苗的)和第三(3)组猪(模拟接种的)猪进行攻击(鼻内2.5ml和IM 2.5ml)，而用104.8TCID50的PCV2d-2JX535296病毒株对第二(2)组(接种疫苗的)和第四(4)组(未接种疫苗的)分别进行相似地攻击。在攻击后的二十(20)天(dpc)内(或六十二(62)dpv内)，每周收集血液样品，在攻击后第二十(20)天对所有的猪进行称重并进行尸体剖检。收集一组血清样品和组织样品用于对病毒DNA载量进行定量和用于PCV2相关病变的组织学检查。

病理学和组织病理学总体评估：在攻击后第二十(20)天(dpc)对所有猪以盲评的处理方法进行尸体剖检。对于每只猪，获得了对肉眼可见的肺损伤(范围从0％至100％的受影响的肺)和淋巴结大小(范围从零(0)[正常]至三(3)[正常大小的四倍])的估计。在尸体剖检期间收集肺、淋巴结(腹股沟浅淋巴结、纵隔淋巴结、气管支气管淋巴结和肠系膜淋巴结)、扁桃体、心脏、胸腺、肾、脾和肝的切片，并将其常规地进行组织学检查和PCV2免疫组织化学(IHC)(Iowa State University兽医诊断实验室)。此外，从每只猪收集气管支气管淋巴结(TBLN)的样品，用于提取DNA和通过实时定量PCR对PCV2病毒基因组进行定量。对淋巴组织、肺、心脏、肝、肾、回肠和结肠中的显微病变以盲评的处理方法进行评分。具体地，评估淋巴结、脾和扁桃体的淋巴细胞耗竭和组织细胞替换的存在和程度。

定量PCR对血清和组织中的病毒DNA载量的定量：对于两种动物实验，我们使用先前发表的方案从血清和淋巴结样品中提取DNA，并使用先前发表的qPCR SYBR green测定法来对这些样品中的病毒载量进行定量。对于试验性感染研究(图1)和攻击实验(图2)，将PCV2特异性引物用于扩增跨越复制起点的保守区和复制酶基因的部分，如先前报道的，使用引物PCV2-83F和PCV2-83R(表1)。为了在攻击研究中检测PCV1-3cl.14疫苗株(图2)，使用引物PCV1-qRepF和PCV1-qRepR(表1)仅扩增基于PCV1骨架的疫苗病毒DNA。

血清学：如之前所述，使用PCV2特异性的ELISA(Iowa State University兽医诊断实验室)来检测每个血清样品中的抗PCV2ORF2IgG。参见Nawagitgul P等人，“Modifiedindirect porcine circovirus(PCV)type 2-based and recombinant capsid protein(ORF2)-based enzyme-linked immunosorbent assays for detection of antibodiesto PCV”Clin Diagn Lab Immunol 9(2002)33-40。

从被感染的猪中回收的病毒的序列确认：通过PCR对来自在第二十(20)dpc从各组所选猪收集的血清样品的DNA提取物检测PCV2衣壳序列，并对扩增的PCR产物进行测序，以验证从被感染的猪中回收的病毒为接种到动物中的同一种病毒。用上述进行克隆的相同的PCR程序(表1)，使用PCR引物Unirep-F和2aORF-2在这些样品中对PCV2衣壳基因进行扩增。另外，还测试了来自每组中所选猪的TBLN组织的DNA提取物，以确认来自感染猪的通过PCR检测的病毒为接种到动物中的同一种病毒。如之前所述(Beach等人，同上)，使用对PCV2b特异性的引物对PCV2b进行扩增和测序。使用与PCV2b相同的正向引物和PCV2d特异性的反向引物NB-56-m2b对PCV2d-2vDNA进行扩增和测序(表1)。

统计分析：使用Prism 6.0版本(Graphpad，La Jolla CA)进行统计学分析。使用单尾t检验来分析两组之间的统计学显著性，同时使用单因素ANOVA和随后经多重比较校正的t检验来确定三组或更多组之间的显著性。

来自5种基因上不同的PCV2病毒株的含有改组衣壳的感染性嵌合型病毒的产生：使用传统的DNA改组来对衣壳基因进行分子育种，所述衣壳基因来自代表不同亚型的PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d-1以及“PCV2e”(趋异的(divergent)PCV2a)的五种基因上不同的PCV2病毒株(图3)。在图3中指出了3cl.13(SEQ ID NO：4)、3cl.4_2(SEQ ID NO：2)、3cl.14(SEQ ID NO：8)和3cl.12_2(SEQ ID NO：6)为改组的PCV2衣壳氨基酸序列。虽然普遍的共识是先前分类的“PCV2e”病毒分离株并没有与鉴定的PCV2a病毒株足够趋异分化而被认为是它们特有的亚型，但选择“PCV2e”衣壳序列有助于增加所得的改组衣壳的遗传多样性。使用DNA酶I消化对来自这五种病毒株的衣壳基因序列进行改组，并在通过没有引物的PCR重新组装。然后用跨越衣壳基因的特异性引物在第二轮PCR后产生预期大小的PCR产物。然后将改组衣壳基因文库克隆到PCV2a(病毒株40985)的感染性克隆骨架中，以筛选有活力的嵌合病毒。当转染到PK-15细胞中时，在超过五十(50)个具有“良好改组”的衣壳(含有来自全部5种亲本PCV2病毒株的区域)的克隆中，仅有四个成功地拯救了感染性病毒(数据未显示)。

具有改组衣壳的这四种嵌合病毒含有来自全部五种亲本病毒株的PCV2基因组的遗传特征的一系列组合(图3)。源自PCV2c的改组衣壳引入了大多数独特的氨基酸特征。基于系统发育分析，PCV2c在五种亲本病毒株中在基因上是最不同的(图4)。因此，此处证明了DNA改组成功地产生了具有来自5种不同PCV2亚型的改组衣壳基因的有活力的感染性嵌合病毒。

具有改组衣壳基因的嵌合病毒PCV2-3cl14诱导针对不同PCV2亚型的交叉中和抗体：为了确定生存力并筛选具有改组衣壳的最佳嵌合病毒以用于随后的攻击和功效研究，用四种嵌合病毒(PCV2-3cl.13、PCV2-3cl.14、PCV2-3cl.4_2、和PCV2-3cl.12)中的每一种以及先前得到的嵌合PCV1-2a病毒(Fenaux等人，同上)对常规猪进行实验上地感染。血清样品在感染之前收集，并在感染之后每周收集，并通过ELISA监测全部动物对PCV2a衣壳的血清转变(图1)。用PCV1-2a和/或用PCV2-3cl.14以实验上接种的全部动物在疫苗接种后第49天(dpi)血清转变为PCV2抗体，然而在接种PCV2-3cl.12_2的3只动物中只有2只以及在接种嵌合病毒PCV2-3cl.13或PCV2-3cl.4_2的3只猪中只有1只在第49dpi时是血清反应阳性的(图1)。

针对野生型PCV2a(图5A)、PCV2b(图5C)、PCV2d-1(图5B)和PCV2d-2(图5D)病毒株的交叉中和抗体，在PK15细胞中通过血清病毒中和测定法来检测从第56dpi收集的血清样品。与作为目前Fostera^TM PCV商业疫苗基础的嵌合PCV1-2a病毒相比，用3种具有改组衣壳基因(PCV2-3cl.13、PCV2-3cl.4_2、和PCV2-3cl.12)的嵌合PCV2病毒对猪进行感染不会诱导更高水平的中和抗体。然而，与PCV1-2a相比，用具有来自不同PCV2亚型的改组衣壳基因的嵌合病毒PCV2-3cl.14对猪进行感染诱导了针对PCV2a和PCV2d-2的显著更高的中和抗体滴度(p<0.05)。此外，尽管并非统计学显著的，但嵌合病毒PCV2-3cl.14也比PCV1-2a诱导了针对PCV2b和PCV2d-2更高的中和抗体水平。总而言之，这项试验性动物研究表明，具有改组衣壳基因的嵌合病毒在猪中是有活力和感染性的，并且与其它嵌合病毒以及PCV1-2a疫苗病毒相比，一种嵌合病毒PCV2-3cl.14诱导了针对基因上不同的PCV2病毒株的显著更高的中和抗体水平。因此，选择嵌合病毒PCV2-3cl.14用于在猪中的后续攻击和功效研究，以评估其作为新型疫苗的潜在应用。

嵌合病毒PCV1-3cl14在常规猪中诱导抵抗PCV2b和PCV2d-2攻击的保护性免疫。PCV2a是嵌合病毒PCV2-3cl.14的基因组骨架。因此，为了产生新的候选疫苗，我们随后将来自在最初的交叉中和研究中鉴定的嵌合病毒PCV2-3cl.14的改组衣壳基因转移至非致病性PCV1的基因组骨架，以产生新的嵌合病毒PCV1-3cl.14。为了评估嵌合病毒PCV1-3cl.14候选疫苗是否能够抵抗不同PCV2亚型的攻击，分别用PCV1-3cl.14嵌合病毒对两组猪(n＝8)进行接种，而用PBS模拟接种另外两组猪(n＝8)作为对照(图2)。每周采集血液样品并监测动物对PCV2衣壳抗体的血清转变。在疫苗接种后第42天，用目前在全世界猪群中流行的主要野生病毒株PCV2b对一组接种疫苗的动物和一组模拟接种的动物进行攻击。类似地，用新出现的PCV2d-2病毒对一组接种疫苗的猪和一组模拟接种的猪进行攻击。在攻击后每周采集血液样品，并在第二十(20)dpc对所有动物进行尸体剖检。

如预期的，用PCV2b或PCV2d-2，至第42dpv，两组接种疫苗的猪开始对PCV2衣壳抗体的血清转变，而模拟接种组直至7-14dpc(或49dpv或56dpv)才进行血清转变(图2、图6)。使用靶向PCV1复制酶基因(ORF1)的qPCR测定法检测来自每周血清的PCV1-3cl.14病毒DNA，但是PCV1-3cl.14病毒DNA在接种疫苗后的任何组中检测不到并且低于测定检测极限(数据未显示)。这与先前报道的在猪中的减毒嵌合PCV1-2病毒感染相一致。

相比于用PCV2b攻击的八只对照组动物中在第十四(14)dpc和第二十(20)dpc时分别检测到的四只和七只，接种疫苗并随后用PCV2b攻击的8只动物中只有2只具有可检测到的病毒血症，并且仅在第十四(14)dpc时被检测到(图2)。这一差异是统计学显著的，因为与模拟接种并用PCV2b攻击的动物相比，在第二十(20)dpc，接种疫苗并用PCV2b攻击的组在血清中具有显著更低水平的病毒DNA载量(p<0.01)(图7A和图7B)。对于接种疫苗并随后用PCV2d-2攻击的动物，有1/8在第十四(14)dpc以及有2/8在第二十(20)dpc具有可检测的病毒血症，而有7/8的用PCV2d-2攻击的对照动物在第十四(14)dpc和第二十(20)dpc对血清病毒DNA呈阳性(图2)。此外，与仅用PCV2d-2攻击的对照组相比，在第十四(14)dpc和第二十(20)dpc，接种疫苗并用PCV2d-2攻击的组的血清病毒DNA载量显著降低(分别为p<0.001，p<0.05)(图7A和图7B)。与对照组相比，所有接种疫苗并随后进行攻击的组在病毒复制的峰值处具有显著的更低水平的PCV2病毒血症。此外，与模拟接种且进行攻击的组相比，所有接种疫苗并随后进行攻击的组在淋巴结中具有显著更低水平的可检测的PCV2DNA(PCV2b＝p<0.001，PCV2d-2＝p<0.0001，图8A和图8B)。这些结果表明，当用主要的PCV2b亚型或新出现的PCV2d-2病毒株攻击时，PCV1-3cl.14嵌合病毒的接种显著降低了猪中病毒复制的水平。

除降低了血清和淋巴组织中的病毒DNA载量以外，与未接种疫苗的动物相比，接种疫苗的动物还具有降低的PCVAD损伤评分(图9A-图9F)。对于PCVAD的全部测量，包括在淋巴结(图9A和图9B)中、脾(图9C和图9D)中和扁桃体组织(图9E和图9F)中的淋巴细胞耗竭和组织细胞替换，与未接种疫苗但用PCV2b攻击的对照组相比，随后用PCV2b攻击的接种疫苗的猪具有显著降低的病理损伤评分。

类似地，对于淋巴结测量以及扁桃体淋巴细胞耗竭(图10A、图10B、图10C)，与未接种疫苗但用PCV2d-2攻击的对照组相比，接种并随后用PCV2d-2攻击的猪具有显著更低的病理损伤评分。与血清和淋巴结病毒DNA检测的结果一致，相比于仅进行攻击的对照组，接种疫苗并随后进行攻击的组在淋巴结、脾和扁桃体中均具有显著更低的病毒抗原评分(图8A-图8C)。总体而言，这些结果表明接种PCV1-3cl.14嵌合病毒候选疫苗能够保护抵抗两种基因上不同且相关的PCV2病毒株(目前在全球养猪场中传播的主要PCV2b亚型和新出现的PCV2d-2病毒株)。

实施例2

嵌合型病毒衍生物

本文公开的嵌合型PCV衣壳多肽的衍生物包含于本公开的范围内。可以在一定程度上改变包含于本文公开的嵌合型PCV衣壳多肽中的表位的氨基酸序列且使其仍然适合用作治疗性免疫原。例如，在不会对被包含表位的免疫原性产生有害影响的情况下，可以在衣壳多肽的表位结构域以及其他非表位结构域中进行某些保守氨基酸置换。本领域技术人员理解保守置换的性质，例如，用另一带正电荷的氨基酸置换带正电荷的氨基酸；用带另一负电的氨基酸置换带负电荷的氨基酸；用另一疏水性氨基酸置换疏水性氨基酸等。本文公开的嵌合型PCV衣壳多肽的所有这些置换或改变旨在包括在本发明中，只要被包含表位保持免疫原性即可。另外，包含本文公开的PCV衣壳多肽上的表位的免疫原不需要包括全长PCV衣壳多肽或含表位的结构域。本领域技术人员将理解，可以使用或确实优选使用本文公开的嵌合型PCV衣壳多肽的截短形式，只要保留免疫原性表位即可。本文公开的嵌合型PCV衣壳多肽的衍生物包括截短形式。衍生物可包括以各种原因引入的序列修饰，例如或包括消除或引入蛋白酶切割位点、增加或降低溶解度、促进或阻止分子内或分子间相互作用，例如折叠、离子相互作用、盐桥等，这些修饰可能会以其他方式干扰沿着嵌合体长度的各个表位的呈递和可及性。所有这些改变旨在包含于本发明中，只要所得的氨基酸序列起到引发针对作为表位起源的一种或多于一种PCV2类型的保护性抗体反应的作用。通常，此类置换序列与本文公开的嵌合型PCV衣壳多肽具有至少约80％至90％的同一性。在某些实施方案中，经置换的衍生物序列与本文公开的嵌合型PCV衣壳多肽具有90％至99％的同一性。

如本文所用，参考嵌合型PCV衣壳多肽及其衍生物和截短形式。在某些实施方案中，这些可以用作分离的纯化多肽亚单位疫苗或用作灭活的全病毒疫苗。可以例如在细菌、哺乳动物、酵母、植物或昆虫细胞中通过化学合成或使用重组DNA技术产生多肽。然而，在其他实施方案中，通过培养包含编码嵌合型PCV衣壳多肽的DNA序列的病毒载体来产生嵌合型PCV衣壳多肽。病毒载体可以是PCV病毒例如PCV1或PCV2，或者可以是不同的病毒载体例如痘病毒或杆状病毒载体。病毒载体将编码并指导可以是部分纯化和使用的亚单位疫苗的嵌合型PCV衣壳多肽的产生，或将编码并指导包含嵌合型PCV衣壳蛋白及其衍生物以作为活的或灭活的病毒疫苗的病毒颗粒的产生。

表2显示了图3所示的每种亲本衣壳氨基酸序列和每种嵌合型改组衣壳氨基酸序列之间相差的氨基酸数目。例如，如表2所示，嵌合型衣壳多肽3cl.14与PCV2a和PCV2b的衣壳多肽相差29个氨基酸、与PCV2c的衣壳多肽相差3个氨基酸、与PCV2d的衣壳多肽相差26个氨基酸以及与PCV2e(“分歧PCV2a”)的衣壳多肽相差27个氨基酸。施用包含嵌合型衣壳多肽3cl.14的疫苗显著地导致了对当前最重要的致病性病毒株PCV2b和PCV2d的交叉保护。在某些实施方案中，提供了包含一种或多于一种嵌合型PCV2衣壳蛋白及其衍生物的疫苗，其中每种嵌合蛋白及其衍生物是独特的并且与任何贡献的亲本病毒株相差3至37个氨基酸。在其他实施方案中，提供了包含一种或多于一种的嵌合型PCV2衣壳蛋白及其衍生物的疫苗，其中每种嵌合蛋白及其衍生物是独特的并且与任何亲本嵌合型衣壳多肽相差1-27个氨基酸。在某些实施方案中，提供了包含至少PCV2c和PCV2d的衍生于衣壳的氨基酸序列的重组PCV2衣壳多肽及其免疫原性衍生物。在某些实施方案中，提供了在细菌、酵母、哺乳动物、或昆虫细胞中表达的重组PCV2衣壳多肽。在某些实施方案中，包含重组PCV2衣壳多肽的免疫原性组合物是亚单位疫苗，而在其他实施方案中，重组PCV2衣壳多肽在灭活的全病毒疫苗情况下呈现。

在其他实施方案中，提供了包含一种或多于一种嵌合型PCV2衣壳蛋白的衍生物的疫苗，其中该衍生物通过保守置换而与任何亲本嵌合型衣壳多肽不同。在其他实施方案中，提供了嵌合型衣壳蛋白的衍生物，其与任何亲本嵌合型衣壳多肽相差一到二十七个氨基酸，优选一到十五个氨基酸、一到十个氨基酸、一到五个氨基酸、或一个氨基酸或两个氨基酸。在其他实施方案中，提供了包含氨基酸置换以提供衣壳多肽衍生物的免疫原性PCV2衣壳蛋白，该氨基酸置换选自如图3中突出显示的病毒株特异性变体氨基酸，该PCV2衣壳蛋白在用作疫苗时，提供针对PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e病毒株或基因型及其新出现的变体中的两种或多于两种的交叉保护。

表2亲本衣壳多肽与嵌合衍生物之间的氨基酸差异

表3嵌合型衣壳多肽之间的氨基酸差异

实施例3

嵌合型疫苗组合物

无论是作为活病毒疫苗、经修饰的活病毒疫苗、灭活病毒疫苗、减毒疫苗、质粒DNA疫苗还是亚单位多肽疫苗，都施用免疫有效量。“免疫原性有效”量足以刺激免疫应答，即刺激体液抗体的产生和/或刺激细胞介导的应答。疫苗组合物可包括合适的佐剂以及一种或多于一种润湿剂或分散剂。这种润湿剂包括非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物，即以商标销售的并可从BASF公司(Mt.Olive，N.J.)购得的那些。其它有用的非离子表面活性剂包括聚氧乙烯酯，例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(聚山梨醇酯80)，其可以以商标TWEEN购得。

适合的佐剂的实例包括但不限于免疫刺激的生物相容性油，例如植物油(即玉米油、芝麻油、橄榄油、大豆油、红花油、棉籽油、菜籽油、向日葵油、荷荷巴油、椰子油、花生油或其混合物)、角鲨烷(鲨鱼肝油)或其他可代谢的油以及佐剂混合物，包括SP油(包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、角鲨烷、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯和缓冲盐溶液的油乳剂)、EMULSIGEN(MPV Laboratories，Omaha，NE，USA)、MONTANIDE(Seppic，Paris，France)。其他佐剂包括水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂和维生素E佐剂。

适合的SP油佐剂的一个实例包括1mg聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物如PLURONICL121、2mg角鲨烷、0.16mg聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(聚山梨醇酯80)如TWEEN 80和0.05ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

该组合物的其他组分可包括药物赋形剂和缓冲剂，包括但不限于HEPES稀释剂、Eagle's Earle's MEM生长培养基、HEPES酸、碳酸氢钠、盐酸、氢氧化钠、如福尔马林和硫柳汞此类的防腐化合物以及注射用水。

实施例4

嵌合型衣壳特异性单克隆抗体及模拟表位疫苗

在一个实施方案中，使用本文提供的重组嵌合型猪圆环病毒作为抗原以产生对嵌合病毒PCV2-3cl13、PCV2-3cl14、PCV2-3cl4_2和PCV2-3cl12_2中的一种或多于一种的衣壳蛋白上的表位特异性的抗体。当抗体是单克隆抗体时，用于获得杂交瘤和单克隆抗体的方法可以遵循最初由Kohler&Milstein在Nature 256(1975)495-497中描述的淋巴细胞融合和杂交瘤培养的常规方法。用于制备单克隆抗体的其他方法也是已知的，包括噬菌体展示，如由Barbas CF等人“Assembly of combinatorial antibody libraries on phagesurfaces:the gene III site”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88(18)(1991)7978-82所述并随后进行了修饰。衍生的抗体用于诊断和疫苗开发。

在疫苗开发的背景下，针对肽文库，例如根据已知技术产生的噬菌体展示肽文库筛选衍生的单克隆抗体，这些技术例如由Smith GR.“Filamentous fusion phage:novelexpression vectors that display cloned antigens on the virion surface”Science228(4705)(1985)1315-7最先描述。在一个实施方案中，将对嵌合型病毒PCV2-3cl13、PCV2-3cl14、PCV2-3cl4_2、和PCV2-3cl12_2中的一种或多于一种的衣壳蛋白上的表位特异性的抗体吸附在微量滴定板上并与噬菌体展示肽文库一起孵育。通过反复轮的选择分离与抗体结合的噬菌体。选择有希望的克隆，如需要，包括使用计算匹配研究进行选择。可以在模拟表位的免疫研究中测试所分离的和证实的模拟表位，以通过产生识别衣壳蛋白的抗体来证实分子模拟。然后将对不同PCV亚型具有特异性的衣壳表位模拟表位的混合物与佐剂一起作为肽抗原或作为多重模拟表位线性构建体，以产生针对数种PCV2病毒株的保护性免疫应答。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同在本文中完整阐述一样。虽然已经参考说明性实施方案来描述本发明，但该描述并不旨在以限制的意义进行解释。通过参考该描述，说明性实施方案的各种修改和组合以及本发明的其他实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，所附权利要求旨在涵盖这些修改和增强。

序列表

<110> 弗吉尼亚科技知识产权有限公司

孟祥金

莎伦·R·马青格

南森·M·比奇

<120> 嵌合型猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗

<130> 124617-00422

<150> US 62/304596

<151> 2016-03-07

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 705

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

<400> 1

atgacgtatc caaggaggcg ttaccggaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60

cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120

aaaaatggca tcttcaacac ccgcctatcc cgcaccttcg gatatactat caagcgaacc 180

acagtcagaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat tcaatattaa tgactttctt 240

cccccaggag ggggctcaaa cccccgctct gtgccctttg aatactacag aataagaaag 300

gttaaggttg aattctggcc ctgctccccg atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360

agtgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca cagccctcac ctatgacccc 420

tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccgctac 480

tttaccccca aacctgtcct agattccact attgattact tccaaccaaa caacaaaaga 540

aaccagctgt ggctgagact acaaactgct ggaaatgtag accatgtagg cctcggacac 600

gcctttcaaa acagtacaaa tgcccaggcc tacaatgtcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660

ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaacccta aatga 705

<210> 2

<211> 234

<212> PRT

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

<400> 2

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Arg Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly His Ala Phe Gln Asn Ser Thr Asn Ala

195 200 205

Gln Ala Tyr Asn Val Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys

225 230

<210> 3

<211> 705

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

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<212> PRT

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

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165 170 175

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cccccaggag ggggctcaaa ccccctcact gtgccctttg aatactacag aataaggaag 300

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tatgtaaact actcctcccg ccataccata ccccagccct tctcctacca ctcccgctat 480

ttcaccccca aacctgtcct tgataggaca atcgattact tccaacccaa taacaaaaga 540

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gcgttcgaaa acagtaaata cgaccaggac tacaatatcc gtataaccat gtatgtacaa 660

ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaacccta aatga 705

<210> 6

<211> 234

<212> PRT

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

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tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattactttc ttggtatttt ggaagaatgc 1680

tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc catgccctga 1740

atttccatat gaaataaatt actgagt 1767

<210> 34

<211> 1767

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

<400> 34

cttttttatc acttcgtaat ggtttttatt attcatttag ggttaagtgg ggggtcttta 60

agattaaatt ctctgaattg tacatacatg gttacacgga cattgtaggc ctgggcattt 120

gtactgtttt gaaaggcgtg tccgaggcct acatggtcta catttccagt agtttgtagt 180

ctcatccaca gctgatttct tttgttattt ggttggaagt aatcaatagt ggaatcaagg 240

acaggtttgg gggtaaagta gcgggagtgg taggagaagg gttgggttat ggtatggcgg 300

gaggagtagt ttacataggg gtcataggtg agggctgtgg cctttgttac aaagttatca 360

tctagaataa cagcactgga gcccactccc ctgtcaccct gggtgatcgg ggagcagggc 420

cagaattcaa ccttaacctt tcttattctg tagtattcaa agggcacaga gcgggggttt 480

gagccccctc ctgggggaag aaagtcatta atattaaatc tcatcatgtc caccgcccaa 540

gagggtggtg agacctgtga ggcattaacg gtataaacaa aggagcggga gaggcgggca 600

ttgaagattc catttttcct tctccaacgg tagcggtggc gggggtggac gagccagggg 660

cggcggcgga ggatatggcc aagatggctg cgggggcggt gtcttcttct ccggtaacgc 720

ctccttggat acgtcatatc tgaaaacgaa agaagtgcgc tgtaagtatt accagcgcac 780

ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca agaagaatgg 840

aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc cttccgaaga 900

cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta ttgttggcga 960

ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt ttgtgaagaa 1020

gcaaactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc tgccatatcg agaaagccaa 1080

aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac ttattgaatg 1140

tggagctcct cgatctcaag gacaacggag tgacctgtct actgctgtga gtaccttgtt 1200

ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg tcagaaattt 1260

ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg attggaagac 1320

caatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg ctgctaattt 1380

tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg atggttacca 1440

tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg atgatctact 1500

gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agagactaaa ggtggaactg tacctttttt 1560

ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact cctcaactgc 1620

tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattactttc ttggtatttt ggaagaatgc 1680

tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc catgccctga 1740

atttccatat gaaataaatt actgagt 1767

<210> 35

<211> 1767

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

<400> 35

cttttttatc acttcgtaat ggtttttatt attcatttag ggttaagtgg ggggtcttta 60

agattaaatt ctctgaattg tacatacatg gttatacgga tattgtagtc ctggtcgtat 120

ttactgtttt cgaacgcagt gccgaggcct acatggtcta catttccagt agtttgtagt 180

ctcagccaga gttgatttct tttgttattg ggttggaagt aatcgattgt cctatcaagg 240

acaggtttgg gggtgaaata gcgggagtgg taggagaagg gctggggtat ggtatggcgg 300

gaggagtagt ttacataggg gtcataggtt agggctgtgg cctttgttac aaagttatca 360

tctagaataa cagcagtgga gcccactccc ctgtcaccct gggtgattgg ggagcagggc 420

cagaattcaa ccttaatctt ccttattctg tagtattcaa agggcacagt gagggggttt 480

gagccccctc ctgggggaag aaattggtta atattaaatc tcatcatgtc caccgcccaa 540

gagggtggtg agacctgtga ggcattaacg gtataaacaa aggagcggga gaggcgggca 600

ttgaagattc catttttcct tctccaacgg tagcggtggc gggggtggac gagccagggg 660

cggcggcgga ggatatggcc aagatggctg cgggggcggt gtcttcttct ccggtaacgc 720

ctccttggat acgtcatatc tgaaaacgaa agaagtgcgc tgtaagtatt accagcgcac 780

ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca agaagaatgg 840

aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc cttccgaaga 900

cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta ttgttggcga 960

ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt ttgtgaagaa 1020

gcaaactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc tgccatatcg agaaagccaa 1080

aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac ttattgaatg 1140

tggagctcct cgatctcaag gacaacggag tgacctgtct actgctgtga gtaccttgtt 1200

ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg tcagaaattt 1260

ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg attggaagac 1320

caatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg ctgctaattt 1380

tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg atggttacca 1440

tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg atgatctact 1500

gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agagactaaa ggtggaactg tacctttttt 1560

ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact cctcaactgc 1620

tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattactttc ttggtatttt ggaagaatgc 1680

tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc catgccctga 1740

atttccatat gaaataaatt actgagt 1767

<210> 36

<211> 1768

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

<400> 36

cttttttatc acttcgtaat ggtttttatt attcatttag ggtttaagtg gggggtcttt 60

aagattaaat tctctgaatt gtacatacat ggttacacgg acattgtagg cctgggcatt 120

tgtactgttt tgaaaggcgt gtccgaggcc tacatggtct acatttccag tagtttgtag 180

tctcatccac agctgatttc ttttgttatt tggttggaag taatcaatag tggaatcaag 240

gacaggtttg ggggtaaagt agcgggagtg gtaggagaag ggttgggtta tggtatggcg 300

ggaggagtag tttacatagg ggtcataggt tagggctgtg gcctttgtta caaagttatc 360

atttagaata acagcagtgg agcccactcc cctgtcacct tgggtgatgg gggatcttgc 420

aaagaattcc actttaacct ttcttattct gtagtattca aagggcacag tgagggggtt 480

tgagccccct cctgggggaa gaaattggtt aatattaaat ctcatcatgt ccaccgccca 540

agagggtggt gagacctgtg aggcattaac ggtataaaca aaggagcggg agaggcgggc 600

attgaagatt ccatttttcc ttctccaacg gtagcggtgg cgggggtgga cgagccaggg 660

gcggcggcgg aggatctggc caagatggct gcgggggccg tgtcttcttc tccggtaacg 720

cctccttgga tacgtcatat ctgaaaacga aagaagtgcg ctgtaagtat taccagcgca 780

cttcggcagc ggcagcacct cggcagcacc tcagcagcaa catgcccagc aagaagaatg 840

gaagaagcgg accccaacca cataaaaggt gggtgttcac gctgaataat ccttccgaag 900

acgagcgcaa gaaaatacgg gagctcccaa tctccctatt tgattatttt attgttggcg 960

aggagggtaa tgaggaagga cgaacacctc acctccaggg gttcgctaat tttgtgaaga 1020

agcaaacttt taataaagtg aagtggtatt tgggtgcccg ctgccatatc gagaaagcca 1080

aaggaactga tcagcagaat aaagaatatt gcagtaaaga aggcaactta cttattgaat 1140

gtggagctcc tcgatctcaa ggacaacgga gtgacctgtc tactgctgtg agtaccttgt 1200

tggagagcgg gagtctggtg accgttgcag agcagcaccc tgtaacgttt gtcagaaatt 1260

tccgcgggct ggctgaactt ttgaaagtga gcgggaaaat gcagaagcgt gattggaaga 1320

ccaatgtaca cgtcattgtg gggccacctg ggtgtggtaa aagcaaatgg gctgctaatt 1380

ttgcagaccc ggaaaccaca tactggaaac cacctagaaa caagtggtgg gatggttacc 1440

atggtgaaga agtggttgtt attgatgact tttatggctg gctgccgtgg gatgatctac 1500

tgagactgtg tgatcgatat ccattgactg tagagactaa aggtggaact gtaccttttt 1560

tggcccgcag tattctgatt accagcaatc agaccccgtt ggaatggtac tcctcaactg 1620

ctgtcccagc tgtagaagct ctctatcgga ggattacttt cttggtattt tggaagaatg 1680

ctacagaaca atccacggag gaagggggcc agttcgtcac cctttccccc ccatgccctg 1740

aatttccata tgaaataaat tactgagt 1768

<210> 37

<211> 1764

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

<400> 37

cttttttgtt atcacatcgt aatggttttt attattcatt tagggtttaa gtggggggtc 60

tttaagatta aattctctga attgtacata catggttaca cggacattgt aggcctgggc 120

atttgtactg ttttgaaagg cgtgtccgag gcctacatgg tctacatttc cagtagtttg 180

tagtctcatc cacagctgat ttcttttgtt atttggttgg aagtaatcaa tagtggaatc 240

aaggacaggt ttgggggtaa agtagcggga gtggtaggag aagggttggg ttatggtatg 300

gcgggaggag tagtttacat aggggtcata ggttagggct gtggcctttg ttacaaagtt 360

atcatttaga ataacagcag tggagcccac tcccctgtca ccttgggtga tgggggatct 420

tgcaaagaat tccactttaa cctttcttat tctgtagtat tcaaagggca cagtgagggg 480

gtttgagccc cctcctgggg gaagaaattg gttaatatta aatctcatca tgtccaccgc 540

ccaagagggt ggtgagacct gtgaggcatt aacggtataa acaaaggagc gggagaggcg 600

ggcattgaag attccatttt tccttctcca acggtagcgg tggcgggggt ggacgagcca 660

ggggcggcgg cggaggatct ggccaagatg gctgcggggg ccgtgtcttc ttctccggta 720

acgcctcctt ggatacgtca tcctataaaa gtgaaagaag tgcgctgctg tagtattacc 780

agcgcacttc ggcagcggca gcacctcggc agcgtcagtg aaaatgccaa gcaagaaaag 840

cggcccgcaa ccccataaga ggtgggtgtt cacccttaat aatccctccg aggaggagaa 900

aaacaaaata cgggagcttc caatctccct ttttgattat tttgtttgcg gagaggaagg 960

tttggaagag ggtagaactc ctcacctcca ggggtttgcg aattttgcta agaagcagac 1020

ttttaacaag gtgaagtggt attttggtgc ccgctgccac atcgagaaag cgaaaggaac 1080

cgaccagcag aataaagaat actgcagtaa agaaggccac atacttatcg agtgtggagc 1140

tccgcggaac caggggaagc gcagcgacct gtctactgct gtgagtaccc ttttggagac 1200

ggggtctttg gtgactgtag ccgagcagtt ccctgtaacg tatgtgagaa atttccgcgg 1260

gctggctgaa cttttgaaag tgagcgggaa gatgcagcag cgtgattgga agacagctgt 1320

acacgtcata gtgggcccgc ccggttgtgg gaagagccag tgggcccgta attttgctga 1380

gcctagcgac acctactgga agcctagtag aaataagtgg tgggatggat atcatggaga 1440

agaagttgtt gttttggatg atttttatgg ctggttacct tgggatgatc tactgagact 1500

gtgtgaccgg tatccattga ctgtagagac taaagggggt actgttcctt ttttggcccg 1560

cagtattttg attaccagca atcaggcccc ccaggaatgg tactcctcaa ctgctgtccc 1620

agctgtagaa gctctctatc ggaggattac tactttgcaa ttttggaaga ctgctggaga 1680

acaatccacg gaggtacccg aaggccgatt tgaagcagtg gacccaccct gtgccctttt 1740

cccatataaa ataaattact gagt 1764

<210> 38

<211> 16

<212> DNA

<213> 合成的(synthetic)

<400> 38

gtaaaacgac ggccag 16

<210> 39

<211> 17

<212> DNA

<213> 合成的(synthetic)

<400> 39

caggaaacag ctatgac 17

Claims

1.一种包含重组猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳多肽或其免疫原性衍生物的疫苗组合物，其中所述重组猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳多肽是不同于任何天然存在的PCV2衣壳多肽并且包含来自多种PCV2基因型的衍生于衣壳的氨基酸序列的嵌合氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述重组PCV2衣壳多肽选自命名为3cl.14(SEQ ID NO：8)、3cl.13(SEQ ID NO：4)、3cl.4_2(SEQ ID NO：2)、3cl.12_2(SEQ ID NO：6)的衣壳多肽。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述重组PCV2衣壳多肽或其免疫原性衍生物包含来自PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e亲本基因型中的两种或多于两种的衍生于衣壳的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中所述重组PCV2衣壳多肽或其免疫原性衍生物与任何贡献的亲本基因型相差3至37个氨基酸。

5.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中所述免疫原性衍生物与任何亲本嵌合型衣壳多肽相差1至27个氨基酸。

6.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中所述重组PCV2衣壳多肽或其免疫原性衍生物包含至少PCV2c和PCV2d的衍生于衣壳的氨基酸序列。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗组合物，其中所述重组PCV2衣壳多肽在细菌、酵母、哺乳动物或昆虫细胞中表达。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗组合物，其中所述组合物是亚单位疫苗或灭活的全病毒疫苗。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗组合物，其中所述重组PCV2衣壳多肽或其免疫原性衍生物由病毒载体编码。

10.根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗组合物，其中所述组合物还包含佐剂。

11.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂及其组合。

12.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述组合物包含油乳剂，所述油乳剂包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、角鲨烷、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯和缓冲盐溶液(SP-油)。

13.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。

14.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述组合物还包含至少一种额外的抗原。

15.根据权利要求14所述的疫苗组合物，其中所述至少一种额外的抗原保护性地抵御能够引起猪疾病的微生物。

16.根据权利要求15所述的疫苗组合物，其中所述微生物选自细菌、病毒、和寄生虫。

17.根据权利要求16所述的疫苗组合物，其中所述细菌微生物选自胸膜肺炎放线杆菌；支气管炎博德特氏菌；猪痢疾短螺旋体；布鲁氏菌病(猪布鲁氏菌)；弯曲杆菌；梭菌；大肠杆菌；猪红斑丹毒丝菌；副猪嗜血杆菌；猪等孢子球虫；胞内劳森菌；钩端螺旋体；单核细胞增生利斯特氏菌；猪鼻支原体；猪滑液支原体；絮状支原体；猪肺炎支原体；出血败血性巴斯德氏菌；猪链球菌；葡萄球菌，包括金黄色葡萄球菌和猪葡萄球菌；沙门氏菌，包括猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌；耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)；牛旋毛虫；刚地弓形虫以及小肠结肠炎耶尔森氏菌中的一种或多于一种。

18.根据权利要求16所述的疫苗组合物，其中所述病毒微生物选自非洲猪瘟病毒、经典猪瘟病毒(CSF)、口蹄疫病毒(FMDV)、尼帕病毒、猪巨细胞病毒、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪肠道病毒、脑心肌炎病毒、猪生殖和呼吸道综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪呼吸道冠状病毒(PRVV)、假狂犬病病毒(PRV)又称猪疱疹病毒1型、轮状病毒、猪流感病毒(SIV)、细环病毒(TTV)、以及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)中的一种或多于一种。

19.根据权利要求16所述的疫苗组合物，其中所述寄生微生物选自猪蛔虫、结肠小袋纤毛虫、刚地弓形虫和小隐孢子虫中的一种或多于一种。

20.一种具有含有DNA改组的PCV2衣壳基因序列的序列的嵌合核酸分子，所述DNA改组的PCV2衣壳基因序列来源于多种PCV2基因型或其编码PCV2衣壳多肽的免疫原性表位的衍生物。

21.根据权利要求20所述的嵌合核酸，其中所述DNA改组的PCV2衣壳基因序列选自命名为3cl.14(SEQ ID NO：7)、3cl.13(SEQ ID NO：3)、3cl.4_2(SEQ ID NO：1)、3cl.12_2(SEQID NO：5)的衣壳基因序列。

22.一种含有权利要求20所述的嵌合核酸分子的病毒载体。

23.根据权利要求22所述的病毒载体，其中所述病毒载体是杆状病毒载体或副痘病毒载体。

24.一种保护猪免受多种PCV2基因型感染的方法，其包括向猪施用免疫有效量的权利要求1至6和权利要求20至23中任一项所述的疫苗组合物、嵌合核酸分子或病毒载体。

25.根据权利要求24所述的方法，其包括通过选自肠胃外、鼻内、皮内和经皮的一种或多于一种途径向猪施用所述疫苗组合物、嵌合核酸分子或病毒载体。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述疫苗组合物、嵌合核酸分子或病毒载体以单剂量施用。

27.根据权利要求24所述的方法，其中所述疫苗、嵌合核酸分子或病毒载体与至少一种额外的抗原联合施用，所述额外的抗原保护性地抵御能够引起猪疾病的微生物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述微生物选自细菌、病毒和寄生虫。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述细菌微生物选自胸膜肺炎放线杆菌；支气管炎博德特氏菌；猪痢疾短螺旋体；布鲁氏菌病(猪布鲁氏菌)；弯曲杆菌；梭菌；大肠杆菌；猪红斑丹毒丝菌；副猪嗜血杆菌；猪等孢子球虫；胞内劳森菌；钩端螺旋体；单核细胞增生利斯特氏菌；猪鼻支原体；猪滑液支原体；絮状支原体；猪肺炎支原体；出血败血性巴斯德氏菌；猪链球菌；葡萄球菌，包括金黄色葡萄球菌和猪葡萄球菌；沙门氏菌，包括猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌；耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)；牛旋毛虫；刚地弓形虫以及小肠结肠炎耶尔森氏菌中的一种或多种。

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述病毒微生物选自非洲猪瘟病毒、经典猪瘟病毒(CSF)、口蹄疫病毒(FMDV)、尼帕病毒、猪巨细胞病毒、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪肠道病毒、脑心肌炎病毒、猪生殖和呼吸道综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪呼吸道冠状病毒(PRVV)、假狂犬病病毒(PRV)又称猪疱疹病毒1型、轮状病毒、猪流感病毒(SIV)、细环病毒(TTV)、以及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)中的一种或多于一种。

31.根据权利要求27所述的方法，其中所述寄生微生物选自猪蛔虫、结肠小袋纤毛虫、弓形虫和小隐孢子虫中的一种或多于一种。

32.根据权利要求24所述的方法，其中所述猪被保护免受至少PCV2b和PCV2d的感染。

33.一种包含重组嵌合型猪圆环病毒的疫苗组合物，所述重组嵌合型猪圆环病毒包含编码猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳多肽而非猪圆环病毒1型(PCV1)的衣壳蛋白的重组PCV1，所述PCV2衣壳多肽包含来自多种PCV2基因型的衣壳多肽的表位。

34.根据权利要求33所述的疫苗组合物，其中所述PCV2衣壳多肽由DNA改组的PCV2衣壳基因序列编码。

35.根据权利要求33至34中任一项所述的疫苗组合物，其中所述PCV2衣壳多肽选自命名为3cl.14(SEQ ID NO：8)、3cl.13(SEQ ID NO：4)、3cl.4_2(SEQ ID NO：2)、3cl.12_2(SEQID NO：6)的衣壳多肽及其衍生物。

36.根据权利要求33所述的疫苗组合物，其中所述疫苗是活疫苗、经修饰的活疫苗、灭活疫苗或减毒疫苗。

37.根据权利要求33所述的疫苗组合物，其中所述重组嵌合型猪圆环病毒被命名为PCV1_3cl.14且由SEQ ID NO：37编码。