JP2019507784A - キメラブタサーコウイルス２型（ｐｃｖ２）ワクチン - Google Patents

Abstract

複数のＰＣＶ２遺伝子型のカプシド由来の抗原性エピトープを含む組換えＰＣＶ２カプシドペプチドの投与によって、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）遺伝子型への免疫を提供するためのワクチン組成物及び方法について記載する。他の態様では、ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）の非病原性骨格と、複数のＰＣＶ２遺伝子型のカプシド由来の抗原性エピトープを含むＰＣＶ２カプシドポリペプチドをコードする配列とを組み合わせた、ワクチンとして使用するための組換えキメラブタサーコウイルスを提供する。

Description

関連出願への相互参照
[0001] 本願は、その全体が本明細書に援用される、米国仮特許出願第６２／３０４，５９６号（２０１６年３月７日出願）に基づく優先権を主張する。

電子申請された配列表への言及
[0002] 本願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供しており、本明細書に援用される。この配列表を含有するテキストファイルの名称は、SequenceListing.txt である。このテキストファイルは、４２キロバイトであって、２０１７年２月２４日に作成し、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子申請されている。

技術分野
[0003] 本発明は、概して、養豚場においてかなりの死亡及び疾病を引き起こす哺乳動物のサーコウイルスに対する予防用ワクチンについての組成物及び方法に関するものである。

[0004] 本発明の範囲に限定することなく、その背景技術について、ブタの集団におけるサーコウイルス誘発性の疾病及び死亡に関連して記載する。ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）は、サーコウイルス科に属する、小型でエンベロープのない１本鎖ＤＮＡウイルスである。ＰＣＶ１型（ＰＣＶ１）は、元は、１９７０年代に、ブタ腎細胞系、ＰＫ−１５の細胞培養汚染物として同定されたものであり、ブタでは非病原性であることが後に判明した。１９９７年、ＰＣＶ２型（ＰＣＶ２）と名付けられた病原性変異体が離乳直後の消耗性の仔ブタにおいて同定された。より多くの症例が世界中で同定されるにつれて、ＰＣＶ２は、消耗、生殖障害、呼吸兆候、腸炎、及びブタの皮膚炎及び腎障害症候群といった広範囲の臨床症状が含まれる、ブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の主たる原因因子であると決定された。

[0005] ＰＣＶ２は、世界の養豚業界に今日も影響を及ぼす、経済に壊滅的な打撃を与えるウイルス病原体の１つであって、ＰＣＶ２感染に関連した経済損失を抑えるのに有効な戦略は、ワクチン接種である。現行では、市販されているすべての不活化又はサブユニットワクチンがＰＣＶ２ａサブタイプを標的にしている。しかしながら、米国と他の国々では、２００５年以降、ＰＣＶＡＤ症例に関連した最も蔓延したＰＣＶ２株として、新しいサブタイプのＰＣＶ２ｂが引き継いできた。加えて、全世界で新たに出現した新興のＰＣＶ２ｄ株（以前は「ＰＣＶ２ｂ突然変異体」と呼ばれた）がワクチン接種済の家畜群において増加傾向の症例数で同定されてきて、ワクチン予防を克服し得るとの推測もある。最近まで、認知されていたＰＣＶ２サブタイプは、ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、及びＰＣＶ２ｃ［２０００年代にデンマークで同定されたが、あまり蔓延していない］を含めて、３種だけであった。現在、米国における大多数のＰＣＶＡＤ症例がＰＣＶ２ｂに関連付けられている一方で、新興のＰＣＶ２ｄサブタイプ（以前は「ＰＣＶ２ｂ突然変異体」と呼ばれた）は、２０１２年におけるその最初の発見以来、米国において徐々に増加していて、今やＰＣＶ２ａより多く蔓延している。Xiao CT, Halbur PG, Opriessnig T.,“Global molecular genetic analysis of porcine circovirus type 2 (PCV2) sequences confirms the presence of four main PCV2 genotypes and reveals a rapid increase of PCV2d（ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）配列の全分子遺伝子解析は、４種の主要なＰＣＶ２遺伝子型の存在を確定し、ＰＣＶ２ｄの急速な増加を明らかにする）”J. Gen. Virol. 96 (2015) 1830-1841を参照のこと。ＰＣＶ２ｄの出現についての正確な理由は不明なままであるが、それがワクチン接種済の家畜群においてよく見出され得ることは、この新興ウイルス株に対する予防の低下を示唆する。事実、最近の報告では、ＰＣＶ２ｄサブタイプ間の遺伝子多様性の増加が実証されて、１９９９〜２０１１年に同定された大多数の単離株は、「ＰＣＶ２ｄ−１」というサブクレードの下で分類され得て、最近の２００６〜２０１４年に同定された大多数の単離株は、このＰＣＶ２ｄ−１サブクレードから分岐したものであって、現在では「ＰＣＶ２ｄ−２」と指定されている。Xiao et al. 2015, 同上を参照のこと。加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏの証拠は、ＰＣＶ２サブタイプ間で別個の抗原差異があることを示唆し、このことは、新たなウイルス株の出現を説明するのに役立つかもしれない。したがって、全世界のブタ家畜群において現在流行している優勢なＰＣＶ２ｂだけでなく、新興のＰＣＶ２ｄへの懸念にも対処するために、将来のワクチン戦略は、ＰＣＶ２ｄのような新興ウイルス株と優勢なＰＣＶ２ｂサブタイプを標的とすることによって単一ワクチンでの予防を広げることに集中すべきである。

[0006] 上述のことから、本発明者には、ブタサーコウイルスの大流行を防ぐには、新たなワクチンが求められると思われた。本発明で提供するのは、そのような予防用ワクチンである。

[0007] 本発明は、複数のＰＣＶ２遺伝子型のカプシド由来の抗原性エピトープを含む組換えブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）カプシドポリペプチドが含まれるワクチン組成物を提供する。

[0008] １つの態様では、本発明は、組換えブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）カプシドポリペプチド又はその免疫原性誘導体を含むワクチン組成物を提供するものであり、組換えブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）カプシドポリペプチドは、天然ＰＣＶ２カプシドポリペプチドとは異なるキメラアミノ酸配列であって、複数のＰＣＶ２遺伝子型からのカプシド由来アミノ酸配列を包含する。

[0009] １つの態様では、ワクチン組成物は、３ｃｌ．１４（配列番号８）、３ｃｌ．１３（配列番号４）、３ｃｌ．４＿２（配列番号２）、３ｃｌ．１２＿２（配列番号６）と指定されるカプシドポリペプチドより選択される、組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチドを含む。

[0010] １つの態様では、組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチド又はその免疫原性誘導体には、ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、ＰＣＶ２ｃ、ＰＣＶ２ｄ、及びＰＣＶ２ｅの親遺伝子型の２以上からのカプシド由来アミノ酸配列が含まれる。

[0011] １つの態様では、組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチド又はその免疫原性誘導体は、寄与する親遺伝子型と３〜３７アミノ酸異なっている。１つの態様では、その免疫原性誘導体は、親キメラカプシドポリペプチドと１〜２７アミノ酸異なっている。

[0012] １つの態様では、組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチド又はその免疫原性誘導体は、少なくともＰＣＶ２ｃ及びＰＣＶ２ｄのカプシド由来アミノ酸配列を含む。
[0013] １つの態様では、ＰＣＶ２カプシドポリペプチドは、細菌、酵母、哺乳動物、又は昆虫の細胞において発現される。

[0014] １つの態様では、組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチド又はその免疫原性誘導体は、ウイルスベクターによってコードされる。
[0015] １つの態様では、ワクチン組成物には、ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）の非病原性の骨格と、複数のＰＣＶ２遺伝子型のカプシド由来の抗原性エピトープを含む、新規の組換え的に産生されたブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）カプシドポリペプチドとを組み合わせた、組換えキメラブタサーコウイルスが含まれる。

[0016] １つの態様では、ワクチン組成物には、ＰＣＶ１のカプシドタンパク質の代わりにブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）カプシドポリペプチドをコードする組換えブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）を含んでなる組換えキメラブタサーコウイルスが含まれ、該ＰＣＶ２カプシドポリペプチドは、複数のＰＣＶ２遺伝子型のカプシドポリペプチド由来のエピトープを含む。１つの態様では、組換えキメラブタサーコウイルスは、ＰＣＶ１＿３ｃｌ．１４と指定され、配列番号３７によってコードされる。

[0017] １つの態様では、ＰＣＶ２カプシドポリペプチドは、ＤＮＡシャッフルしたＰＣＶ２カプシド遺伝子配列によってコードされる。
[0018] １つの態様では、ＰＣＶ２カプシドポリペプチドは、ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、ＰＣＶ２ｃ、ＰＣＶ２ｄ、及び最近同定された分岐ＰＣＶ２ａウイルス（以前は「ＰＣＶ２ｅ」と称された）から成る群より選択される少なくとも２種のＰＣＶ２遺伝子型のカプシド由来の抗原性エピトープを含む。本明細書において、「分岐ＰＣＶ２ａウイルス」及び「ＰＣＶ２ｅ」という用語は、同義に使用される。別の態様では、ＰＣＶ２カプシドポリペプチドは、少なくともＰＣＶ２ｃ株及びＰＣＶ２ｄ株のカプシド由来の抗原性エピトープを含む。

[0019] １つの態様では、ワクチンは、生ワクチン、修飾生ワクチン、不活化ワクチン、弱毒化ワクチン、又はサブユニットワクチンである。別の態様では、ワクチン組成物は、ＰＣＶ２カプシドポリペプチドをコードするウイルスベクターを含む。

[0020] １つの特別な態様では、ワクチンは、不活化ワクチンである。別の特別な態様では、ワクチンは、サブユニットワクチン又は不活化全ウイルスワクチンである。
[0021] １つの側面では、本発明によるワクチン組成物には、アジュバントがさらに含まれる。１つの態様では、アジュバントは、水中油型アジュバント、高分子／水アジュバント、油中水型アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、ビタミンＥアジュバント、及びこれらの組合せより選択される。１つの特別な態様では、アジュバントは、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体、スクアラン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、及び緩衝塩類溶液が含まれる油乳剤（ＳＰ油剤）を含む。１つの態様では、該組成物には、医薬的に許容される担体がさらに含まれる。

[0022] 別の態様では、ワクチン組成物には、少なくとも１つの追加抗原がさらに含まれる。ある態様では、少なくとも１つの追加抗原は、ブタにおいて疾患を引き起こし得る微生物から保護する。別の態様では、この抗原は、ブタにおいて病原性であることが知られている、細菌、ウイルス、又は寄生虫の微生物に由来する１以上の抗原を含む。例えば、細菌微生物は、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、気管支敗血症菌、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブルセラ属（ブタ流産菌）、カンピロバクター属菌、クロストリジウム属菌、大腸菌、ブタ丹毒菌、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）、イソスポラ・スイス（Isospora suis）、ローソニア・イントラセルラリス、レプトスピラ属菌、リステリア・モノサイトゲネス、マイコプラズマ・ハイオライニス、マイコプラズマ・ハイオシノヴィエ、マイコプラズマ・フロクラーレ（Mycoplasma flocculare）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、パスツレラ・ムルトシダ、ブタ連鎖球菌、黄色ブドウ球菌及びスタフィロコッカス・ハイカスを含めたブドウ球菌属菌、サルモネラ・コレラスイス及びサルモネラ・エンテリティディスを含めたサルモネラ属菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、旋毛虫、トキソプラズマ、及びエルシニア・エンテロコリチカの１以上より選択され得る。ウイルス微生物には、アフリカブタコレラウイルス、ブタコレラウイルス（ＣＳＦ）、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）、ニパウイルス、ブタサイトメガロウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタエンテロウイルス、脳心筋炎ウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ブタ呼吸器型コロナウイルス（ＰＲＶＶ）、ブタヘルペスウイルス１型としても知られる仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ロタウイルス、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）、及びブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）が含まれ得る。寄生虫微生物には、ブタ回虫、大腸バランチジウム、トキソプラズマ、及び小形クリプトスポリジウムが含まれ得る。

[0023] さらなる態様では、ＰＣＶ２カプシドポリペプチドのエピトープをコードする、複数のＰＣＶ２遺伝子型由来のＤＮＡシャッフルしたＰＣＶ２カプシド遺伝子配列又はその誘導体を有するキメラ核酸分子が提供される。１つの態様では、これらのキメラ核酸分子は、ＰＣＶ１核酸分子のカプシド遺伝子配列の代わりに、複数のＰＣＶ２遺伝子型由来のＤＮＡシャッフルしたＰＣＶ２カプシド遺伝子配列を含有する、非病原性のＰＣＶ１をコードする核酸分子を含む。１つの態様では、ＤＮＡシャッフルしたＰＣＶ２カプシド遺伝子配列は、３ｃｌ．１４（配列番号７）、３ｃｌ．１３（配列番号３）、３ｃｌ．４＿２（配列番号１）、３ｃｌ．１２＿２（配列番号５）と指定されるカプシド遺伝子配列より選択される。

[0024] ある態様では、キメラ核酸分子は、ウイルスベクターに含まれる。例として、限定されるものではないが、バキュロウイルスベクターとパラポックスウイルスベクターが挙げられる。

[0025] また、本発明において提供されるのは、複数のＰＣＶ２遺伝子型による感染からブタを保護する方法である。方法には、本明細書に開示されるワクチン組成物、キメラ核酸分子、又はウイルスベクターの免疫学的有効量をブタへ投与することが含まれる。様々な態様では、該方法には、ワクチン組成物、キメラ核酸分子、又はウイルスベクターを、非経口、鼻腔内、皮内、及び経皮より選択される１以上の経路によってブタへ投与することが含まれる。別の態様では、ワクチン組成物、キメラ核酸分子、又はウイルスベクターは、単回用量で投与される。別の態様では、該組成物は、ブタにおいて疾患を引き起こし得る微生物（その例については、上に記載されている）から保護する少なくとも１つの追加抗原と共に投与される。さらに別の態様では、ブタは、少なくともＰＣＶ２ｂ及びＰＣＶ２ｄによる感染から保護される。

[0026] 特徴及び利点を含めて本発明をより完全に理解するために、本発明の詳細な説明について添付の図面と共に以下に言及する。

[0027] 図１は、シャッフルしたカプシドを含有するキメラＰＣＶ２ウイルス、又はＰＣＶ１−２ａワクチンウイルスを実験的に感染させたブタにおける、ＰＣＶ２特異的抗体への血清変換の結果を示す。 [0028] 図２は、ＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ウイルスをワクチン接種され、ＰＣＶ２ｂ又はＰＣＶ２ｄ−２にチャレンジしたブタにおける、ＰＣＶ２特異的抗体への血清変換のＥＬＩＳＡによる結果と、ウイルス血症のＰＣＲによる検出の結果を示す。 [0029] 図３は、５種の親ＰＣＶ２野生型株からのカプシドタンパク質、及び本明細書に開示される４種の新規のＤＮＡシャッフルしたカプシドタンパク質のアミノ酸配列アラインメントを図示する。最初の５つの配列は親株を表し、下の４つの配列は、ＤＮＡシャッフルしたＰＣＶ２カプシドを表す。コンセンサスと異なるアミノ酸を黒字で示す。 [0030] 図４は、異なるサブタイプより選択したＰＣＶ２株のカプシド遺伝子の系統樹を図示する。この系統樹は、近隣結合法を使用して、１，０００個の複製におけるブートストラップにより構築した。それぞれの主枝上の数字は、ブートストラップ値を示す。太字のイタリック配列名は、本明細書に開示のＤＮＡシャッフリングのために使用した５種の親株のＰＣＶ２配列を表す。 [0031] 図５Ａ〜図５Ｂは、２種のＰＣＶ２野生型株に対する、シャッフルしたカプシド遺伝子を有するキメラウイルスのＰＣＶ２−３ｃｌ．１３、ＰＣＶ２−３ｃｌ．１４、ＰＣＶ２−３ｃｌ．４＿２、及びＰＣＶ２−３ｃｌ．１２＿２、又はＰＣＶ１−２ａを実験的に接種されたブタ血清からの５０％中和抗体力価を比較する。感染後５６日目に採取した各血清の、２種の親ＰＣＶ２株：（図５Ａ）ＰＣＶ２ａ及び（図５Ｂ）ＰＣＶ２ｄ−１単離株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ５０％中和アッセイ。ＮＡ力価は、同じ希釈の偽（ＰＢＳ）接種対照群からの血清試料と比較して、陽性の蛍光輝点数の５０％以上の低下を示す血清試料の最高２倍希釈数（２^ｎ）として計算した。アステリスク（＊）は、片側ＡＮＯＶＡを使用して解析される、ｐ＜０．０５を示す。 図５Ｃ〜図５Ｄは、２種のＰＣＶ２野生型株に対する、シャッフルしたカプシド遺伝子を有するキメラウイルスのＰＣＶ２−３ｃｌ．１３、ＰＣＶ２−３ｃｌ．１４、ＰＣＶ２−３ｃｌ．４＿２、及びＰＣＶ２−３ｃｌ．１２＿２、又はＰＣＶ１−２ａを実験的に接種されたブタ血清からの５０％中和抗体力価を比較する。感染後５６日目に採取した各血清の、２種の親ＰＣＶ２株：（図５Ｃ）ＰＣＶ２ｂ及び（図５Ｄ）ＰＣＶ２ｄ−２単離株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ５０％中和アッセイ。ＮＡ力価は、同じ希釈の偽（ＰＢＳ）接種対照群からの血清試料と比較して、陽性の蛍光輝点数の５０％以上の低下を示す血清試料の最高２倍希釈数（２^ｎ）として計算した。アステリスク（＊）は、片側ＡＮＯＶＡを使用して解析される、ｐ＜０．０５を示す。 [0032] 図６は、キメラウイルスのＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ワクチン候補物質を実験的に接種され、野生型ウイルス株のＰＣＶ２ｂ又はＰＣＶ２ｄ−２にチャレンジした通常のブタにおける、ＰＣＶ２カプシド特異的抗体の応答を図示する。各処理群について、本試験期間にわたる平均Ｓ／Ｐ比±ＳＥＭをプロットする。ウイルスチャレンジは、ワクチン接種後４２日目（ｄｐｖ）に行った。０．２Ｓ／Ｐ比での破線は、本アッセイにおける陽性試料の下端カットオフを示す。 [0033] 図７Ａは、キメラＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ウイルスをワクチン接種され、その後ＰＣＶ２ｂにチャレンジしたブタ由来の血清におけるＰＣＶ２ウイルスＤＮＡロードのｑＰＣＲを使用した定量を、チャレンジのみの対照と比較して示す。図７Ｂは、キメラＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ウイルスをワクチン接種され、その後ＰＣＶ２ｄ−２にチャレンジしたブタ由来の血清におけるＰＣＶ２ウイルスＤＮＡロードのｑＰＣＲを使用した定量を、チャレンジのみの対照と比較して示す。図７Ａと図７Ｂでは、チャレンジ後の各時点について、群平均±ＳＥＭをプロットする。このアッセイの検出限界は、野生型ＰＣＶ２ｂゲノムの１０^１〜１０^１０コピーについての標準曲線によって定量された、１ｍＬの血清につき１０^４．２コピーのＯＲＦ１ ＤＮＡであった。（^＊）は、群間の統計学的有意差を示す（多重検定用に補正した、スチューデントのｔ検定）。 [0034] 図８Ａは、キメラＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ウイルスをワクチン接種され、ＰＣＶ２ｂにチャレンジしたブタ由来のリンパ節におけるＰＣＶ２ウイルスＤＮＡロードのｑＰＣＲを使用した定量を、チャレンジのみの対照と比較して示す。図８Ｂは、キメラＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ウイルスをワクチン接種され、ＰＣＶ２ｄ−２にチャレンジしたブタ由来のリンパ節におけるＰＣＶ２ウイルスＤＮＡロードのｑＰＣＲを使用した定量を、チャレンジのみの対照と比較して示す。図８Ａと図８Ｂでは、チャレンジ後の各時点について、群平均±ＳＥＭをプロットする。このアッセイの検出限界は、野生型ＰＣＶ２ｂゲノムの１０^１〜１０^１０コピーについての標準曲線によって定量された、１ｍｇの組織につき１０^７．１コピーのＯＲＦ１ウイルスＤＮＡであった。アステリスク（^＊）は、その時点での群間の統計学的有意差を示す（多重検定用に補正した、スチューデントのｔ検定）。 [0035] 図９Ａ〜図９Ｂは、キメラＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ウイルスをワクチン接種され、その後ＰＣＶ２ｂ又はＰＣＶ２ｄ−２にチャレンジしたブタにおけるリンパ系組織を、チャレンジのみの対照のそれと比較する。図９Ａは、リンパ節におけるリンパ球枯渇を示す。図９Ｂは、リンパ節における組織球置換を示す。図９Ａ〜図９Ｂのそれぞれにおいて、ワクチン接種されてチャレンジした動物（■）の剖検結果を、チャレンジのみの対照（ｏ）のそれと比較した。個々の動物スコアを個々の記号によって表し、群平均±ＳＥＭを表示する。アステリスク（^＊）は、群間の統計学的有意差を示す（スチューデントのｔ検定）。 図９Ｃ〜図９Ｄは、キメラＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ウイルスをワクチン接種され、その後ＰＣＶ２ｂ又はＰＣＶ２ｄ−２にチャレンジしたブタにおけるリンパ系組織を、チャレンジのみの対照のそれと比較する。図９Ｃは、脾臓におけるリンパ球枯渇を示す。図９Ｄは、脾臓における組織球置換を示す。図９Ｃ〜図９Ｄのそれぞれにおいて、ワクチン接種されてチャレンジした動物（■）の剖検結果を、チャレンジのみの対照（ｏ）のそれと比較した。個々の動物スコアを個々の記号によって表し、群平均±ＳＥＭを表示する。アステリスク（^＊）は、群間の統計学的有意差を示す（スチューデントのｔ検定）。 図９Ｅ〜図９Ｆは、キメラＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ウイルスをワクチン接種され、その後ＰＣＶ２ｂ又はＰＣＶ２ｄ−２にチャレンジしたブタにおけるリンパ系組織を、チャレンジのみの対照のそれと比較する。図９Ｅは、扁桃におけるリンパ球枯渇を示す。図９Ｆは、扁桃における組織球置換を示す。図９Ｅ〜図９Ｆのそれぞれにおいて、ワクチン接種されてチャレンジした動物（■）の剖検結果を、チャレンジのみの対照（ｏ）のそれと比較した。個々の動物のスコアを個々の記号によって表し、群平均±ＳＥＭを表示する。アステリスク（^＊）は、群間の統計学的有意差を示す（スチューデントのｔ検定）。 [0036] 図１０Ａ〜図１０Ｃは、リンパ系組織におけるＰＣＶ２ウイルス抗原のＰＣＶ２免疫組織化学（ＩＨＣ）による定量を図示する。キメラＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ウイルスをワクチン接種され、その後ＰＣＶ２ｂ又はＰＣＶ２ｄ−２にチャレンジしたブタより組織を入手し、チャレンジのみの対照と比較した。図１０Ａは、リンパ節について定量したＰＣＶ２ウイルス抗原を示し、図１０Ｂは、脾臓について定量したＰＣＶ２ウイルス抗原スコアを示し、図１０Ｃは、扁桃について定量したＰＣＶ２ウイルス抗原を示す。図１０Ａ〜図１０Ｃのそれぞれにおいて、ワクチン接種されてチャレンジした動物（■）の剖検結果を、チャレンジのみの対照（ｏ）のそれと比較した。個々の動物のスコアを個々の記号によって表し、群平均±ＳＥＭを表示する。アステリスク（^＊）は、群間の統計学的有意差を示す（スチューデントのｔ検定）。 [0037] 図１１は、キメラＰＣＶ２−３ｃｌ．４＿２ウイルスのカプシドタンパク質についての核酸（配列番号１）、ポリペプチド配列（配列番号２）、及び並置した核酸／アミノ酸翻訳を示す。 図１２は、ＰＣＶ２−３ｃｌ．４＿２ウイルスの全長核酸配列（配列番号３３）を示す。 [0038] 図１３は、キメラＰＣＶ２−３ｃｌ．１３ウイルスのカプシドタンパク質についての核酸（配列番号３）、ポリペプチド配列（配列番号４）、及び並置した核酸／アミノ酸翻訳を示す。 図１４は、ＰＣＶ２−３ｃｌ．１３ウイルスの全長核酸配列（配列番号３４）を示す。 [0039] 図１５は、キメラＰＣＶ２−３ｃｌ．１２＿２ウイルスのカプシドタンパク質の核酸（配列番号５）、ポリペプチド配列（配列番号６）、及び並置した核酸／アミノ酸翻訳を示す。 図１６は、ＰＣＶ２−３ｃｌ．１２＿２ウイルスの全長核酸配列（配列番号３５）を示す。 [0040] 図１７は、キメラＰＣＶ２−３ｃｌ．１４ウイルスのカプシドタンパク質の核酸（配列番号７）、ポリペプチド配列（配列番号８）、及び並置した核酸／アミノ酸翻訳を示す。 図１８は、ＰＣＶ２−３ｃｌ．１４ウイルスの全長核酸配列（配列番号３６）を示す。 [0041] 図１９は、ＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ウイルスの全長核酸配列（配列番号３７）を示し、ここで、ＰＣＶ２−３ｃｌ．１４ウイルスのカプシド配列は、ＰＣＶ１骨格にクローニングされている。 [0042] 図２０Ａは、クエリ配列としてのＰＣＶ１＿３ｃｌ．１４全長と、サブジェクト配列としてのＰＣＶ２＿３ｃｌ．１４全長の間のアラインメントを示す。キメラＰＣＶ２−３ｃｌ．１４のカプシドタンパク質の配列は、下線を施されて、太字である。 図２０Ｂは、クエリ配列としてのＰＣＶ１＿３ｃｌ．１４全長と、サブジェクト配列としてのＰＣＶ２＿３ｃｌ．１４全長の間のアラインメントを示す。キメラＰＣＶ２−３ｃｌ．１４のカプシドタンパク質の配列は、下線を施されて、太字である。 図２０Ｃは、クエリ配列としてのＰＣＶ１＿３ｃｌ．１４全長と、サブジェクト配列としてのＰＣＶ２＿３ｃｌ．１４全長の間のアラインメントを示す。キメラＰＣＶ２−３ｃｌ．１４のカプシドタンパク質の配列は、下線を施されて、太字である。 [0043] 図２１は、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ２６４０４２に反映されるＰＣＶ２ａ遺伝子型ウイルスのカプシドタンパク質について並置した核酸（配列番号９）／アミノ酸翻訳（配列番号１０）を示す。 [0044] 図２２は、ＧｅｎＢａｎｋ ＧＵ７９９５７６に反映されるＰＣＶ２ｂ遺伝子型ウイルスのカプシドタンパク質について並置した核酸（配列番号１ｌ）／アミノ酸翻訳（配列番号１２）を示す。 ［0045］ 図２３は、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ１８１９４７に反映されるＰＣＶ２ｄ−１遺伝子型ウイルスのカプシドタンパク質について並置した核酸（配列番号１３）／アミノ酸翻訳（配列番号１４）を示す。 [0046] 図２４は、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＵ１４８５０３に反映されるＰＣＶ２ｃ遺伝子型ウイルスのカプシドタンパク質について並置した核酸（配列番号１５）／アミノ酸翻訳（配列番号１６）を示す。 [0047] 図２５は、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＵ５２４５３３に反映されるＰＣＶ２ｅ遺伝子型ウイルスのカプシドタンパク質について並置した核酸（配列番号１７）／アミノ酸翻訳（配列番号１８）を示す。

[0048] 本発明の様々な態様を作製して使用することについて下記に詳しく考察するが、多種多様な具体的状況において利用し得る多くの応用可能な独創的概念が本発明により提供されることを理解されたい。本明細書において考察される具体的な態様は、本発明を作製して使用するための具体的なやり方の例示にすぎず、本発明の範囲を定めるものではない。

[0049] 本明細書で開示するのは、ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、ＰＣＶ２ｃ、ＰＣＶ２ｄ、及び「ＰＣＶ２ｅ」のサブタイプを代表する遺伝子分岐したＰＣＶ２株をカプシド遺伝子のＤＮＡシャッフリングによって分子育種し、ＰＣＶ２サブタイプ間の遺伝的多様性を代表する新規のキメラＰＣＶ２カプシド配列を産生することである。これは、異なるサブタイプに属する５種の分岐ＰＣＶ２株のカプシド遺伝子をシャッフルすることにより、有効なキメラＰＣＶ２ワクチン候補物質を構築することについての初めての開示であると考えられる。

[0050] １つの態様では、ＰＣＶ２ａ骨格に配置される場合、あるキメラウイルス（ＰＣＶ２−３ｃｌ．１４）が異なるＰＣＶ２サブタイプに対して高い中和抗体力価を誘導した。別の態様では、シャッフルした３ｃｌ．１４カプシドを非病原性ＰＣＶ１骨格にクローニングすることによって、候補ワクチン（ＰＣＶ１−３ｃｌ．１４）を産生した。ワクチン効力試験は、キメラウイルスのＰＣＶ１−３ｃｌ．１４が、ブタにおけるＰＣＶ２ｂ又はＰＣＶ２ｄへのチャレンジに対して防護免疫を誘発することを示したので、変化しやすいＰＣＶ２株に感染したブタにおける新規ワクチンの強力な候補物質であることを表している。

[0051] 本発明の理解を促進するために、いくつかの用語を下記に定義する。本明細書において定義される用語は、本発明に関連する技術領域の当業者によって通常理解されるような意味を有する。「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、及び「ｔｈｅ（その）」のような用語は、単数の実体だけに言及するのではなく、その具体例が例解のために使用され得る一般クラスが含まれることを意図する。本明細書における用語法は、本発明の具体的な態様について記載するために使用されるが、それらの使用法は、特許請求の範囲において概略が述べられる以外に、本発明を規定するものではない。

[0052] 本明細書及び特許請求の範囲において使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」（不定冠詞）と「ｔｈｅ」（定冠詞）には、文脈が明らかに他に指定しなければ、複数の指示対象が含まれる。例えば、「タンパク質抗原」という用語には、複数のタンパク質抗原が、それらの混合物を含めて、含まれる。

[0053] 本明細書において使用されるように、「を含む」という用語は、本発明の組成物及び方法に引用される要素が含まれるが、他の要素を排除するわけではないことを意味するものであると意図される。

[0054] 「抗原」という用語は、抗体の産生又はＴ細胞応答、又はその両方を動物において刺激することができる、化合物、組成物、又は免疫原性物質を意味し、動物へ注射又は吸収される組成物も含まれる。この免疫応答は、分子全体に対して生成される場合もあれば、分子の一部（例えばエピトープ又はハプテン）に対して生成される場合もある。

[0055] 本明細書において使用されるように、「エピトープ」という用語は、抗体又はＴ細胞受容体によって認識される結合部位として役立つ、抗原の個別部分を意味する。例えば、エピトープは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）によって認識される抗原決定基を意味する可能性がある。それぞれの結合抗体のエピトープ結合面は、「パラトープ」と呼ばれる。

[0056] Ｂ細胞エピトープは、直線的又は立体的であり得て、強いエピトープの大多数は立体的である。Ｔ細胞エピトープは直線的である。直線的エピトープは、より大きいタンパク質の中に位置する、典型的には５〜２０アミノ酸の長さである、アミノ酸の連続配列である。典型的には、強いＢ細胞エピトープは、ネイティブタンパク質の立体的な構造によって明確化される。立体的エピトープを形成するアミノ酸は、連続したアミノ酸の折り畳まれたストレッチであり得るか、又はパラトープ認識面がタンパク質の離れた部分に位置していて、ネイティブタンパク質構造の折り畳みによって一緒になる場合は不連続でもよい。

[0057] カプシドタンパク質を完全に組み立てられたビリオン粒子へ組立てることによって形成される独特の３次元立体構造により、ウイルスエピトープには、クリプトトープ（組み立てられたビリオン中に隠れたエピトープである）とネオトープ（完全に組み立てられたビリオンにおいてのみ形成されるが、その分解した成分には存在しないエピトープである）が含まれ得る。本明細書において使用されるエピトープという用語には、クリプトトープとネオトープが含まれる。１つの非限定的な例として、本明細書において使用される「エピトープ」は、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２のシャッフルしたカプシドの領域を意味し、ＰＣＶ２カプシド特異的抗体のパラトープがそれに反応する。

[0058] 本明細書において使用されるように、「ミモトープ」という用語は、エピトープの立体構造を模倣して、対応するエピトープを認識する抗体によって結合される、高分子（ほとんどの場合はペプチド）を意味する。従って、ミモトープは、所与のエピトープに特異的な抗体を使用して、ファージ又はファージミドのディスプレイライブラリーをバイオパニングすることによって入手することができる。

[0059] 本明細書において定義されるように、「免疫原性又は免疫学的組成物」は、目的とする組成物又はワクチンに対する細胞性及び／又は抗体介在性の免疫応答という免疫学的応答を宿主において誘発する少なくとも１つの抗原を含む、物質の組成物を意味する。

[0060] 本明細書において使用される「免疫応答」という用語は、動物において誘発される応答を意味する。免疫応答は、細胞性免疫（ＣＭＩ）又は液性免疫を意味する場合もあれば、その両方に関連する場合もある。本発明は、免疫系の一部に限定される応答も考慮する。通常、「免疫学的応答」には、限定されるものではないが、以下の事象の１以上が含まれる：目的とする組成物又はワクチンに含まれる単数又は複数の抗原に対して特異的に指向される、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞の産生又は活性化。宿主は、新たな感染への抵抗性が強化され、及び／又は疾患の臨床重篤度が低下するように、療法的又は予防的免疫学的応答を示すことが好ましい。そのような防護は、被感染宿主が通常示す症状の低減又は欠落、より速やかな回復時間、及び／又は被感染宿主におけるウイルス力価の低下によって実証される。

[0061] 本明細書において使用されるように、「抗体」という用語には、完全な免疫グロブリン分子、並びにその一部、断片、及び、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、Ｆｓｃ、ＣＤＲ領域のような誘導体、あるいは抗原又はエピトープに結合することが可能な抗体のあらゆる部分が含まれ、２重特異性であるか又はある抗体を起源とする抗原結合部位を別種のポリペプチドと組み合わせたキメラ抗体も含まれる。本明細書において使用される「抗体」という用語には、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、及び重鎖抗体の単一モノマー抗体可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有するその断片も含まれる。可変軽鎖ドメイン（Ｖ_Ｌ）と定常軽鎖（Ｃ_Ｌ）ドメインを欠くｓｄＡｂは、自然界では、ラクダ科動物（Ｖ_ＨＨ）と軟骨魚類（Ｖ_ＮＡＲ）に見出され、リャマにおいて特異抗原結合性のｓｄＡｂを初めて開発した製薬企業のＡｂｌｙｎｘによって「ナノボディ」と呼ばれる場合もある。「モノクローナル」という修飾句は、元は単一のＢリンパ球クローンより産生される、実質的に均質な抗体の集団より入手されるものとしての抗体の特性を示し、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈してはならない。「モノクローナル抗体」という用語には、限定されるものではないが、ファージディスプレイ、親和性成熟、及び部位特異的突然変異誘発が含まれる分子技術と、共有結合の修飾及びコンジュゲーションが含まれる化学技術が含まれる公知のあらゆる技術によって提供される、モノクローナル抗体と種適合性モノクローナル抗体より誘導されるキメラ抗体、並びにその断片、部分、領域、又は誘導体が含まれる。

[0062] 本明細書において使用される「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を高める１以上の物質から構成される組成物を意味する。アジュバントがいかに作動するかの機序については、完全には知られていない。抗原をゆっくり放出することによって免疫応答を高めると考えられているアジュバンもあれば、それ自体が強く免疫原性であって、相乗的に機能すると考えられているアジュバントもある。

[0063] 本明細書において使用されるように、「多価」という用語は、同一種（即ち、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの異なる単離株）又は異なる種（即ち、パスツレラ・ヘモリチカ及びパスツレラ・ムルトシダからの単離株）由来の１種より多い抗原を含有するワクチン、あるいは異なる属由来の抗原の組合せを含有するワクチン（例えば、パスツレラ・ムルトシダ、サルモネラ属菌、大腸菌、ヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）、及びクロストリジウム属菌由来の抗原を含むワクチン）を意味する。

[0064] 本明細書において使用される「ブタ」又は「仔ブタ」という用語は、ブタ起源の動物を意味する。
[0065] 本明細書において使用されるように、「毒性」という用語は、動物宿主において感染性であるその能力を保持する単離株を意味する。

[0066] 「不活化ワクチン」は、もはや複製も増殖も可能でない、感染性の微生物又は病原体を含有するワクチン組成物を意味する。病原体は、起源が細菌、ウイルス、原生動物、又は真菌であり得る。不活化は、凍結融解、化学処理（例えば、チメロサール又はホルマリンでの処理）、超音波処理、放射線照射、加熱、あるいは微生物の免疫原性を維持しながらその複製又は増殖を予防するのに十分な他のあらゆる慣用手段を含めた多様な方法によって達成され得る。

[0067] 本明細書において使用される「変異体」という用語は、対応するポリペプチドがその野生型ポリペプチドと比較されるときに実質的に同等な機能を有するように、保存的変異又は他のマイナー修飾（例えば末端切断）などの１以上のアミノ酸変異を有するポリペプチド、又はポリペプチドをコードする核酸配列を表す。

[0068] 「保存的変異」は、アミノ酸残基を別の生物学的に類似した残基に置換すること、あるいはコードされるアミノ酸残基が変化しないか又は別の生物学的に類似した残基であるように、核酸配列中のヌクレオチドを置換することを意味する。保存的変異の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、若しくはメチオニンのような疎水性残基を別の疎水性残基に置換すること、又はアルギニンをリジンに、グルタミン酸をアスパラギン酸に、若しくはグルタミンをアスパラギンに置換することのような１つの極性残基を置換すること等が含まれる。「保存的変異」という用語には、置換されたポリペプチドに対して産生される抗体が未置換ポリペプチドとも免疫反応する限りにおいて、未置換の親アミノ酸に代わって置換アミノ酸を使用することも含まれる。

[0069] 本明細書において使用されるように、「シャッフルした」という用語は、異なるＰＣＶ株のカプシド遺伝子の断片間の分子組換えを意味する。シャッフリングは、ＰＣＲシャッフリング、付着伸長プロセス（ＳｔＥＰ）、合成シャッフリング、ハイブリッド酵素創出用の漸増的短縮（ＩＴＣＨＹ）、及び非相同性ランダム組換え（ＮＲＲ）を含めた現在公知のいくつかの方法によって実施することができる。どのようにシャッフリングが行われるかにかかわらず、結果的に生じる分子は、異なる親ＤＮＡの組換え片から構成されるため、「キメラ」と呼ばれる。ＰＣＲシャッフリングは、ＤＮアーゼによる消化のような断片化、その断片の混合、そして無プライマーＰＣＲによる増幅、次いでシャッフリングによって組換えられる遺伝子の末端領域に特異的なプライマーを使用する増幅によって実施される。最終プライマーには、シャッフルされ再構成された断片のクローニングを可能にする制限酵素部位が含まれる。この方法は、Stemmer, W. P. C.,“DNA Shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution（ランダム断片化と再構成によるＤＮＡシャッフリング：分子進化のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え）”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(22) (1994) 10747-10, 751によって最初に記載された。ＳｔＥＰ法では、反復未熟変性ＰＣＲ伸長期によって相同組換え体を得る。この一部重合した遺伝子は、鋳型を交換することができ、得られる全長キメラには、可変数の交差がある。アセンブリＰＣＲとしても知られる合成シャッフリングは、いくつかの遺伝子座での遺伝的変異をコードする、オリゴヌクレオチドの重複ライブラリーを利用する。合成シャッフリングは、かなりの変異を生じる可能性がある。ＩＴＣＨＹでは、異なる遺伝子変異体の混合物を末端切断するエクソヌクレアーゼの使用の後、平滑末端ライゲーションを伴う。ＮＲＲは、ＤＮアーゼ断片化に続いて平滑末端ライゲーションを使用して、多様なトポロジー再構成（欠失、挿入、及びドメイン再構築）を産生する。

[0070] 本明細書において使用されるように、「医薬的に許容される担体」及び「医薬的に許容されるビヒクル」という用語は、同義で互換性があり、副作用を伴わずに宿主へ注射することができる、ワクチン抗原を含有するための流動ビヒクルを意味する。当該技術分野で公知の好適な医薬的に許容される担体には、限定されるものではないが、滅菌水、生理食塩水、ブドウ糖溶液、デキストロース溶液、又は緩衝化溶液が含まれる。担体には、限定されるものではないが、希釈剤、安定化剤（糖類とアミノ酸）、保存剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、増粘添加剤、着色剤等を含めた補助剤が包含され得る。

[0071] 本明細書において使用されるように、「ワクチン組成物」という用語には、宿主において免疫応答を誘発するのに有用な、医薬的に許容されるビヒクル中の少なくとも１つの抗原又は免疫原が含まれる。ワクチン組成物は、レシピエント動物の年齢、性別、体重、種、及び状態といった因子、並びに投与経路を考慮して、医学又は獣医学分野の当業者に周知の投与量及び技術によって投与することができる。投与経路は、経皮的（皮内、経皮、皮下、筋肉内の経路を介して皮膚より、又は口腔、鼻腔、肛門、膣を介して粘膜より）又は非経口経路（静脈内若しくは腹腔内）であり得る。ワクチン組成物は、単独で投与しても、他の治療薬若しくは療法とともに同時投与又は連続投与してもよい。投与の形態には、懸濁液剤、シロップ剤、又はエリキシル剤、及び非経口、皮下、皮内、筋肉内、又は静脈内投与（例えば注射可能な投与）用の滅菌懸濁液剤又は乳液剤のような調製品が含まれ得る。ワクチン組成物は、スプレー剤として投与しても、食品及び／又は水に混合しても、好適な担体、希釈剤、又は賦形剤、例えば、滅菌水、生理食塩水、ブドウ糖等と混合して送達してもよい。組成物は、投与経路及び所望される調製品に応じて、湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化又は増粘添加剤、保存剤、香味剤、着色剤等のような補助物質を含有することができる。好適な調製品を過度の実験無しに製造するには、“Remington’s Pharmaceutical Sciences（レミントン製剤科学）”（1990）のような標準の製薬テキストが参考になり得る。

[0072] ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）は、制御されない場合、世界の養豚業界に多大な経済的損失を引き起こすブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の主たる原因物質である。実際、ＰＣＶＡＤは、間違いなく、世界の養豚業界に影響を及ぼしている、経済的に最も重要な疾患の１つである。進行性の消耗、組織球浸潤を伴うリンパ球枯渇の顕著な組織学的病変、及びＰＣＶ２の抗原又はＤＮＡの病変部における存在を特徴として、ＰＣＶＡＤは、ＰＣＶ２感染によって引き起こされるが、臨床ＰＣＶＡＤの全スペクトルの発症には、他の病原体との同時感染が通常必要である。現在利用可能な市販ワクチンはいずれも、２００５年までは主要なサブタイプであったＰＣＶ２ａサブタイプを標的とするが、世界のブタ集団において現在流行している優勢なサブタイプはＰＣＶ２ｂであって、ワクチン接種済の家畜群では、新興のＰＣＶ２ｄサブタイプが次第にＰＣＶＡＤに関連してきている。今や、ＰＣＶ２ｂは、養豚業界においてＰＣＶＡＤによる損失に関連する最も蔓延した株として、ＰＣＶ２ａを凌駕している。加えて、近年、ワクチン失敗の証拠が報告されており、ＰＣＶ２ｄ（又はＰＣＶ２ｂ突然変異体）サブタイプの出現と関連付けられてきている。したがって、特に新興のＰＣＶ２株に対する次世代ワクチンを開発することが必須である。

[0073] この目的のために、本発明者らは、異なるＰＣＶ２サブタイプ由来のカプシド遺伝子をＤＮＡシャッフリングによって分子育種すること、そして非病原性のＰＣＶ１骨格及び分岐ＰＣＶ２サブタイプのシャッフルしたカプシド遺伝子に基づいて候補キメラウイルスワクチンを開発することに着手した。ＤＮＡシャッフリングアプローチでは、４種の公知ＰＣＶ２サブタイプのそれぞれから、並びに現在は一般に分岐ＰＣＶ２ａ株とみなされている「ＰＣＶ２ｅ」タイプから、５種の遺伝的に異なるカプシド配列を使用した。クローニングして配列決定した５０より多いシャッフルしたＰＣＶ２カプシドの中で、ＰＫ１５細胞においてレスキューされた感染性のキメラウイルスは、その中の４つだけであり、この小さなＰＣＶ２ゲノムでは、カプシド遺伝子内の多数の強制的なランダム再集合を支援することができないことを示唆している。

[0074] ＤＮＡシャッフリングによって生成されたシャッフルＰＣＶ２カプシドを有する４種の生存可能なキメラウイルスは、５種の遺伝的に分岐したＰＣＶ２株のすべてに由来する抗原性エピトープを含有していたが、シャッフルしたカプシドにおける多様性の大部分は、ＰＣＶ２ｃ親株に見出すことができた。ＰＣＶ２ｃサブタイプは、系統樹解析に基づけば、これまでに同定されたＰＣＶ２サブタイプの残りから最も分岐した株である。この５種の選択された親株のアラインメントは、ＰＣＶ２ｃが、実際に、最も遺伝的に異なるアミノ酸変異を含有することを明らかにしたが、これらのアミノ酸のうちいくつかは、末端リジン残基の付加を含めて、親ＰＣＶ２ｄ株と重複している。ＰＣＶ２ｃ株とＰＣＶ２ｄ株に独特のアミノ酸残基が存在することは、ＰＣＶ２ｃサブタイプが臨床疾患に関連していないとしても、このサブタイプが現行のＰＣＶ２ｄサブタイプの進化的出現に寄与した可能性があることを示唆している。実際、ＰＣＶ２ｃサブタイプは、１９９０年代初頭にデンマークにおいて最初に記載されて以降初めて、最近になってブラジルの野生のブタより単離された。野生のブタ集団は、他の３種のＰＣＶ２サブタイプにも感染しており、遺伝子組換えの可能性が示唆された。したがって、これらの知見は、現在出現しているＰＣＶ２株及び将来出現する可能性があるＰＣＶ２株に対する、得られる候補ワクチンの防護の幅を増やすために、ＤＮＡシャッフリングにＰＣＶ２ｃを含めることを支持するものである。

[0075] シャッフルしたキメラウイルスのｉｎ ｖｉｖｏ感染力を定量し、その後のチャレンジと効力試験に最も適したキメラをスクリーニングするために、パイロット試験において、ＰＣＶ２ａ骨格にシャッフルしたカプシドを有する４種のキメラウイルスのそれぞれを、キメラＰＣＶ１−２ａワクチンウイルスとともに在来ブタに実験的に接種した。結果は、キメラウイルスＰＣＶ２−３ｃｌ．１４が、キメラＰＣＶ１−２ａウイルス、並びに他の３種のキメラウイルスと比較して、より高いレベルの中和抗体力価を誘導することを示した。キメラウイルスＰＣＶ２−３ｃｌ．１４は、ＰＣＶ２ａ株及びＰＣＶ２ｄ−２株に対しても有意に高い中和抗体力価を誘導した。シャッフルしたカプシド３ｃｌ．１４のアミノ酸配列を、他の３種のシャッフルしたカプシド、並びにＰＣＶ１−２ａと比較すると、図３に示すように、異なるアミノ酸残基を有する３つの領域を示している。これらの領域のうち２つ、アミノ酸１０６〜１０８及び１２６は、以前同定されたＢ細胞抗原性エピトープと重複する。加えて、１２６位での突然変異は、予測されるＢ細胞エピトープ及びＳＬＡ−クラスＩＩエピトープ内の位置に相当した。興味深いことに、３ｃｌ．１３、３ｃｌ．４＿２、及び３ｃｌ．１２＿２のシャッフルしたカプシドはいずれも、ＰＣＶ２ｄ親株に見出されるカプシドのＣ末端に、追加のリジン残基を含有する。この突然変異は、病原性の増加と新興のＰＣＶ２ｄ株へのワクチンの失敗に役割を果たすことが示唆されるが、この役割の直接的証拠については今日まで報告されていない。しかしながら、３ｃｌ．１４シャッフルカプシド配列には追加のリジンが含まれず、チャレンジ及び効力の実験ではＰＣＶ１−３ｃｌ．１４がＰＣＶ２ｄ−２感染を防ぐため、それがＰＣＶ２ｄ−２株に対する中和抗体産生に必要なエピトープではないことを示唆している。上で考察した３ｃｌ．１４カプシド配列の特性は、ブタにおける交差防護的な中和抗体の産生に重要である可能性がある。

[0076] 有意に高い交差中和抗体力価の誘導に基づいて、シャッフルした３ｃｌ．１４カプシド配列をその後選択して、キメラウイルスＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ワクチン候補物質を産生した。このＰＣＶ１−３ｃｌ．１４キメラウイルスの潜在的なワクチンとしての防護効果について、ワクチン接種済のブタをＰＣＶ２ｂ又はＰＣＶ２ｄでそれぞれチャレンジすることによって評価した。ＰＣＶ２ｂは現在全世界のブタに感染している優勢なサブタイプであり、一方、ＰＣＶ２ｄは新興のサブタイプである。我々は、以前、非病原性ＰＣＶ１のゲノム骨格のキメラＰＣＶ１−２ａウイルス及びＰＣＶ１−２ｂウイルスの弱毒化をｉｎ ｖｉｖｏで実証した。こういった以前の報告に一致して、ＰＣＶ２カプシド抗体への血清変換によって証明されるようにワクチン接種済のブタが感染しているとしても、本試験の期間を通して、そのワクチン接種済のブタには検出可能なＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ウイルス血症は無く、ＰＣＶ２ｂ又はＰＣＶ２ｄでのチャレンジに先立って、検出可能な臨床疾患も無かった（データ示さず）。

[0077] キメラウイルスＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ワクチン候補物質でのワクチン接種は、ウイルス血症のピーク時にＰＣＶ２ｂ又はＰＣＶ２ｄウイルスＤＮＡロードを有意に低下させただけでなく、試験の終了時にリンパ系組織におけるウイルスＤＮＡロードを低下させた。さらに、ワクチン接種された後にＰＣＶ２ｂでチャレンジされた群では、偽接種されてチャレンジされた対照と比較して、リンパ系の病変も有意に低下していた。ワクチン接種済の動物は、ＰＣＶ２ｄでチャレンジされたときに、脾臓のリンパ球枯渇と脾臓及び扁桃の組織球置換において有意な低下を示さなかったが、血清及びリンパ節組織におけるウイルスＤＮＡロードの低下と同様に、ＰＣＶＡＤスコアの残りでは有意に低下し、ＰＣＶ１−３ｃｌ．１４キメラウイルスワクチン候補物質が在来ブタにおいてＰＣＶ２ｂ及びＰＣＶ２ｄのチャレンジに対する防護を誘発したことを示している。

[0078] 要約すると、上記のことは、異なるサブタイプに属する５種の分岐ＰＣＶ２株のカプシド遺伝子のシャッフリングによる、生存可能なキメラＰＣＶ２ワクチン候補物質の構築に関する我々の知識についての最初の開示である。重要なことには、シャッフルしたカプシド遺伝子を有するキメラウイルスＰＣＶ１−３ｃｌ．１４でのブタのワクチン接種は、ＰＣＶ２ｂ及びＰＣＶ２ｄでのチャレンジに対する防護免疫を誘発し、この構築体を市販ワクチンとすることを支持している。

[0079] 以下の実施例は、開示の完全性のために含まれるものであり、本発明の組成物及び複合体を作製する方法を例証するとともに、本組成物のいくつかの特徴を提示するためのものである。これらの実施例は、本開示の範囲又は教示を限定することを意図するものでは決してない。

キメラワクチンの生成及び試験
[0080] １つの態様では、最初に、シャッフルしたＰＣＶ２カプシド遺伝子をＰＣＶ２ａ骨格にクローニングした。全部で４種のキメラウイルスがｉｎ ｖｉｔｒｏで生存可能であることがわかり、次いでこれらを使用してブタに感染させ、異なるＰＣＶ２サブタイプに対する交差中和抗体の誘導能について評価した。１つのキメラウイルス（ＰＣＶ２−３ｃｌ．１４）は、異なるＰＣＶ２サブタイプに対してより高い中和抗体力価を誘導した。このシャッフルした３ｃｌ．１４カプシド遺伝子を非病原性ＰＣＶ１のゲノム骨格にクローニングすることによって、候補物質ワクチン（ＰＣＶ１−３ｃｌ．１４）を産生した。

[0081] ３２匹のブタにおいて実施したワクチン効力試験により、キメラウイルスのＰＣＶ１−３ｃｌ．１４がＰＣＶ２ｂ又はＰＣＶ２ｄでのチャレンジに対して防護免疫を誘導することが明らかにされた。ＰＣＶ１−３ｃｌ．１４でワクチン接種され、その後ＰＣＶ２ｂ又はＰＣＶ２ｄでチャレンジされたブタでは、偽ワクチン接種されたブタと比較して、微視的病変が有意に減少し、血清及びリンパ系組織におけるウイルスＤＮＡロードが低下していた。このキメラＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ウイルスは、変異しやすいＰＣＶ２株によく感染するブタ集団にとって、新規の第２世代ＰＣＶ２ワクチンの有力な候補物質を提供する。

[0082] 細胞： ＰＫ−１５細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３３）の限界希釈によって、ＰＣＶ１汚染の無いＰＫ−１５細胞のサブクローンを以前のように産生した。このサブクローンＰＫ−１５細胞株を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を添加した最小必須培地（ＭＥＭ）において培養し、血清ウイルス中和アッセイにおいて使用し、そして本試験用のすべてのウイルスストックを増殖させるために使用した。

[0083] ５種の異なるＰＣＶ２サブタイプ由来カプシド遺伝子のＤＮＡシャッフリング： ＰＣＶ２ａ（４０８９５株、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ２６４０４２、配列番号９）、ＰＣＶ２ｂ（ＮＣ１６８４５株、寄託番号ＧＵ７９９５７６、配列番号１１）、ＰＣＶ２ｃ（寄託番号ＥＵ１４８５０３、配列番号１５）、ＰＣＶ２ｄ−１（寄託番号ＡＹ１８１９４７、配列番号１３）、及び「ＰＣＶ２ｅ」（寄託番号ＥＦ５２４５３３、配列番号１７）を含めた５種の遺伝的に多様化したＰＣＶ２サブタイプのそれぞれを代表するカプシド遺伝子配列を選択してＤＮＡシャッフリングした。ＰＣＶ２ａ株及びＰＣＶ２ｂ株は、米国のブタより単離され、Fenaux et al.及びBeach et al.に記載されており、一方ＰＣＶ２ｃ、ＰＣＶ２ｄ−１、及び「ＰＣＶ２ｅ」のカプシド遺伝子は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって合成された。Fenaux M, Opriessnig T, Halbur PG, Elvinger F, Meng XJ.,“A chimeric porcine circovirus (PCV) with the immunogenic capsid gene of the pathogenic PCV type 2 (PCV) cloned into the genomic backbone of the nonpathogenic PCV1 induces protective immunity against PCV2 infection in pigs（非病原性ＰＣＶ１のゲノム骨格にクローニングされた、病原性ＰＣＶ２型（ＰＣＶ２）の免疫原性カプシド遺伝子を有するキメラ豚サーコウイルス（ＰＣＶ）は、ブタにおけるＰＣＶ２感染に対して防護免疫を誘導する）”J Virol 78 (2004) 6297-6303、及びBeach NM, Ramamoorthy S, Opriessnig T, Wu SQ, Meng XJ.,“Novel chimeric porcine circovirus (PCV) with the capsid gene of emerging PCV2b subtype cloned in the genomic backbone of the non-pathogenic PCV1 is attenuated in vivo and induces protective and cross-protective immunity against PCV2b and PCV2a subtypes in pigs（非病原性ＰＣＶ１のゲノム骨格にクローニングされた、新興のＰＣＶ２ｂサブタイプのカプシド遺伝子を有する新規キメラブタサーコウイルス（ＰＣＶ）は、ｉｎ ｖｉｖｏで弱毒化され、ブタにおいてＰＣＶ２ｂサブタイプ及びＰＣＶ２ａサブタイプに対する防護及び交差防護免疫を誘導する）”Vaccine 29 (2010) 221-232を参照のこと。

[0084] ＰＲＲＳＶについて以前NiYY et alに記載されたのと本質的に同じようにＤＮＡシャッフリングを使用して、５種の異なるＰＣＶ２カプシド遺伝子をシャッフルした。Ni YY, Opriessnig T, Zhou L, Cao D, Huang YW, Halbur PG, Meng XJ.,“Attenuation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by molecular breeding of virus envelope genes from genetically divergent strains（遺伝子分岐株由来のウイルスエンベロープ遺伝子の分子育種による、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスの弱毒化）”J Virol 87 (2013) 304-313を参照のこと。簡潔に言えば、５種のＰＣＶ２株のそれぞれに由来するカプシド遺伝子ＤＮＡを等量で混合して全部で５μｇのＤＮＡとし、５０μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２に希釈した。この混合物を０．１５ＵのＤＮアーゼＩ（シグマ）とともに１５℃にて３分間インキュベートした。５０〜１５０ｂｐのサイズに及ぶＤＮＡ断片を２％アガロースゲルより精製し、その後、１×Ｐｆｕ緩衝液、２ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及び０．０６Ｕ Ｐｆｕポリメラーゼから成るＰｆｕ ＰＣＲ混合物へ加えた。プライマーを使用しないＰＣＲプログラム（９５℃で４分；９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、５７℃で３０秒、５４℃で３０秒、５１℃で３０秒、４８℃で３０秒、４５℃で３０秒、４２℃で３０秒、及び７２℃で２分を４０サイクル；そして最後に、７２℃で７分）を実施して、消化済みのＤＮＡ断片を再構成した。その後、シャッフルしたＰＣＶ２カプシド領域に隣接する特異的プライマーのＵｎｉＲｅｐ−Ｆ及び２ａＯＲＦ２−Ｒ（表１）を使用し、Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アジレント・テクノロジー）を製造業者の説明書に従って使用して（９５℃で４分；９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒を１０サイクル；９５℃で３０秒、５４℃で３０秒、７２℃で３０秒を２５サイクル；そして最後に７２℃で７分）、シャッフルしたＰＣＶ２カプシドを増幅させた。

[0085] シャッフルしたＰＣＶ２カプシド遺伝子を有するキメラＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ１ウイルスの感染性ＤＮＡクローンの構築： シャッフルしたカプシド遺伝子産物ライブラリーは、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（ライフテクノロジーズ、カールスバッド）を製造業者の説明書に従って使用し、平滑末端クローニングベクターであるｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩにクローニングした。選択したクローンについて配列決定し、ＤＮＡシャッフリング効率を解析し、全５種のＰＣＶ２サブタイプに由来する領域を含有する、十分にシャッフルしたカプシド遺伝子を増幅させ、その後、Opriessnig T, Xiao CT, Gerber PF, Halbur PG, Matzinger SR, Meng XJ.,“Mutant USA strain of porcine circovirus type 2 (mPCV2) exhibits similar virulence to the classical PCV2a and PCV2b strains in caesarean-derived, colostrum-deprived pigs（ブタサーコウイルス２型の米国の突然変異株（ｍＰＣＶ２）は、帝王切開由来で初乳無摂取のブタにおいて、典型的なＰＣＶ２ａ株及びＰＣＶ２ｂ株に類似した毒性を示す）”J Gen Virol 95 (2014) 2495-2503に本質的に記載されている融合ＰＣＲによって、ＰＣＶ２ａ ４０８９５株の感染性ＤＮＡクローン骨格にクローニングした。

[0086] 簡潔に言えば、プライマーのＵｎｉＲｅｐ−Ｆ及び２ａＯＲＦ２−Ｒを使用して、シャッフルしたＰＣＶ２カプシドを増幅させた（表１）。ＰＣＶ２ａ感染性ＤＮＡクローン骨格配列は、ＰＣＶ２カプシド領域に隣接する２つの断片において、それぞれＰＣＶ２ａの断片１ではプライマーのＳａｃＩＩ−ｕｎｉ−Ｆ及びＵｎｉＲｅｐ−Ｒを使用して、断片２ではプライマーの２ａＯＲＦ２Ｆ及びＳａｃＩＩ−ｕｎｉ−Ｒを使用して増殖させた（表１）。３回のＰＣＲ反応はいずれも、ＡＣＣＵＺＹＭＥ ＭＩＸ^ＴＭ（バイオライン）を９５℃で１０分；９５℃で３０秒、５４℃で３０秒、及び６８℃で１．５分を３５サイクルで使用して実施した。第１の融合ＰＣＲは、ＰＣＶ２断片１及びシャッフルしたＰＣＶ２カプシド配列を用いて、外部プライマーのＳａｃＩＩ−ｕｎｉ−Ｆ及び２ａＯＲＦ２−Ｒを使用して実施した。その後、第２の融合ＰＣＲ反応は、第１の融合ＰＣＲ反応産物及びＰＣＶ２ａ断片２を用いて、外部プライマーのＳａｃＩＩ−ｕｎｉ−Ｆ及びＳａｃＩＩ−ｕｎｉ−Ｒを使用して実施した（表１）。いずれの融合ＰＣＲ反応も、ＡＣＣＵＺＹＭＥ ＭＩＸ^ＴＭ（バイオライン）を９５℃で１０分；９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、及び６８℃で４分を３５サイクルで使用して実施した。それぞれ別個のシャッフルしたＰＣＶ２カプシドを含有する全長キメラＰＣＶ２ａを増幅させて、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングキットを使用してｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ ＴＯＰＯプラスミドにクローニングし、シャッフルしたカプシド遺伝子を有するキメラＰＣＶ２ａの感染性ＤＮＡクローンを産生した。

[0087] 類似した融合ＰＣＲプロトコールによって、シャッフルしたＰＣＶ２カプシド３ｃｌ．１４（配列番号７）を非病原性ＰＣＶ１の感染性ＤＮＡクローン骨格にクローニングし、ワクチン候補物質のＰＣＶ１−３ｃｌ．１４（配列番号３７）を創出した。簡潔に言えば、プライマーのＰＣＶ１−ＢＢ−Ｆ及びＰＣＶ１−ＤＳ−ＯＲＦ２−Ｒ（表１）を使用して、シャッフルしたＰＣＶ２カプシド３ｃｌ．１４配列を増幅させた。感染性ＤＮＡクローンＰＣＶ１骨格配列は、ＰＣＶ１を含有するＰＢＳＫ＋プラスミドから、ＰＣＶ１カプシド領域に隣接する２つの断片において、それぞれＰＣＶ１断片１ではプライマーのＭ１３Ｆ（−２０）及びＰＣＶ−ＢＢ−Ｒを使用して、ＰＣＶ１断片２ではプライマーのＰＣＶ−ＤＳ−ＯＲＦ２−Ｆ及びＭ１３Ｒを使用して（表１）増幅させた。３回のＰＣＲ反応は、いずれもＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（サーモサイエンティフィック）を９４℃で３分；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で１分を３５サイクルで使用して実施した。融合ＰＣＲは、初めにＰＣＶ１断片１及びシャッフルしたＰＣＶ２カプシド３ｃｌ．１４断片を用いて、外部プライマーのＭ１３Ｆ及びＰＣＶ１−ＤＳ−ＯＲＦ２−Ｒ（表１）を使用して実施した。第２の融合ＰＣＲ反応は、第１の融合ＰＣＲ反応の産物及びＰＣＶ１断片２を用いて、外部プライマーのＭ１３Ｆ及びＭ１３Ｒ（周知の市販ｐＵＣ／Ｍ１３配列決定プライマー）を使用して実施した。シャッフルしたカプシド３ｃｌ．１４を含有する全長キメラＰＣＶ１ウイルスを、ＺｅｒｏＢｌｕｎｔ（登録商標）クローニングキットを使用してｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ ＴＯＰＯにクローニングし、ワクチン候補物質のキメラＰＣＶ１ウイルス３ｃｌ．１４の感染性ＤＮＡクローンを産生した。

[0088] ウイルスストックの調製： ＰＣＶ２ｂ株ＮＣ１６８４５、米国ＰＣＶ２ｄ−２株：ＪＸ５３５２９６、及びＰＣＶ２ａカプシドをシャッフルしたキメラウイルスのそれぞれの感染性ウイルスストックは、ＰＫ−１５細胞に、それぞれの感染性ＤＮＡクローンに由来するコンカテマー化ウイルスゲノムをトランスフェクトすることによって産生した。簡潔に言えば、それぞれのＰＣＶ２ゲノムを、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ ＴＯＰＯからＳａｃＩＩ消化によって切り出し、コンカテマー化し、ＰＫ−１５細胞へトランスフェクトして、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によってその生存率及び感染性を決定した。キメラＰＣＶ１−２ａ及びシャッフルした３ｃｌ．１４カプシドを含有するキメラＰＣＶ１（ＰＣＶ１−３ｃｌ．１４）のウイルスストックは、コンカテマー化に先立ってＫｐｎ１で消化することによりウイルスゲノムをｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ ＴＯＰＯベクターから切り出したこと以外は、上記と同様にして調製した。

[0089] ＰＣＶ２カプシドをシャッフルしたキメラウイルスの感染性及び交差中和活性の決定： 異なるＰＣＶ２サブタイプに対する交差中和活性が改善された、生存可能なシャッフルしたキメラウイルスを最初に同定するために、限定数（ｎ＝３）の動物を用いたパイロットブタ感染試験を初めに実施した。選択したブタのバッチに対する定期的なＰＣＶ２ ＰＣＲによって決定されるように、ＰＲＲＳＶやマイコプラズマ・ハイオニューモニエが存在しないことが知られており、ＰＣＶ２流行が活発でない生産農家より、全部で１８匹の４週齢で雑種の在来ブタを購入した。雌ブタは、ＰＣＶ２に対して低量の抗体を有するか又は血清陰性であるので、交差哺育を受けていない、陰性の雌ブタからの同腹仔を選択した。この仔ブタを各群３匹の６群へ無作為に割り当てて、各群のブタを別々に収容した。接種に先立って、各ブタを秤量し、採血して、ＰＣＲと血清学によってＰＣＶ２陰性であることを確認した。５つの群に、それぞれ５ｍｌ（１０３．６６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）のキメラウイルスＰＣＶ１−２ａ又は４種のシャッフルしたＰＣＶ２カプシドキメラウイルス（ＰＣＶ２−３ｃｌ．１３、ＰＣＶ２−３ｃｌ．１４、ＰＣＶ２−３ｃｌ４−２、又はＰＣＶ２−３ｃｌ．１２−２）のうちの１種を筋肉内接種した。１つの群には、５ｍＬのＰＢＳ緩衝液を同様に偽接種した（図１）。血液を毎週採取して、ＰＣＶ２抗体への血清変換はＥＬＩＳＡにより、ＰＣＶ２感染の証拠はｑＰＣＲにより動物をモニターした。感染後５６日目（５６ｄｐｉ）に動物を剖検した。毎週の血清試料を使用して、異なるＰＣＶ２サブタイプを代表する株に対する血清ウイルス中和試験を実施した。

[0090] 血清ウイルス中和アッセイ： 被感染ブタより採取した血清試料について、野生型ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、ＰＣＶ２ｄ−１、及びＰＣＶ２ｄ−２株に対する中和抗体力価をＩＦＡによって検定した。簡潔に言えば、血清試料をＰＢＳで１：２に段階希釈し、１５０ＴＣＩＤ５０のＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、ＰＣＶ２ｄ−１、又はＰＣＶ２ｄ−２ウイルスのストックとそれぞれ等量比で混合して、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、この血清−ウイルス混合物を９６ウェルプレート中のＰＫ−１５細胞へ同一２検体で加えた。３７℃で７２時間のインキュベーション後、１０００倍希釈した抗ＰＣＶ２ａブタ血清を１次抗体として、５０倍希釈したＦＩＴＣ結合ヤギ抗ブタＩｇＧ（ＫＰＬ）を２次抗体として使用して、ＩＦＡを実施した。５０％血清中和抗体力価は、ＰＢＳ対照ブタ群の血清のその希釈倍数での平均と比較して、ウイルス力価が５０％以上低下した最高希釈倍数として定量した。

[0091] 在来ブタにおけるワクチン接種の効力及びチャレンジ試験： ＰＣＶ２ａ骨格にシャッフルしたカプシド３ｃｌ．１４を含有するキメラウイルスは、異なるＰＣＶ２株に対して有意に高い中和抗体応答を誘導した。したがって、次いでシャッフルしたカプシド配列３ｃｌ．１４を非病原性ＰＣＶ１の感染性ＤＮＡクローン骨格にクローニングし、ＰＣＶ１−３ｃｌ．１４キメラウイルスをワクチン候補物質として産生した。その後、ブタチャレンジ試験を実施して、現在優勢な流行中のＰＣＶ２ｂ、並びに新興のＰＣＶ２ｄ−２での感染に対する、候補物質ＰＣＶ１−３ｃｌ．１４キメラウイルスワクチンの効力を評価した。

[0092] 簡潔に言えば、ＰＲＲＳＶやマイコプラズマ・ハイオニューモニエが存在しないことが知られておりＰＣＶ２が陰性である生産農家より、全部で３２匹の３週齢で雑種の在来ブタを購入した。この動物試験は、アイオワ州立大学ＩＡＣＵＣ、並びに バージニア工科大学ＩＡＣＵＣによって承認された。この仔ブタを各群８匹の４群へ割り当てた。接種に先立って、各ブタを秤量し、採血して、ＰＣＶ２が陰性であることを確認した。第１群及び第２群のブタに、それぞれ５ｍｌの候補物質ＰＣＶ１−３ｃｌ．１４キメラウイルスワクチン（１０３．７ＴＣＩＤ５０／ｍＬ／ブタ）を頸部にて筋肉内（ＩＭ）接種した。第３群及び第４群のブタに、それぞれ５ｍｌのＰＢＳ緩衝液をＩＭで偽ワクチン接種した（図２）。すべての動物について、消耗、呼吸困難、並びに無気力及び食欲不振のような挙動変化を含めた臨床徴候を毎日モニターした。接種に先立って血液試料を採取し、その後、ワクチン接種後４２日目（４２ｄｐｖ）まで各ブタより毎週採取した。

[0093] ４２ｄｐｖに、第１群（ワクチン接種済）及び第３群（偽ワクチン接種済）のブタは、ＰＣＶ２ｂ ＮＣ１６８４５ウイルス株１０４．８ＴＣＩＤ５０（２．５ｍｌ鼻腔内、２．５ｍｌ ＩＭ）にそれぞれチャレンジし、第２群（ワクチン接種済）及び第４群（非ワクチン接種）のブタは、ＰＣＶ２ｄ−２ ＪＸ５３５２９６ウイルス株１０４．８ＴＣＩＤ５０にそれぞれ同様にチャレンジした。チャレンジ後２０日目（２０ｄｐｃ）（又は６２ｄｐｖ）まで血液試料を毎週採取し、その時点ですべてのブタを秤量して剖検した。ウイルスＤＮＡロードの定量とＰＣＶ２関連病変の組織学的検査のために、血清及び組織試料のパネルを採取した。

[0094] 肉眼病理学及び組織病理学的評価： チャレンジ後２０日目（２０ｄｐｃ）にすべてのブタに対して処置状態が盲目の形式で剖検を実施した。各ブタについて、肉眼での肺病変評価（０〜１００％の肺影響率）及びリンパ節サイズの評価（０［正常］〜３［正常サイズの４倍］）を得た。肺、リンパ節（浅鼠径、縦隔、気管気管支、及び腸管膜）、扁桃、心臓、胸腺、腎臓、脾臓、及び肝臓の切片を剖検の間に採取して、組織学的検査及びＰＣＶ２免疫組織化学（ＩＨＣ）のために定型的に処理した（アイオワ州立大学獣医診断研究所）。また、気管気管支リンパ節（ＴＢＬＮ）の試料を、ＤＮＡ抽出及びリアルタイム定量的ＰＣＲによるＰＣＶ２ウイルスゲノムの定量のために各ブタより採取した。リンパ系組織、肺、心臓、肝臓、腎臓、回腸、及び結腸における微視的病変について、処置状態が盲目の形式でスコア化した。特に、リンパ節、脾臓、及び扁桃については、リンパ球枯渇及び組織球置換の存在と程度を評価した。

[0095] 血清及び組織中のウイルスＤＮＡロードを定量するための定量的ＰＣＲ： いずれの動物実験でも、血清及びリンパ節の試料からＤＮＡを抽出するための以前公表されたプロトコール、並びにこれら試料中のウイルスロードを定量するための以前公表されたｑＰＣＲ ＳＹＢＲグリーンアッセイを使用した。パイロット感染試験（図１）及びチャレンジ実験（図２）では、先に報告されたように、ＰＣＶ２特異的プライマーＰＣＶ２−８３Ｆ及びＰＣＶ２−８３Ｒ（表１）を使用して、複製起点を網羅する保存領域及びレプリカーゼ遺伝子の一部を増幅させた。チャレンジ試験（図２）におけるＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ワクチン株の検出では、ＰＣＶ１−ｑＲｅｐＦプライマー及びＰＣＶ１−ｑＲｅｐＲプライマー（表１）を使用して、ＰＣＶ１骨格ベースのワクチンウイルスＤＮＡのみを増幅させた。

[0096] 血清学： ＰＣＶ２特異的ＥＬＩＳＡ（アイオワ州立大学獣医診断研究所）を以前に記載されたように使用して、各血清試料中の抗ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＩｇＧを検出した。Nawagitgul P, et al.“Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based enzyme-linked immunosorbent assays for detection of antibodies to PCV（ＰＣＶに対する抗体の検出用に改良された間接的なブタサーコウイルス（ＰＣＶ）２型ベース及び組換えカプシドタンパク質（ＯＲＦ２）ベースの酵素結合免疫吸着法）”Clin Diagn Lab Immunol 9 (2002) 33-40を参照のこと。

[0097] 被感染ブタより回収したウイルスの配列確認： 各群から選択されたブタより２０ｄｐｃで採取した血清試料由来のＤＮＡ抽出物について、ＰＣＲによりＰＣＶ２カプシド配列を検査し、増幅させたＰＣＲ産物について配列決定して、被感染ブタより回収したウイルスが動物へ接種したのと同じウイルスであることを証明した。ＰＣＲプライマーＵｎｉｒｅｐ−Ｆ及び２ａＯＲＦ−２（表１）を使用して、クローニングについて上記したのと同じＰＣＲプログラムを使用して、上記試料中のＰＣＶ２カプシド遺伝子を増幅させた。加えて、各群から選択されたブタ由来のＴＢＬＮ組織のＤＮＡ抽出物についても検査し、ＰＣＲによって検出された、被感染ブタ由来のウイルスが、その動物へ接種したのと同じウイルスであることを確認した。以前に記載されたように（Beach et al. 同上）、ＰＣＶ２ｂに特異的なプライマーを使用して、ＰＣＶ２ｂを増幅させて配列決定した。ＰＣＶ２ｄ−２ ｖＤＮＡは、ＰＣＶ２ｂと同じフォワードプライマー及びＰＣＶ２ｄ特異的リバースプライマーＢ−５６−ｍ２ｂ（表１）を使用して、増幅させて配列決定した。

[0098] 統計解析： Ｐｒｉｓｍ ｖ６．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して統計解析を実施した。片側ｔ検定を使用して２群間の統計学的有意差を解析し、一方、片側ＡＮＯＶＡ、次いで多重比較用に補正したｔ検定を使用して、３群間以上の有意差を判定した。

[0099] ５種の遺伝的に異なるＰＣＶ２株由来のシャッフルしたカプシドを含有する感染性キメラウイルスの生成： 従来のＤＮＡシャッフリングを使用して、異なるサブタイプのＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、ＰＣＶ２ｃ、及びＰＣＶ２ｄ−１、並びに「ＰＣＶ２ｅ」（分岐ＰＣＶ２ａ）を代表する、５種の遺伝的に異なるＰＣＶ２株由来のカプシド遺伝子を分子育種した（図３）。シャッフルしたＰＣＶ２カプシドアミノ酸配列は、図３において、３ｃｌ．１３（配列番号４）、３ｃｌ．４＿２（配列番号２）、３ｃｌ．１４（配列番号８）、及び３ｃｌ．１２＿２（配列番号６）と指定される。以前分類された「ＰＣＶ２ｅ」ウイルス単離株は、同定されたＰＣＶ２ａ株からさほど分岐していないので、それ自身のサブタイプとみなせないというのが一般的なコンセンサスであるが、「ＰＣＶ２ｅ」カプシド配列を選択して、得られるシャッフルしたカプシドの遺伝的多様性を高めるのに役立たせた。これら５種の株由来のカプシド遺伝子配列を、ＤＮアーゼＩ消化を使用してシャッフルし、プライマー無しのＰＣＲによって再構成した。次いで、カプシド遺伝子を網羅する特異的プライマーを用いた第２ラウンドのＰＣＲの後、予測サイズのＰＣＲ産物を生成した。次いで、シャッフルしたカプシド遺伝子ライブラリーを、ＰＣＶ２ａ（４０９８５株）の感染性クローン骨格にクローニングして、生存可能なキメラウイルスをスクリーニングした。「十分シャッフルした」カプシド（全５種の親ＰＣＶ２株由来の領域を含有する）を有する５０個以上のクローンの中で、わずか４クローンのみが、ＰＫ−１５細胞にトランスフェクトしたときに感染性ウイルスを成功裡にレスキューされた（データ示さず）。

[00100] シャッフルしたカプシドを有する４種のキメラウイルスは、全５種の親株由来のＰＣＶ２ゲノムの遺伝子の特徴の様々な組合せを含有する（図３）。シャッフルしたカプシドに導入された独特のアミノ酸の特徴の大部分は、ＰＣＶ２ｃを起源とした。系統樹解析に基づくと、ＰＣＶ２ｃは、この５種の親株の中で遺伝的に最も異なるものである（図４）。したがって、ＤＮＡシャッフリングにより、５種の異なるＰＣＶ２サブタイプに由来するシャッフルしたカプシド遺伝子を有する生存可能な感染性キメラウイルスが成功裡に生成されたことを実証している。

[00101] シャッフルしたカプシド遺伝子を有するキメラウイルスＰＣＶ２−３ｃｌ．１４は、異なるＰＣＶ２サブタイプに対する交差中和抗体を誘導する： 生存可能性を決定して、後続のチャレンジ及び効力試験に最も適したシャッフルしたカプシドを有するキメラウイルスをスクリーニングするために、４種のキメラウイルス（ＰＣＶ２−３ｃｌ．１３、ＰＣＶ２−３ｃｌ．１４、ＰＣＶ２−３ｃｌ．４＿２、及びＰＣＶ２−３ｃｌ．１２）のそれぞれ、並びに以前誘導したキメラＰＣＶ１−２ａウイルス（Fenaux et al, 同上）を在来ブタに実験的に感染させた。感染前及びその後毎週血清試料を採取し、すべての動物についてＰＣＶ２ａカプシドへの血清変換をＥＬＩＳＡによってモニターした（図１）。ＰＣＶ１−２ａ及び／又はＰＣＶ２−３ｃｌ．１４を実験的に接種したすべての動物は、接種後４９日目（４９ｄｐｉ）までにＰＣＶ２抗体へ血清変換したが、ＰＣＶ２−３ｃｌ．１２＿２では３匹中２匹だけが、キメラウイルスＰＣＶ２−３ｃｌ．１３又はＰＣＶ２−３ｃｌ．４＿２を接種した３匹のブタでは１匹だけが４９ｄｐｉで血清陽性であった（図１）。

[00102] ５６ｄｐｉに採取した血清試料について、ＰＫ１５細胞中の血清ウイルス中和アッセイによって、野生型ＰＣＶ２ａ（図５Ａ）、ＰＣＶ２ｂ（図５Ｃ）、ＰＣＶ２ｄ−１（図５Ｂ）、及びＰＣＶ２ｄ−２（図５Ｄ）ウイルス株に対する交差中和抗体を検査した。シャッフルしたカプシド遺伝子を有する３種のキメラＰＣＶ２ウイルス（ＰＣＶ２−３ｃｌ．１３、ＰＣＶ２−３ｃｌ．４＿２、及びＰＣＶ２−３ｃｌ．１２）によるブタの感染は、現行のＦｏｓｔｅｒａ^ＴＭＰＣＶ市販ワクチンの基礎であるキメラＰＣＶ１−２ａウイルスより高レベルの中和抗体を誘導しなかった。しかしながら、異なるＰＣＶ２サブタイプ由来のシャッフルしたカプシド遺伝子を有するキメラウイルスＰＣＶ２−３ｃｌ．１４によるブタの感染は、ＰＣＶ１−２ａと比較して、ＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｄ−２に対する有意に高い中和抗体力価を誘導した（ｐ＜０．０５）。加えて、統計的に有意ではないものの、キメラウイルスのＰＣＶ２−３ｃｌ．１４は、ＰＣＶ２ｂ及びＰＣＶ２ｄ−２に対しても、ＰＣＶ１−２ａより高レベルの中和抗体を誘導した。要約すると、このパイロット動物試験は、シャッフルしたカプシド遺伝子を有するキメラウイルスがブタにおいて生存可能で感染性であること、そして１つのキメラウイルスＰＣＶ２−３ｃｌ．１４が、他のキメラウイルス及びＰＣＶ１−２ａワクチンウイルスと比較して、遺伝的に異なるＰＣＶ２株に対して有意に高レベルの中和抗体を誘導することを示唆している。したがって、キメラウイルスＰＣＶ２−３ｃｌ．１４を、ブタにおける後続のチャレンジ及び効力試験用に選択し、新規ワクチンとしてのその潜在的な使用について評価した。

[00103] キメラウイルスのＰＣＶ１−３ｃｌ．１４は、在来ブタにおいて、ＰＣＶ２ｂ及びＰＣＶ２ｄ−２によるチャレンジに対して防護免疫を誘導する： ＰＣＶ２ａは、キメラウイルスＰＣＶ２−３ｃｌ．１４のゲノム骨格である。したがって、次いで、新規ワクチン候補物質を産生するために、当初の交差中和試験において同定されたキメラウイルスＰＣＶ２−３ｃｌ．１４由来のシャッフルしたカプシド遺伝子を、非病原性ＰＣＶ１のゲノム骨格へ移し、新規キメラウイルスＰＣＶ１−３ｃｌ．１４を産生した。キメラウイルスＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ワクチン候補物質が、異なるＰＣＶ２サブタイプによるチャレンジを防護するかどうかを評価するために、２群のブタ（ｎ＝８）をＰＣＶ１−３ｃｌ．１４キメラウイルスでそれぞれワクチン接種し、別の２群のブタ（ｎ＝８）には、対照としてＰＢＳで偽ワクチン接種した（図２）。血液試料を毎週採取し、ＰＣＶ２カプシド抗体への血清変換について動物をモニターした。ワクチン接種後４２日目に、１群のワクチン接種済みの動物及び１群の偽ワクチン接種済みの動物を、現在世界のブタ集団において流行中の優勢な野外株のＰＣＶ２ｂでチャレンジした。同様に、１群のワクチン接種済みブタと１群の偽ワクチン接種済みブタを新興のＰＣＶ２ｄ−２ウイルスでチャレンジした。チャレンジ後、血液試料を毎週採取し、全動物を２０ｄｐｃで剖検した。

[00104] 予測されるように、偽ワクチン接種済の群がＰＣＶ２ｂ又はＰＣＶ２ｄ−２で７〜１４ｄｐｃ（あるいは４９又は５６ｄｐｖ）までに血清変換しなかったのに対し、２つのワクチン接種済み群のブタは、４２ｄｐｖまでにＰＣＶ２カプシド抗体へ血清変換し始めた（図２、図６）。ＰＣＶ１レプリカーゼ遺伝子（ＯＲＦ１）を標的とするｑＰＣＲアッセイを使用して、毎週採取した血清由来のＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ウイルスＤＮＡを検査したが、ＰＣＶ１−３ｃｌ．１４ウイルスＤＮＡは、ワクチン接種後のどの群においても、検出不能であり、アッセイの検出限界以下であった（データ示さず）。このことは、ブタにおける弱毒化キメラＰＣＶ１−２ウイルス感染についての以前の報告に一致している。

[00105] ＰＣＶ２ｂにチャレンジした対照動物８匹のうち４匹及び７匹がそれぞれ１４ｄｐｃ及び２０ｄｐｃで検出可能なウイルス血症を有したのと比較して、ワクチン接種した後ＰＣＶ２ｂにチャレンジした８匹の動物では、わずか２匹が１４ｄｐｃにのみそれを有した（図２）。ワクチン接種してＰＣＶ２ｂチャレンジした群は、偽ワクチン接種してＰＣＶ２ｂチャレンジした動物と比較して、２０ｄｐｃにて血清ウイルスＤＮＡロードが有意に低レベルであったため（ｐ＜０．０１）、この差は統計的に有意であった（図７Ａ及び図７Ｂ）。ワクチン接種した後ＰＣＶ２ｄ−２にチャレンジした動物では、１４ｄｐｃで１／８、２０ｄｐｃで２／８が検出可能なウイルス血症を有し、一方、ＰＣＶ２ｄ−２チャレンジした対照動物では７／８が、１４ｄｐｃ及び２０ｄｐｃで血清ウイルスＤＮＡについて陽性であった（図２）。また、ワクチン接種してＰＣＶ２ｄ−２チャレンジした群では、１４ｄｐｃ及び２０ｄｐｃで、ＰＣＶ２ｄ−２チャレンジのみの対照と比較して、血清ウイルスＤＮＡロードが有意に低下した（それぞれｐ＜０．００１及びｐ＜０．０５）（図７Ａ及び図７Ｂ）。ワクチン接種した後チャレンジしたすべての群は、対照群と比較して、ウイルス複製のピーク時にＰＣＶ２ウイルス血症が有意に低レベルであった。加えて、ワクチン接種した後チャレンジしたすべての群は、リンパ節において、偽ワクチン接種してチャレンジした群と比較して、検出可能なＰＣＶ２ ＤＮＡが有意に低レベルであった（ＰＣＶ２ｂ＝ｐ＜０．００１、ＰＣＶ２ｄ−２＝ｐ＜０００１、図８Ａ及び図８Ｂ）。これらの結果は、ＰＣＶ１−３ｃｌ．１４キメラウイルスによるワクチン接種が、優勢なＰＣＶ２ｂサブタイプ又は新興のＰＣＶ２ｄ−２株にチャレンジすると、ブタにおいてウイルス複製レベルを有意に低下させることを示した。

[00106] 血清及びリンパ系組織においてウイルスＤＮＡロードを低下させることに加えて、ワクチン接種された動物は、非ワクチン接種動物と比較して、ＰＣＶＡＤ病変スコアが低下した（図９Ａ〜図９Ｆ）。その後ＰＣＶ２でチャレンジされたワクチン接種済のブタは、ワクチン接種されないがＰＣＶ２ｂでチャレンジされた対照と比較して、リンパ節（図９Ａ及び図９Ｂ）、脾臓（図９Ｃ及び図９Ｄ）、及び扁桃組織（図９Ｅ及び図９Ｆ）におけるリンパ球枯渇及び組織球置換を含めたＰＣＶＡＤの全尺度について病理学的病変スコアが有意に低下した。

[00107] 同様に、ワクチン接種した後ＰＣＶ２ｄ−２にチャレンジしたブタは、ワクチン接種されないがＰＣＶ２ｄ−２にチャレンジした対照と比較して、リンパ節の尺度、並びに扁桃リンパ球枯渇について病理学的病変スコアが有意に低下した（図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ）。血清及びリンパ節のウイルスＤＮＡ検出についての結果に一致して、ワクチン接種した後チャレンジしたいずれの群も、チャレンジのみの対照と比較して、リンパ節、脾臓、及び扁桃においてウイルス抗原スコアが有意に低かった（図８Ａ〜図８Ｃ）。全体的にみれば、これらの結果は、ＰＣＶ１−３ｃｌ．１４キメラウイルスワクチン候補物質によるワクチン接種が、２種の遺伝的に異なるが関連するＰＣＶ２株である、世界の養豚場において現在流行中の優勢なＰＣＶ２ｂサブタイプ及び新興のＰＣＶ２ｄ−２株を防護することを示唆している。

キメラウイルス誘導体
[00108] 本明細書に開示されるキメラＰＣＶカプシドポリペプチドの誘導体も、本開示の範囲に含まれる。本明細書に開示されるキメラＰＣＶカプシドポリペプチドに含まれるエピトープのアミノ酸配列は、いくらか改変してもよく、それでも治療用免疫原としての使用に適している。例えば、カプシドポリペプチドのエピトープドメイン及び他の非エピトープドメインにおいて、包含されるエピトープの免疫原性に有害な影響を及ぼすことなく、ある種の保存的アミノ酸置換を行うことができる。当業者は、保存的置換の本質、例えば、ある正電荷アミノ酸から別の正電荷アミノ酸への置換；ある負電荷アミノ酸から別の負電荷アミノ酸への置換；ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、などを認識している。本明細書に開示されるキメラＰＣＶカプシドポリペプチドのそのような置換又は改変は、包含されるエピトープが依然として免疫原性である限りにおいて、本発明に含まれることが意図される。加えて、本明細書に開示されるＰＣＶカプシドポリペプチドのエピトープが含まれる免疫原は、全長のＰＣＶカプシドポリペプチドもエピトープ含有ドメインも包含する必要はない。当業者には、本明細書に開示されるキメラＰＣＶカプシドポリペプチドの短鎖型も、免疫原性エピトープが残っている限りにおいて、利用し得るか又は実際は好ましい場合もあることを理解するであろう。本明細書に開示されるキメラＰＣＶカプシドポリペプチドの誘導体には短鎖型が含まれる。誘導体には、例えば、プロテアーゼ切断部位を排除又は導入すること、可溶性を増加又は減少させること、フォールディング、イオン性相互作用、塩架橋などのような分子内又は分子間の相互作用を促進又は抑制すること（これらは、キメラの全長にわたる個別エピトープの提示及び接近可能性に干渉する可能性がある）を含めた、多様な理由により導入される配列修飾も含めてよい。すべてのそのような変更は、結果として生じるアミノ酸配列が、それらエピトープの起源となる１以上のＰＣＶ２型に対する防護抗体反応を誘発するように機能する限りにおいて、本発明に包含されることが意図される。一般に、そのような置換配列は、本明細書に開示されるキメラＰＣＶカプシドポリペプチドに対して少なくとも約８０〜９０％同一であろう。ある態様では、置換誘導体の配列が本明細書に開示されるキメラＰＣＶカプシドポリペプチドに対して９０〜９９％同一であろう。

[00109] 本明細書において使用されるように、キメラＰＣＶカプシドポリペプチドとその誘導体及び短鎖型に関して述べる。ある態様では、そのようなものが単離精製されたポリペプチドサブユニットワクチンとして、又は不活化全ウイルスワクチンとして使用され得る。このポリペプチドは、化学的に合成しても、細菌、哺乳動物、酵母、植物、又は昆虫の細胞におけるような組換えＤＮＡ技術を使用して産生してもよい。しかしながら、他の態様では、キメラＰＣＶカプシドポリペプチドは、キメラＰＣＶカプシドポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が含まれるウイルスベクターの培養によって生成される。このウイルスベクターは、ＰＣＶ１又は２のようなＰＣＶウイルスであっても、例えばポックスウイルス又はバキュロウイルスベクターのような異なるウイルスベクターであってもよい。そのウイルスベクターは、部分精製されてサブユニットワクチンとして使用され得るキメラＰＣＶカプシドポリペプチドをコードしてその産生を指令するか、又は生ウイルスワクチン又は死滅ウイルスワクチンとしてのキメラＰＣＶカプシドタンパク質とその誘導体が含まれるウイルス粒子をコードしてその産生を指令する。

[00110] 表２は、図３に示す親カプシドアミノ酸配列のそれぞれと、シャッフルしたキメラカプシドアミノ酸配列のそれぞれの間で異なるアミノ酸の数を示す。１つの例を挙げると、表２に見られように、キメラカプシドポリペプチドの３ｃｌ．１４は、ＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂのカプシドポリペプチドとは２９アミノ酸、ＰＣＶ２ｃとは３アミノ酸、ＰＣＶ２ｄとは２６アミノ酸、そしてＰＣＶ２ｅ（「分岐ＰＣＶ２ａ」）とは２７アミノ酸異なっている。キメラカプシドポリペプチドの３ｃｌ．１４が含まれるワクチンを投与すると、現在最も重要な病原性の株であるＰＣＶ２ｂ及びＰＣＶ２ｄに対する交差防護をもたらす。ある態様では、１以上のキメラＰＣＶ２カプシドタンパク質とその誘導体が含まれるワクチンが提供され、ここで、それぞれのキメラタンパク質とその誘導体は、独自であって、寄与する親株と３〜３７アミノ酸異なっている。他の態様では、１以上のキメラＰＣＶ２カプシドタンパク質とその誘導体が含まれるワクチンが提供され、ここで、それぞれのキメラタンパク質とその誘導体は、独自であって、親キメラカプシドタンパク質と１〜２７アミノ酸異なっている。ある態様では、少なくともＰＣＶ２ｃ及びＰＣＶ２ｄのカプシド由来アミノ酸配列が含まれる、組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチドとその免疫原性誘導体が提供される。ある態様では、細菌、酵母、哺乳動物、又は昆虫の細胞において発現される組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチドが提供される。ある態様では、組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチドが含まれる免疫原性組成物は、サブユニットワクチンであって、他の態様では、組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチドは、不活化全ウイルスワクチンという状況で提示される。

[00111] 他の態様では、キメラＰＣＶ２カプシドタンパク質の１以上の誘導体が含まれるワクチンが提供され、ここで、その誘導体は、保存的置換によって親キメラカプシドポリペプチドと異なっている。他の態様では、親キメラカプシドポリペプチドと、１〜２７アミノ酸、好ましくは１〜１５、１〜１０、１〜５、あるいは１又は２アミノ酸異なっている、キメラカプシドタンパク質の誘導体が提供される。さらに他の態様では、図３に強調して示されるような株特異的な変異アミノ酸から選択されるアミノ酸置換が含まれる免疫原性ＰＣＶ２カプシドタンパク質が提供され、ワクチンとして使用される場合、ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、ＰＣＶ２ｃ、ＰＣＶ２ｄ、ＰＣＶ２ｅ株又は遺伝子型及び新たに出現しつつあるこれらの変異体の２以上に対する交差防護をもたらす、カプシドポリペプチド誘導体を提供する。

キメラワクチン組成物
[00112] 生ウイルスワクチン、修飾生ウイルスワクチン、不活化ウイルスワクチン、弱毒化ワクチン、プラスミドＤＮＡワクチン、又はサブユニットポリペプチドワクチンのいずれも、免疫学的に有効な量が投与される。「免疫学的に有効な」量は、免疫応答を刺激する、即ち液性抗体の産生を刺激する、及び／又は細胞介在性の応答を刺激するのに十分である。ワクチン組成物には、好適なアジュバント、及び１以上の湿潤剤又は分散剤が含まれ得る。そのような湿潤剤には、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体のような非イオン性界面活性剤、即ち、プルロニック（登録商標）の商標で市販され、ＢＡＳＦ社（ニュージャージー州マウントオリーブ）より入手可能なものが含まれる。他の有用な非イオン性界面活性剤には、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）の商標で入手可能な、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０）のようなポリオキシエチレンエステル類が含まれる。

[00113] 好適なアジュバントの例としては、限定されるものではないが、植物ベースの油剤（即ち、コーン油、ゴマ油、オリーブ油、ダイズ油、サフラワー油、綿実油、菜種油、ヒマワリ油、ホホバオイル、ヤシ油、落花生油、又はこれらの混合物）、スクアラン（サメ肝油）、又は他の代謝可能な油剤、並びにＳＰ油剤（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体、スクアラン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、及び緩衝塩類溶液を含んでなる油乳剤）、エマルシゲン（ＭＰＶ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ネブラスカ州オマハ、アメリカ）、モンタニド（Ｓｅｐｐｉｃ、パリ、フランス）を含めたアジュバント混合物などの、免疫刺激性の生体適合性油剤が挙げられる。他のアジュバントには、水中油型アジュバント、高分子／水アジュバント、油中水型アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、及びビタミンＥアジュバントが含まれる。

[00114] 好適なＳＰ油剤アジュバントの１例には、１ｍｇのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体（プルロニックＬ１２１など）、２ｍｇのスクアラン、０．１６ｍｇのポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０）（Ｔｗｅｅｎ８０など）、及び０．０５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。

[00115] 該組成物の他の成分には、限定されるものではないが、ＨＥＰＥＳ希釈液、イーグル（アール塩）ＭＥＭ増殖培地、ＨＥＰＥＳ酸、炭酸水素ナトリウム、塩酸、水酸化ナトリウム、ホルマリンやチメロサールのような保存用化合物、及び注射用水を含めた医薬用の賦形剤及び緩衝液が含まれ得る。

キメラカプシド特異的なモノクローナル抗体とミモトープワクチン
[00116] １つの態様では、本発明で提供される組換えキメラブタサーコウイルスは、１以上のキメラウイルス：ＰＣＶ２−３ｃｌ．１３、ＰＣＶ２−３ｃｌ．１４、ＰＣＶ２−３ｃｌ４＿２、及びＰＣＶ２−３ｃｌ．１２＿２のカプシドタンパク質上のエピトープに特異的な抗体を産生するための抗原として使用される。この抗体がモノクローナル抗体である場合、ハイブリドーマとモノクローナル抗体を入手するために使用される方法論は、Kohler & Milstein Nature 256 (1975) 495-497 によって初めに記載されたリンパ球融合及びハイブリドーマ培養の慣用法に従ってよい。モノクローナル抗体を調製するための他の方法も知られており、Barbas CF, et al. “Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site（コンビナトリアル抗体ライブラリーのファージ表面でのアセンブリ：ＩＩＩ遺伝子部位）” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (18) (1991) 7978-82 によって記載され、その後改良されたようなファージディスプレイが含まれる。誘導される抗体は、診断及びワクチン開発に利用される。

[00117] ワクチン開発の文脈において、誘導されるモノクローナル抗体は、Smith GR. “Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface（線維状融合ファージ：クローン化抗体をビリオン表面上に提示する新規発現ベクター）” Science 228 (4705) (1985) 1315-7 によって初めて記載された既知の技術に従って産生される、ファージディスプレイライブラリーのようなペプチドライブラリーに対してスクリーニングされる。１つの態様では、１以上のキメラウイルス：ＰＣＶ２−３ｃｌ．１３、ＰＣＶ２−３ｃｌ．１４、ＰＣＶ２−３ｃｌ４＿２、及びＰＣＶ２−３ｃｌ．１２＿２のカプシドタンパク質上のエピトープに特異的な抗体は、マイクロタイタープレートに吸着され、ファージディスプレイペプチドライブラリーとともにインキュベートされる。この抗体に結合しているファージを、反復ラウンドの選択を介して単離する。所望により、計算マッチングを使用することを含めて、有望なクローンを選択する。単離されて証明されたミモトープについて、ミモトープを用いた免疫化試験において検査し、カプシドタンパク質を認識する抗体の産生によって分子類似性を証明し得る。次いで、異なるＰＣＶサブタイプに特異的なカプシドエピトープミモトープの混合物を、アジュバントと一緒にペプチド抗原としてするか、又は複数のミモトープの直鎖構築体として使用して、数種のＰＣＶ２株に対する防護免疫応答を産生させる。

[00118] 本明細書に引用されるすべての公表文献、特許、及び特許出願は、その全体が本明細書に明記されるかのようにして、本明細書に援用される。本発明について、例示の態様を参照して記載してきたが、本記載は、限定的な意味で解釈されることを意図するものではない。当業者には、本記載を参考にして、例示の態様の様々な修飾及び組合せ、並びに本発明の他の態様が明らかであろう。したがって、添付の特許請求の範囲には、そのような修飾及び改善も含まれることが意図される。

Claims (37)

1. 組換えブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）カプシドポリペプチド又はその免疫原性誘導体を含むワクチン組成物であって、組換えブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）カプシドポリペプチドは、天然ＰＣＶ２カプシドポリペプチドとは異なるキメラアミノ酸配列であって、複数のＰＣＶ２遺伝子型からのカプシド由来アミノ酸配列を包含する、前記組成物。
2. 組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチドが、３ｃｌ．１４（配列番号８）、３ｃｌ．１３（配列番号４）、３ｃｌ．４＿２（配列番号２）、３ｃｌ．１２＿２（配列番号６）と指定されるカプシドポリペプチドから成る群より選択される、請求項１のワクチン組成物。
3. 組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチド又はその免疫原性誘導体が、ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、ＰＣＶ２ｃ、ＰＣＶ２ｄ、及びＰＣＶ２ｅの親遺伝子型の２以上からのカプシド由来アミノ酸配列を包含する、請求項１のワクチン組成物。
4. 組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチド又はその免疫原性誘導体が、寄与する親遺伝子型と３〜３７アミノ酸異なっている、請求項３のワクチン組成物。
5. 免疫原性誘導体が、親キメラカプシドポリペプチドと１〜２７アミノ酸異なっている、請求項３のワクチン組成物。
6. 組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチド又はその免疫原性誘導体が、少なくともＰＣＶ２ｃ及びＰＣＶ２ｄのカプシド由来アミノ酸配列を含む、請求項３のワクチン組成物。
7. 組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチドが、細菌、酵母、哺乳動物、又は昆虫の細胞において発現される、請求項１〜６のいずれか１項のワクチン組成物。
8. サブユニットワクチン又は不活化全ウイルスワクチンである、請求項１〜６のいずれか１項のワクチン組成物。
9. 組換えＰＣＶ２カプシドポリペプチド又はその免疫原性誘導体が、ウイルスベクターによってコードされる、請求項１〜６のいずれか１項のワクチン組成物。
10. アジュバントをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項のワクチン組成物。
11. アジュバントが、水中油型アジュバント、高分子／水（polymer and water）アジュバント、油中水型アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、ビタミンＥアジュバント、及びこれらの組合せから成る群より選択される、請求項１０のワクチン組成物。
12. ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体、スクアラン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、及び緩衝塩類溶液が含まれる油乳剤（ＳＰ油剤）を含む、請求項１０のワクチン組成物。
13. 医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項１０のワクチン組成物。
14. 少なくとも１つの追加抗原をさらに含む、請求項１０のワクチン組成物。
15. 少なくとも１つの追加抗原が、ブタにおいて疾患を引き起こし得る微生物から保護する、請求項１４のワクチン組成物。
16. 微生物が、細菌、ウイルス、及び寄生虫より選択される、請求項１５のワクチン組成物。
17. 細菌微生物が、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、気管支敗血症菌、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブルセラ属（ブタ流産菌）、カンピロバクター属菌、クロストリジウム属菌、大腸菌、ブタ丹毒菌、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）、イソスポラ・スイス（Isospora suis）、ローソニア・イントラセルラリス、レプトスピラ属菌、リステリア・モノサイトゲネス、マイコプラズマ・ハイオライニス、マイコプラズマ・ハイオシノヴィエ、マイコプラズマ・フロクラーレ（Mycoplasma flocculare）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、パスツレラ・ムルトシダ、ブタ連鎖球菌、黄色ブドウ球菌及びスタフィロコッカス・ハイカスを含めたブドウ球菌属菌、サルモネラ・コレラスイス及びサルモネラ・エンテリティディスを含めたサルモネラ属菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、旋毛虫、トキソプラズマ、及びエルシニア・エンテロコリチカの１以上より選択される、請求項１６のワクチン組成物。
18. ウイルス微生物が、アフリカブタコレラウイルス、ブタコレラウイルス（ＣＳＦ）、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）、ニパウイルス、ブタサイトメガロウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタエンテロウイルス、脳心筋炎ウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ブタ呼吸器型コロナウイルス（ＰＲＶＶ）、ブタヘルペスウイルス１型としても知られる仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ロタウイルス、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）、及びブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）の１以上より選択される、請求項１６のワクチン組成物。
19. 寄生虫微生物が、ブタ回虫、大腸バランチジウム、トキソプラズマ、及び小形クリプトスポリジウムの１以上より選択される、請求項１６のワクチン組成物。
20. ＰＣＶ２カプシドポリペプチドの免疫原性エピトープをコードする、複数のＰＣＶ２遺伝子型由来のＤＮＡシャッフルしたＰＣＶ２カプシド遺伝子配列又はその誘導体を含有する配列を有するキメラ核酸分子。
21. ＤＮＡシャッフルしたＰＣＶ２カプシド遺伝子配列が、３ｃｌ．１４（配列番号７）、３ｃｌ．１３（配列番号３）、３ｃｌ．４＿２（配列番号１）、３ｃｌ．１２＿２（配列番号５）と指定されるカプシド遺伝子配列から成る群より選択される、請求項２０のキメラ核酸。
22. 請求項２０のキメラ核酸分子を含有するウイルスベクター。
23. バキュロウイルスベクター又はパラポックスウイルスベクターである、請求項２２のウイルスベクター。
24. 複数のＰＣＶ２遺伝子型による感染からブタを保護する方法であって、請求項１〜６及び請求項２０〜２３のいずれか１項のワクチン組成物、キメラ核酸分子、又はウイルスベクターの免疫学的有効量をブタへ投与することを含む、前記方法。
25. ワクチン組成物、キメラ核酸分子、又はウイルスベクターを、非経口、鼻腔内、皮内、及び経皮から成る群より選択される１以上の経路によってブタへ投与することを含む、請求項２４の方法。
26. ワクチン組成物、キメラ核酸分子、又はウイルスベクターが、単回用量で投与される、請求項２５の方法。
27. ワクチン組成物、キメラ核酸分子、又はウイルスベクターが、ブタにおいて疾患を引き起こし得る微生物から保護する少なくとも１つの追加抗原と共に投与される、請求項２４の方法。
28. 微生物が、細菌、ウイルス、及び寄生虫より選択される、請求項２７の方法。
29. 細菌微生物が、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、気管支敗血症菌、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブルセラ属（ブタ流産菌）、カンピロバクター属菌、クロストリジウム属菌、大腸菌、ブタ丹毒菌、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）、イソスポラ・スイス（Isospora suis）、ローソニア・イントラセルラリス、レプトスピラ属菌、リステリア・モノサイトゲネス、マイコプラズマ・ハイオライニス、マイコプラズマ・ハイオシノヴィエ、マイコプラズマ・フロクラーレ（Mycoplasma flocculare）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、パスツレラ・ムルトシダ、ブタ連鎖球菌、黄色ブドウ球菌及びスタフィロコッカス・ハイカスを含めたブドウ球菌属菌、サルモネラ・コレラスイス及びサルモネラ・エンテリティディスを含めたサルモネラ属菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、旋毛虫、トキソプラズマ、及びエルシニア・エンテロコリチカの１以上より選択される、請求項２７の方法。
30. ウイルス微生物が、アフリカブタコレラウイルス、ブタコレラウイルス（ＣＳＦ）、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）、ニパウイルス、ブタサイトメガロウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタエンテロウイルス、脳心筋炎ウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ブタ呼吸器型コロナウイルス（ＰＲＶＶ）、ブタヘルペスウイルス１型としても知られる仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ロタウイルス、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）、及びブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）の１以上より選択される、請求項２７の方法。
31. 寄生虫微生物が、ブタ回虫、大腸バランチジウム、トキソプラズマ、及び小形クリプトスポリジウムの１以上より選択される、請求項２７の方法。
32. 少なくともＰＣＶ２ｂ及びＰＣＶ２ｄによる感染からブタを保護する、請求項２４の方法。
33. ＰＣＶ１のカプシドタンパク質の代わりにブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）カプシドポリペプチドをコードする組換えブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）を含む組換えキメラブタサーコウイルスを含むワクチン組成物であって、該ＰＣＶ２カプシドポリペプチドは、複数のＰＣＶ２遺伝子型のカプシドポリペプチド由来のエピトープを含む、前記組成物。
34. ＰＣＶ２カプシドポリペプチドが、ＤＮＡシャッフルしたＰＣＶ２カプシド遺伝子配列によってコードされる、請求項３３のワクチン組成物。
35. ＰＣＶ２カプシドポリペプチドが、３ｃｌ．１４（配列番号８）、３ｃｌ．１３（配列番号４）、３ｃｌ．４＿２（配列番号２）、３ｃｌ．１２＿２（配列番号６）と指定されるカプシドポリペプチド、及びその誘導体から成る群より選択される、請求項３３または３４のワクチン組成物。
36. ワクチンが、生ワクチン、修飾生ワクチン、不活化ワクチン、又は弱毒化ワクチンである、請求項３３のワクチン組成物。
37. 組換えキメラブタサーコウイルスが、ＰＣＶ１＿３ｃｌ．１４と指定され、配列番号３７によってコードされる、請求項３３のワクチン組成物。