JP6126176B2 - 豚トルクテノウイルスワクチンおよび診断 - Google Patents

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Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２００９年８月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／２３５，８３３号および２０１０年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／３１６，５１９号の利益を主張するものであり、これら仮特許出願の開示は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、豚トルクテノウイルス（ＴＴＶ）感染を防御するためのワクチン、豚ＴＴＶ（ＰＴＴＶ）の感染性ＤＮＡクローン、およびそれらの使用に関する。本発明は、豚トルクテノウイルス（ＰＴＴＶ）感染の診断、特に種特異的または型特異的ＰＴＴＶ感染の診断、および遺伝子型の異なる複数株による同時感染の診断にも関係する。
トルクテノウイルス（ＴＴＶ）は、１９９７年に輸血後非Ａ〜Ｅ型肝炎を有する日本人患者から初めて発見された（ニシザワ，ティ（Nishizawa,T.）、オカモト，エイチ（Okamoto,H.）、コニシ，ケイ（Konishi,K.）、ヨシザワ，エイチ（Yoshizawa,H.）、ミヤカワ，ワイ（Miyakawa,Y.）およびマユミ，エム（Mayumi,M.）、１９９７年、「原因不明の輸血後肝炎におけるトランスアミナーゼレベルの上昇に関連する新規ＤＮＡウイルス（ＴＴＶ）（A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology）」、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem Biophys Res Commun）、第２４１巻、第１号、ｐ．９２−７）。それ以来、多数のヒトＴＴＶ株と、後にトルクテノ・ミニ・ウイルス（ＴＴＭＶ）およびトルクテノ・ミディ・ウイルス（ＴＴＭＤＶ）と名付けられた２群のＴＴＶ関連ウイルスが、健常な人の血清および他の組織に高い有病率で同定されている（ヒノ，エス（Hino,S.）およびミヤタ，エイチ（Miyata，Ｈ．）、２００７年、「トルクテノウイルス（ＴＴＶ）：現状（Torque teno virus (TTV): current status）」、レビューズ・イン・メディカル・バイロロジー（Rev Med Virol）、第１７巻、第１号、ｐ．４５−５７；オカモト，エイチ（Okamoto,H.）、２００９年ａ、「ＴＴウイルスの発見の歴史と病原性（History of discoveries and pathogenicity of TT virues）」、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Curr Top Microbiol Immunol）、第３３１巻、ｐ．１−２０）。ヒトＴＴＶ、ＴＴＭＶおよびＴＴＭＤＶは、それぞれ３．６〜３．９、２．８〜２．９および３．２ｋｂの長さの環状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを持つ無エンベロープ球形ウイルスであり、現在は、国際ウイルス分類委員会（ICTV;http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?bhcp=1）によって新たに設立されたアネロウイルス科（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）に分類されている（ビアジーニ，ピー（Biagini,P.）、２００９年、「ＴＴＶおよび関連ウイルス（アネロウイルス）の分類（Classification of TTV and related viruses (anelloviruses)）」、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Curr Top Microbiol Immunol）、第３３１巻、ｐ．２１−３３）。これら３群のＴＴＶ関連ウイルスは高度な遺伝的異質性を示し、それぞれが数多くの遺伝子グループおよび遺伝子型からなる（ビアジーニ，ピー（Biagini,P.）、ガリアン，ピー（Gallian,P.）、カンタローブ，ジェイ・エフ（Cantaloube,J.F.）、アットーウィ，エイチ（Attoui,H.）、デ・ミッコ，ピー（de Micco,P.）、およびデ・ランバレリエ，エックス（de Lamballerie,X.）、２００６年、「フランス人献血者におけるＴＴＶおよびＴＴＭＶ主要系統群の分布および遺伝子解析（Distribution and genetic analysis of TTV and TTMV major phylogenetic groups in French blood donors）」、ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー（J Med Virol）、第７８巻、第２号、ｐ．２９８−３０４；ジェルシック，アイ（Jelcic,I.）、ホッツ−ワーゲンブラット，エイ（Hotz-Wagenblatt,A.）、ハンジカー，エイ（Hunziker,A.）、ツア・ハウゼン，エイチ（Zur Hausen,H.）、およびド・ヴィリエ，イー・エム（de Villiers,E.M.）、２００４年、「ホジキン病患者の脾生検組織からの複数のＴＴウイルス遺伝子型の分離：超可変領域におけるゲノムの再編成および多様性（Isolation of multiple TT virus genotypes from spleen biopsy tissue from a Hodgkin’s diesase patient: genome reorganization and diversity in the hypervariable region）」、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J Virol）、第７８巻、第１４号、ｐ．７４９８−５０７）。異なる遺伝子型を持つＴＴＶによる多重感染、ならびにＴＴＶ、ＴＴＭＶおよびＴＴＭＤＶの二重または三重感染の有病率がヒトにおいて記録されており、これらは健常な成人ではよく見られる事象であると考えられる（ニール，シー（Niel,C.）、サバック，エフ・エル（Saback,F.L.）、およびランペ，イー（Lampe,E.）、２０００年、「異なる遺伝子型に属する複数のＴＴウイルスによる同時感染はブラジル人成人ではよく見られる事象である（Coinfection with multiple TT virus strains belonging to different genotypes is a common event in healthy Brazilian adults）」、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（J Clin Microbiol）、第３８巻、第５号、ｐ．１９２６−３０；ニノミヤ，エム（Ninomiya,M.）、タカハシ，エム（Takahashi,M.）、ホシノ，ワイ（Hoshino,Y.）、イチヤマ，ケイ（Ichiyama,K.）、シモンズ，ピー（Simmonds,P.）、およびオカモト，エイチ（Okamoto,H.）、２００９年、「チンパンジーにおけるトルクテノ・ミディ・ウイルス変異体の全ゲノムの解析：ヒトとチンパンジーのまれな異種間感染（Analysis of the entire genomes of torque teno midi virus variants in chimpanzees: infrequent cross-species infection between humans and chimpanzees）」、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J Gen Virol）、第９０巻、第２号、ｐ．３４７−５８；オカモト，エイチ（Okamoto,H.）、２００９年ａ、「ＴＴウイルスの発見の歴史と病原性（History of discoveries and pathogenicity of TT virues）」、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Curr Top Microbiol Immunol）、第３３１巻、ｐ．１−２０；タカヤマ，エス（Takayama,S.）、ミウラ，ティ（Miura,T.）、マツオ，エス（Matsuo,S.）、タキ，エム（Taki,M.）、およびスギイ，エス（Sugii,S.）、１９９９年、「日本人血友病患者における新規ＤＮＡ ＴＴウイルス（ＴＴＶ）感染の有病率および残留性（Prevalence and persistence of novel DNA TT virus (TTV) infection in Japanese haemophiliacs）」、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（Br J Haematol）、第１０４巻、第３号、ｐ．６２６−９）。
ＴＴＶは、ヒトに感染するだけでなく、非ヒト霊長類、ツパイ、豚、牛、猫、犬およびアシカを含む他のさまざまな動物種にも、同様に感染する（ビアジーニ，ピー（Biagini,P.）、ウチ，アール（Uch,R.）、ベルフーシェ，エム（Belhouchet,M.）、アットーウィ，エイチ（Attoui,H.）、カンタローブ，ジェイ・エフ（Cantaloube,J.F.）、ブリスバレー，エヌ（Brisbarre,N.）、およびデ・ミッコ，ピー（de Micco,P.）、２００７年、「複合ローリングサークル増幅／配列非依存単一プライマー増幅法を使用することによってヒトおよび動物試料中に同定されたアネロウイルスに関連する環状ゲノム（Circular genomes related to anelloviruses identified in human and animal samples by using a combined rolling-circle amplification/sequence-independent single primer amplification approach）」、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J Gen Virol）、第８８巻、第１０号、ｐ．２６９６−７０１；イマイ，ティ（Inami,T.）、オバラ，ティ（Obara,T.）、モリヤマ，エム（Moriyama,M.）、アラカワ，ワイ（Arakawa,Y.）およびアベ，ケイ（Abe,K.）、２０００年、「チンパンジーから得られたサルＴＴウイルス分離株の完全長ヌクレオチド配列：新しいＴＴウイルス様種の証拠（Full-length nucleotide sequence of a simian TT virus isolate obtained from a chimpanzee: evidence for a new TT virus-like species）」、バイロロジー（Virology）、第２７７巻、第２号、ｐ．３３０−５；エング，ティ・エフ（Ng,T.F.）、スエドマイヤー，ダブリュ・ケイ（Suedmeyer,W.K.）、ホイーラー，イー（Wheeler,E.）、ガランド，エフ（Gulland,F.）、およびブライトバルト，エム（Breitbart,M.）、２００９年、「捕獲されたカリフォルニアアシカの死亡事象から発見された新規アネロウイルス（Novel anellovirus discovered from a mortality event of captive California sea lions）」、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J Gen Virol）、第９０巻、第５号、ｐ．１２５６−６１；オカモト，エイチ（Okamoto,H.）、２００９年ｂ、「動物におけるＴＴウイルス（TT viruses in animals）」、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Curr Top Microbiol Immunol）、第３３１巻、ｐ．３５−５２；オカモト，エイチ（Okamoto,H.）、ニシザワ，ティ（Nishizawa,T.）、タカハシ，エム（Takahashi,M.）、タワラ，エイ（Tawara,A.）、ポン，ワイ（Peng,Y.）、キシモト，ジェイ（Kishimoto,J.）、およびワン，ワイ（Wang,Y.）、２００１年、「ツパイにおけるＴＴウイルスのゲノム特徴および進化的特徴の分析ならびにヒトおよび非ヒト霊長類における種特異的ＴＴＶとの比較（Genomic and evolutionary characterization of TT virus (TTV) in tupaias and comparison with species-specific TTVs in humans and non-human primates）」、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J Gen Virol）、第８２巻、第９号、ｐ．２０４１−５０；オカモト，エイチ（Okamoto,H.）、ニシザワ，ティ（Nishizawa,T.）、タワラ，エイ（Tawara,A.）、パン，ワイ（Peng,Y.）、タカハシ，エム（Takahashi,M.）、キシモト，ジェイ（Kishimoto,J.）、タナカ，ティ（Tanaka,T.）、ミヤカワ，ワイ（Miyakawa,Y.)、およびマユミ，エム（Mayumi,M.）、２０００年ａ、「ヒトおよび非ヒト霊長類における種特異的ＴＴウイルスならびにそれらの系統発生学的関係（Species-specific TT viruses in humans and nonhuman primates and their phylogenetic relatedness)」、バイロロジー（Virology）、第２７７巻、第２号、ｐ．３６８−７８；オカモト，エイチ（Okamoto,H.）、タカハシ，エム（Takahashi,M.）、ニシザワ，ティ（Nishizawa,T.）、タワラ，エイ（Tawara,A.）、フカイ，ケイ（Fukai,K.）、ムラマツ，ユー（Muramatsu,U.）、ナイトウ，ワイ（Naito,Y.）、およびヨシカワ，エイ（Yoshikawa,A.）、２００２年、「豚、猫および犬におけるＴＴウイルス（ＴＴＶ）のゲノム特徴分析ならびに霊長類およびツパイにおける種特異的ＴＴＶとそれらの関係（Genomic characterization of TT viruses (TTVs) in pigs,cats and dogs and their relatedness with species-specific TTVs in primates and tupaias)」、ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー（J Gen Virol）、第８３巻、第６号、ｐ．１２９１−７）。また、チンパンジーはＴＴＭＶおよびＴＴＭＤＶにも感染する（ニノミヤ，エム（Ninomiya,M.）、タカハシ，エム（Takahashi,M.）、ホシノ，ワイ（Hoshino,Y.）、イチヤマ，ケイ（Ichiyama,K.）、シモンズ，ピー（Simmonds,P.)、およびオカモト，エイチ（Okamoto,H.）、２００９年、「チンパンジーにおけるトルクテノ・ミディ・ウイルス変異体の全ゲノムの解析：ヒトとチンパンジーのまれな異種間感染（Analysis of the entire genomes of torque teno midi virus variants in chimpanzees: infrequent cross-species infection between humans and chimpanzees）」、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J Gen Virol）、第９０巻、第２号、ｐ．３４７−５８；オカモト（Okamoto）ら、２０００年ａ、前掲書）。同定された動物ＴＴＶ株、とりわけ非霊長類動物ＴＴＶのゲノムサイズは、ヒトＴＴＶのゲノムサイズと比べて比較的小さいが、これらは同じゲノム構造を有し、マイナス鎖ｓｓＤＮＡから翻訳される少なくとも２つの部分的にオーバーラップするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）と、高いＧＣ含量（約９０％）を有する非翻訳領域（ＵＴＲ）の短いストレッチとを持つ（オカモト（Okamoto）、２００９年ｂ、前掲書）。ＴＴＶ ＯＲＦの配置は、サーコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）のジャイロウイルス属（Ｇｙｒｏｖｉｒｕｓ）に属する鶏貧血ウイルス（ＣＡＶ）のそれと極めて類似しているが、やはり同じ科に分類される豚サーコウイルス（ＰＣＶ）１型（ＰＣＶ１）および２型（ＰＣＶ２）とは異なっている（デビッドソン，アイ（Davidson,I.）およびシャルマン，エル・エム（Shulman,L.M.）、２００８年、「鶏貧血ウイルスによる鳥類感染との比較によってヒトアネロウイルス感染の謎を解明する（Unraveling the puzzle of human anellovirus infections by comparison with avian infections with the chicken anemia virus）」、ウイルス・リサーチ（Virus Res）、第１３７巻、第１号、ｐ．１−１５；ヒノ，エス（Hino，Ｓ．）およびプラセティオ，エイ・エイ（Prasetyo,A.A.）、２００９年、「トルクテノウイルスと鶏貧血ウイルスとの関連性（Relationship of Torque teno virus to chicken anemia virus）」、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Curr Top Microbiol Immunol）、第３３１巻、ｐ．１１７−３０）。ＰＣＶ１とＰＣＶ２のゲノムはアンビセンスであり、ＯＲＦ１はゲノム鎖によってコードされ、ＯＲＦ２はアンチゲノム鎖によってコードされる（ヒノ（Hino）およびミヤタ（Miyata）、２００７年、前掲書）。最近、ヒトＴＴＶ遺伝子型１および６の両方の転写パターンおよび翻訳産物が、それぞれのＴＴＶ感染性ＤＮＡクローンを培養細胞中にトランスフェクションすることによって同定された（ミュラー，ビー（Mueller,B.）、メルツ，エイ（Maerz,A.）、ドベルスタイン，ケイ（Doberstein,K.）、フィンスターブッシュ，ティ（Finsterbusch,T.）、およびマンカーツ，エイ（Mankertz,A.）、２００８年、「ヒトトルクテノウイルス分離株Ｐ／１Ｃ１の遺伝子発現（Gene expression of the human Torque Teno Virus isolate P/1C1）」、バイロロジー（Virology）、第３８１巻、第１号、ｐ．３６−４５；キュウ，ジェイ（Qiu,J.）、カッコラ，エル（Kakkola,L.）、チェン，エフ（Cheng,F.）、イェ，シー（Ye,C.）、ソダールンド−ヴェネルモ，エム（Soderlund-Venermo,M.）、ヘドマン，ケイ（Hedman,K.）、およびピンテル，ディ・ジェイ（Pintel,D.J.）、２００５年、「ヒトサーコウイルスＴＴウイルス遺伝子型６は完全長クローンのトランスフェクション後に６つのタンパク質を発現する（Human circovirus TT virus genotype 6 expresses six proteins following transfection of a full-length clone）」、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J Virol）、第７９巻、第１０号、ｐ．６５０５−１０）。スプライスされた３つ以上のｍＲＮＡから、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ１／１、ＯＲＦ２／２、ＯＲＦ１／２およびＯＲＦ２／３と呼ばれる少なくとも６つのタンパク質の発現が報告されている（カッコラ，エル（Kakkola,L.）、ヘドマン，ケイ（Hedman,K.）、キュウ，ジェイ（Qiu,J.）、ピンテル，ディ（Pintel,D.）、およびソダールンド−ヴェネルモ，エム（Soderlund-Venermo,M.）、２００９年、「ＴＴウイルスの複製およびＴＴウイルスによるタンパク質合成（Replication of and protein synthesis by TT viruses）」、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Curr Top Microbiol Immunol）、第３３１巻、ｐ．５３−６４；ミュラー（Mueller）ら、２００８年、前掲書；キュウ（Qiu）ら、２００５年、前掲書）。したがって、動物ＴＴＶに関して、より多くのデータが利用できるようになれば、推定されている動物ＴＴＶのゲノム構造を修正することが必要になる可能性が高い。
ＴＴＶは特発性肝炎患者において初めて同定されたが、その後の研究は、肝炎または他の疾患の病理発生にＴＴＶが重要な役割を果たすという証拠を示すことができなかった（ヒノ（Hino）およびミヤタ（Miyata）、２００７年、前掲書；マギー，エフ（Maggi,F.）およびベンディネリ，エム（Bendinelli,M.）、２００９年、「トルクテノウイルスおよび他のアネロウイルスの免疫生物学（Immunobiology of the Torque teno viruses and other anellovirueses）」、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Curr Top Microbiol Immunol）、第３３１巻、ｐ．６５−９０；オカモト（Okamoto）、２００９年ａ、前掲書）。ヒトＴＴＶは疾患に直接関連するとは見なされていないが、豚ＴＴＶ（ＰＴＴＶ）は、豚繁殖呼吸器病症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）感染と組み合わされると豚皮膚炎腎症症候群（ＰＤＮＳ）の実験的誘導の一因になり（クラコウカ，エス（Krakowka,S.）、ハーチュニアン，シー（Hartunian,C.）、ハンバーグ，エイ（Hamberg,A.）、シャウプ，ディ（Shoup,D.）、リングス，エム（Rings M.）、チャン，ワイ（Zhang,Y.）、アラン，ジー（Allan,G.）、およびエリス，ジェイ・エイ（Ellis,J.A.）、２００８年、「豚サーコウイルス２型に関して結果が陰性であったノトバイオート豚における豚皮膚炎腎症症候群の誘導の評価（Evaluation of induction of porcine determatitis and nephropathy syndrome in gnotobiotic pigs with negative results for porcine circovirus type 2）」、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am J Vet Res）、第６９巻、第１２号、ｐ．１６１５−２２）、また、ノトバイオート豚モデルにおいて、ＰＣＶ２感染と組み合わされると、離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）の実験的誘導の一因にもなること（エリス，ジェイ・エイ（Ellis,J.A.）、アラン，ジー（Allan,G.）、およびクラコウカ，エス（Krakowka,S.）、２００８年、「ノトバイオート豚におけるサーコウイルス２型関連離乳後多臓器消耗症候群に遺伝子グループ１豚トルクテノウイルスとの同時感染が及ぼす効果（Effect of coinfection with genogroup 1 porcine toruque teno virus on porcine circovirus type 2-associated postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic pigs）」、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am J Vet Res）、第６９巻、第１２号、ｐ．１６０８−１４）が示された。このデータから、豚ＴＴＶは豚において病原性であることが示唆された。しかし、ＰＴＴＶに関連する疾患および病変を決定的に特徴づけるには、生物学的に純粋な形態のＰＴＴＶウイルスを使ったさらに綿密な研究が必要である。
ヒトＴＴＶと比較すると、ＰＴＴＶのゲノム情報は極めて限られている。現時点で、ＰＴＴＶについては、日本およびブラジルの豚から、それぞれ１つの完全長ゲノム配列と２つのほぼ完全長のゲノム配列とが報告されているにすぎない（ニール，シー（Niel,C.）、ディニシュ−メンデス，エル（Diniz-Mendes,L.）、およびデバル，エス（Devalle,S.）、２００５年、「ヒトおよび豚血清からのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）完全ゲノムのローリングサークル増幅と新規豚ＴＴＶ遺伝子グループの同定（Rolling-circle amplification of Torque teno virus (TTV) complete genomes from human and swine sera and identification of a novel swine TTV genogroup）」、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J Gen Virol）、第８６巻、第５号、ｐ．１３４３−７；オカモト（Okamoto）ら、２００２年、前掲書）。３つの既知ＰＴＴＶ株のうち、Ｓｄ−ＴＴＶ３１株とＴＴＶ−１ｐ株が遺伝子グループ１（ＰＴＴＶ１）にまとめられたのに対し、ＴＴＶ−２ｐは遺伝子グループ２（ＰＴＴＶ２）に分類される唯一の株だった（ニール（Niel）ら、２００５年、前掲書）。しかし遺伝子グループ分類はウイルス学の分類法における漠然とした概念であり、さらにより正確なＰＴＴＶの分類が必要とされているが、それは、多数の遺伝子型を代表する新しいＰＴＴＶ株の完全長ゲノム配列が、より多く利用可能にならなければ、行うことができない。
ＰＴＴＶ感染が米国、カナダ、スペイン、中国、韓国およびタイを含む６つの異なる国の豚に蔓延していることは、先に示されている（マキューン，エヌ・イー（McKeown,N.E.）、フェノー，エム（Fenaux,M.）、ハルバー，ピー・ジー（Halbur,P.G.）、およびモン，エックス・ジェイ（Meng,X.J.）、２００４年、「６つの異なる国の豚におけるオーファンウイルス・豚ＴＴウイルスの分子キャラクタリゼーション（Molecular characterization of porcine TT virus,an orphan virus,in pigs from six different countries）」、ベテリナリー・マイクロバイオロジー（Vet Microbiol）、第１０４巻、第１−２号、ｐ．１１３−７）。
豚ＴＴＶが特定豚疾患の病理発生において重要な役割を果たすかどうかは、依然として議論の余地がある。ノトバイオート豚モデルでは、ＰＴＴＶ１感染だけでは臨床的疾患を何も発生させないが、軽度の組織学的病変を誘導することが示された（クラコウカ，エス（Krakowka,S.）およびエリス，ジェイ・エイ（Ellis,J.A.）、２００８年、「ノトバイオート豚における豚遺伝子グループ１トルクテノウイルスの効果の評価（Evaluation of the effects of procine genogroup 1 torque teno virus in gnotobiotic swine）」、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am J Vet Res）、第６９巻、ｐ．１６２３−９）。ＰＴＴＶ１と豚繁殖呼吸器病症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の両方を実験的に接種されたノトバイオート豚が、臨床的な豚皮膚炎腎症症候群（ＰＤＮＳ）を発症したのに対し（クラコウカ，エス（Krakowka,S.）、ハーチュニアン，シー（Hartunian,C.）、ハンバーグ，エイ（Hamberg,A.）、シャウプ，ディ（Shoup,D.）、リングス，エム（Rings M.）、チャン，ワイ（Zhang,Y.）、アラン，ジー（Allan,G.）、およびエリス，ジェイ・エイ（Ellis,J.A.）、２００８年、「豚サーコウイルス２型に関して結果が陰性であったノトバイオート豚における豚皮膚炎腎症症候群の誘導の評価（Evaluation of induction of porcine determatitis and nephropathy syndrome in gnotobiotic pigs with negative results for porcine circovirus type 2）」、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am J Vet Res）、第６９巻、ｐ．１６１５−２２）、ＰＴＴＶ１と豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の両方を接種された豚は、急性離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）を発症した（エリス（Ellis）ら、２００８年、前掲書）。ＰＣＶ２は臨床的ＰＭＷＳまたはＰＣＶ関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の主要原因因子であると見なされているが、スペインでは、ＰＣＶ２が少ないかＰＣＶ２を持たないＰＭＷＳ罹患豚において、ＰＴＴＶ２感染の有病率が非ＰＭＷＳ罹患豚と比較して高いことが観察された（ケカライネン（Kekarainen）ら、２００６年、前掲書）。これらのデータは、全体として、豚ＴＴＶが豚における疾患の惹起または増悪に関与する共同因子として働き得ることを示唆している。
豚ＴＴＶは、感染した豚の豚血清、糞便、唾液、精液および組織試料に検出されており、このことは、水平伝播と垂直伝播の両者を含むその多様な伝播経路を示している（ケカライネン（Kekarainen）ら、２００７年、前掲書；ポッツート，ティ（Pozzuto,T.）、ミュラー，ビー（Mueller，Ｂ．）、ミーハン，ビー（Meehan,B.）、リングラー，エス・エス（Ringler,S.S.）、マッキントッシュ，ケイ・エイ（McIntosh,K.A.）、エリス，ジェイ・エイ（Ellis,J.A.）、マンカーツ，エイ（Mankertz,A.）およびクラコウカ，エス（Krakowka,S.）、２００９年、「豚トルクテノウイルスの子宮内伝播（In utero transmission of porcine torque teno viruses）」、ベテリナリー・マイクロバイオロジー（Vet Microbiol）、第１３７巻、ｐ．３７５−９；シビラ，エム（Sibila,M.）、マルティネス−ギノー，エル（Martinez-Guino,L.）、ウエルタ，イー（Huerta,E.）、ローレンス，エイ（Llorens,A.)、モーラ，エム(Mora,M.)、グロウ−ローマ，エル(Grau-Roma,L.)、ケカライネン，ティ(Kekarainen,T.)、およびシーゲイルス，ジェイ(Segales,J.)、２００９年、「従来の養豚場における豚トルクテノウイルス(TTV)感染および排泄動態(Swine torque teno virus (TTV) infection and excretion dynamics in conventional pig farms)」、ベテリナリー・マイクロバイオロジー(Vet Microbiol）、第１３９巻、ｐ．２１３−８）。しかし、現在の豚ＴＴＶ感染の検出は、主として、従来のＰＣＲアッセイに基づいていた。今までのところ、血清学的アッセイもウイルス培養系も確立されていない。具体的には、スペインのグループによってそれぞれ開発されたＰＴＴＶ１およびＰＴＴＶ２のＵＴＲ中の保存領域のネステッドＰＣＲ増幅が、広く使用されるようになっている（ケカライネンら、２００６年、前掲書）。ＰＣＶ２誘発性ＰＣＶＡＤについて証明されたように、ウイルスの量は臨床的疾患の重症度と関連すると思われるので（オプリースニヒ，ティ（Opriessnig,T.）、モン，エックス・ジェイ（Meng,X.J.）およびハルバー，ピー・ジー（Halbur,P.G.）、２００７年、「豚サーコウイルス２型関連疾患：最新用語、臨床症状発現、病理発生、診断、および介入戦略に関する最新情報（Porcine circovirus type 2 associated disease: update on current terminology,clinical manifestations,pathogenesis,diagnosis,and intervention strategies）」、ジャーナル・オブ・ベテリナリー・ダイアグノスティック・インベスティゲーション（J Vet Diagn Invest）、第１９巻、ｐ．５９１−６１５）、従来のＰＣＲによってＴＴＶ ＤＮＡの存在を決定するのではなく、定量リアルタイムＰＣＲによって豚ＴＴＰのウイルス負荷量を決定することが重要になるだろう。また、リアルタイムＰＣＲは、従来のＰＣＲよりも信頼性が高く、迅速かつ安価でもある。最近、２つの豚ＴＴＶ種を検出し定量するための２つのタックマン（TaqMan）プローブ・ベース・リアルタイムＰＣＲアッセイが記載された（ブラッサード，ジェイ（Brassard,J.）、ガニエ，エム・ジェイ（Gagne,M.J.）、ウーデ，エイ（Houde,A.）、ポイトラス，イー（Poitras,E.）およびウォード，ピー（Ward,P.）、２００９年、「豚および牛トルクテノウイルスを検出するためのリアルタイム・タックマンＰＣＲアッセイの開発（Development of a real-time TaqMan PCR assay for the detection of porcine and bovine Torque teno virus）」、ジャーナル・オブ・アプライド・マイクロバイオロジー（J Appl Microbiol）、２００９年１１月１４日、印刷物に先立つ電子ジャーナルでの公開；ガレイ，エイ（Gallei,A.）、ペッシュ，エス（Pesch,S.）、エスキング，ダブリュ・エス（Esking,W.S.）、ケラー，シー（Keller,C.）およびオーリンガー，ブイ・エフ（Ohlinger,V.F.）、２００９年、「豚トルクテノウイルス：遺伝子グループ特異的マルチプレックスｒｔ−ＰＣＲによるウイルスゲノム負荷量の決定、遺伝子グループ１または２による頻繁な多重感染の検出、およびウイルス完全長配列の確立（Porcione Torque teno virus: Determination of viral genomic loads by genogroup-specific multiplex rt-PCR,detection of frequent multiple infections with genogroups 1 or 2,and establishment of viral full-length sequences）」、ベテリナリー・マイクロバイオロジー（Vet Microbiol）、２００９年１２月２１日、印刷物に先立つ電子ジャーナルでの公開）。プローブに基づくアッセイの主な欠点は、プローブ結合配列が突然変異を含有する場合に、偽陰性結果が得られる可能性がある点である（アンダーソン，ティ・ピー（Anderson,T.P.）、ウェルノ，エイ・エム（Werno,A.M.）、ベイノン，ケイ・エイ（Beynon,K.A.）およびマードック，ディ・アール（Murdoch,D.R.）、２００３年、「プローブ結合部位内の配列変位に起因するリアルタイムＰＣＲアッセイおよび融解曲線分析による単純ヘルペスウイルスの遺伝子タイピングの失敗（Failure to genotype herpes simplex virus by real-time PCR assay and melting curve analysis due to sequence variation within probe binding sites）」、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（J Clin Microbiol）、第４１巻、ｐ．２１３５−７）。既知の豚ＴＴＶ株の配列間の高度な不均一性を考えると、ＰＴＴＶの野外株ではプローブ結合配列中の変異が予期される。ＳＹＢＲグリーンに基づくリアルタイムＰＣＲは、この潜在的問題を回避する代替的方法であり、その比較的低い特異性にもかかわらず、潜在的豚ＴＴＶ変異体を検出し定量するための普遍的方法になる。さらにまた、ＳＹＢＲグリーン・リアルタイムＰＣＲに続く融解曲線分析（ＭＣＡ）により、反応特異性が確保され、型が異なるウイルスの多重検出が可能になる（リリー，ケイ・エム（Ririe,K.M.）、ラスムッセン，アール・ピー（Rasmussen,R.P.）およびウイットワー，シー・ティー（Wittwer,C.T.）、１９９７年、「ポリメラーゼ連鎖反応中のＤＮＡ融解曲線の分析による生成物の区別（Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction）」、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal Biochem）、第２４５巻、ｐ．１５４−６０）。ＭＣＡに基づくＳＹＢＲグリーン・リアルタイムＰＣＲ法はさまざまなヒトウイルスおよび家畜ウイルスに応用されて成功を収めている（ジベリーニ，ディ（Gibellini,D.）、ガルディーニ，エフ（Gardini,F.）、ビトーネ，エフ（Vitone,F.）、スキアボーネ，ピー（Schiavone,P.）、フルリーニ，ジー（Furlini,G.）およびリ，エム・シー（Re,M.C.）、２００６年、「血漿試料におけるＳＹＢＲグリーン・リアルタイム・マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ技法によるＨＣＶとＨＩＶ−１の同時検出（Simultaneous detection of HCV and HIV-1 by SYBR Green real time multiplex RT-PCR technique in plasma samples）」、モレキュラー・アンド・セルラー・プローブス（Mol Cell Probes）、第２０巻、ｐ．２２３−９；マルティネス，イー（Martinez,E.）、リエラ，ピー（Riera,P.）、シッジャ，エム（Sitja,M.）、ファン，ワイ（Fang,Y.）、オリベイラ，エス（Oliveira,S.）およびマルドナド，ジェイ（Maldonado,J.）、２００８年、「ＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびアンプリコン融解曲線分析による豚繁殖呼吸器病症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の同時検出および遺伝子タイピング（Simultaneous detection and genotyping of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) by real-time RT-PCR and amplicon melting curve analysis using SYBR Green）」、リサーチ・イン・ベテリナリー・サイエンス（Res Vet Sci）、第８５巻、ｐ．１８４−９３；ムイユソー，ケイ・ピー（Mouillesseaux,K.P.）、クリムペル，ケイ・アール（Klimpel,K.R.）およびダール，エイ・ケイ（Dhar,A.K.）、２００３年、「ＳＹＢＲグリーン・リアルタイムＰＣＲにおいてアンプリコンサイズを増大させることによるクルマエビのタウラ症候群ウイルスおよびイエローヘッド病ウイルスに関する検出特異性および検出感受性の改善（Improvement in the specificity and sensitivity of detection for the Taura syndrome virus and yellow head virus of penaeid shrimp by increasing the amplicon size in SYBR Green real-time RT-PCR）」、ジャーナル・オブ・バイロロジカル・メソッズ（J Virol Methods）、第１１１巻、ｐ．１２１−７；ウィルヘルム，エス（Wilhelm,S.）、チンマーマン，ピー（Zimmermann,P.）、ゼルビッツ，エイチ・ジェイ（Selbitz,H.J.）およびトリューエン，ユー（Truyen,U.）、２００６年、「野外試料中の豚パルボウイルスを検出するためのリアルタイムＰＣＲプロトコール（Real-time PCR protocol for the detection of porcine parvovirus in field samples）」、ジャーナル・オブ・バイロロジカル・メソッズ（J Virol Methods）、第１３４巻、ｐ．２５７−６０）。
現在、ＰＴＴＶ特異的体液性応答については、ほとんどわかっていない。ＰＣＲベースのアッセイは豚におけるＰＴＴＶ感染の経過を反映しないので、ＰＴＴＶの血清有病率を評価し、豚疾患におけるＰＴＴＶの役割の特徴づけを助けるには、ＰＴＴＶ血清抗体を検出するための効率のよい酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が必要である。
今のところ、豚ＴＴＶのサブユニットワクチン、死滅ワクチンおよび生ワクチンは入手できない。ＰＴＴＶサブユニットワクチンを開発するには、さまざまな遺伝子型から組換えＰＴＴＶキャプシドタンパク質を発現させることが望ましく有益であり、また、死滅ワクチンおよび生ワクチンの開発に使用される細胞培養系において生物学的に純粋な形態のＰＴＴＶを増殖させるには、さまざまな遺伝子型から感染性ＰＴＴＶ分子ＤＮＡクローンを構築することが、望ましく有益であるだろう。
本発明は、ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡの遺伝子型からなる群より選択されるゲノム配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する少なくとも１コピーのゲノム配列を含有する感染性ＰＴＴＶをコードする核酸分子を含む、豚トルクテノウイルス（ＰＴＴＶ）の感染性核酸分子（「感染性ＤＮＡクローン」）を提供する。
本発明の一態様によれば、ゲノム配列が配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示す配列から選択される、請求項１に記載のＰＴＴＶの感染性ＤＮＡクローン。
本発明は、感染性ＰＴＴＶゲノムを含有する生物学的に機能的なプラスミドまたはウイルスベクターを提供する。
本発明は、感染性クローンＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターをトランスフェクトされた適切な宿主細胞を提供する。
本発明は、ＰＴＴＶ感染性ＤＮＡクローンをトランスフェクトされた細胞によって産生される感染性ＰＴＴＶを提供する。
本発明は、無毒性（ｎｏｎｔｏｘｉｃ）の生理学的に許容される担体と、（ａ）ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡからなる群より選択されるゲノム配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する少なくとも１コピーのゲノム配列またはその相補鎖を含有する核酸分子、（ｂ）ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡからなる群より選択されるゲノム配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する少なくとも１コピーのゲノム配列またはその相補鎖を含有する核酸分子を含有する生物学的に機能的なプラスミドまたはウイルスベクター、および（ｃ）ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡからなる群より選択されるゲノム配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する少なくとも１コピーのゲノム配列を含有する無発病性（ａｖｉｒｕｌｅｎｔ）、感染性かつ非病原性（ｎｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）ＰＴＴＶ、からなる群より選択される免疫原量の構成要素とを含むウイルスワクチンも提供する。
本発明の一態様によれば、ワクチンは、ＰＴＴＶ感染性クローン由来の生ＰＴＴＶウイルスを含有する。本発明のもう一つの態様によれば、ワクチンは、ＰＴＴＶ感染性クローン由来の死滅ＰＴＴＶウイルスを含有する。
本発明は、細菌発現系においてＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１キャプシド遺伝子から発現した精製組換えタンパク質と、ＰＴＴＶ感染に対するサブユニットワクチンとしてのこれらの組換えキャプシドタンパク質の使用を提供する。本発明の一実施形態では、サブユニットワクチンとして使用するための組換えキャプシドタンパク質を、バキュロウイルス発現系および他の発現ベクター系において発現させる。
本発明のさらなる一態様によれば、アジュバントをさらに含む。
本発明はさらに、ＰＴＴＶウイルス感染に対して豚を免疫化する方法であって、豚に免疫学的有効量のウイルスワクチンを投与することを含む方法を提供する。
本発明の一態様によれば、本方法は、組換えサブユニットキャプシドタンパク質、感染性核酸分子または生ＰＴＴＶウイルスを豚に投与することを含む。
本発明のもう一つの態様によれば、本方法は、ワクチンを豚に非経口投与、鼻腔内投与、皮内投与、または経皮投与することを含む。本発明のさらなる一態様によれば、本方法は、ワクチンを豚にリンパ系内投与または筋肉内投与することを含む。
本発明は、配列番号９に示すＰＴＴＶ１ａ−ＶＡのヌクレオチド配列の配列からなる単離されたポリヌクレオチドも提供する。
本発明は、配列番号１０に示すＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡのヌクレオチド配列の配列からなる単離されたポリヌクレオチドも提供する。
本発明は、配列番号１１に示すＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡのヌクレオチド配列の配列からなる単離されたポリヌクレオチドも提供する。
本発明は、配列番号１２に示すＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのヌクレオチド配列の配列からなる単離されたポリヌクレオチドも提供する。
本発明はさらに、ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ１／１、およびＯＲＦ２／２、特にキャプシドタンパク質をコードするＯＲＦ１、からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に従って翻訳されたポリペプチド配列の免疫原性フラグメントまたは完全タンパク質を含むサブユニットワクチンを提供する。
本発明の一態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１からなる群より選択される。
本発明のもう一つの態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、ＰＴＴＶ遺伝子型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡのＯＲＦ１である。本発明のさらなる一態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、ＰＴＴＶ遺伝子型ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡのＯＲＦ１である。本発明のさらにもう一つの態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、ＰＴＴＶ亜型ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１である。
本発明の一態様によれば、ポリペプチド配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８に示す配列からなる群より選択される。
本発明のもう一つの態様によれば、ポリペプチド配列は、配列番号１３に示される。本発明のもう一つの態様によれば、ポリペプチド配列は、配列番号１４に示される。本発明のさらなる一態様によれば、ポリペプチド配列は、配列番号１６に示される。本発明の具体的一実施形態では、ポリペプチド配列が、配列番号１６のＣ末端領域（ａａ３１０−６２５）である。本発明のさらにもう一つの態様によれば、ポリペプチド配列は、配列番号２０に示される。
本発明のさらなる態様によれば、ワクチンは、さらにアジュバントを含有する。
本発明はさらに、ＰＴＴＶウイルス感染に対して豚を免疫化する方法であって、ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ１／１、およびＯＲＦ２／２からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に従って翻訳されたポリペプチド配列の免疫原性フラグメントまたは完全タンパク質を含むワクチンの免疫学的有効量を豚に投与することを含む方法を提供する。
本発明の一態様によれば、本方法は、免疫原性フラグメントまたは組換えキャプシドタンパク質を豚に投与することを含む。
本発明のもう一つの態様によれば、本方法は、ワクチンを豚に非経口投与、鼻腔内投与、皮内投与、または経皮投与することを含む。本発明のさらなる一態様によれば、本方法は、ワクチンを豚にリンパ系内投与または筋肉内投与することを含む。
また、本発明は、ＰＴＴＶ１感染を診断し、ＰＴＴＶ１負荷量を定量するための方法であって、ＰＴＴＶ１感染が疑われる試料からＤＮＡを抽出すること、配列番号２９および配列番号３０に示す配列を含むプライマーを使ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、およびＰＴＴＶ１特異的増幅を検出することを含む方法も提供する。本発明の一態様によれば、ポリメラーゼ連鎖反応はＳＹＢＲグリーン・リアルタイムＰＣＲである。
本発明はさらに、ＰＴＴＶ２感染を診断し、ＰＴＴＶ２負荷量を定量するための方法であって、ＰＴＴＶ２感染が疑われる試料からＤＮＡを抽出すること、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２に示す配列を含むプライマーを使ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、およびＰＴＴＶ２特異的増幅を検出することを含む方法を提供する。本発明の一態様によれば、ポリメラーゼ連鎖反応はＳＹＢＲグリーン・リアルタイムＰＣＲである。
本発明は、ＰＴＴＶ１感染とＰＴＴＶ２感染を同時に検出し診断するための方法であって、ＰＴＴＶ感染が疑われる試料からＤＮＡを抽出すること、配列番号３１および配列番号３２に示す配列を含むプライマーを使ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、ならびにＰＴＴＶ１およびＰＴＴＶ２特異的増幅を検出することを含む方法も提供する。本発明の一態様によれば、ポリメラーゼ連鎖反応はＳＹＢＲグリーン・リアルタイムＰＣＲである。
また、本発明は、ＰＴＴＶ１ａ感染とＰＴＴＶ１ｂ感染を同時に検出し診断するための方法であって、ＰＴＴＶ１感染が疑われる試料からＤＮＡを抽出すること、配列番号３３および配列番号３４に示す配列を含むプライマーを使って第１ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示す配列を含むプライマーを使って第２ＰＣＲを行うこと、ならびにＰＴＴＶ１ａおよびＰＴＴＶ１ｂ特異的増幅を検出することを含む方法も提供する。
本発明は、ＰＴＴＶ感染を診断するための方法であって、ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ１／１、およびＯＲＦ２／２からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に従って翻訳されたポリペプチド配列の免疫原性フラグメントを固定化すること、ＰＴＴＶ感染が疑われる豚からの血清試料を固定化免疫原性フラグメントと接触させること、および免疫原性フラグメントに特異的な、捕捉された抗体を検出することを含む方法を提供する。
本発明の一態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１からなる群より選択される。
本発明の一実施形態によれば、ポリヌクレオチド配列は、ＰＴＴＶ遺伝子型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡのＯＲＦ１である。本発明のもう一つの実施形態によれば、ポリヌクレオチド配列は、ＰＴＴＶ遺伝子型ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡのＯＲＦ１である。本発明のさらなる一実施形態によれば、ポリヌクレオチド配列は、ＰＴＴＶ亜型ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１である。
本発明のもう一つの態様によれば、ポリペプチド配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８に示す配列からなる群より選択される。
本発明の一実施形態によれば、ポリペプチド配列は、配列番号１３に示される。本発明のもう一つの態様によれば、ポリペプチド配列は、配列番号１４に示される。本発明のもう一つの実施形態によれば、ポリペプチド配列は、配列番号１６に示される。本発明のさらなる一実施形態によれば、免疫原性フラグメントは、配列番号１６のＣ末端領域（ａａ３１０−６２５）である。本発明のさらにもう一つの実施形態によれば、ポリペプチド配列は、配列番号２０に示される。
本発明は、ＰＴＴＶ感染を診断し、ＰＴＴＶ遺伝子型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ種２の全ての既知の亜型に感染した豚の血清における抗体を検出するための、３つの標準化酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を提供する。
本ＥＬＩＳＡ診断検査は、ＰＴＴＶ遺伝子型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡの細菌発現またはバキュロウイルス発現組換えＯＲＦ１キャプシドタンパク質に基づく。
本発明のもう一つの態様によれば、捕捉された抗体の検出は、ウェスタンブロットによる。本発明のさらにもう一つの態様によれば、捕捉された抗体の検出は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による。
本発明の上述の特徴は、本発明の以下の詳細な説明を図面と併せて読めば、より明確に理解されることになるだろう。
図１Ａおよび１Ｂは、豚ＴＴＶウイルス・グループ１（種１）およびグループ２（種２）株の４つの原型米国株のゲノム構造と、ゲノムクローニングおよびアセンブリのための戦略の概略図である。 図２は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースにおいて入手することができる１２１のＴＴＶ株のヌクレオチド配列比較のＰＡＳＣ（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）分布を表す。属、種、型、亜型および変異体、ならびにそれらの対応するヌクレオチド配列同一性百分率を示す。 図３Ａは、完全長ゲノムヌクレオチド配列に基づく近隣結合法によって構築された系統樹を表す。図３Ｂは、７つの豚ＴＴＶ株間で、ＯＲＦ１の推定アミノ酸配列に基づいて構築された系統樹を表す。図３Ｃは、７つの豚ＴＴＶ株間で、ＯＲＦ１／１の推定アミノ酸配列に基づいて構築された系統樹を表す。図３Ｄは、７つの豚ＴＴＶ株間で、ＯＲＦ２の推定アミノ酸配列に基づいて構築された系統樹を表す。図３Ｅは、７つの豚ＴＴＶ株間で、ＯＲＦ２／２の推定アミノ酸配列に基づいて構築された系統樹を表す。 図４は、７つのＰＴＴＶ株間のＯＲＦ１の完全長アミノ酸配列のアラインメントを表す。 図５は、７つのＰＴＴＶ株間のＯＲＦ２の完全長アミノ酸配列のアラインメントを表す。 図６Ａは、各々の標準テンプレート（青色で示すもの）および２０個の豚血清試料を４０サイクル増幅した後のＰＴＴＶ１リアルタイムＰＣＲ産物の融解曲線を表す。図６Ｂは、各々の標準テンプレートおよび２０個の豚血清試料を４０サイクル増幅した後のＰＴＴＶ２リアルタイムＰＣＲ産物の融解曲線を表す。 図７Ａ〜７Ｅは、ＰＴＴＶ１／ＰＴＴＶ２ ＳＹＢＲグリーン・ベース・デュプレックス・リアルタイムＰＣＲの融解曲線分析（ＭＣＡ）を表す。 図８は、７つのＰＴＴＶ株間の予測ＯＲＦ１のＮ末端部分に位置するヌクレオチド配列のアラインメントを表す。 図９Ａおよび９Ｂは、４つの既知豚ＴＴＶ２の親水性プロファイルおよび保存領域を表す。 図１０Ａ〜１０Ｃは、組換えＰＴＴＶ２ｃ ＯＲＦ１キャプシドタンパク質の発現と精製を表す。 図１１Ａ〜１１Ｃは、選ばれた豚血清試料のウェスタンブロット分析の代表的結果を表す。 図１２は、ＰＴＴＶ２ｃ−ＯＲＦ１に基づくウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡの整合性を表す。 図１３は、異なる供給源に由来する１３８頭の豚におけるウイルス負荷量によるＰＴＴＶ２血清抗体レベルの箱ひげ図を表す。 図１４Ａは、ＰＴＴＶ２のウイルス負荷量の遡及的評価を表す。図１４Ｂは、到着時から到着の２ヶ月後まで成長した１０頭の豚におけるＰＴＴＶ２ ＯＲＦ１キャプシドタンパク質に対する抗体レベルを表す。 図１５Ａ〜１５Ｃは、ＰＴＴＶ１ａおよびＰＴＴＶ１ｂ組換えＯＲＦ１キャプシドタンパク質の発現と精製を表す。 図１６は、ウィスコンシンの飼育場に由来する選ばれた豚血清試料のＰＴＴＶ１ａ−ＯＲＦ１ベースのウェスタンブロット分析の例を表す。 図１７は、クローン等を表す。 図１８は、フラグメント等を表す。 図１９は、コンカテマー等を表す。 図２０は、コンカテマー等を表す。 図２１は、コンカテマー等を表す。 図２２は、クローン等を表す。 図２３は、ウイルス価の変化等を表す。
本発明によれば、具体的一実施形態において、上記４つの新規豚ＴＴＶ亜型が、バージニアにおいて、一頭の雄豚から分離される。
図１Ａでは、ＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２のゲノムがどちらもボールド体で示され、４つの予測ＯＲＦ（ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ１／１およびＯＲＦ２／２）のサイズと向きが矢印で示されている。ＧＣリッチ領域も示されている。破線の弧ＡおよびＤは、それぞれ、ネステッドＰＣＲによって血清試料および精液試料からＰＴＴＶ１およびＰＴＴＶ２を検出するために使用した領域を表す。破線の弧ＢおよびＣは、ＰＴＴＶ１のゲノムクローニングのための２つのオーバーラップＰＣＲフラグメントを表し、一方、破線の弧ＥおよびＦは、ＰＴＴＶ２のゲノムクローニングのための２つのオーバーラップＰＣＲフラグメントを表す。本研究に使用したプライマー（表１参照）の場所も、対応する位置に示されている。
第１ラウンドＰＣＲにおいてＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２のどちらについても陽性と示されることから、高いウイルス負荷量が示唆された１つの雄豚血清試料（ＳＲ＃５）を、その後のＰＴＴＶの完全長ゲノムクローニングに使用した。驚いたことに、最初のＰＴＴＶ株Ｓｄ−ＴＴＶ３１をクローニングするために設計されたインバースＰＣＲ（オカモト（Okamoto）ら、２００２年、前掲書）の２組のプライマーセット（ＮＧ３７２／ＮＧ３７３およびＮＧ３８４／ＮＧ３８５）を利用してウイルスゲノムＤＮＡを増幅しようとする最初の試みは、成功しなかった。数回試行したがＰＣＲ産物は得られなかった。次に、ＰＴＴＶ１の領域ＡおよびＰＴＴＶ２の領域Ｄの初期配列に基づいて、想定されるＰＴＴＶ１ゲノムにまたがる領域ＢおよびＣを増幅するための２つの新しいプライマー対（ＴＴＶ１−Ｉｆ（配列番号１）／ＴＴＶ１−２３４０Ｒ（配列番号２）およびＴＴＶ１−２３１１Ｆ（配列番号３）／ＴＴＶ１−ＩＲ（配列番号４））と、想定されるＰＴＴＶ２ゲノムにまたがる領域ＥおよびＦを増幅するための２つのさらなるプライマー対（ＴＴＶ２−ＩＦ（配列番号５）／ＴＴＶ２−２３１６Ｒ（配列番号６）およびＴＴＶ２−ＧＣＦ（配列番号７）／ＴＴＶ２−ＩＲ（配列番号８））を、それぞれ設計した（図１Ａおよび表１）。プライマーＴＴＶ１−２３４０Ｒ（配列番号２）およびＴＴＶ１−２３１１Ｆ（配列番号３）は、ＰＴＴＶ２株ＴＴＶ−２ｐ（ニール（Niel）ら、２００５年、前掲書）中には存在しないＰＴＴＶ１株Ｓｄ−ＴＴＶ３１（オカモト（Okamoto）ら、２００２年、前掲書）およびＴＴＶ−１ｐ（ニール（Niel）ら、２００５年）中の共通配列から推定し、一方、プライマーＴＴＶ２−２３１６Ｒ（配列番号６）およびＴＴＶ２−ＧＣＦ（配列番号７）は、前記２つのＰＴＴＶ１株には存在しない株ＴＴＶ−２ｐの配列から推定した。その結果生じた予期されるサイズの４つの異なるＰＣＲ産物を、平滑末端クローニングベクターにそれぞれ挿入し、その結果生じた組換えプラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に挿入した。フラグメントＢ、Ｃ、ＥおよびＦを表す各コンストラクトについて８〜１５個の陽性（白色）細菌クローンを同定し、次に配列決定した。
Figure 0006126176
意外なことに、各コンストラクトから２群の配列データが同定され、同じ豚から得られる遺伝子グループ１および遺伝子グループ２に２タイプのＰＴＴＶが存在することが示された。それら４つのＰＴＴＶ株を区別しアセンブルするために、３つの既知ＰＴＴＶ株Ｓｄ−ＴＴＶ３１、ＴＴＶ−１ｐおよびＴＴＶ−２ｐと共に、配列比較を行った（図１Ｂおよび１Ｃ）。
図１Ｂは、ＰＴＴＶ１株ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡおよびＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡの完全長ゲノム配列の区別およびアセンブリを、続いてクローニングされたＰＣＲフラグメントＢおよびＣと共に図解している。フラグメントＢ中のＯＲＦ１およびＯＲＦ２の開始コドンと、フラグメントＣ中のＯＲＦ１の終止コドンに「＾」または「＊」で印が付けられている。２つの既知ＰＴＴＶ１株Ｓｄ−ＴＴＶ３１およびＴＴＶ−１ｐの対応する配列も示されている。保存されている配列を影付きで表し、ダッシュ記号はヌクレオチド欠失を示す。
ＰＴＴＶ１の場合、予測ＯＲＦ１の開始コドンＡＴＧおよび終止コドンＴＧＡは、それぞれフラグメントＢおよびＣ中に位置していた（図１Ｂ）。これらのコドンの位置は２つのＰＴＴＶ１グループにおいて異なり、１つ目はＳｄ−ＴＴＶ３１と同一、２つ目はＴＴＶ−１ｐと同一だった（図１Ｂ）。また、これら２つのグループにおけるＯＲＦ２開始コドンも、ＯＲＦ１の場合と同じく、異なる位置にあった。さらにまた、領域Ｂの４つの異なる配列（配列決定データからの２つと株Ｓｄ−ＴＴＶ３１およびＴＴＶ−１ｐからの２つ）および領域Ｃの４つの異なる配列を使った系統解析も、１つ目の配列がＳｄ−ＴＴＶ３１とクラスターを形成し、２つ目がＴＴＶ−１ｐとクラスターを形成することを裏付けた（データ未掲載）。それゆえに、本発明者らは、フラグメントＢとＣの両方からの２群の配列データを区別し、２つの完全長ＰＴＴＶ１ゲノム（これらを、それぞれ、株ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ（配列番号９）およびＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ（配列番号１０）と名付けた）にアセンブルすることができた（図１Ｂ）。
図１Ｃは、ＰＴＴＶ２株ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡおよびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡの完全長ゲノム配列の区別とアセンブリを、続いてクローニングされたＰＣＲフラグメントＥおよびＦと共に図解している。ＴＴＶ−２ｐ株の対応する配列も含まれており、保存されている配列が影付きで表されている。ダッシュ記号はヌクレオチド欠失を示す。各株について、オーバーラップ領域（破線で囲んだ部分）内のユニークなヌクレオチド（ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ（配列番号１１）の場合は連続する「ＡＧ」ヌクレオチド、ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ（配列番号１２）の場合は２つの単一「Ａ」ヌクレオチドおよび単一「Ｇ」ヌクレオチド）が、それぞれ示されている。
これら２つのＰＴＴＶ２株の区別の方が容易だった。２つのＰＣＲフラグメントのオーバーラップ領域中に位置しているユニークな連続「ＡＧ」ヌクレオチドは、それぞれフラグメントＥおよびＦからの２群の配列データに共通していた（図１Ｃ）。アセンブルした完全長ゲノム配列は、１つのＰＴＴＶ２株を表し、これをＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ（配列番号１１）と名付けた。同様に、フラグメントＥおよびＦからのもう１つの配列データセットがオーバーラップ領域中に共有している２つのユニークな単一「Ａ」ヌクレオチドおよび単一「Ｇ」ヌクレオチドに基づいて、ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ（配列番号１２）と名付けた第２の株の完全ゲノム配列をアセンブルした（図１Ｃ）。フラグメントＥおよびＦからの４つの配列をＴＴＶ−２ｐからの２つの対応する配列と共に使った系統解析も、この割当を裏付けた（データ未掲載）。
本発明は、豚におけるウイルス感染に関連する４つの分離された豚ＴＴＶウイルス遺伝子型または亜型を提供する。本発明は、豚ＴＴＶウイルス遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ、配列番号９（ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ）、配列番号１０（ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ）、配列番号１１（ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ）、および配列番号１２（ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ）に示すヌクレオチド配列、それらの機能的等価物または相補鎖を有するウイルス遺伝子型または亜型を包含するが、これらに限るわけではない。任意の豚ＴＴＶに由来する特定のヌクレオチド配列が、個々のウイルス間に自然に存在するわずかな変異を有するであろうことは理解されるだろう。これらの配列の変異は、欠失、置換、挿入などに見ることができる。
４つのＰＴＴＶ株のそれぞれについて提案されるゲノム構造を詳細に分析し、３つの既知ＰＴＴＶ株Ｓｄ−ＴＴＶ３１、ＴＴＶ−１ｐおよびＴＴＶ−２ｐと共に、表２に要約する。ＰＴＴＶの４つの米国株は、それぞれ、２，８７８ｂｐ（ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ 配列番号９）、２，８７５ｂｐ（ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ 配列番号１０）、２，７５０ｂｐ（ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ 配列番号１１）、および２，８０３ｂｐ（ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ 配列番号１２）という、類似したゲノムサイズを有する。ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ（配列番号９）とＳｄ−ＴＴＶ３１はどちらも同じゲノム長を有する。株ＴＴＶ−１ｐおよびＴＴＶ−２ｐの公表された配列は、いずれも、ＵＴＲのＧＣリッチ領域に多くの未決定ヌクレオチドを有する。これらのヌクレオチドをＰＴＴＶ１およびＰＴＴＶ２に対応するコンセンサス配列で人工的に埋めたところ、それぞれゲノム長が、ＴＴＶ−１ｐはＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ（配列番号１０）とより近い関係にあり、ＴＴＶ−２ｐはＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ（配列番号１１）とより近い関係にあることが示された（データ未掲載）。
アセンブルされた豚ＴＴＶウイルス遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ（配列番号９）、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ（配列番号１０）、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ（配列番号１１）、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ（配列番号１２）のゲノム配列は、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標））に提出され（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓａｅｒｃｈ）、２００８年１月；３６（データベース号（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２５−３０）、それぞれアクセッション番号ＧＵ４５６３８３、ＧＵ４５６３８４、ＧＵ４５６３８５、およびＧＵ４５６３８６が付与されている。
Figure 0006126176
 数字（完全長ゲノム、ＯＲＦのサイズ、およびエクソン番号を除く）は、各ＰＴＴＶ株のゲノム上のヌクレオチド（ｎｔ）位置を示す。
最近行われた２つの研究により、ヒトＴＴＶ複製時に、転写されたウイルスｍＲＮＡと、少なくとも６個のウイルスタンパク質の発現が同定された（ミュラー（Mueller）ら、２００８年、前掲書；キュウ（Qiu）ら、２００５年、前掲書）。これはヒトＴＴＶがコードすると予想されるＯＲＦの数よりも多い（オカモト，エイチ（Okamoto,H.）、ニシザワ，ティ（Nishizawa,T.）、タワラ，エイ（Tawara,A.）、タカハシ，エム（Takahashi,M.）、キシモト，ジェイ（Kishimoto,J.）、サイ，ティ（Sai,T.）、およびスガイ，ワイ（Sugai,Y.）、２０００年ｂ、「感染個体からの骨髄細胞に検出されるＴＴウイルスｍＲＮＡ（TT virus mRNAs detected in the bone marrow cells from an infected individual）」、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem Biophys Res Commun）、第２７９巻、第２号、ｐ．７００−７）。そこで本発明者らは、ＰＴＴＶ配列との比較のために、この新しいヒトＴＴＶゲノム情報を含めた。ヒトＴＴＶ株Ｐ／１Ｃ１のｍＲＮＡ転写産物の５’端は、ＴＡＴＡボックスの２５ｎｔ下流にある「Ａ」にマッピングされた（ミュラー（Mueller）ら、２００８年、前掲書）。この開始点、その隣接配列（ＣＧＡＡＴＧＧＣＴＧＡＧＴＴＴＡＴＧＣＣＧＣ（配列番号３９）；開始点に下線を付した）および上流にあるＴＡＴＡボックスまでの距離（２４ｎｔ；表２）は、７つのＰＴＴＶ株の全てにおいてよく保存されており、ＰＴＴＶとヒトＴＴＶは、ｍＲＮＡの共通の５’端を翻訳に利用し得ることが示唆される。
７つのＰＴＴＶ株の全ての間で完全に保存されているさらに５つの領域がＴＡＴＡボックスの近傍に同定された。それぞれ１１ｎｔの２つの領域（ＡＧＴＣＣＴＣＡＴＴＴ（配列番号４０）およびＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＡ（配列番号４１））は、ＴＡＴＡボックスの上流に位置し、残り３つの領域（１７ｎｔのＣＴＧＧＧＣＧＧＧＴＧＣＣＧＧＡＧ（配列番号４２）；１４ｎｔのＣＧＧＡＧＴＣＡＡＧＧＧＧＣ（配列番号４３）；１１ｎｔのＴＡＴＣＧＧＧＣＡＧＧ（配列番号４４））は、提案されているｍＲＮＡの５’端とＯＲＦ２の開始コドンとの間に位置する。これらの保存されたＰＴＴＶ特異的配列はウイルス遺伝子発現を調節する共通の要素を含有するのだろう。
以前、３つの既知ＰＴＴＶ株のゲノムに、それぞれ３つのＯＲＦ（ＯＲＦ１〜３）が提案された（ニール（Niel）ら、２００５年、前掲書；オカモト（Okamoto）ら、２００２年、前掲書）。本研究で同定されたＰＴＴＶの４つの原型米国株は、この構造を有している。ヒトＴＴＶ中の対応するＯＲＦ３は、ＯＲＦ２中の同じＡＴＧで開始しスプライシング後も同じＯＲＦ（伸張したＯＲＦ２）中に留まるので（図１Ａ）、これにはＯＲＦ２／２という新たな名前が付けられている（ミュラー（Mueller）ら、２００８年、前掲書；キュウ（Qiu）ら、２００５年、前掲書）。本研究では、ＰＴＴＶ分類を改定するために、本発明者らはヒトＴＴＶの命名法に従う。ヒトＴＴＶ ＯＲＦ１／１は、ＯＲＦ１中の２つのエクソンによってコードされる新たに同定されたウイルスタンパク質である（キュウ（Qiu）ら、２００５年、前掲書）。ＯＲＦ１／１は、ＯＲＦ１と、同一のＮ末端部分およびＣ末端部分を共有している。ＰＴＴＶ ＯＲＦ１／１対応物は、７つのＰＴＴＶ株の全てにおいて、すぐに同定された（図１Ａおよび表２）。
ＯＲＦ１およびＯＲＦ２が約２．８ｋｂのウイルスｍＲＮＡによってコードされるのに対し、ＯＲＦ１／１およびＯＲＦ２／２は、ヒトＴＴＶでは、スプライスされた約１．２ｋｂのウイルスｍＲＮＡによってコードされる（ミュラー（Mueller）ら、２００８年、前掲書；キュウ（Qiu）ら、２００５年、前掲書）。これら４つのＯＲＦがＰＴＴＶゲノムでも推定されたことと、７つのＰＴＴＶ株において予測されるスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位配列の配列および位置がよく保存されていることから（表２）、豚ＴＴＶもおそらく２つの対応するｍＲＮＡをコードすると推測される。
ヒトＴＴＶ株の大半はＣＡＶと遺伝的類似性を共有していて、ＴＴＶアポトーシス誘導タンパク質（ＴＡＩＰ）をコードし、そのＣＡＶ対応部分はアポプチンと名付けられている（ド・スミット，エム・エイチ（de Smit,M.H.）およびノートボルン，エム・エイチ（Noteborn,M.H.）、２００９年、「鶏貧血ウイルスおよびＴＴウイルスにおけるアポトーシス誘導タンパク質（Apoptosis-inducing proteins in chicken anemia virus and TT virus）」、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Curr Top Microbiol Immunol）、第３３１巻、ｐ．１３１−４９）。ＴＡＩＰのＯＲＦはＯＲＦ２内に埋め込まれている。しかし豚ＴＴＶには、対応するＴＡＩＰが存在しない。最近の研究により、培養細胞におけるＣＡＶの複製にはアポプチンまたはＴＡＩＰの発現が必要であることが示された（プラセチョウ，エイ・エイ（Prasetyo,A.A.）、カマホラ，ティ（Kamahora,T.）、クロイシ，エイ（Kuroishi,A.）、ムラカミ，ケイ（Murakami,K.）、およびヒノ，エス（Hino,S.）、２００９年、「鶏貧血ウイルス（ＣＡＶ）の複製はアポプチンを必要とし、ヒトトルクテノウイルス（ＴＴＶ）のＶＰ３によって補完される（Replication of chicken anemia virus (CAV) requires apoptin and is complemented by VP3 of human torque teno virus (TTV)）」、バイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第３８５巻、第１号、ｐ．８５−９２）。
ペアワイズ配列比較（ＰＡＳＣ）は、同じファミリー内のウイルスの全ての利用可能なゲノム配列からペアワイズヌクレオチド配列同一性百分率の頻度分布をプロットする有用な方法である（バオ，ワイ（Bao,Y.）、カプースチン，ワイ（Kapustin,Y.）、およびタツソワ，ティ（Tatusova,T.）、２００８年、「ペアワイズ配列比較（ＰＡＳＣ）によるウイルス分類（Virus Classification by Pairwise Sequence Comparison (PASC)）」、エイサイクロペディア・オブ・バイロロジー５巻セット（Encyclopedia of Virology,5 vols）（ビー・ダブリュ・ジェイ・マーヒー（B.W.J.Mahy）およびエム・エイチ・ブイ・ファン・レーゲンモルテル（M.H.V.Van Regenmortel）編）の第５巻、ｐ．３４２−８、エルゼビア（Elsevier）、オックスフォード（Oxford））。ＰＡＳＣプログラムによって生成した異なるピークは、通常、ウイルスの属、種、型、亜型および株を表す（図２）。この研究において、本発明者らは、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースに見いだされる１２１の、ヒトおよび動物ＴＴＶ関連株の完全長ゲノム配列を使って、ＴＴＶのＰＡＳＣ解析を行った（図２）。ＴＴＶの構成要素が一つの独立した科、アネロウイルス科（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）に分類されると仮定すると、３６〜５５％および５５〜６７％のヌクレオチド配列同一性に見られる２つの主要ピークは、それぞれ属および種のグループを表す（図２）。したがってＴＴＶ型は６７〜８５％のヌクレオチド配列同一性を有するＴＴＶのグループと定義され、一方、ＴＴＶ亜型は８５〜９５％のヌクレオチド配列同一性を共有するＴＴＶ配列のグループと定義することができる。９５％を上回るヌクレオチド配列同一性を共有するＴＴＶ株は、さらに変異体に分類することができる（図２）。同じような分類が、ジェルシック（Jelcic）らにより、１０３個のＴＴＶ分離株の配列を使って提案されている（ジェルシック，アイ（Jelcic,I.）、ホッツ−ワーゲンブラット，エイ（Hotz-Wagenblatt,A.）、ハンジカー，エイ（Hunziker,A.）、ツア・ハウゼン，エイチ（Zur Hausen,H.）、およびド・ヴィリエ，イー・エム（de Villiers,E.M.）、２００４年、「ホジキン病患者の脾生検組織からの複数のＴＴウイルス遺伝子型の分離：超可変領域におけるゲノムの再編成および多様性（Isolation of multiple TT virus genotypes from spleen biopsy tissue from a Hodgkin’s diesase patient: genome reorganization and diversity in the hypervariable region）」、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J Virol）、第７８巻、第１４号、ｐ．７４９８−５０７）。
ここに提案されたＴＴＶ分類の基準を、ＰＴＴＶの４つの原型米国株と他の３つの既知ＰＴＴＶ株のゲノム配列の系統解析に適用した。これらの株間で行った完全長ヌクレオチド配列のペアワイズ比較は、４つのＰＴＴＶ１株は３つのＰＴＴＶ２株と比較して５４．０〜５６．４％のヌクレオチド配列同一性を有することを示した（表３）。したがって、文献において以前にＰＴＴＶの「遺伝子グループ（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ）」と呼ばれていたものは、おそらく「種（ｓｐｅｃｉｅｓ）」と呼ぶ方が、より適切であり、ＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２はおそらくそれぞれ豚ＴＴＶ種１および種２を表すはずである。ＰＴＴＶ種１は、それぞれ１ａ型（Ｓｄ−ＴＴＶ３１およびＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ（配列番号９）を含む）および１ｂ型（ＴＴＶ−１ｐおよびＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ（配列番号１０））と呼ばれる２つのウイルス型からなる。というのも、これら２つのウイルス型の間のヌクレオチド配列同一性は６９．８〜７０．７％だからである（表３）。Ｓｄ−ＴＴＶ３１とＴＴＶ１ａ−ＶＡ（配列番号９）は、それらの高い配列同一性（９５．１％）ゆえに、同じ種の変異体株であると認識される。しかし、２つの１ｂ型株、ＴＴＶ−１ｐおよびＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ（配列番号１０）は２つの異なる亜型に属し得る（ヌクレオチド配列同一性＝８６．４％）。ＰＴＴＶ種２の場合、３つの株は、８６．５〜９０．９％というそれらのヌクレオチド配列同一性に基づいて、別々の亜型（それぞれ、ＴＴＶ−２ｐは亜型２ａ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ（配列番号１１）は亜型２ｂ、ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ（配列番号１２）は亜型２ｃ）に分類される可能性が高い。ここに提案されたＰＴＴＶのための新しい分類システムは、系統樹に明確に見てとることができた（図３Ａ）。ＰＴＴＶのＯＲＦ１、ＯＲＦ１／１、ＯＲＦ２およびＯＲＦ２／２の推定アミノ酸配列に基づいて構築した系統樹も、ここに提案された分類と合致した（図３Ｂ〜３Ｅ）。
Figure 0006126176
 データはＰＡＳＣプログラムを使用することによって生成したもので、値は％ヌクレオチド配列同一性を示す。
ＰＴＴＶ種、型および亜型の間で、ユニークな突然変異ならびに欠失および／または挿入は、ゲノム全体に散在している。例えば、上述のように図１Ｂに示すＯＲＦ１の開始および終止コドンならびにＯＲＦ２の開始コドンの場所は、ＰＴＴＶ１ａ型と１ｂ型の間で異なる。２つのＰＴＴＶ１ｂ株は、ＰＴＴＶ１ａと比較して、ＯＲＦ２開始後に２コドンの欠失も有する（図１Ｂ）。
注目すべきことに、ＴＴＶ−２ｐとＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡはどちらも、ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡと比較して、ＵＴＲ中の最初の１１ｎｔ保存配列（ＡＧＴＣＣＴＣＡＴＴＴ（配列番号４０））の３９ｎｔ上流に、大きな５２ｎｔ欠失を有する。この欠失ゆえに、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡのゲノムサイズ（おそらくＴＴＶ−２ｐも同様である）は、ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのゲノムサイズよりもかなり小さい（表２）。多くの「サブウイルス」ヒトＴＴＶクローンが血清試料から単離されており、これらサブウイルス分子の大部分においてＯＲＦが通常はインタクトなままであることから、それらは完全長ＴＴＶゲノムであるとみなされている（ド・ヴィリエ（de Villiers）ら、２００９年；レピック（Leppik）ら、２００７年）。それらは、完全にまたは部分的に欠失しているＵＴＲに、さまざまな長さを有する。ＴＴＶ−２ｐとＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡの状況は、ヒトＴＴＶサブウイルス分子の状況に似ていると思われ、亜型ＰＴＴＶ２ａとＰＴＴＶ２ｂは、亜型ＰＴＴＶ２ｃに由来するサブウイルス分子である可能性があることが示唆される。注目すべきことに、野外試料からＰＴＴＶ２を検出するために他のグループ（エリス（Ellis）ら、２００８年、前掲書；ケカライネン（Kekarainen）ら、２００７年、前掲書；ケカライネン（Kekarainen）ら、２００６年、前掲書；クラコウカ（Krakowka）ら、２００８年、前掲書）によってよく使用されているネステッドＰＣＲプライマーＴＴＶ２−ｎＦ（表１）の３’末端配列は、その欠失の両側に位置している。したがって、ＰＴＴＶ２を検出するための現在のネステッドＰＣＲアッセイは、遺伝的に多様なＰＴＴＶ２ｃ亜型の株を同定するには十分でない可能性が高い。
分離ウイルス株の供給源は、豚ＴＴＶウイルス感染を有する豚の血清、糞便、唾液、精液および組織試料である。しかし、組換えＤＮＡ技術を使ってヌクレオチド配列を複製し化学的に合成することができると考えられる。したがって本発明の範囲は、例えば限定するわけではないが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示すヌクレオチド配列、またはその相補鎖を含む、単離されたポリヌクレオチド；配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズし、そのヌクレオチド配列に少なくとも６７％相補的な、好ましくは８５％相補的な、より好ましくは９５％相補的なポリヌクレオチド；または配列番号１３（ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ）、配列番号１４（ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ）、配列番号１５（ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ）、配列番号１６（ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ）に示すＯＲＦ１タンパク質のアミノ酸配列、配列番号１７（ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ）、配列番号１８（ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ）、配列番号１９（ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ）、配列番号２０（ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ）に示すＯＲＦ２タンパク質のアミノ酸配列、配列番号２１（ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ）、配列番号２２（ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ）、配列番号２３（ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ）、配列番号２４（ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ）に示すＯＲＦ１／１タンパク質のアミノ酸配列、配列番号２５（ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ）、配列番号２６（ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ）、配列番号２７（ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ）、配列番号２８（ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ）に示すＯＲＦ２／２タンパク質のアミノ酸配列からなる群より選択される免疫原性フラグメントを包含する。免疫原性または抗原性コード領域またはフラグメントは、当技術分野において知られている技法によって決定することができ、次にそれらを使って、免疫反応性スクリーニングまたは他の診断目的のためのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を作製することができる。本発明はさらに、単離されたポリヌクレオチドによってコードされる精製免疫原性タンパク質を包含する。望ましくは、タンパク質は、上記分離豚ＴＴＶ亜型の少なくとも１つの単離または組換えＯＲＦ１タンパク質またはＯＲＦ２タンパク質、より望ましくはＯＲＦ１タンパク質であることができる。
豚ＴＴＶのＯＲＦ１は、構造および複製関連タンパク質をコードすると考えられている（マギー，エフ（Maggi,F.）およびベンディネリ，エム（Bendinelli,M.）、２００９年、「トルクテノウイルスおよび他のアネロウイルスの免疫生物学（Immunobiology of the Torque teno viruses and other anelloviruses）」、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Curr Top Microbiol Immunol）、第３３１巻、ｐ．６５−９０）。７つのＰＴＴＶ株のＯＲＦ１がコードする産物は、６２４〜６３５ａａの長さを有し、ＤＮＡ結合活性を有すると考えられる多数のアルギニン残基をＮ末端に持っている（図４）。図４では、保存されている配列を影付きで表している。ダッシュ記号はアミノ酸欠失を示す。ＲＣＲモチーフは実線で囲まれている。ＰＴＴＶ１株の３つのＨＶＲ（ＰＴＴＶ１−ＨＶＲ１、２および３）とＰＴＴＶ２株の２つのＨＶＲ（ＰＴＴＶ２−ＨＶＲ１および２）は破線で囲まれている。ＯＲＦ１／１の接合境界を矢印で示す。予想されるローリングサークル複製ローリングサークル複製（ＲＣＲ）モチーフ（イリイナ，ティ・ブイ（Ilyina,T.V.）およびクーニン，イー・ブイ（Koonin,E.V.）、１９９２年、「真正細菌、真核生物および古細菌の多様なレプリコンによってコードされるローリングサークルＤＮＡ複製のための開始タンパク質における保存された配列モチーフ（Conserved sequence motifs in the initiator proteins for rolling circle DNA replication encoded by diverse replicons from eubacteria,eucaryotes and archaebacteria）」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、第２０巻、第１３号、ｐ．３２７９−８５）は、異なるＰＴＴＶ型および亜型では異なる位置に示され、それらの位置は型特異的または亜型特異的であり得る。ＲＣＲモチーフＩＩＩ（ＹｘｘＫ）は、ＰＴＴＶ１ａ型株（ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ 配列番号１３のａａ位置１４−１７）および１ｂ型株（ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ 配列番号１４のａａ位置３７９−３８２）において、それぞれ保存されているが、３つのＰＴＴＶ２株の全てに同定された同じ保存モチーフは、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ 配列番号１５のａａ位置４８２−４８５に位置している（図４）。ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ 配列番号１５とＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ 配列番号１６はどちらも、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡのａａ位置３３１−３３３に保存されたＲＣＲモチーフＩＩ（ＨｘＱ）も有し、ＴＴＶ−２ｐにはこれが存在しない（図４）。
ＰＴＴＶ株のＯＲＦ１タンパク質が種１と種２の間で共有する配列同一性はわずかに２２．４〜２５．８％と極めて低く、それが、これら２つの種の間で有意に保存されたａａ配列を同定することを困難にしている（図４）。ＰＴＴＶ種１では、１ａ型株と１ｂ型株の間のＯＲＦ１のａａ同一性が５０．３〜５２．７％である。４つのＰＴＴＶ１株には、比較的多数のａａ置換を伴う３つの主要超可変領域（ＨＶＲ）ＰＴＴＶ１−ＨＶＲ１〜３が同定されたのに対し、３つのＰＴＴＶ２株の間には２つのＨＶＲ（ＰＴＴＶ２−ＨＶＲ１および２）が観察された（図４）。３つのＰＴＴＶ２株は、対応するＰＴＴＶ１−ＨＶＲ１領域に約２０ａａの欠失を有する。そのうえ、ＰＴＴＶ２の２つのＨＶＲは、対応するＰＴＴＶ１−ＨＶＲ３領域内にある（図４）。これらのＨＶＲはＯＲＦ１中にのみ位置するが、切断型のＯＲＦ１／１中にはない。これらは、ヒトＴＴＶの研究によって示唆されているとおり、宿主免疫監視機構を免れ、ＰＴＴＶが持続感染を樹立するのを助ける役割を果たすらしい。
ＯＲＦ２のａａ配列は４つのＰＴＴＶ１株（ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ 配列番号１７；ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ 配列番号１８）および３つのＰＴＴＶ２株（ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ 配列番号１９；ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ 配列番号２０）の間でかなり異なっていた（図５）。しかしこれらは保存されたタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ）様モチーフ（Ｗｘ７Ｈｘ３ＣｘＣｘ５Ｈ）をＮ末端に共有している（図４）。このモチーフは、全てのヒトＴＴＶ、ＴＴＭＶおよびＴＴＭＤＶ株ならびにＣＡＶにも保存されている。ＴＴＭＶまたはＣＡＶのＯＲＦ２タンパク質は、セリン／スレオニンホスファターゼ（Ｓ／Ｔ ＰＰアーゼ）活性も示した（ピータース，エム・エイ（Peters,M.A.）、ジャクソン，ディ・シー（Jackson,D.C.）、クラッブ，ビー・エス（Crabb,B.S.）、およびブラウニング，ジー・エフ（Browning,G.F.）、２００２年、「鶏貧血ウイルスＶＰ２は新規二重特異性プロテインホスファターゼである（Chicken anemia virus VP2 is a novel dual specificity protein phosphatase）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J Biol Chem）、第２７７巻、第４２号、ｐ．３９５６６−７３）。ＯＲＦ２タンパク質の二重特異性は、ウイルス複製時に、宿主の遺伝子転写、シグナル伝達およびサイトカイン応答を調節すると思われる。最近、ＣＡＶ中のモチーフの最後のヒスチジン残基の前にある保存された２つの塩基性ａａ残基の変異導入解析により、これら２つの残基は、ウイルス複製、インビトロの細胞病理、およびインビボの弱毒化に影響を及ぼすことが明らかになった（ピータース，エム・エイ（Peters,M.A.）、クラッブ，ビー・エス（Crabb,B.S.）、ワシントン，イー・エイ（Washington,E.A.）、およびブラウニング，ジー・エフ（Browning,G.F.）、２００６年、「鶏貧血ウイルスのＶＰ２遺伝子の部位特異的変異導入は、ウイルス複製、細胞病理および宿主細胞ＭＨＣクラスＩ発現に影響を及ぼす（Site-directed mutagenesis of the VP2 gene of Chicken anemia virus affects virus replication,cytopathology and host-cell MHC class I expression）」、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J Gen Virol）、第８７巻、第４号、ｐ．８２３−３１；ピータース，エム・エイ（Peters,M.A.）、クラッブ，ビー・エス（Crabb,B.S.）、チベンデール，ケイ・エイ（Tivendale,K.A.）、およびブラウニング，ジー・エフ、２００７年、「ＶＰ２の部位特異的変異導入による鶏貧血ウイルスの弱毒化（Attenuation of chicken anemia virus by site-directed mutagenesis of VP2）」、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J Gen Virol）、第８８巻、第８号、ｐ．２１６８−７５）。これら２つの塩基性ａａ残基（「ＫＫ」）は３つのＰＴＴＶ２株に保存されている。しかし、２つのＰＴＴＶ１ａ株では最初の塩基性残基（「Ｒ」）だけが保たれており、一方、ＰＴＴＶ１ｂ株では塩基性残基はどちらも置換されている（図５）。図５において、ダッシュ記号はアミノ酸欠失を示す。ＴＴＶ、ＴＴＭＶおよびＣＡＶにおいて同定された共通モチーフＷｘ７Ｈｘ３ＣｘＣｘ５Ｈ（下線部）内の保存された５つのアミノ酸を影付きで示す。このモチーフの最後のヒスチジンの前にある２つの塩基性アミノ酸（ＣＡＶにおいてウイルス複製、細胞病理、またはインビボ弱毒化に影響を及ぼすことが示されているもの）の位置を「＾」で示す。
要約すると、本発明は、バージニアの一頭の雄豚の血清試料における異なる遺伝子型または亜型を代表する４つの豚ＴＴＶ株の完全長ゲノム配列を決定した。この研究から得られた知見は、ヒトＴＴＶと同様に、豚には異なる遺伝子型または亜型による多重ＰＴＴＶ感染が存在し、おそらくそれが一般的であることを明確に示している。本発明者らは、ＰＴＴＶのゲノム編成、可変性の程度、保存されているヌクレオチドモチーフおよびアミノ酸モチーフの特徴に関する新しい情報も提供した。これらの情報は、現在のＰＣＲ検出アッセイを改善し、血清学的診断法のための試薬の開発を助け、ＰＴＴＶの構造的および機能的研究を開始するのに役立つであろう。この研究では、７つの既知ＰＴＴＶ株のゲノム配列の系統解析および遺伝子解析に基づいて、ＰＴＴＶの新しい分類も提案する。
本発明は、豚ＴＴＶに感染した豚または他の哺乳動物の試料中のウイルスＤＮＡを検出することによる、豚ＴＴＶ感染の診断方法も提供する。本発明の好ましい一実施形態は、ウイルス感染またはウイルス疾患の診断をさらに助けるために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のオリゴヌクレオチドプライマーを使って、豚または他の哺乳動物種における豚ＴＴＶ核酸配列を検出するための方法を伴う。豚または他の哺乳動物種における豚ＴＴＶウイルス核酸配列の有無を検出するのに役立つ診断検査は、豚ＴＴＶに感染した豚またはＴＴＶの感染が疑われる豚の試料からウイルスＤＮＡを単離することと、ＰＴＴＶ１特異的プライマー（配列番号２９／配列番号３０）またはＰＴＴＶ２特異的プライマー（配列番号３１／配列番号３２）を使って、ＳＹＢＲグリーン・リアルタイム定量ＰＣＲを行うこととを含む。
本発明のもう一つの実施形態では、ＰＴＴＶ１／ＰＴＴＶ２デュプレックス・リアルタイムＰＣＲを使用することによって、ＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２が同時に検出されるように、診断方法を適合させることができる。より具体的に述べると、この方法は、豚ＴＴＶに感染した豚またはＴＴＶの感染が疑われる豚の試料からウイルスＤＮＡを単離することと、ＰＴＴＶ１特異的プライマー（配列番号２９／配列番号３０）またはＰＶＶＴ２特異的プライマー（配列番号３１／配列番号３２）の両方を使ってリアルタイムＰＣＲを行うこととを含む。ＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２のＴｍ値はＭＣＡで識別することができるので、ＰＴＴＶ１ ＤＮＡとＰＴＴＶ２ ＤＮＡの存在を同時に検出することができる。
本発明のさらにもう一つの実施形態において、診断方法はデュプレックス・ネステッドＰＣＲを使用し得る。この方法は、豚ＴＴＶに感染した豚またはＴＴＶの感染が疑われる豚の試料からウイルスＤＮＡを単離すること、１対のプライマーＰ１ａｂ−ｍＦ（配列番号３３）／Ｐ１ａｂ−ｍＲ（配列番号３４）を使って第１ラウンドのＰＣＲを行うこと、ＰＴＴＶ１ａを検出するためのＰ１ａ−ｎＦ（配列番号３５）／Ｐ１ａ−ｎＲ（配列番号３６）およびＰＴＴＶ１ｂを検出するためのＰ１ｂ−ｎＦ（配列番号３７）／Ｐ１ｂ−ｎＲ（配列番号３８）という２対のプライマーの混合物を使って第２ラウンドのＰＣＲを行うこと、およびＰＣＲ産物を可視化することを含む。
当業者は当技術分野において周知の方法に従って、上記の診断方法を最適化することができる。
したがって本発明の一実施形態は、２つの豚ＴＴＶ種のウイルス負荷量をそれぞれ定量するために、２つの新規シングルプレックスＳＹＢＲグリーン・リアルタイムＰＣＲアッセイを開発する。現時点で利用することができる６つのＰＴＴＶ１完全長ゲノムと４つのＰＴＴＶ２完全長ゲノムの間でそれぞれによく保存されている領域を標的とするＰＴＴＶ１特異的プライマーとＰＴＴＶ２特異的プライマーを設計した。本発明のもう一つの実施形態では、２つの豚ＴＴＶ種ＰＴＴＶ１ａおよびＰＴＴＶ１ｂを同時検出するために、前記２つのシングルプレックスアッセイを組み合わせてデュプレックス・リアルタイムＰＣＲアッセイを行った後、異なる融解温度によって同定することができるウイルスアンプリコンのＭＣＡを行う。第３の実施形態では、単一試料中の豚ＴＴＶ種の２つの型ＰＴＴＶ１ａおよびＰＴＴＶ１ｂを同定する目的で、第１ラウンドＰＣＲにおいて２つの型のＰＴＴＶ１からのウイルスＤＮＡを同時増幅し、第２ラウンドＰＣＲにおいて１ａ型と１ｂ型の区別的検出を行うためのデュプレックス・ネステッドＰＣＲアッセイを開発した。これらのアッセイは、種特異的または型特異的豚ＴＴＶの診断のための簡単で実用的なツールになる。
利用可能な１０個の豚ＴＴＶ完全長ゲノムの多重配列アラインメントによって、潜在的プライマー配列を同定した。ＰＴＴＶ１特異的プライマーＴＴＶ１Ｆ（配列番号２９）およびＴＴＶ１Ｒ（配列番号３０）は、６個のＰＴＴＶ１ゲノム間で予測ＯＲＦ２の直前にある２つの保存されたゲノム領域に基づいて設計し、一方、ＰＴＴＶ２特異的プライマーＴＴＶ２Ｆ４（配列番号３１）およびＴＴＶ２Ｒ４（配列番号３２）は、４つのＰＴＴＶ２ゲノム間で予測ＯＲＦ２／２の直後にある２つの保存されたゲノム領域に基づいて設計した（表４）。プライマーは自己二量体化および交差二量体化の可能性を示さなかった。予期されるアンプリコンサイズは、それぞれ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡゲノムに対応するＰＴＴＶ１プライマーからの１１８ｂｐフラグメントと、ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡゲノムに対応するＰＴＴＶ２プライマーからの２００ｂｐフラグメントであった。
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本発明の具体的一実施形態によれば、ＰＴＴＶ１特異的プライマーおよびＰＴＴＶ２特異的プライマーを用いるＳＹＢＲグリーン・シンプレックス・リアルタイムＰＣＲを使って、それぞれ豚ＴＴＶ１およびＴＴＶ２ ＤＮＡを特異的に検出することができる。ＰＴＴＶ１については、ある範囲の、２５μｌあたりのターゲットＤＮＡ濃度にわたって、標準曲線を確立した。線形範囲は、４．４×１０１〜４．４×１０８コピーにまたがることが示された。最低検出限界（４４コピー）は、３７．５７の閾サイクル数（Ｃｔ）に対応した。ＰＴＴＶ２についても標準曲線を作成し、それを使って、２５μｌの反応あたり８．６×１００〜８．６×１０８コピーの範囲にあるＤＮＡ濃度を検出した。最低検出限界（８．６コピー）に対応するＣｔは３６．５３だった。
本発明のもう一つの具体的実施形態では、豚ＴＴＶ１ ＤＮＡと豚ＴＴＶ２ ＤＮＡの同時検出に、ＳＹＢＲグリーン・デュプレックス・リアルタイムＰＣＲを利用する。ＰＴＴＶ１（８７．０℃）とＰＴＴＶ２（８０．０℃）の間の７度というＴｍ値の差が、それらをＭＣＡによって互いに識別することを可能にした。したがって、ＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２を同時検出するために、２つのシングルプレックスアッセイを結びつけてデュプレックス・リアルタイムＰＣＲアッセイにすることができる。陽性試料は、その産物についての既知Ｔｍ内で対称的な融解ピークを有するものであった。この新しいアッセイを、まず最初に、ＰＴＴＶ１標準とＰＴＴＶ２標準の混合物の１０倍希釈液を使って検証した。テンプレートとして滅菌水を使用した非テンプレート陰性対照は、シングルプレックスアッセイでは見られなかったＰＴＴＶ１プライマーとＰＴＴＶ２プライマーの間の交差二量体化が引き起こす非特異的増幅を示した（図７ａ）。これにより、７２．０℃〜７６．０℃に別個の融解ピークが生じた。図７Ａは、ＰＴＴＶ１標準（赤色；Ｔｍ＝８７．０℃）、ＰＴＴＶ２標準（緑色；Ｔｍ＝８０．０℃）および非テンプレート陰性対照（プライマー交差二量体化によるもの；黒色）の融解ピークを示している。図７Ｂ〜７Ｅは、異なるウイルス負荷量のＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２とを含む代表的な血清試料の融解ピークを示している。図７Ｂは、雄豚血清試料番号５（ＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２のウイルス負荷量はどちらも比較的高いが、ＰＴＴＶ２＞ＰＴＴＶ１）を表し、図７Ｃは、雄豚血清試料番号１２（ＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２のウイルス負荷量はどちらも比較的高いが、ＰＴＴＶ１＞ＰＴＴＶ２）を表し、図７Ｄは雄豚血清試料番号１４（ＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２のウイルス負荷量はどちらも低い）を表し、図７Ｅは雄豚血清試料番号１０（ＰＴＴＶ１陽性だが、ＰＴＴＶ２陰性）を表す。シングルプレックス・リアルタイムＰＣＲによって決定された各試料中のＰＴＴＶ１およびＰＴＴＶ２のウイルス負荷量（単位：ゲノムコピー／ｍｌ）を、対応する融解ピークの上に示した。
ある例では、デュプレックス・リアルタイム・アッセイを２０個の成体雄豚血清試料に適用した場合に、ＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２のウイルス負荷量がどちらも比較的高い試料は、ＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２に対応する２つの異なる融解曲線を示し、非特異的融解ピークは示さなかったのに対し（図７Ｂおよび７Ｃ）、ＰＴＴＶ１またはＰＴＴＶ２のどちらか一方のウイルス負荷量が低い試料は、ウイルス特異的融解曲線だけでなく、非特異的融解曲線も示した（図７Ｄおよび７Ｅ）。試料番号１４における２つの融解ピークは極めて小さかったが、それらはＰＴＴＶ１およびＰＴＴＶ２の適当なＴｍに視覚的に明確で対称的な上昇と降下を示したので、それらは陽性と見なされた（図７Ｄ）。これに対し、試料番号１０は、対称的なＰＴＴＶ２融解ピークが明白には存在しなかったので、ＰＴＴＶ１のみ陽性と見なされた（図７Ｅ）。これらの結果は、２つのシングルプレックスアッセイの結果と一致した（表５）。さらにまた、融解ピークのサイズと形状は、検出された試料における対応するウイルス負荷量を定量的に反映した。
本発明のもう一つの態様では、デュプレックス・ネステッドＰＣＲを、２つの豚ＴＴＶ型ＰＴＴＶ１ａおよびＰＴＴＶ１ｂの区別的検出に使用する。
本発明の発明者は、豚ＴＴＶ種１における２つの異なる遺伝子型（暫定的にＰＴＴＶ１ａおよびＰＴＴＶ１ｂと名付けた）の存在を証明した。さらに、ＰＴＴＶ１ａとＰＴＴＶ１ｂの同時感染が豚において一般的であるかどうかを決定するために、これら２つを迅速に識別するための新規デュプレックス・ネステッドＰＣＲアッセイを開発した。豚ＴＴＶゲノムＤＮＡ配列のアラインメントにより、ウイルスキャプシドタンパク質をコードする予測ＯＲＦ１のＮ末端部分に位置する保存されたゲノム領域が同定された（図８）。この領域はＯＲＦ２全体と上流の部分的ＵＴＲも含有している。第１ラウンドＰＣＲにおいてＰＴＴＶ１ａ ＤＮＡとＰＴＴＶ１ｂ ＤＮＡの両方を同時に増幅するために、プライマーＰ１ａｂ−ｍＦ（配列番号３３）／Ｐ１ａｂ−ｍＲ（配列番号３４）を設計した。第２ラウンドＰＣＲでは、ＰＴＴＶ１ａ特異的プライマーＰ１ａ−ｎＦ（配列番号３５）／Ｐ１ａ−ｎＲ（配列番号３６）とＰＴＴＶ１ｂ特異的プライマーＰ１ｂ−ｎＦ（配列番号３７）／Ｐ１ｂ−ｎＲ（配列番号３８）との混合物を使って、各遺伝子型を区別的に増幅した。ＰＴＴＶ１ａおよびＰＴＴＶ１ｂの最終ＰＣＲ産物は、それぞれサイズが１６２ｂｐおよび９６ｂｐであり、それらは臭化エチジウムで染色した１％アガロースゲルでの電気泳動により、容易に識別することができた。このアッセイでは、プライマーの特異性ゆえに、ＰＴＴＶ２ ＤＮＡは検出されないと予期された（図８）。図８では、保存されている配列を点で示し、影付きにした。ダッシュ記号によってヌクレオチド欠失を示した。デュプレックス・ネステッドＰＣＲに使用した３対のプライマーの場所と向きを矢印で示した。
ある例では、デュプレックス・ネステッドＰＣＲアッセイに付した成体雄豚からの血清試料２０個は、予期されるサイズの２本のバンドの可視化と、続いて行われた配列決定によるＰＣＲ産物の確認とによる決定で（データ未掲載）、全てが、ＰＴＴＶ１ａとＰＴＴＶ１ｂの両方について陽性であることがわかった。１９個の精液試料ではＰＣＲ産物が増幅されず、上述したＰＴＴＶ１従来型ネステッドＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲアッセイの結果と合致した。
２つの豚ＴＴＶ種による豚の感染は、遡及的研究によれば、スペインの養豚場において１９８５年には見いだされている（シーゲイルス（Segales）ら、２００９年、前掲書）。しかし豚ＴＴＶが何らかの特定豚疾患と関連しているかどうかは依然として不明である。どちらの豚ＴＴＶ種も飼育豚において高い有病率を有するので、ＴＴＶ ＤＮＡの存在を評価することよりも、ＴＴＶウイルス負荷量の決定の方が、おそらく、より重要である。血清試料および精液試料におけるウイルス負荷量のレベルは、ＰＣＶ２感染におけるＰＣＶＡＤの重要なマーカーとして示されている（オプリースニヒ（Opriessnig）ら、２００７年、前掲書）。したがって、定量的なＰＴＴＶ特異的リアルタイムＰＣＲアッセイの確立は、豚ＴＴＶに関連する潜在的疾患状態を同定するのに役立つだろう。
２つのタックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブ・ベース・リアルタイムＰＣＲアッセイが最近になって記載された。カナダのグループが開発したシングルプレックス・アッセイは種特異的ではなく、２つのＰＴＴＶ種の総ウイルス負荷量を定量するようにしか設計されなかった（ブラッサード（Brassard）ら、２００９年、前掲書）。ドイツのグループが確立したデュプレックス・アッセイでは両方の種の特異的な同時検出が可能だった（ガレイ（Gallei）ら、２００９年、前掲書）。これら２つのアッセイにおいて使用されたプライマーのターゲット配列は、３つの豚ＴＴＶゲノム配列（Ｓｄ−ＴＴＶ３１、ＴＴＶ−１ｐおよびＴＴＶ−２ｐ）のアラインメントによって決定されたもので、ＵＴＲ中に位置していた。本研究において、本発明者らは、利用可能な７つの完全ＰＴＴＶゲノム配列（４つのＰＴＴＶ１配列と３つのＰＴＴＶ２配列）を追加して、１０個の完全長ＰＴＴＶゲノムの間で保存されている領域を分析し、再決定した。この研究で得られた最新のアラインメント結果に基づいて、ＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２のウイルス負荷量をそれぞれ定量するために、２つの種特異的シングルプレックスＳＹＢＲグリーンベース・リアルタイムＰＣＲアッセイを開発した。本発明者らのアッセイで使用したプライマーは、先の研究とは異なる保存ゲノム領域に結合するように設計されたもので、これらは定量の正確度を向上させ得る。本発明者らのアッセイは、２５μｌの反応あたり、ＰＴＴＶ１については４４ゲノムコピー数、ＰＴＴＶ２については８．８ゲノムコピー数と、かなりの種特異性および選択性を示した。これに対し、タックマン（ＴａｑＭａｎ）ベースのデュプレックス・リアルタイムＰＣＲでは、１反応あたり１０ゲノムコピー数という検出限界が報告されている（ガレイ（Gallei）ら、２００９年、前掲書）。また、ＳＹＢＲグリーンベースのリアルタイムＰＣＲアッセイは、蛍光標識したプローブを使用する必要がなく直ちに行うことができるフレキシブルで安価なアプローチである。最後に、豚ＴＴＶが高度の遺伝的多様性を示すことを考えると、ＳＹＢＲグリーンベース・アッセイによる結果は、タックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブベースのアッセイにおけるプローブ結合配列中に突然変異を含有する可能性が高い豚ＴＴＶ変異体の異なる遺伝的背景による影響を受ける可能性が少ない。
ＴＴＶ ＤＮＡが存在するとはいえ、この研究において試験された健常な豚からの血清試料はいずれも、２×１０６コピー／ｍｌ未満という少量のＰＴＴＶ１およびＰＴＴＶ２を有していた。さらにまた、３つの精液試料には、極めて低いタイターのＰＴＴＶ２ ＤＮＡしか検出されなかった。試験した血清試料の大半は、従来のネステッドＰＣＲで決定したところ、ＰＣＶ２ ＤＮＡについても陽性だった（データ未掲載）。ウイルス負荷量が低い多くのＰＣＶ２陽性豚は、臨床的ＰＣＶＡＤを発症しない。ＰＣＶＡＤの発症に関して提案されている閾は、１０７以上のＰＣＶ２ゲノムコピー／ｍｌ血清である（オプリースニヒ（Opriessnig）ら、２００７年、前掲書）。また、精液ＰＣＶ２ ＤＮＡ陽性も、疾患状態の注目すべきマーカーである（オプリースニヒ（Opriessnig）ら、２００７年、前掲書；パル，エヌ（Pal,N.）、ファン，ワイ・ダブリュ（Huang,Y.W.）、マドソン，ディ・エム（Madson,D.M.）、カスター，シー（Kuster,C.）、モン，エックス・ジェイ（Meng,X.J.）、ハルバー，ピー・ジー（Halbur,P.G.）およびオプリースニヒ，ティ（Opriessnig,T.）、２００８年、「豚精液試料における豚サーコウイルス２型および内部対照の同時検出および定量のためのデュプレックス・リアルタイムＰＣＲアッセイの開発と検証（Development and validation of a duplex real-time PCR assay for the simultaneous detection and quantification of porcine circovirus type 2 and an internal control on porcine samen samples）」、ジャーナル・オブ・バイロロジカル・メソッズ（J Virol Methods）、第１４９巻、ｐ．２１７−２５）。種特異的ＰＴＴＶの状況はＰＣＶ２のそれと類似していると考えられ、豚疾患の誘導には１０７コピー／ｍｌを上回る高いＰＴＴＶ価が要求されるのだろう。この研究において開発された種特異的リアルタイムＰＣＲアッセイは、今後、さまざまな疾患状態から採取される多数の臨床試料を使ってＰＴＴＶと疾患との関連を調べるための簡単で実用的なツールになるだろう。
さらにまた、これら２つの種特異的シングルプレックス・アッセイを結びつけることにより、本発明者らは、ＭＣＡベースのデュプレックス・リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて２つの豚ＴＴＶ種ＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２を同時に検出し区別するための迅速で安価で信頼できるスクリーニングを開発し、検証した。このアッセイは両ＰＴＴＶ種の正確な定量を意図したものではないが、検出を目的とするなら、従来のネステッドＰＣＲに取って代わることのできる、より便利なアプローチである。リアルタイムＰＣＲと比較すると、豚ＴＴＶ検出のための従来のネステッドＰＣＲアッセイは、時間がかかり（合計４ラウンドのＰＣＲを必要とする）、面倒であり、複数ラウンドのＰＣＲ処理中に起こる試料汚染に見舞われやすい。ＰＴＴＶ１種とＰＴＴＶ２種の間のＴｍ値の相違ゆえに、デュプレックスＰＣＲ増幅後のＭＣＡにより、異なる反応特異性を確保することができる。このデュプレックス・リアルタイム・アッセイのもう一つの利点は、記載のプロトコールを行う際にＰＴＴＶ１標準とＰＴＴＶ２標準を含めることが必須でなくなる点であり、これにより、自動リアルタイムＰＣＲ機器を装備した診断検査室におけるはるかに幅広い使用が容易になる。
同じ種の異なる遺伝子型または亜型による豚ＴＴＶの多重感染は実証されている（ガレイ（Gallei）ら、２００９年、前掲書）。特に、本発明者らの以前の研究では、豚ＴＴＶ種１は、２つの異なる型ＰＴＴＶ１ａ（株Ｓｄ−ＴＴＶ３１およびＰＴＴＶ１ａ−ＶＡを含む）およびＰＴＴＶ１ｂ（株ＴＴＶ−１ｐおよびＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡを含む）からなることが示された。完全長ゲノムを持つ新たに公表された２つのＰＴＴＶ１分離株、カナダ由来のｓｗＳＴＨＹ−ＴＴ２７（ＧＱ１２０６６４）とドイツ由来のＴＴＶ１＃４７１８１９（ＧＵ１８８０４５）は、どちらも、系統解析に基づいて１ｂ型に分類された（データ未掲載）。この研究において記載するデュプレックス・ネステッドＰＣＲにより、２つのＰＴＴＶ１遺伝子型の二重感染は豚では頻繁に起こることが確認された。この新規アッセイは、ＰＴＴＶ１ａと１ｂを識別するために現在までに開発された最初の診断的ＰＣＲアプローチである。ＰＴＴＶ１ａ感染とＰＴＴＶ１ｂ感染の一方または両方が疾患と関連する関連要因を表すかどうかは現時点ではわかっていないので、本発明者らの区別的ＰＣＲアッセイは、これら２つのＰＴＴＶ型の今後の潜在的疾患関連性にとって、大いに価値があるはずである。
本発明のもう一つの態様では、豚ＴＴＶ ＯＲＦタンパク質を発現させ、豚ＴＴＶ特異的抗体の存在を検出するための免疫検出アッセイにおいて使用した。本発明の一実施形態では、ＰＴＴＶ１ａ、ＰＴＴＶ１ｂおよびＰＴＴＶ２の３つの切断型ヒスチジンタグ付きＯＲＦ１タンパク質を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で、それぞれ発現させた。さらにまた、これらの組換え抗原に基づく血清ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイを開発し、異なる供給源からの豚血清試料を使って検証した。特に、ＰＴＴＶ１ａ特異的、ＰＴＴＶ１ｂ特異的およびＰＴＴＶ２特異的ＥＬＩＳＡを使った血清検査は、豚ＴＴＶ感染と疾患との関連を明らかにするための正確で簡単なツールになる。
本発明のさらなる一態様では、豚ＴＴＶ ＯＲＦタンパク質を、大腸菌発現系において、組換えＯＲＦ１キャプシドタンパク質として発現させ、精製した（図１０、図１５）。ＰＴＴＶ１ａ、ＰＴＴＶ１ｂおよびＰＴＴＶ２の３つの切断型Ｈｉｓタグ付きＯＲＦ１タンパク質を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で、それぞれ発現させ、精製し、ＰＴＴＶ感染に対する組換えキャプシドサブユニットワクチンとして利用した。
４つの豚ＴＴＶ２株、ＴＴＶ−２ｐ、ＴＴＶ２＃４７２１４２、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡおよびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡは、現在までに、利用可能な完全ゲノム配列を持っていた。それらは系統学的に３つの予測亜型に分類されるが、４つのＰＴＴＶ２に由来するアミノ酸をコードするＯＲＦ１の親水性プロファイルの比較分析により、それらは３つの親水性領域、すなわちＮ末端にあるａａ１〜４９のアルギニンリッチ領域と、それぞれ中央部とＣ末端部に位置する２つの特定ドメイン（ＩおよびＩＩ）を共有することが示された（図９Ａ）。切断型ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ ＯＲＦ１発現に使用したＣ末端領域と、他の３つのＰＴＴＶ２株において共有されている対応領域を、破線の枠で示した。アミノ酸配列のアラインメントにより、４つのＰＴＴＶ２株間でのドメインＩ（ａａ３２２−３４９）およびＩＩ（ａａ５３６−６２５）の高レベルな配列保存が示された（図９Ｂ）。
親水性ドメインは多くのタンパク質の抗原性にとって重要であると考えられるので、上記２つのドメインを含有するＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ ＯＲＦ１ 配列番号１６のＣ末端領域（ａａ３１０−６２５）を、豚血清におけるＰＴＴＶ２特異的抗体検出用の抗原として使用されるタンパク質発現のために選択した。本発明の一態様によれば、切断型ＰＴＴＶ２ｃ ＯＲＦ１の発現は、全てのＰＴＴＶ２亜型（２ａ、２ｂおよび２ｃ；図３Ａも参照されたい）を検出するのに十分であった。
本発明の一実施形態では、８×Ｈｉｓタグと融合したＰＴＴＶ２ｃ ＯＲＦ１遺伝子のＣ末端部分を構築し、大腸菌中で発現させた。組換えタンパク質は不溶性であり、細菌封入体内に発現した。図１０Ａは、未精製２ｃ−ＯＲＦ１産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１０Ｂは、精製２ｃ−ＯＲＦ１産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１０Ｃは、抗ＨｉｓタグｍＡｂを使った精製２ｃ−ＯＲＦ１産物のウェスタンブロット分析を示す。白い矢じりは、予期されるサイズを持つＯＲＦ１タンパク質とその切断産物を示し、一方、黒い矢じりは、予期される切断型タンパク質の予測二量体を示す。Ｍ：タンパク質マーカー。図１０Ａにおいて、２ｃ−ＯＲＦ１未精製試料では、対照試料と比較して、２つの際立ったポリペプチド（白い矢じり）が生成していた。約４０ＫＤａのバンドは２ｃ−ＯＲＦ１の予期されるサイズと一致し、一方、約３０ＫＤａポリペプチドは、おそらく、前者からのＮ末端切断産物であった。ニッケルアフィニティカラムによる精製後に、２つの前記際立ったバンドを含む４つのポリペプチドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに示された（図１０Ｂ）。それらは、抗ＨｉｓタグｍＡｂを用いるウェスタンブロットでも検出された（図１０Ｃ）。２つの高分子量バンド（黒い矢じり）は、予想されるサイズ（約８０ＫＤａおよび約６０ＫＤａ）によれば、それぞれ約４０ＫＤａおよび約３０ＫＤａの２つのポリペプチドによって形成されるホモ二量体だった。これらの結果から、精製Ｃ末端ＰＴＴＶ２ｃ−ＯＲＦ１がうまく生産され、豚血清中の豚ＴＴＶ２抗体検出に使用できることが証明された。
本発明のもう一つの態様によれば、さまざまな豚血清試料における豚ＴＴＶ２抗体を、精製Ｃ末端ＰＴＴＶ２ｃ−ＯＲＦ１を使ったウェスタンブロットによって検出することができる。白い矢じりは、予期されるサイズを持つＯＲＦ１タンパク質とその切断産物を示す。緑色のバンドだけが陽性と認識されることに注意すべきである。さまざまな供給源から得た在来豚（健常または罹患）、ＣＤ／ＣＤ豚およびノトバイオート豚の血清試料を全部で２００個以上収集した。抗原として精製Ｃ末端ＰＴＴＶ２ｃ−ＯＲＦ１を使って抗ＰＴＴＶ２ｃ−ＯＲＦ１ ＩｇＧ抗体を検出するために、試料をランダムに選択した。図１１Ａは、在来豚の選ばれた豚血清試料のウェスタン分析の結果を示し、図１１ＢはＣＤ／ＣＤ豚を示し、図１１Ｃはノトバイオート豚を示す。精製ＰＴＴＶ２ｃ−ＯＲＦ１産物を抗原として使用した。印を付けた約４０ＫＤａと約３０ＫＤａの２つのバンドは、在来豚（図１１Ａ）およびＣＤ／ＣＤ豚（図１１Ｂ）の試料の大半に検出されたことから、これらの豚におけるＰＴＴＶ２感染が幅広く示された。しかし、２つの異なる供給源（バージニア州ブラックスバーグおよびアイオワ州エイムズ）から得たノトバイオート豚はいずれも、検出可能なＰＴＴＶ２抗体を持っていなかった（図１１Ｃ）。別の低分子量バンドも観察された（図１１Ａおよび１１Ｂ）。それらはおそらくウェスタンブロットにおける非特異的反応性に由来したのだろう。
本発明のさらにもう一つの態様によれば、ＰＴＴＶ２特異的ＥＬＩＳＡを、豚ＴＴＶ２血清検査として使用することができる。血清陰性結果は、ウィスコンシンの飼育場の在来豚からの数個の試料にも示された（図１２）。これらの陰性試料をプールし、ＰＴＴＶ２特異的ＥＬＩＳＡの開発において陰性参照として使用した。同じ供給源から得られた残りの試料は陽性だった（図１２、左側の４レーン）。また、細胞培養に使用される営利会社から得た豚血清（ＯＩＥ疾患フリーと考えられる）も、強い抗ＰＴＴＶ２−ＯＲＦ２陽性を示し（図１２）、これをＥＬＩＳＡの陽性対照として使用した。精製２ｃ−ＯＲＦ１抗原、豚血清およびＩｇＧコンジュゲートの濃度は、交差力価測定法により、低いバックグラウンドシグナルを呈し、陽性対照と陰性対照とのＯＤ４０５値の差が最も大きくなるように決定した。最適な抗原量は１ウェルあたり６９ｎｇであり、最適なＥＬＩＳＡ結果は、血清試料の１：１００希釈液およびＩｇＧコンジュゲートの１：４０００希釈液を使用することによって得られた。ＥＬＩＳＡカットオフ値は各試行において０．２５〜０．５の範囲にあった。図４は、血清ウェスタンブロットと開発されたＥＬＩＳＡとの整合性を反映した代表的結果を示す。
３つの群れから得た１３８個の在来豚血清試料を選んで、リアルタイムＰＣＲによるＰＴＴＶ２ウイルス負荷量とＥＬＩＳＡによる抗ＰＴＴＶ２ＩｇＧ抗体レベルの間の相関関係を分析した。その結果、検出不可能であるか高いＰＴＴＶ２ウイルス負荷量（１０８コピー／ｍｌ）を持つ豚の方が、中間的な値のＰＴＴＶ２ウイルス負荷量を持つ豚よりも低い血清ＰＴＴＶ２抗体価を持つ可能性が高いことが示された（図１３）。
特に、同じ群れの豚１０頭からの血清を、それらが新しい施設に到着した時から到着の２ヶ月後まで、それらの血清のＰＴＴＶ２ウイルス負荷量と抗ＰＴＴＶ２抗体レベルとを比較することによっても分析した。１０頭中９頭の豚は２ヶ月後にウイルス負荷量が減少していた（３頭は検出可能なウイルスを持っていなかった）が、抗ＰＴＴＶ２抗体価は１０頭中９頭の豚において増加していた（図１４Ａおよび１４Ｂ）。これらの結果から、１０頭の豚は早期にＰＴＴＶ２感染を獲得し、それが体液性応答を誘導して、徐々に抗ＯＲＦ１キャプシドＩｇＧ抗体を産生したことが示唆された。ＰＴＴＶ２−ＯＲＦ１ ＩｇＧ抗体は、ウイルスを中和することができ、またはウイルスを除去することさえできたことから、ＯＲＦ１が実際にウイルスキャプシドタンパク質をコードし、ＰＴＴＶ２に対する中和エピトープを含有し得ることが示された。
本発明の一実施形態では、Ｃ末端ＰＴＴＶ１ａ−およびＰＴＴＶ１ｂ−ＯＲＦ１タンパク質を、それぞれ大腸菌系で発現させ、精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、抗ＨｉｓタグｍＡｂを使ったウェスタンブロット分析により、１ａ−ＯＲＦ産物と１ｂ−ＯＲＦ産物はどちらも２つのポリペプチドを生じ、一つは予期されるサイズのもの（約４０ＫＤａ）、もう一つは予測ホモ二量体（約８０ＫＤａ）であることが示された（図１５Ａ〜Ｃ）。図１５Ａは、未精製および精製１ａ−ＯＲＦ１産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１５Ｂは、精製１ｂ−ＯＲＦ１および１ｂ−ＯＲＦ１ｃｔｒｕｃ産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１５Ｃは、抗ＨｉｓタグｍＡｂを使った精製１ａ−および１ｂ−ＯＲＦ１産物のウェスタンブロット分析を示す。白い矢じりは予期されるサイズのＯＲＦ１タンパク質を示し、一方、黒い矢じりはＯＲＦ１タンパク質の予測二量体を示す。２ｃ−ＯＲＦ１発現と比較して、切断型ポリペプチドは観察されなかった。比較対照として、Ｃ末端切断型１ｂ−ＯＲＦ１領域（１ｂ−ＯＲＦ１ｃｔｒｕｃ）の発現は、そのＣ末端非切断対応物１ｂ−ＯＲＦ１と比較して、低分子量ポリペプチドをもたらした（図１５Ｂ）。
本発明の一実施形態では、ＰＴＴＶ２について上述したように、精製Ｃ末端ＰＴＴＶ１ａ−およびＰＴＴＶ１ｂ−ＯＲＦ１タンパク質を使って、遺伝子型特異的な血清ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡを開発した。図１６は、１ａ−ＯＲＦ１を抗原として用いる血清ウェスタンブロットの陰性例（レーン１〜２）と陽性例（レーン３〜５）を示す。ＰＴＴＶ１ａ特異的およびＰＴＴＶ１ｂ特異的ＥＬＩＳＡでは、ＰＴＴＶ２−ＯＲＦ１と同じ抗原量（６９ｎｇ）、血清の希釈度（１：１００）およびＩｇＧコンジュゲートの希釈度（１：４０００）を使用した（データ未掲載）。
さらに本発明は、豚ＴＴＶ感染を検出するための有用な診断試薬であって、例えば豚に豚ＴＴＶまたは本発明の免疫原性組成物を有効免疫原量で接種してウイルス感染を生じさせ、感染した豚の血清から抗体を回収することなどによって自然宿主から精製された、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む診断試薬を提供する。あるいは、単離された豚ＴＴＶのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列または免疫原性フラグメントに由来する、またはそこから発現される、天然または合成ポリペプチドに対して、実験動物において、抗体を産生させることもできる。例えば、モノクローナル抗体は、単離された豚ＴＴＶのヌクレオチド配列に由来するポリペプチド抗原で免疫化された例えばＢａｌｂ／ｃなどのマウスから得られるハイブリドーマ細胞から産生され得る。ハイブリドーマ細胞の選択は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）または最小必須培地のような標準的細胞培養培地に入れたハイプロキサンチン（ｈｙｐｒｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、チミジンおよびアミノプテリン中で成長させることによって行う。抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、当技術分野において知られている手法に従ってクローン化することができる。次に、形成される離散コロニーを、適切な培養培地で培養するために、培養プレートの別々のウェルに移すことができる。抗体分泌細胞の同定は、適当な抗原または免疫原を使って、従来のスクリーニング法によって行われる。ハイブリドーマ細胞をインビトロで培養するか、ハイブリドーマの注入後にマウスの腹水を得ることにより、インビボで培養することで、所望のモノクローナル抗体が周知の技法で生産される。
もう一つの代替的方法では、当技術分野において知られている手法に従って、豚ＴＴＶキャプシドタンパク質をバキュロウイルス発現系または大腸菌発現系で発現させることができる。発現した組換え豚ＴＴＶキャプシドタンパク質は、診断用の抗原として、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において使用することができる。豚組換えキャプシド抗原に基づくＥＬＩＳＡアッセイは、例えば、豚および哺乳動物種における豚ＴＴＶに対する抗体を検出するために使用することができる。ＥＬＩＳＡアッセイは好ましいものの、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ペルオキシダーゼアッセイ（ＩＰＡ）などといった他の既知の診断検査も使用することができる。
望ましくは、豚における豚ＴＴＶ感染を診断するために、本発明による市販のＥＬＩＳＡ診断アッセイを使用することができる。豚ＴＴＶの精製ＯＲＦ１およびＯＲＦ２タンパク質を使った、豚における抗ＴＴＶ抗体を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイの開発を、実施例に例示する。豚ＴＴＶに感染した豚から集めた血清と、対照豚から得た陰性血清とを使って、アッセイを検証する。ＰＴＴＶ２特異的抗体、ＰＴＴＶ１ａ特異的抗体、およびＰＴＴＶ１ｂ特異的抗体が、ＰＴＴＶ ＯＲＦタンパク質を特異的に認識することが証明された。当業者に知られる技法による検査のさらなる標準化により、豚ＴＴＶに関する診断アッセイの商品化を最適化することができる。
本発明のもう一つの態様は、分離された豚ＴＴＶまたは上述の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる抗原タンパク質を含むユニークな免疫原組成物、および抗体を産生または生産するためのその使用である。組成物は、無毒性の生理学的に許容される担体と、場合によっては、１つ以上のアジュバントとを含有する。適切な担体、例えば水、食塩水、エタノール、エチレングリコール、グリセロールなどは、従来の賦形剤から容易に選択され、共製剤化剤を加えることができる。最終組成物の物理的適合性および安定性を保証するために、日常的検査を行うことができる。
本発明によれば、豚トルクテノ（ＴＴＶ）の感染性分子および核酸分子、その核酸分子から産生される生ウイルス、および豚ＴＴＶウイルス感染または豚ＴＴＶと他のウイルスとの同時感染が引き起こす疾患から豚を保護するための動物用ワクチンが、さらに提供される。本発明はさらに、ワクチンとして使用することができる免疫原性ポリペプチド発現産物を提供する。
豚ＴＴＶの新規感染性ＤＮＡ分子は、感染性ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ（配列番号９）、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ（配列番号１０）、ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ（配列番号１１）、またはＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ（配列番号１２）ゲノムの少なくとも一部をコードする核酸分子を含む。感染性ＰＴＴＶ ＤＮＡクローンは、好ましくは、ＰＴＴＶ１またはＰＴＴＶ２のＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ１／１、およびＯＲＦ２／２遺伝子の少なくとも一つを含有する。複数コピーのＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ（配列番号９）、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ（配列番号１０）、ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ（配列番号１１）、またはＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ（配列番号１２）ゲノムを、単一のＤＮＡ分子に挿入して、タンデム感染性ＰＴＴＶクローンを構築してもよい。
本明細書に記載するＰＴＴＶ、特にＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ、およびタンデムＰＴＴＶ２ｂ−ＲＲ、ＰＴＴＶ２ｃ−ＲＲのクローニングされたゲノムＤＮＡは、ＰＫ−１５細胞にトランスフェクトして豚に与えた場合に、インビトロまたはインビボで感染性であることが示される。この新しい、容易に再現できる病原因子は、豚におけるＰＴＴＶ感染を予防するための適切なワクチン接種プログラムの開発に向いている。
本発明のさらなる一実施形態では、３つの１ゲノムコピーＰＴＴＶ ＤＮＡクローンを、それぞれ原型米国分離株ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡおよびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡから、融合ＰＣＲ（ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ）によって誘導した。完全長ゲノムＤＮＡのそれぞれを、平滑末端ライゲーションによって、クローニングベクターｐＳＣ−Ｂ−ａｍｐ／ｋａｎに挿入した。制限部位ＢａｍＨＩは、３つのＰＴＴＶゲノム上のユニーク部位であり、これは、コンカテマーの生成を容易にし、したがってＴＴＶ環状ゲノムを模倣するために、３つのゲノムの両端に工学的に作製されたものである。各クローンの選ばれたプラスミドＤＮＡのＢａｍＨＩ単独消化は、明らかに、サイズが４．３Ｋｂと２．８Ｋｂの二つの異なるフラグメントをもたらした（図１８Ａ）。４．３Ｋｂフラグメントがバックボーンベクターに相当し、一方で２．８Ｋｂフラグメントは、挿入されたＰＴＴＶゲノムＤＮＡに相当した。同じ酵素だけで消化した空ベクターｐＳＣ−Ｂ−ａｍｐ／ｋａｎは、４．３Ｋｂバンドを示した（図１８Ａ）。得られたＰＴＴＶクローンを、それぞれｐＳＣ−ＰＴＴＶ１ａ、ｐＳＣ−ＰＴＴＶ１ｂおよびｐＳＣ−ＰＴＴＶ２ｃと名付けた（図１７Ａ〜Ｃ）。
さらにまた、クローンｐＳＣ−ＰＴＴＶ２ｃから得られる２コピーの完全長ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡゲノムを、ｐＳＣ−Ｂ−ａｍｐ／ｋａｎベクター中に、直列にライゲーションして、クローンｐＳＣ−２ＰＴＴＶ２ｃ−ＲＲ（図１７Ｄ）を作製した。ｐＳＣ−ＰＴＴＶ２ｃとｐＳＣ−２ＰＴＴＶ２ｃ−ＲＲのＡｆｌＩＩ単独消化パターンを比較したところ、後者のプラスミドは、ＰＴＴＶ２ｃゲノムの２つめのコピーに相当する追加の２．８Ｋｂフラグメントを有することがわかった（図１８Ｂ、右側）。次に、本発明者らは同じクローニング戦略を利用して、ドイツＴＴＶクローンＴＴＶ２−＃４７１９４２−ｆｕｌｌから、タンデム二量体化ＰＴＴＶ２ｂ ＤＮＡクローンを作製した。ｐＳＣ−２ＰＴＴＶ２ｂ−ＲＲ（図１７Ｆ）と名付けたこのコンストラクトには、これをＨｉｎｄＩＩＩだけで消化して、その１ゲノムコピー対応物と比較した場合に、ＰＴＴＶ２ｂゲノムの２つ目のコピーに相当する追加の２．８Ｋｂフラグメントが存在したことから（図１８Ｂ、左側）、構築の成功が確認された。
構築したＰＴＴＶ感染性クローンの複製能を、ＰＫ−１５細胞のインビトロ・トランスフェクションによって調べた。業者が作製したＰＴＴＶ２ｃＯＲＦ１に対するウサギポリクローナル抗体を用いるＩＦＡにより、クローンＴＴＶ２−＃４７１９４２−ｆｕｌｌとｐＳＣ−ＰＴＴＶ２ｃのコンカテマーはどちらも、それぞれ複製能を有することが確認された（図１９Ａおよび図２０Ａ）。トランスフェクト細胞の継代では、蛍光シグナルが排除されず減少もしなかったことから（図１９Ｂおよび図２０Ｂ）、ＯＲＦ１タンパク質の発現は、天然のＰＴＴＶ２ｂまたはＰＴＴＶ２ｃ環状分子を模倣したＰＴＴＶ２コンカテマーからもたらされることが示唆された。モックトランスフェクト細胞、またはＩＦＡ検出用の抗体として免疫前ウサギ血清を使用したＤＮＡトランスフェクト細胞には、蛍光シグナルが観察されなかった（データ未掲載）。クローンｐＳＣ−ＰＴＴＶ１ａのコンカテマーも複製能を有することが抗ＰＴＴＶ１ａ ＯＲＦ１抗体を使って示された（図２１）。陽性蛍光シグナルは、トランスフェクト細胞または継代細胞の核に位置することから、豚ＴＴＶは細胞核内で複製するらしいことが示された。豚サーコウイルス（ＰＣＶ）はインビトロで類似の発現パターンを有するので、これは予期されないことではない。
ＰＫ−１５細胞におけるタンデム二量体化クローンｐＳＣ−２ＰＴＴＶ２ｂ−ＲＲまたはｐＳＣ−２ＰＴＴＶ２ｃ−ＲＲの直接トランスフェクションは、ウイルス複製をもたらし、ＯＲＦ１キャプシド抗原を産生する。ＰＴＴＶ２ ＯＲＦ１に対する抗体を使ったＩＦＡにより、どちらのクローンも複製能を有し、陽性ＯＲＦ１抗原は核内に局在化することが確認された（図２２ＡおよびＢ）。
本発明の一実施形態によれば、豚ＴＴＶの感染性クローンを使って豚に接種することができる。それは次に、宿主動物の免疫応答を引きだし、中和抗体の産生を刺激するであろう。本発明のある特定実施形態において、２つのタンデム二量体化ＰＴＴＶ２クローンを在来豚のリンパ節および筋中に注射したところ、それらは感染性であった。
ＰＴＴＶ２分子クローンのインビボ感染性を調べるために、在来豚に、クローンｐＳＣ−２ＴＴＶ２ｂ−ＲＲまたはｐＳＣ−２ＴＴＶ２ｃ−ＲＲを接種した。接種後０、７、１４、２１および２８日目（０、７、１４、２１および２８ＤＰＩ）に動物から血清試料を集めた。ＰＴＴＶ２ ＤＮＡは、ｐＳＣ−２ＴＴＶ２ｃ−ＲＲ接種豚では、７ＤＰＩ以降（＃９２）、１４ＤＰＩ以降（＃１８８および＃１９１）および２１ＤＰＩ以降（＃１８０）に、それぞれ検出された（図２３Ａ、右側）。クローンｐＳＣ−２ＴＴＶ２ｂ−ＲＲを接種した豚では、ＰＴＴＶウイルス血症が遅れて現れ、２頭は１４ＤＰＩ以降（＃１８９および＃１９２）、１頭は２１ＤＰＩ以降（＃１８１）、１頭は２８ＤＰＩ以降（＃１９３）だった（図２３Ａ、左側）。ＰＴＴＶ２特異的リアルタイムＰＣＲで決定したところ、ウイルス負荷量は、接種した全ての豚において、時間の経過と共に増加し、ウイルス負荷量は剖検前の２８ＤＰＩが最も高かった（図２３Ａ）。選ばれた豚から増幅されたリアルタイムＰＣＲ産物を配列決定したところ、ｐＳＣ−２ＴＴＶ２ｂ−ＲＲまたはｐＳＣ−２ＴＴＶ２ｃ−ＲＲの対応する領域と同一の配列を有することがわかった（データ未掲載）。
接種された全ての豚は、０ＤＰＩおよび７ＤＰＩでは、ＰＴＴＶ２ ＯＲＦ１抗体に関して陰性だった。４頭のｐＳＣ−２ＴＴＶ２ｂ−ＲＲ接種豚の全てが１４ＤＰＩにおいて抗ＰＴＴＶ２ ＯＲＦ１ ＩｇＧ陽性に血清転換したのに対し、ｐＳＣ−２ＴＴＶ２ｃ−ＲＲ接種群の豚は、１４（＃９２および＃１８０）、２１（＃１９１）および２８（＃１８８）ＤＰＩにおいて、それぞれ血清転換した（図２３Ｂ）。これらの結果は、活動性の豚ＴＴＶ２ｂまたはＴＴＶ２ｃ感染が起こったことを示した。
感染性ウイルスおよび分子ＤＮＡクローンのワクチン、ならびにそれらを使用する方法も、本発明の範囲に包含される。接種された豚は、ウイルス感染およびＴＴＶ２感染または同時感染によって引き起こされる関連疾患から防御される。この新規方法では、ウイルス感染から防御する必要がある豚を、その豚に、免疫学的有効量の本発明のワクチン（例えば、免疫原量の感染性ＰＴＴＶ ＤＮＡ、ＰＴＴＶの感染性ＤＮＡクローンを含有するプラスミドまたはウイルスベクター、組換えＰＴＴＶ ＤＮＡ、ポリペプチド発現産物、細菌発現またはバキュロウイルス発現精製組換えＯＲＦ１キャプシドタンパク質を含むワクチンなど）を投与することによって防御する。広範囲にわたるウイルス感染からの防御が得られるように、他の抗原、例えばＰＲＲＳＶ、ＰＰＶ、他の感染性豚因子および免疫刺激物質を、豚に同時投与してもよい。
ワクチンは、例えば、無毒性の生理学的に許容される担体および場合によっては１つ以上のアジュバントと組み合わされた、感染性ウイルスおよび分子ＤＮＡクローン、例えばｐＳＣ−Ｂベクターなどの適切なプラスミドまたはベクター中のクローン化ＰＴＴＶ感染性ＤＮＡゲノム、無発病性生ウイルス、不活化ウイルス、発現された組換えキャプシドサブユニットワクチンなどを含む。ワクチンは、本明細書に記載の感染性ＴＴＶ２分子ＤＮＡクローンも含み得る。感染性ＰＴＴＶ ＤＮＡ、感染性ウイルスゲノムを含有するプラスミドＤＮＡ、および生ウイルスは好ましく、生ウイルスは最も好ましい。毒性状態に復帰するリスクを冒す弱毒化生ウイルスを使用するか、ウイルス疾患からの防御にとって十分な抗体免疫応答を誘導しない可能性がある死滅細胞培養増殖全ウイルスを使用する従来のウイルスワクチンと比較して、本発明の無発病性生ウイルスワクチンは有利である。
ワクチンおよびそれらを使用する方法も本発明の範囲に包含される。接種された哺乳動物種は、重症ウイルス感染から防御され、ＰＴＴＶの同時感染に関係する疾患、例えば豚皮膚炎腎症症候群（ＰＤＮＳ）、離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）、および他の関連疾病からも防御され得る。ワクチンは、例えば、不活化または弱毒化豚ＴＴＶウイルス、無毒性の生理学的に許容される担体、および場合によっては、１つ以上のアジュバントを含む。
本発明のワクチンと一緒に投与し得るアジュバントは、ワクチンに対する豚の免疫学的応答を増加させる物質である。アジュバントは、ワクチンと同時に同じ部位に投与するか、異なる時点で、例えばブースターとして投与することができる。アジュバントは、ワクチンを投与する方法とは異なる方法で投与すること、またはワクチンを投与する部位とは異なる部位に投与することが、有利な場合もある。適切なアジュバントには、例えば水酸化アルミニウム（アラム）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、非イオン性ブロックポリマーまたはコポリマー、サイトカイン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなど）、サポニン、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）などがあるが、これらに限るわけではない。他の適切なアジュバントには、例えば硫酸アルミニウムカリウム、大腸菌由来の非耐熱性または耐熱性エンテロトキシン、コレラ毒素またはそのＢサブユニット、ジフテリア毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、フロイント不完全または完全アジュバントなどがある。ジフテリア毒素、破傷風毒素および百日咳毒素などの毒素ベースのアジュバントは、使用前に、例えばホルムアルデヒドで処理することなどによって不活化することができる。
ワクチンはさらに、感染性ＰＴＴＶ ＤＮＡクローンの免疫学的活性を増進するために、例えば豚繁殖呼吸器病症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、豚パルボウイルス（ＰＰＶ）、他の感染性豚因子および免疫刺激物質などといった追加の抗原を含有してもよい。
本発明の新しいワクチンは、どの特定のタイプまたは製造方法にも限定されない。クローン化ウイルスワクチンには、例えば感染性ＤＮＡワクチン（すなわち、豚にＤＮＡを直接注入するためにプラスミド、ベクターまたは他の従来の担体を使用するもの）、生ワクチン、改変生ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、弱毒化ワクチン、遺伝子操作ワクチンなどが含まれるが、これらに限るわけではない。これらのワクチンは当技術分野において知られている標準的方法によって製造される。
さらにもう一つの利点として、本発明の好ましい生ウイルスは、製造、貯蔵および搬送が他のタイプの弱毒化ワクチンよりも容易な、遺伝子的に安定なワクチンを与える。
本発明のもう一つの好ましいワクチンでは、非病原性ＤＮＡクローンを豚に送達するために、適切なプラスミドを利用する。生または死滅細胞培養増殖全ウイルスを使用する従来のワクチンとは対照的に、この発明では、感染性ウイルスゲノムを含有するプラスミドＤＮＡによる豚の直接接種が可能である。
本発明において望ましいさらなる遺伝子操作ワクチンは、当技術分野において知られている技法によって製造される。そのような技法は、例えば組換えＤＮＡのさらなる操作、組換えタンパク質のアミノ酸配列の修飾または置換などを伴うが、これらに限るわけではない。
組換えＤＮＡ技術に基づく遺伝子操作ワクチンは、例えば、豚において、より強い免疫応答または防御応答を誘導する原因になるタンパク質（例えばＯＲＦ１、ＯＲＦ１／１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ２／２に由来するタンパク質など）をコードするウイルス遺伝子の代替的部分を同定することによって作製される。同定されたそのような遺伝子または免疫優性フラグメントは、バキュロウイルスベクターなどの標準的タンパク質発現ベクターにクローニングし、それを使って適当な宿主細胞を感染させることができる（例えばオライリー（O’Reilly）ら、「バキュロウイルス発現ベクター：ア・ラブ・マニュアル（Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual）」、フリーマン・アンド・カンパニー（Freeman & Co.）、１９９２年を参照されたい）。宿主細胞を培養することで所望のワクチンタンパク質を発現させ、それを所望する程度にまで精製し、適切なワクチン製品へと製剤化することができる。組換えサブユニットワクチンは、ＰＴＴＶ１ａ、ＰＴＴＶ１ｂおよびＰＴＴＶ２の細菌発現（図１０、図１５）またはバキュロウイルス発現ＯＲＦ１キャプシドタンパク質に基づく。
疾患を引き起こすという望ましくない天然の能力をクローンが少しでも保っている場合は、残存ビルレンスの原因になっているウイルスゲノム中のヌクレオチド配列を特定し、例えば部位特異的突然変異導入法などにより、ウイルスを遺伝子操作して無発病性にすることもできる。部位特異的突然変異導入法では、１つ以上のヌクレオチドを付加、削除または改変することができる（例えば、ツェラー（Zoller）ら、ＤＮＡ ３：４７９−４８８、１９８４を参照されたい）。所望の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドを合成し、一本鎖ウイルスＤＮＡの一部にアニールさせる。この手順によって生じるハイブリッド分子を使って細菌を形質転換する。次に、適当な突然変異を含有する単離された二本鎖ＤＮＡを使って、完全長ＤＮＡの制限フラグメントにライゲーションすることによって、完全長ＤＮＡを作製し、次にそれを適切な細胞培養中にトランスフェクトする。適切な導入用ベクターへのゲノムのライゲーションは、当業者に知られる任意の標準的技法によって達成することができる。ウイルス子孫を生産するための宿主細胞へのベクターのトランスフェクションは、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合および他の周知の技法など、従来の方法のどれを使って行ってもよい（例えばサムブルック（Sambrook）ら、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年を参照されたい）。クローニングされたウイルスは所望の突然変異を示す。あるいは、適当な突然変異を含有する２つのオリゴヌクレオチドを合成することもできる。これらをアニールさせて二本鎖ＤＮＡを形成させ、それをウイルスＤＮＡに挿入して、完全長ＤＮＡを作製することができる。
免疫学的有効量の本発明のワクチンを、ウイルス感染からの防御を必要とする豚に投与する。豚に接種する免疫学的有効量または免疫原量は、日常的試験により、容易に決定することができ、または迅速に漸増することができる。有効量とは、ＰＴＴＶウイルスにばく露された豚を保護するのに十分な、ワクチンに対する免疫学的応答が得られる量である。好ましくは、豚は、ウイルス疾患の有害な生理学的症状または影響の１つから全部が有意に低減するか、改善するか、完全に防止される程度にまで保護される。
ワクチンは、単回投与するか、反復投与することができる。投薬量は、例えば約１マイクログラム〜約１，０００マイクログラムの範囲の感染性キメラＤＮＡゲノムを含有するプラスミドＤＮＡ（ワクチンの免疫活性構成成分の濃度に依存する）、好ましくは１００〜２００マイクログラムの範囲の豚ＴＴＶ ＤＮＡクローンであり得るが、ウイルス感染の有害反応または生理学的症状をもたらすのに十分であるような量のウイルスに基づく抗原を含有してはならない。豚の体重、抗原の濃度および他の典型的要因に基づいて最低有効投薬量を見いだすために、活性抗原性因子の適切な投薬量を決定または漸増するための方法は、当技術分野において知られている。好ましくは、感染性ウイルスＤＮＡクローンをワクチンとして使用するか、生感染性ウイルスをインビトロで作製してから、その生ウイルスをワクチンとして使用することができる。その場合、例えば約５０〜約１０，０００の５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の生ウイルスを、豚に与えることができる。
本発明の新しいワクチンは、どの特定のタイプまたは製造方法にも限定されない。ワクチンには、改変生ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、弱毒化ワクチン、遺伝子操作ワクチンなどが含まれるが、これらに限るわけではない。
生ワクチンの利点は、全身性免疫応答、局所免疫応答、体液性免疫応答および細胞性免疫応答を含む、考え得る全ての免疫応答がワクチンの受容者において活性化されることである。利点を上回り得る生ウイルスワクチンの欠点は、生付随ウイルス因子による汚染の可能性またはウイルスが野外で先祖返りしてビルレンスを持つようになり得る危険にある。
不活化ウイルスワクチンを製造するには、例えば限定するわけではないがＰＫ−１５細胞などの培養豚細胞中で、ウイルス増殖およびウイルス生産を行うことができる。次に、当業者に一般に知られているプロトコールによって、または好ましくは本明細書に記載する方法によって、一連のウイルス不活化を最適化する。
不活化ウイルスワクチンは、豚ＴＴＶをホルマリンまたは疎水性溶媒、酸などの不活化剤で処理すること、紫外線またはＸ線を照射すること、加熱することなどによって、製造することができる。不活化は当技術分野において理解されているやり方で行われる。例えば化学的不活化では、適切なウイルス試料またはウイルスを含有する血清試料を、ウイルスを不活化するために、十分に高い（または不活化剤によっては低い）温度またはｐＨにおいて十分な量または濃度の不活化剤で十分な時間処理する。加熱による不活化は、ウイルスを不活化するのに十分な温度および時間行われる。照射による不活化は、ある光の波長または他のエネルギー源を使って、ウイルスを不活化するのに十分な時間行われる。ウイルスは、それが、感染を起こしやすい細胞に感染することができなくなれば、不活化されたと見なされる。
サブユニットワクチンの製造は、典型的には、改変生ワクチンまたは不活化ワクチンの製造とは異なる。サブユニットワクチンの製造に先だって、ワクチンの防御構成成分または抗原構成成分を同定しなければならない。本発明において、ＰＴＴＶの抗原構成成分は、ＰＴＴＶ１ａ、ＰＴＴＶ１ｂおよびＰＴＴＶ２のＯＲＦ１キャプシドタンパク質と同定され、これを本発明では、サブユニット組換えキャプシドワクチンとして使用するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバキュロウイルス発現系などの他の発現系で発現させ、精製した。そのような防御構成成分または抗原構成成分は、豚において特に強い防御応答または免疫学的応答を引き起こすウイルスキャプシドタンパク質の一定のアミノ酸セグメントまたはフラグメント；単一または複数のウイルスキャプシドタンパク質そのもの、そのオリゴマー、およびウイルスの部分構造またはそのような部分構造の同定可能な部分もしくはユニットを形成するウイルスキャプシドタンパク質の高次会合体；ウイルスの表面上もしくは表面近くに存在するか、ウイルスと会合しているリポタンパク質または脂質基などのウイルス部分構造中に存在する、オリゴグリコシド、糖脂質または糖タンパク質などを含む。好ましくは、ＯＲＦ１タンパク質をサブユニットワクチンの抗原構成成分として使用する。ＯＲＦ２、ＯＲＦ１／１、およびＯＲＦ２／２遺伝子中のヌクレオチド配列によってコードされるものなど、他のタンパク質も使用することができる。これらの免疫原構成成分は当技術分野において知られている方法により、すぐに同定することができる。ひとたび同定されたら、次に、ウイルスの防御部分または抗原部分（すなわち「サブユニット」）を、当技術分野において知られている手法で精製および／またはクローニングする。ウイルスの高精製サブユニットなどのサブユニットは全ウイルスよりも毒性が低いので、サブユニットワクチンには、生ウイルスに基づく他のワクチンをしのぐ利点がある。
組換え遺伝子技法によってサブユニットワクチンを製造する場合、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ１／１、およびＯＲＦ２／２遺伝子などといったクローン化サブユニットの発現は、例えば、上述の方法によって行うことができ、当業者に知られる方法によって最適化することもできる（例えばマニアティス（Maniatis）ら、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、マサチューセッツ州コールドスプリングハーバー、１９８９年を参照されたい）。一方、使おうとするサブユニットが、例えばキャプシドタンパク質全体など、ウイルスのインタクトな構造的特徴を表す場合は、ウイルスからそれを単離するための手法を最適化しなければならない。いずれにせよ、不活化プロトコールの最適化後には、製造に先だって、サブユニット精製プロトコールを最適化することができる。
弱毒化ワクチンを製造するには、生病原性ウイルスをまず最初に、当技術分野において知られている方法によって、または好ましくは本明細書に記載する方法によって、弱毒化する（非病原性または無害にする）。例えば弱毒化ウイルスは、有胚豚卵による新規連続継代を伴う本発明の技法によって調製することができる。弱毒化ウイルスは自然に見いだすことができ、天然の遺伝子欠失を有し得る。あるいは、遺伝子を欠失させるか遺伝子を突然変異させることによって、病原性ウイルスを弱毒化することもできる。弱毒化および不活化ウイルスワクチンは、本発明の好ましいワクチンを構成する。
本発明において同様に望ましい遺伝子操作ワクチンは、当技術分野において知られている技法によって作製される。そのような技法は、ＲＮＡ、組換えＤＮＡ、組換えタンパク質、生ウイルスの使用などを伴うが、これらに限るわけではない。
例えば、精製後に、野生型ウイルスは、感染した豚または感染した適切な細胞株を使って、血清、糞便、唾液、精液および組織試料などの適切な臨床生物学的試料から、当技術分野において知られている方法によって、好ましくは本明細書において教示する方法によって、単離することができる。生物学的に純粋なウイルスまたは感染性因子から当技術分野において知られている方法によってＤＮＡを抽出し、当技術分野において知られている方法によって、好ましくはＣｓＣｌ勾配における超遠心分離によって精製する。ウイルスゲノムのｃＤＮＡを、当技術分野において知られている方法によって、適切な宿主中にクローニングし（マニアティス（Maniatis）ら、同上）、次に、ウイルスゲノムを解析して、ウイルスの抗原部分を生産するのに不可欠なゲノムの領域を決定する。その後の手順は、改変生ワクチン、不活化ワクチンまたはサブユニットワクチンの場合と、おおむね同じである。
組換えＤＮＡ技術に基づく遺伝子操作ワクチンは、例えば、ウイルス遺伝子のうち、豚において、より強い免疫応答または防御応答を誘導する原因になるタンパク質（例えばＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ１／１、ＯＲＦ２／２に由来するタンパク質など）をコードする部分を同定することによって作製される。同定されたそのような遺伝子または免疫優性フラグメントは、バキュロウイルスベクターなどの標準的タンパク質発現ベクターにクローニングし、それを使って適当な宿主細胞を感染させることができる（例えばオライリー（O’Reilly）ら、「バキュロウイルス発現ベクター：ア・ラブ・マニュアル（Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual）」、フリーマン・アンド・カンパニー（Freeman & Co.）、１９９２年を参照されたい）。宿主細胞を培養することで所望のワクチンタンパク質を発現させ、それを所望する程度にまで精製し、適切なワクチン製品へと製剤化することができる。
ワクチンにおいて有用な遺伝子操作タンパク質は、例えば、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現させることができる。従来の方法によって精製または単離することができる遺伝子操作タンパク質は、豚ＴＴＶからの防御を付与するために、豚または哺乳動物種に直接接種することができる。
昆虫細胞株（例えばｓｆ９、ｓｆ２１、またはハイ・ファイブ（ＨＩＧＨ−ＦＩＶＥ））は、ウイルスから得られたまたはウイルスゲノムからコピーされたポリ核酸であってウイルスの免疫優性タンパク質の１つ以上をコードするものを含有する導入ベクターで、形質転換することができる。導入ベクターには、例えば、線状化バキュロウイルスＤＮＡおよび所望のポリヌクレオチドを含有するプラスミドが含まれる。宿主細胞株には、組換えバキュロウイルスを作製するために、線状化バキュロウイルスＤＮＡとプラスミドを同時トランスフェクトすることができる。
あるいは、分離された豚ＴＴＶのＤＮＡであって１つ以上のキャプシドタンパク質をコードするものを、ポックスウイルスまたはアデノウイルスなどの生ベクター中に挿入して、ワクチンとして使用することもできる。
本発明のワクチンの免疫学的有効量は、前記感染または症候群からの防御を必要とする豚または哺乳動物種に投与される。「免疫学的有効量」は、日常的試験により、容易に決定することができ、または迅速に漸増することができる。有効量とは、豚皮膚炎腎症症候群（ＰＤＮＳ）、離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）または関連疾病を引き起こし得る、豚ＴＴＶウイルスまたは豚ＴＴＶ同時感染にばく露された豚または他の哺乳動物を保護するのに十分な、ワクチンに対する免疫学的応答が得られる量である。好ましくは、豚または他の哺乳動物種は、ウイルス疾患の有害な生理学的症状または影響の１つから全部が有意に低減するか、改善するか、完全に防止されることが見いだされる程度にまで保護される。
ワクチンは、単回投与するか、反復投与することができる。投薬量は、例えば１〜１，０００マイクログラムのウイルスに基づく抗原（ワクチンの免疫活性構成成分の濃度に依存する）を含有し得るが、ウイルス感染の有害反応または生理学的症状をもたらすのに十分であるような量のウイルスに基づく抗原を含有してはならない。鳥または哺乳動物の体重、抗原の濃度および他の典型的要因に基づいて活性抗原性因子の適切な投薬量を決定または漸増するための方法は、当技術分野において知られている。
ワクチンは豚に投与することができる。ワクチンは、ウイルス因子に感染するリスクが高い養豚業者などのヒトに与えることもできる。豚ＴＴＶに基づくワクチンは、豚ＴＴＶおよびヒトＴＴＶの両方からの幅広い防御をもたらすように設計することができると考えられる。言い換えると、豚ＴＴＶに基づくワクチンは、好ましくは、いわゆる「ジェンナーの方法」（すなわち牛痘ウイルスワクチンは、エドワード・ジェンナー（Ｅｄｗａｒｄ Ｊｅｎｎｅｒ）により、ヒト痘瘡に対して使用することができる）によって、ヒトＴＴＶ感染を防御するように設計することができる。望ましくは、まだＴＴＶウイルスにばく露されていない豚または他の哺乳動物種に、ワクチンを直接投与する。ワクチンは、都合よく、例えば経口投与、口内投与、鼻腔内投与、経皮投与、非経口投与することができる。非経口投与経路には、筋肉内経路、静脈内経路、腹腔内経路および皮下経路が含まれるが、これらに限るわけではない。
液体として投与される場合、本ワクチンは、水性溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、チンキ剤などの形態に調製することができる。そのような製剤は当技術分野において知られており、典型的には、抗原および他の典型的添加剤を適当な担体または溶媒系に溶解することによって調製される。適切な担体または溶媒には、例えば水、食塩水、エタノール、エチレングリコール、グリセロールなどがあるが、これらに限るわけではない。典型的添加剤は、例えば認可された色素、香料、甘味料、およびチメロサール（エチルメルクリチオサリチル酸ナトリウム）などの抗微生物保存剤である。そのような溶液は、例えば部分加水分解ゼラチン、ソルビトールまたは細胞培養培地の添加などによって安定化することができ、例えばリン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウム、その混合物などといった当技術分野において知られている試薬類を使って、従来の方法で緩衝化することができる。
液状製剤には、他の標準的共製剤化剤と組み合わされた懸濁化剤または乳化剤を含有する懸濁剤および乳剤も含まれる。これらのタイプの液状製剤は、従来の方法で調製することができる。例えば懸濁剤はコロイドミルを使って調製することができる。例えば乳剤はホモジナイザーを使って調製することができる。
体液系に注射するように意図された非経口製剤は、対応する哺乳動物体液のレベルへの適正な等張性およびｐＨ緩衝作用を必要とする。等張性は、必要に応じて塩化ナトリウムおよび他の塩で、適当に調節することができる。エタノールまたはプロピレングリコールなどの適切な溶媒を使って、製剤中の成分の溶解度と液状調製物の安定性を増加させることができる。本ワクチンに使用することができるさらなる添加剤には、デキストロース、従来の酸化防止剤および従来のキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などがあるが、これらに限るわけではない。また、非経口剤形は使用前に滅菌しなければならない。
以下に実施例を挙げて本発明の一定の態様を例証する。しかし、これらの実施例が単なる例示であること、そして本発明の条件および範囲に関して完全に決定的なものであるとは考えていないことを理解すべきである。典型的な反応条件（例えば温度、反応時間など）が記載されている場合、指定された範囲を上回る条件も下回る条件も、一般的には利便性が下がるとはいえ、使用できることを理解すべきである。本実施例は室温（約２３℃〜約２８℃）および大気圧で行われる。別段の指定がない限り、本明細書において言及する割合およびパーセントはいずれも重量ベースであり、温度は全て摂氏温度である。
（実施例１）
ウイルスＤＮＡ抽出、ネステッドＰＣＲおよびゲノムＰＣＲ：
この研究には、バージニアの養豚場の２０頭の在来成体雄豚から採取した好都合な血清試料および精液試料を使用した。キアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＤＮＡミニキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）を使って２０個の血清試料および１９個の精液試料から全ＤＮＡを単離した。陽性ＰＴＴＶ含有試料をスクリーニングするために、まず最初に、ＰＴＴＶ１およびＰＴＴＶ２中の保存領域のネステッドＰＣＲ増幅を、アンプリタック・ゴールド（ＡｍｐｌｉＴａｇ Ｇｏｌｄ）ポリメラーゼ（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使って行った。ＰＴＴＶ１のフラグメントＡを増幅するために使用した２つのプライマー対は、ＴＴＶ１−ｍＦ（配列番号４５）／ＴＴＶ１−ｍＲ（配列番号４６）（第１ラウンドＰＣＲ用）およびＴＴＶ１−ｎＦ（配列番号４７）／ＴＴＶ１−ｎＲ（配列番号４８）（第２ラウンドＰＣＲ用）であり、一方、ＰＴＴＶ２のフラグメントＤを増幅するために使用した２つのプライマー対は、ＴＴＶ２−ｍＦ（配列番号４９）／ＴＴＶ２−ｍＲ（配列番号５０）（第１ラウンドＰＣＲ用）およびＴＴＶ２−ｎＦ（配列番号５１）／ＴＴＶ２−ｎＲ（配列番号５２）（第２ラウンドＰＣＲ用；図１Ａおよび表１）だった。
ＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２の両方の完全長ゲノム配列を増幅するために、本発明者らは、まず、ＰＴＴＶ１用には領域Ａ中に位置する一対の保存された遺伝子特異的プライマーＴＴＶ１−ＩＦ（配列番号１）／ＴＴＶ１−ＩＲ（配列番号４）およびＰＴＴＶ２用には領域Ｄ中に意図するもう一対の遺伝子特異的プライマーＴＴＶ２−ＩＦ（配列番号５）／ＴＴＶ２−ＩＲ（配列番号８）を、それぞれ、ヘラキュレース（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ）ＩＩフュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））と共に、製造者の説明書に従って使用することにより、インバースゲノムＰＣＲを行った。予期されるサイズのＰＣＲ産物は検出されなかった。次に本発明者らは、第２ラウンドのＰＣＲにおいて、ＰＴＴＶ１ゲノム全体およびＰＴＴＶ２ゲノム全体をカバーするそれぞれ２つの領域を増幅するために、新しいプライマーセットを設計した（図１Ａ）。ＰＴＴＶ１のフラグメントＢおよびＣを増幅するために使用したプライマー対は、それぞれ、ＴＴＶ１−ＩＦ（配列番号１）／ＴＴＶ１−２３４０Ｒ（配列番号２）とＴＴＶ１−２３１１Ｆ（配列番号３）／ＴＴＶ１−ＩＲ（配列番号４）であり、一方、ＰＴＴＶ２のフラグメントＥおよびＦを増幅するために使用したプライマー対は、それぞれ、ＴＴＶ２−ＩＦ（配列番号５）／ＴＴＶ２−２３１６Ｒ（配列番号６）およびＴＴＶ２−ＧＣＦ（配列番号７）／ＴＴＶ２−ＩＲ（配列番号８）だった（図１Ａおよび表１）。フラグメントＣおよびＦは、それぞれＰＴＴＶ１およびＰＴＴＶ２のＧＣリッチ領域を含有する。増幅されたＰＣＲ産物を個別に切り出し、精製し，次に、ストラタクローン・ブラント（ＳｔｒａｔａＣｌｏｎｅ Ｂｌｕｎｔ）ＰＣＲクローニングストラテジーにより、製造者の説明書（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従って、ｐＳＣ−Ｂ−ａｍｐ／ｋａｎベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングした後、ＤＮＡ配列決定を行った。
（実施例２）
バージニアの飼育場にいる雄豚から収集した豚ＴＴＶ陽性試料のスクリーニング：
豚ＴＴＶ ＤＮＡは、以前に、日本ＰＴＴＶ１株Ｓｄ−ＴＴＶ３１のＵＴＲ配列に基づくネステッドＰＣＲにより、異なる地理的領域の豚から検出されている（マキューン（McKeown）ら、２００４年、前掲書）。ＰＴＴＶ２が最近同定されたことから、ＰＴＴＶ１の領域ＡとＰＴＴＶ２の領域Ｄをそれぞれ増幅するために、２つの異なるネステッドＰＣＲプライマーセットが使用された（図１Ａ）（エリス（Ellis）ら、２００８年、前掲書；ケカライネン，ティ（Kekarainen,T.）、シビラ，エム（Sibila,M.）およびシーゲイルス，ジェイ（Segales,J.）、２００６年、「スペインの離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）罹患豚および非ＰＭＷＳ罹患豚における豚トルクテノウイルスの有病率（Prevalence of swine Torque teno virus in post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)-affected and non-PMWS-affected pigs in Spain）」、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J Gen Virol）、第８７巻、第４号、ｐ．８３３−７；クラコウカ（Ｋｒａｋｏｗｋａ）、２００８年、前掲書）。本研究においても同様の検出法を利用して、米国の豚からＰＴＴＶ株を同定した。後に完全長ゲノムの決定に使用する、土地固有のＰＴＴＶ１陽性試料またはＰＴＴＶ２陽性試料をスクリーニグするために、バージニアの飼育場にいる２０頭の雄豚から収集した２０個の血清試料（ＳＲ＃１〜２０）および１９個の精液試料（ＳＭ＃１〜１８およびＳＭ＃２０）を、ネステッドＰＣＲ分析に付した。驚いたことに、２０個の血清試料は全てＰＴＴＶ１に関して陽性であり、１９個はＰＴＴＶ２についても陽性だった（ＳＲ＃１８を除く）。対照的に、１つの精液試料（ＳＭ＃６）だけがＰＴＴＶ１陽性であり、３つの精液試料だけ（ＳＭ＃８、９および２０）がＰＴＴＶ２陽性だった。この結果は、スペインにおける雄豚精液試料がＰＴＴＶ ＤＮＡに関して陽性であることが示された最近の研究と合致した（ケカライネン，ティ（Kekarainen,T.）、ロペス−ソリア，エス（Lopez-Soria,S.）およびシーゲイルス，ジェイ（Segales,J.）、２００７年）。雄豚の血清および精液には豚トルクテノウイルス遺伝子グループ１および２が検出されたことから（セリオゲノロジー（Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第７号、ｐ．９６６−７１）、ＰＴＴＶの潜在的垂直感染が示唆された。しかし、精液におけるＰＴＴＶ１とＰＴＴＶ２の有病率は、血清中のそれよりもはるかに低かったので、同じ豚の血清および精液におけるＰＴＴＶ ＤＮＡの存在に関して直接的な関連はないことが示唆された。
（実施例３）
配列解析および系統解析：
ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の一般解析（ｇｅｎｅｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）およびアラインメントはレーザージーン（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）パッケージ（ディエヌエイスター・インコーポレイテッド（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン）を使って行った。アラインメントと比較に使用した３つの既知ＰＴＴＶ株のゲノム配列およびそれらの対応するジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号は、Ｓｄ−ＴＴＶ３１（ＡＢ０７６００１）、ＴＴＶ−１ｐ（ＡＹ８２３９９０）およびＴＴＶ−２ｐ（ＡＹ８２３９９１）である。ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）において利用できるヒトおよび動物のＴＴＶ関連株の１２１個の完全長ゲノム配列を使用し、オンラインプログラムＰＡＳＣ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/pasc/viridty.cgi?textpage=overview）（バオ（Bao）ら、２００８年）で、ペアワイズ配列比較（ＰＡＳＣ）を行った。
系統樹は、ＰＡＵＰ４．０プログラム（デービッド・スウォフォード（Ｄａｖｉｄ Ｓｗｏｆｆｏｒｄ）、スミソニアン・インスティチュート（Ｓｍｉｔｈｓｏｎｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ワシントンＤＣ、シナウアー・アソシエート・インコーポレイテッド（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ Ｉｎｃ．）が配布）の近隣結合法により、７つのＰＴＴＶ株の４つのＯＲＦの完全長ゲノム配列および推定アミノ酸配列に基づいて構築した。データは１０００回のリサンプリングから得た。
（実施例４）
豚ＰＴＴＶ感染を診断するためのＰＣＲプライマーの設計
ＤＮＡ配列の解析およびアラインメントは、レーザージーン（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）パッケージ（ディエヌエイスター・インコーポレイテッド（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン）を使って行った。アラインメントに使用した１０個の豚ＴＴＶ株の完全長ゲノム配列およびそれらの対応するジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号は、次のとおりであった。種ＰＴＴＶ１：Ｓｄ−ＴＴＶ３１（ＡＢ０７６００１）、ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ（ＧＵ４５６３８３）、ＴＴＶ−１ｐ（ＡＹ８２３９９０）、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ（ＧＵ４５６３８４）、ｓｗＳＴＨＹ−ＴＴ２７（ＧＱ１２０６６４）およびＴＴＶ１＃４７１８１９（ＧＵ１８８０４５）。種ＰＴＴＶ２：ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ（ＧＵ４５６３８５）、ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ（ＧＵ４５６３８６）、ＴＴＶ−２ｐ（ＡＹ８２３９９１）およびＴＴＶ２＃４７２１４２（ＧＵ１８８０４６）。６つのＰＴＴＶ１ゲノム間および４つのＰＴＴＶ２ゲノム間で保存されている配列をそれぞれ同定し、次にそれらを指針として、ビーコン・デザイナー（Ｂｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ）プログラム（プレミア・バイオソフト・インターナショナル（ＰＲＥＭＩＥＲ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、カリフォルニア州パロアルト）を使ってリアルタイムＰＣＲプライマーを選択した。ＰＴＴＶ１のデュプレックス・ネステッドＰＣＲに使用したプライマーは、レーザージーン（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）パッケージで設計した。
（実施例５）
ＰＴＴＶ１およびＰＴＴＶ２リアルタイムＰＣＲの標準曲線
ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡゲノムのＰＣＲフラグメントＢに対応する２０９１ｂｐの領域を、同じＰＣＲフラグメントから、既述のように（ファン（Huang）ら、２０１０年）、プライマーＴＴＶ１−ＩＦ（５’−ＣＡＴＡＧＧＧＴＧＴＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＡＴＴＴＡＡＧＧＣＧＴＴ−３’）およびＴＴＶ１−２３４０Ｒ（５’−ＧＧＴＣＡＴＣＡＧＡＣＧＡＴＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＣＡＧ−３’）を使って再増幅した。その結果生じたアンプリコンをキアクイック・ゲル・エクストラクション・キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））でゲル精製し、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）分光測光器で定量して、豚ＴＴＶ種１のリアルタイムＰＣＲ標準テンプレートに使用した。ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＰＣＲフラグメントＥおよびＦをベクターｐＳＣ−Ｂ−ａｍｐ／ｋａｎ中でアセンブルすることにより、ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ株ｐＳＣ−ＰＴＴＶ２ｃの完全長ＤＮＡクローンを構築した（ファン（Huang）ら、未公表データ）。プラスミドｐＳＣ−ＰＴＴＶ２ｃ（７０８２ｂｐ）を豚ＴＴＶ種２のリアルタイムＰＣＲ標準テンプレートに使用し、プラスミドＤＮＡ濃度をナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）分光測光器で測定した。これら２つのテンプレートの１０倍希釈系列を使ってリアルタイムＰＣＲ標準曲線をそれぞれ作成した。
（実施例６）
ＰＣＲアッセイ用のウイルスＤＮＡの抽出
バージニアの養豚場の２０頭の在来成体雄豚（臨床的症候群を持たないもの）から収集した２０個の血清試料と１９個の精液試料から、キアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＤＮＡミニキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使って、既述のように（ファン（Huang）ら、２０１０年）、全ＤＮＡを単離した。血清および精液について４００μｌの試料体積を使って、滅菌水５０μｌの最終溶出液で、ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ試料は全て、リアルタイムＰＣＲ試験まで、−２０℃で保存した。従来のネステッドＰＣＲによるこれらの試料中の豚ＴＴＶの検出は既に記述されている（ファン（Huang）ら、２０１０年）。同じ手順でヤギ血清試料から抽出された全ＤＮＡを陰性対照として使用した。
（実施例７）
ＳＹＢＲグリーン・リアルタイム定量ＰＣＲアッセイ
ＰＴＴＶ１特異的およびＰＴＴＶ２特異的リアルタイムＰＣＲを、センシミックス（ＳｅｎｓｉＭｉｘ）ＳＹＢＲアンド・フルオレセインキット（クオンテース・リミテッド（Ｑｕａｎｔａｃｅ Ｌｔｄ））およびマイアイキュー・アイサイクラー（ＭｙｉＱ ｉＣＹＣＬＥＲ）リアルタイムＰＣＲ機器（バイオラッド・ラボラトリーズ（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を使って、それぞれ行った。各２５μｌの反応は、１２．５μｌのＳＹＢＲグリーン・マスター・ミックス、４μｌの抽出されたＤＮＡ、０．５μｌの各プライマー（１０ｎＭ）および７．５μｌの滅菌水を含有した。ＰＴＴＶ１のＰＣＲ条件は９５℃で１０分の後、４０サイクルの増幅（９５℃で１５秒、５９．４℃で３０秒、７２℃で１０秒）とした。その後、直ちに、０．５℃ごとに蛍光シグナルを測定しながら、５５℃から９５℃まで温度を徐々に上昇させることにより、融点分析を行った。ＰＴＴＶ２のＰＣＲ条件は、アニーリング温度が５６℃である点以外は、ＰＴＴＶ１と同じとした。ＰＴＴＶ１およびＰＴＴＶ２標準テンプレートを陽性対照として全てのランに含めた。増幅およびデータ解析は、マイアイキュー（ＭｙｉＱ）システムソフトウェア（バイオラッド・ラボラトリーズ（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を使って行った。全ての試料を同じプレート上で二つずつ測定した。
（実施例８）
２つのシングルプレックス・アッセイの特異性および感度
ＰＴＴＶ１特異的およびＰＴＴＶ２特異的アッセイの増幅にとって最適なアニーリング温度は、アニーリング温度の勾配を使った増幅の１０倍希釈によって決定したところ、それぞれ５９．４℃および５６℃だった。プライマーＴＴＶ１Ｆ／ＴＴＶ１Ｒを使った１１８ｂｐ産物の増幅がＰＴＴＶ１テンプレートでのみ得られたのに対し、ＰＴＴＶ２テンプレートでの２００ｂｐ産物の増幅は、プライマーＴＴＶＦ４／ＴＴＶＲ４を使った場合にのみ観察された。どちらのアッセイも他方からの交差増幅を与えなかったことから、プライマーおよびターゲットの特異性が確認された（データ未掲載）。
ある範囲の、２５μｌあたりのターゲットＤＮＡ濃度にわたって、ＰＴＴＶ１標準曲線を確立した。線形範囲は、４．４×１０１〜４．４×１０８コピーにまたがることが示された。最低検出限界（４４コピー）は、３７．５７の閾サイクル数（Ｃｔ）に対応した。Ｃｔ＞３７．５７の被験試料は検出限界未満とみなし、定量可能でなかった。同様に、ＰＴＴＶ２標準曲線を作成し、それを使って、２５μｌの反応あたり８．６×１００〜８．６×１０８コピーの範囲にあるＤＮＡ濃度を検出した。最低検出限界（８．６コピー）に対応するＣｔは３６．５３だった。ＰＴＴＶ１陽性またはＰＴＴＶ２陽性とみなした試料は全て、それぞれの最大検出限界より低いコピー数を持っていた。ＰＴＴＶ１またはＰＴＴＶ２標準テンプレートの１０倍希釈（図６ａおよび６ｂ；青色の曲線）ならびに２０個の雄豚血清試料を使った融解曲線は、ＰＴＴＶ１については８７．０℃、ＰＴＴＶ２については８０．０℃の融解温度（Ｔｍ）を、それぞれ示した（図６ａおよび６ｂ；赤色の曲線）。滅菌水またはヤギ血清ＤＮＡをテンプレートとして使用した陰性対照にはピークが観察されなかった（図６ａおよび７ｂ；黒い線）。
（実施例９）
雄豚血清試料および精液試料中の豚ＴＴＶ１およびＴＴＶ２の定量
ウイルス負荷量を、元の雄豚血清試料１ｍｌあたりのＰＴＴＶ１ゲノムまたはＰＴＴＶ２ゲノムのコピー数として表した。ＰＴＴＶ１ ＤＮＡは２０個の血清試料の全てに検出され、１．９１×１０３〜３．２５×１０５コピー／ｍｌの範囲にあった。一方、ＰＴＴＶ２ ＤＮＡは１９個の血清試料（＃１０以外）に検出され、３．５９×１０２〜１．３９×１０６コピー／ｍｌの範囲にあった。この結果は、従来のネステッドＰＣＲを使用した本発明者らの先の研究と合致した（表５）。精液試料はいずれもＰＴＴＶ１陽性ではなかったが、３つの精液試料は、極めて低いウイルス負荷量（それぞれ２３０、２４４および３５７コピー／ｍｌ）でＰＴＴＶ２陽性だった。
Figure 0006126176
（実施例１０）
ＰＴＴＶ１／ＰＴＴＶ２デュプレックス・リアルタイムＰＣＲアッセイ
ＰＴＴＶ１／ＰＴＴＶ２デュプレックス・リアルタイムＰＣＲアッセイは、１２．５μｌのＳＹＢＲグリーン・マスター・ミックス、０．５μｌの各ＰＴＴＶ１プライマー、０．５μｌの各ＰＴＴＶ２プライマー、４μｌのＤＮＡおよび６．５μｌの滅菌水を含有する２５μｌのＰＣＲ系で行った。デュプレックスＰＣＲ条件および融点分析は、アニーリング温度が５８℃である点以外は、ＰＴＴＶ１と同じとした。ＰＴＴＶ１特異的アンプリコンとＰＴＴＶ２特異的アンプリコンを識別するために、溶解ピークを分析した。
（実施例１１）
デュプレックス・ネステッドＰＣＲ
第１ラウンドＰＣＲは、５０μｌの総液量に４μｌの抽出ＤＮＡを使って、プラチナムＰＣＲハイファイ・スーパーミックス（Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ＨｉＦｉ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間のテンプレートの初期変性と、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の３０サイクルとした。同じＰＣＲ試薬類および条件による第２ラウンドのＰＣＲには、第１ラウンドＰＣＲ産物を４μｌずつ使用した。第１ラウンドＰＣＲでは１対のプライマーＰ１ａｂ−ｍＦ／Ｐ１ａｂ−ｍＲを使用したのに対し、第２ラウンドのＰＣＲでは、２対のプライマーＰＴＴＶ１ａ検出用のＰ１ａ−ｎＦ／Ｐ１ａ−ｎＲとＰＴＴＶ１ｂ検出用のＰ１ｂ−ｎＦ／Ｐ１ｂ−ｎＲとの混合物を使用した（表１）。増幅産物を、臭化エチジウムで染色した１％アガロースゲルでのゲル電気泳動によって可視化したところ、各型に特異的な２本のバンドがＵＶ光によって区別された。
（実施例１２）
ＰＴＴＶ１およびＰＴＴＶ２ ＯＲＦ発現プラスミドの構築
ＰＴＴＶ１ａ、ＰＴＴＶ１ｂおよびＰＴＴＶ２ｃのＯＲＦ１のＣ末端部分を、それぞれの完全長ＤＮＡクローン（ｐＳＣ−ＰＴＴＶ１ａ、ｐＳＣ−ＰＴＴＶ１ｂおよびｐＳＣ−ＰＴＴＶ２ｃ；項を改めて記載）から増幅した。増幅されたフラグメントは、ＰＴＴＶ１ａについては３１９ａａ（ＯＲＦ１ａａ位置３１７−６３５（配列番号１３）；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号ＧＵ４５６３８３）、ＰＴＴＶ１ｂについては３１８ａａ（ＯＲＦ１ａａ位置３２２−６３９（配列番号１４）；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号ＧＵ４５６３８４）、ＰＴＴＶ２ｃについては３１６ａａ（ＯＲＦ１ａａ位置３１０−６２５（配列番号１６）；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号ＧＵ４５６３８６）のタンパク質産物を、それぞれコードすると予期された。２４８ａａ（ＯＲＦ１ａａ位置３２２−５６９（配列番号１４））をコードするＰＴＴＶ１ｂのＣ末端切断フラグメントも増幅し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用の比較対象として使用した。プラスミドは全て、Ｃ末端に８×Ｈｉｓタグが付いた融合タンパク質が生成するように大腸菌／バキュロウイルス／哺乳動物細胞三重発現ベクターｐＴｒｉＥｘ１．１−ｎｅｏ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））のＮｃｏＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位の間にＰＣＲ産物をクローニングすることによって構築した。４つの組換えプラスミドをｐＴｒｉ−ＰＴＴＶ１ａ−ＯＲＦ１、ｐＴｒｉ−ＰＴＴＶ１ｂ−ＯＲＦ１、ｐＴｒｉ−ＰＴＴＶ１ｂ−ＯＲＦ１ｃｔｒｕｃおよびｐＴｒｉ−ＰＴＴＶ２ｃ−ＯＲＦ１と名付けた。全てのクローン化配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
（実施例１３）
組換えＰＴＴＶ１およびＰＴＴＶ２タンパク質の発現
４つの発現プラスミドを、それぞれロゼッタ（Ｒｏｓｅｔｔａ）２（ＤＥ３）ｐＬａｃＩコンピテント細胞（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））に形質転換し、細菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上、３７℃で終夜、プレート培養した。各コンストラクトについて単一の形質転換コロニーを使って、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地（ＬＢ／ａｍｐ）３ｍｌに接種し、３７℃で６〜８時間成長させた。次に、各コンストラクトについて濁った３ｍｌ培養物を使用し、２５％濾過滅菌グリセロールを添加してその培養物を−８０℃で凍結することにより、細菌ストックを作製した。精製に先だって、各コンストラクトにつき１０μｌの凍結細菌ストックを使って、ＬＢ／ａｍｐの３ｍｌスターター培養に接種し、３７℃で６〜８時間成長させた。１００ｍｌのオーバーナイト・エクスプレス（Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ）ＴＢ培地（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））にスターター培養物を接種してタンパク質発現を誘導し、３７℃で１６〜１８時間成長させた。インキュベーション後に、自己誘導培養培地を４℃、３４００ｒｐｍで１５分間の遠心分離にかけた。各コンストラクトについてその結果得られた上清を捨て、細菌ペレットのそれぞれを使用時まで−２０℃で保存した。
（実施例１４）
組換えタンパク質の精製および透析
組換えタンパク質は不溶性であり、細菌封入体内に発現した。細菌ペレットのそれぞれを、バグバスター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）およびアールリゾチーム（ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ）で、製造者のプロトコール（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））に従って処理し、ＤＮＡおよびＲＮＡを分解するためにベンゾナーゼ・ヌクレアーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））を加えた。次に、封入体ペレットのそれぞれを８４０μｌの溶解バッファー（６Ｍグアニジン塩酸塩、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．０１Ｍトリス−塩酸、０．０１Ｍイミダゾール、ｐＨ８．０）に再懸濁し、−８０℃で少なくとも３０分間は凍結した。次にそれを融解し、新たな溶解バッファー２．５ｍｌで希釈し、室温で３０分間、穏やかに回転させた。室温、１５，０００×ｇで３０分間の遠心分離により、溶解物上清を集めた。デカントした上清のそれぞれに５０％Ｎｉ−ＮＴＡ Ｈｉｓ−バインド・スラリー（ｂｉｎｄ ｓｌｕｒｒｙ）（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））を加え、ｈｉｓタグ結合を促進するために、その混合物を室温で６０分間振とうした。溶解物／樹脂混合物を空のクロマトグラフィーカラムに充填した。最初の貫流の後、７ｍｌの溶解バッファーをカラムに加えて貫流させた。次に各カラムを７ｍｌの洗浄バッファー（８Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍイミダゾール、ｐＨ８．０））で２回洗浄した。カラムに溶出バッファー（８Ｍ尿素、０．０５Ｍリン酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍイミダゾール、ｐＨ８．０）を１ｍｌずつ別々に４回加えることにより、ターゲットタンパク質の溶出を達成した。それら４つの溶出画分をＳＤＳ ＰＡＧＥとクーマシーブルー染色とによって分析した。
意味のある濃度のターゲットタンパク質を含有する溶出物を、２０，０００分子量カットオフの０．５ｍｌ〜３ｍｌ透析カセット（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））に注入した。透析には、次に挙げる一連の４つの透析バッファーを使用した。透析バッファー１（６Ｍ尿素、０．０５Ｍリン酸ナトリウム、０．８Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍイミダゾール、ｐＨ８．０）、透析バッファー２（４Ｍ尿素、０．０３３Ｍリン酸ナトリウム、０．５３３Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍイミダゾール、ｐＨ８．０）、透析バッファー３（２．６７Ｍ尿素、０．０２２Ｍリン酸ナトリウム、０．３５６Ｍ塩化ナトリウム、０．１３３Ｍイミダゾール、ｐＨ８．０）および透析バッファー４（１．５Ｍ尿素、０．０１４８リン酸ナトリウム、０．２３７Ｍ塩化ナトリウム、０．０８９Ｍイミダゾール、ｐＨ８．０）。透析カセットを逐次、４℃において、各透析バッファーに浸漬し、６時間以上、回転させておいた。透析が完了したら、組換えＨｉｓタグ付き融合タンパク質をそれぞれカセットから取り出し、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を使って定量し、−８０℃で凍結した。
（実施例１５）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｈｉｓタグ・ウェスタンブロット
抗６×Ｈｉｓタグ・モノクローナル抗体（ロックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ））を使って精製組換えタンパク質を検出するために、ウェスタンブロットを開発した。等体積の各精製切断ＯＲＦ１タンパク質とＬＤＳ／１０％β−ＭＥとを混合し、９５℃で１０分間煮沸した。煮沸した試料のうち１０μｌを、４−１２％ビス−トリス・ポリアクリルアミドゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の適当な各ウェルに加え、１×ＭＥＳ泳動バッファー（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中、２００ボルトで、４３分間泳動した。トランスブロット（Ｔｒａｎｓ ｂｌｏｔ）セミドライ転写装置と１×転写バッファー（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））とを使って、タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に転写した。転写が完了したら、ＰＶＤＦメンブレンを、オデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）ブロッキングバッファー（リ−コール（Ｌｉ−Ｃｏｒ））中、室温で１時間、インキュベートした。抗６×ＨｉｓタグＭＡｂをオデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）ブロッキングバッファー／０．２％ツイーン２０で１：１０００に希釈し、先のオデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）ブロッキングバッファーを除去してから、メンブレンに移した。ＭＡｂを振とう機上に放置して、メンブレンと共に室温で２時間、または４℃で終夜、インキュベートした後、メンブレンをトリス緩衝食塩水／０．０５％ツイーン２０（ＴＢＳ−Ｔ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））で３回洗浄した。ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＩＲＤｙｅ８００（リ−コール（Ｌｉ−Ｃｏｒ））抗体を、オデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）ブロッキングバッファー／０．２％ツイーン２０／０．１％ＳＤＳで１：５０００に希釈した。それを、洗浄したばかりのＰＶＤＦメンブレンに移し、穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。メンブレンをＴＢＳ−Ｔで３回、ＴＢＳで１回洗浄し、リ−コール（Ｌｉ−Ｃｏｒ）オデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）で撮像した。
（実施例１６）
血清ウェスタンブロット
ＥＬＩＳＡ開発用の陽性および陰性血清対照を同定するために、血清ウェスタンブロットを開発し、使用した。上述のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、タンパク質をＰＤＶＦメンブレンに転写し、次にそれを、室温においてオデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）ブロッキングバッファー（リ−コール（Ｌｉ−Ｃｏｒ））中で１時間インキュベートした。選択した血清試料をオデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）ブロッキングバッファー／０．２％ツイーン２０で１：１００に希釈し、先のオデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）ブロッキングバッファーを除去してからメンブレンに移した。血清試料を振とう機上に放置して、室温で２時間、メンブレンと共にインキュベートした後、メンブレンをトリス緩衝食塩水／０．０５％ツイーン２０（ＴＢＳ−Ｔ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））で３回洗浄した。ヤギ抗豚ＩｇＧ ＩＲＤｙｅ８００抗体（ロックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ））を、オデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）ブロッキングバッファー／０．２％ツイーン２０／０．１％ＳＤＳで１：２５００に希釈した。それを洗浄したばかりのＰＶＤＦメンブレンに移し、穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。メンブレンをＴＢＳ−Ｔで３回、ＴＢＳで１回洗浄し、リ−コール（Ｌｉ−Ｃｏｒ）オデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）で撮像した。
（実施例１７）
間接的ＰＴＴＶ１ａ、ＰＴＴＶ１ｂおよびＰＴＴＶ２特異的ＥＬＩＳＡ
プレートのコーティングに使用した抗原の至適濃度ならびに抗血清およびコンジュゲートの希釈度を、交差力価測定法によって決定した。ＥＬＩＳＡは、精製組換えＨｉｓタグ付き融合タンパク質のそれぞれ（それぞれＰＴＴＶ１ａ、ＰＴＴＶ１ｂおよびＰＴＴＶ２ｃ）をｐＨ９．６の１×カーボネート・コーティング・バッファー（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ：ＣＣＢ）で６８０ｎｇ／ｍｌに希釈し、ミディアム・バインディング（ｍｅｄｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ）ＥＬＩＳＡプレート（グライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ））を１００μｌ／ウェルでコーティングすることによって開始した。プレートを覆い、３７℃で２時間インキュベートした。コーティング後に、希釈タンパク質を除去し、各ウェルを３００μｌの１×ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次に、プロテイン・フリー・ブロッキング・バッファー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒｅｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を３００μｌ／ウェルの体積で加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。同時に、９６ウェル希釈ブロックでは、血清試料を１５０μｌのプロテイン・フリー・ブロッキング・バッファー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒｅｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）で１：１００に希釈した。次に、そのブロックを除去し、１００μｌの各希釈血清試料を、ＥＬＩＳＡプレート上の対応する各ウェルに移した。プレートを３７℃で２時間インキュベートした後、各ウェルを３００μｌのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次に、ＨＲＰコンジュゲート抗豚ＩｇＧ抗体（ロックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ））を、１２ｍｌのプロテイン・フリー・ブロックで１：４０００に希釈し、プレートの各ウェルに１００μｌを加えた。これを３７℃で１時間インキュベートした後、各ウェルを３００μｌのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＥＬＩＳＡを発色させるために、１００μｌのシュアー・ブルー・リバース１−コンポーネント（Ｓｕｒｅ Ｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ １−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ケー・ピー・エル（ＫＰＬ））をプレートの各ウェルに加えた。２０分後に、発色を停止させるために１００μｌの１Ｎ ＨＣｌを各ウェルに加えた。次にプレートを４５０ｎｍで読んだ。
（実施例１８）
データ解析
営利会社から得た細胞培養研究に使用した豚血清（ニュージーランドで製造され、どのＯＩＥ疾患も持たないと考えられるもの）を、３つのＥＬＩＳＡプロトコールの陽性対照として使用した。なぜなら、この血清は、血清ウェスタンブロットで、ＰＴＴＶ１ａ、ＰＴＴＶ１ｂおよびＰＴＴＶ２の全てについて陽性であると検出され、高いＯＤ値（＞２．０）を示したからである。本発明者らは、まず最初に、プールしたノトバイオート豚血清を陰性対照として使用した。というのも、それらはウェスタンブロット検出において陰性だったからである。次に、陰性ノトバイオート豚血清との比較で、本発明者らは、ウィスコンシンにある従来の養豚場から収集されたいくつかの豚血清をスクリーニングした。それらもウェスタンブロット検出において陰性であり、それらのＯＤ値は陰性ノトバイオート豚血清のそれと一致した。これらの在来豚血清をプールし、陰性対照として使用した。各ＥＬＩＳＡについてのカットオフ値は陰性対照群（ｎ＝４）の平均ＯＤ値＋標準偏差の３倍として算出した。
（実施例１９）
豚ＴＴＶ１ａ、１ｂおよび２ｃの完全長ゲノムＤＮＡクローンの構築
米国分離株ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号ＧＵ４５６３８３）由来のＰＣＲフラグメントＢおよびＣを、既述のコンストラクトから再増幅し、次に、ベクターｐＳＣ−Ｂ−ａｍｐ／ｋａｎ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））上で、ヘラキュレース（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ）ＩＩフュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使って、オーバーラッピングＰＣＲを行うことにより、ゲノムの両端にＢａｍＨＩ部位を持つ完全長ゲノムＤＮＡへとアセンブルした。その結果得られたコンストラクトをｐＳＣ−ＰＴＴＶ１ａと名付けた（図１７Ａ）。同じ戦略を使って、米国分離株ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号ＧＵ４５６３８４）に由来するクローンｐＳＣ−ＰＴＴＶ１ｂ（図１７Ｂ）および米国分離株ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号ＧＵ４５６３８６）に由来するクローンｐＳＣ−ＰＴＴＶ２ｃ（図１７Ｃ）を、同じバックボーンベクター上の同じ制限部位（ＢａｍＨＩ）を使って構築した。完全長ゲノムＤＮＡを含有するプラスミドＴＴＶ２−＃４７１９４２−ｆｕｌｌ（図１７Ｅ）はドイツ病原性豚ＴＴＶ２分離株に由来した。ＴＴＶ２−＃４７１９４２はアンドレアス・ガレイ（Ａｎｄｒｅａｓ Gallei）博士（ビー・アイ・ブイ・アイ（ＢＩＶＩ）、ドイツ）から分譲された。ＴＴＶ２−＃４７１９４２は、系統解析に基づいて米国分離株ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡと共に豚ＴＴＶ亜型２ｂに分類された（データ未掲載）。
（実施例２０）
豚ＴＴＶ２ｂおよび２ｃのタンデム二量体化ＤＮＡクローンの構築
完全長ＰＴＴＶ２ｃゲノムをＢａｍＨＩ消化によってクローンｐＳＣ−ＰＴＴＶ２ｃから切り出し、精製し、ライゲーションして、コンカテマーを形成させた。ライゲーションされたコンカテマーを、ＢａｍＨＩで前もって消化しておいたｐＳＣ−Ｂ−ａｍｐ／ｋａｎベクター中にクローニングして、タンデム二量体化ＤＮＡクローンｐＳＣ−２ＰＴＴＶ２ｃ−ＲＲ（図１Ｄ）を作製した。同様に、タンデム二量体化ＤＮＡクローンｐＳＣ−２ＰＴＴＶ２ｂ−ＲＲを、クローンＴＴＶ２−＃４７１９４２−ｆｕｌｌから、ＥｃｏＲＶ制限部位を使って作製した（図１Ｆ）。
（実施例２１）
ＰＴＴＶ１ａ特異的、ＰＴＴＶ１ｂ特異的およびＰＴＴＶ２特異的抗ＯＲＦ１ポリクローナル抗体の作製
ＯＲＦ１がコードする産物は、ＴＴＶの予測キャプシドタンパク質である。ＰＴＴＶ ＯＲＦ１タンパク質の発現を検出し、ＰＴＴＶ ＤＮＡクローンの感染性を決定する目的で、ＰＴＴＶ１ａ特異的、ＰＴＴＶ１ｂ特異的およびＰＴＴＶ２特異的抗ＯＲＦ１ポリクローナル抗体を作製するために、ＰＴＴＶ１ａ、ＰＴＴＶ１ｂおよびＰＴＴＶ２ｃ由来の３つのＯＲＦ１タンパク質を大腸菌中で発現させ、精製し、次に、それらを使って、ロックランド・イムノケミカルズ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ペンシルバニア州ギルバーツビル）におけるカスタム抗体作製サービスとして、ニュージーランド白色種ウサギをそれぞれ免疫化した。各抗ＯＲＦ１ポリクローナル抗体を免疫化したウサギの血清から作製した。
（実施例２２）
ＰＴＴＶ感染性クローンのインビトロ・トランスフェクション
ＰＫ−１５細胞を６ウェルプレート上に１ウェルあたり２×１０５細胞の密度で播種し、トランスフェクションに先だって６０％〜７０％コンフルエンスまで成長させた。ＤＮＡクローンｐＳＣ−２ＰＴＴＶ２ｂ−ＲＲおよびｐＳＣ−２ＰＴＴＶ２ｃ−ＲＲをそれぞれＰＫ−１５細胞に、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）ＬＴＸ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使って、製造者のプロトコールに従って、直接トランスフェクトした。クローンｐＳＣ−ＰＴＴＶ１ａ、ｐＳＣ−ＰＴＴＶ２ｃおよびＴＴＶ２−＃４７１９４２−ｆｕｌｌについては、上述のように作製された、それらのライゲーションされたコンカテマーを、それぞれトランスフェクションに使用した。細胞を３〜５日間培養した後、豚ＴＴＶのＯＲＦ１の発現を検出するために、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）に付した。あるいは、トランスフェクト細胞を、新しい６ウェルプレートに継代し、３日間培養を続けてから、ＩＦＡ検出を行う。
（実施例２３）
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）
トランスフェクションまたは継代した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、アセトンで固定した。ＰＢＳで１：５００に希釈したＰＴＴＶ１ａまたはＰＴＴＶ２に特異的な抗体５００μｌを細胞の上に加え、室温で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、１：２００希釈のテキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）またはアレクサ・フルオル（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））５００μｌを加えた。室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、細胞を１：１０００希釈のＤＡＰＩ（ケーピーエル・インコーポレイテッド（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．））５００μｌで染色し、蛍光顕微鏡下で可視化した。
（実施例２４）
タンデム二量体化豚ＴＴＶ２クローンによる在来豚のインビボ接種
２つのタンデム二量体化豚ＴＴＶ２クローンｐＳＣ−２ＴＴＶ２ｂ−ＲＲおよびｐＳＣ−２ＴＴＶ２ｃ−ＲＲの感染性を決定する為に豚接種研究を行った。簡単に述べると、豚ＴＴＶ２について血清陰性およびＤＮＡウイルス陰性である８頭の４週齢在来豚を、それぞれ４匹ずつの２群にランダムに割り当てた。各群の豚を別々に収容し、施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ）の要求を全て満たす条件下で維持した。
各群内の全ての豚に、リンパ節内経路と筋肉内経路の両方を組み合わせて注射した。４頭の豚（番号１８１、１８９、１９２および１９３）には、それぞれ２００μｇのｐＳＣ−２ＴＴＶ２ｂ−ＲＲプラスミドＤＮＡを注射し、一方、他方の豚４頭（番号９２、１８０、１８８および１９１）には、それぞれ２００μｇのｐＳＣ−２ＴＴＶ２ｃ−ＲＲクローンを接種した。豚を、疾患の臨床徴候について、合計２８日間、毎日監視した。全ての豚を接種の２８日後に剖検した。
いくつかの実施形態の説明によって本発明を例示し、例示的実施形態について詳細に説明したが、本願請求項の範囲をそのような詳細に制限または多少なりとも限定することは、本願出願人の意図するところではない。さらなる変更は当業者には明白であるだろう。したがって本発明は、さらに広いその態様において、ここに示し説明した具体的詳細、代表的装置および方法、ならびに例示的実施例に限定されない。したがって、本願出願人の一般的発明概念の要旨または範囲から逸脱することなく、そのような詳細から逸脱することができる。
［付記事項］
［付記１］
ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡの遺伝子型からなる群より選択されるゲノム配列に対して少なくとも８５％の相同性を有する少なくとも１コピーのゲノム配列を含有する感染性ＰＴＴＶをコードする核酸分子を含む、豚トルクテノウイルス（ＰＴＴＶ）の感染性核酸分子。
［付記２］
少なくとも１コピーのゲノム配列が、ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡからなる群より選択されるゲノム配列に対して少なくとも９５％の相同性を有する、付記１に記載の感染性核酸分子。
［付記３］
前記ゲノム配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示す配列から選択される、付記１に記載の感染性核酸分子。
［付記４］
付記３に記載の感染性核酸分子を含有する、生物学的に機能的なプラスミドまたはウイルスベクター。
［付記５］
２コピー以上の感染性核酸分子を含有する、付記４に記載の生物学的に機能的なプラスミドまたはウイルスベクター。
［付記６］
付記４に記載の感染性核酸分子を含むベクターによってトランスフェクトされた適切な宿主細胞。
［付記７］
付記６に記載の感染性核酸分子を含有する細胞によって産生される無発病性の感染性ＰＴＴＶ。
［付記８］
無毒性の生理学的に許容される担体と、
（ａ）ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡからなる群より選択されるゲノム配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する少なくとも１コピーのゲノム配列またはその相補鎖を含有する核酸分子、
（ｂ）ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡからなる群より選択されるゲノム配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する少なくとも１コピーのゲノム配列またはその相補鎖を含有する核酸分子を含有する生物学的に機能的なプラスミドまたはウイルスベクター、
（ｃ）ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡからなる群より選択されるゲノム配列に対して少なくとも８５％の相同性を有するゲノム配列から誘導され、それを含有する、無発病性、感染性かつ非病原性豚トルクテノウイルス、
（ｄ）ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ１／１、およびＯＲＦ２／２からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に従って翻訳されたポリペプチド配列の免疫原性フラグメントまたは完全タンパク質
からなる群より選択される免疫原量の構成要素とを含む、ワクチン。
［付記９］
生ＰＴＴＶウイルスを含有する、付記８に記載のワクチン。
［付記１０］
死滅ＰＴＴＶウイルスを含有する、付記８に記載のワクチン。
［付記１１］
ポリペプチド配列の免疫原性フラグメントまたは完全タンパク質が、ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ１／１ およびＯＲＦ２／２から発現された精製細菌発現またはバキュロウイルス発現組換えタンパク質を含む、付記８に記載のワクチン。
［付記１２］
ポリペプチド配列の免疫原性フラグメントまたは完全タンパク質が、ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１から発現された精製細菌発現またはバキュロウイルス発現組換えタンパク質を含む、付記１１に記載のワクチン。
［付記１３］
アジュバントをさらに含む、付記８に記載のワクチン。
［付記１４］
免疫学的有効量の付記８に記載のワクチンを豚に投与することを含む、ＰＴＴＶウイルス感染に対して豚を免疫化する方法。
［付記１５］
前記ワクチンを豚に非経口投与、鼻腔内投与、皮内投与、または経皮投与することを含む、付記１４に記載の方法。
［付記１６］
前記ワクチンを豚にリンパ系内投与または筋肉内投与することを含む、付記１４に記載の方法。
［付記１７］
配列番号９に示すＰＴＴＶ１ａ−ＶＡのヌクレオチド配列に対して８５％の相同性を有するポリ核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
［付記１８］
前記ポリ核酸配列が、配列番号９に示す前記ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡのヌクレオチド配列に対して９５％の相同性を有する、付記１７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
［付記１９］
前記ポリ核酸配列が、配列番号９に示す前記ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡのヌクレオチド配列からなる、付記１７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
［付記２０］
配列番号１０に示すＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡのヌクレオチド配列に対して８５％の相同性を有するポリ核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
［付記２１］
前記ポリ核酸配列が、配列番号１０に示す前記ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡのヌクレオチド配列に対して９５％の相同性を有する、付記２０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
［付記２２］
前記ポリ核酸配列が、配列番号１０に示す前記ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡのヌクレオチド配列からなる、付記２０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
［付記２３］
配列番号１１に示すＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡのヌクレオチド配列に対して８５％の相同性を有するポリ核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
［付記２４］
前記ポリ核酸配列が、配列番号１１に示す前記ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡのヌクレオチド配列に対して９５％の相同性を有する、付記２３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
［付記２５］
前記ポリ核酸配列が、配列番号１１に示す前記ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡのヌクレオチド配列からなる、付記２３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
［付記２６］
配列番号１２に示すＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのヌクレオチド配列に対して８５％の相同性を有するポリ核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
［付記２７］
前記ポリ核酸配列が、配列番号１２に示す前記ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのヌクレオチド配列に対して９５％の相同性を有する、付記２３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
［付記２８］
前記ポリ核酸配列が、配列番号１２に示す前記ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのヌクレオチド配列からなる、付記２３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
［付記２９］
ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ１／１、およびＯＲＦ２／２からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に従って翻訳されたポリペプチド配列の免疫原性フラグメントまたは完全タンパク質を含むワクチン。
［付記３０］
前記免疫原性フラグメントまたは完全タンパク質が、ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのキャプシドタンパク質である、付記２９に記載のワクチン。
［付記３１］
前記ポリヌクレオチド配列が、ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１からなる群より選択される、付記２９に記載のワクチン。
［付記３２］
前記ポリヌクレオチド配列がＰＴＴＶ遺伝子型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡのＯＲＦ１である、付記３１に記載のワクチン。
［付記３３］
前記ポリヌクレオチド配列がＰＴＴＶ遺伝子型ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡのＯＲＦ１である、付記３１に記載のワクチン。
［付記３４］
前記ポリヌクレオチド配列がＰＴＴＶ亜型ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１である、付記３１に記載のワクチン。
［付記３５］
前記ポリペプチド配列が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８に示す配列からなる群より選択される、付記２９に記載のワクチン。
［付記３６］
前記ポリペプチド配列が配列番号１３に示される、付記３５に記載のワクチン。
［付記３７］
前記ポリペプチド配列が配列番号１３のＣ末端領域（ａａ３１７−６３５）である、付記３６に記載のワクチン。
［付記３８］
前記ポリペプチド配列が配列番号１４に示される、付記３５に記載のワクチン。
［付記３９］
前記ポリペプチド配列が配列番号１４のＣ末端領域（ａａ３２２−６３９）である、付記３８に記載のワクチン。
［付記４０］
前記ポリペプチド配列が配列番号１６に示される、付記３５に記載のワクチン。
［付記４１］
前記ポリペプチド配列が配列番号１６のＣ末端領域（ａａ３１０−６２５）である、付記４０に記載のワクチン。
［付記４２］
前記ポリペプチド配列が配列番号２０に示される、付記３５に記載のワクチン。
［付記４３］
アジュバントをさらに含有する、付記２９に記載のワクチン。
［付記４４］
免疫学的有効量の付記２９に記載のワクチンを豚に投与することを含む、ＰＴＴＶウイルス感染に対して豚を免疫化する方法。
［付記４５］
免疫原性フラグメントまたは完全タンパク質を豚に投与することを含む、付記４４に記載の方法。
［付記４６］
ワクチンを豚に非経口投与、鼻腔内投与、皮内投与、または経皮投与することを含む、付記４４に記載の方法。
［付記４７］
ワクチンを豚にリンパ系内投与または筋肉内投与することを含む、付記４４に記載の方法。
［付記４８］
ＰＴＴＶ１感染を診断し、ＰＴＴＶ１負荷量を定量するための方法であって、
ＰＴＴＶ１感染が疑われる試料からＤＮＡを抽出すること、
配列番号２９および配列番号３０に示す配列を含むプライマーを使ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、および
ＰＴＴＶ１特異的増幅を検出すること
を含む方法。
［付記４９］
前記ポリメラーゼ連鎖反応がＳＹＢＲグリーン・リアルタイムＰＣＲである、付記４８に記載の方法。
［付記５０］
ＰＴＴＶ２感染を診断し、ＰＴＴＶ２負荷量を定量するための方法であって、
ＰＴＴＶ２感染が疑われる試料からＤＮＡを抽出すること、
配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２に示す配列を含むプライマーを使ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、および
ＰＴＴＶ２特異的増幅を検出すること
を含む方法。
［付記５１］
前記ポリメラーゼ連鎖反応がＳＹＢＲグリーン・リアルタイムＰＣＲである、付記５０に記載の方法。
［付記５２］
ＰＴＴＶ１感染とＰＴＴＶ２感染を同時に検出し診断するための方法であって、
ＰＴＴＶ感染が疑われる試料からＤＮＡを抽出すること、
配列番号３１および配列番号３２に示す配列を含むプライマーを使ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、および
ＰＴＴＶ１およびＰＴＴＶ２特異的増幅を検出すること
を含む方法。
［付記５３］
前記ポリメラーゼ連鎖反応がＳＹＢＲグリーン・リアルタイムＰＣＲである、付記５２に記載の方法。
［付記５４］
ＰＴＴＶ１ａ感染とＰＴＴＶ１ｂ感染を同時に検出し診断するための方法であって、
ＰＴＴＶ１感染が疑われる試料からＤＮＡを抽出すること、
配列番号３３および配列番号３４に示す配列を含むプライマーを使って第１ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、
配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示す配列を含むプライマーを使って第２ＰＣＲを行うこと、および
ＰＴＴＶ１ａおよびＰＴＴＶ１ｂ特異的増幅を検出すること
を含む方法。
［付記５５］
ＰＴＴＶ感染を診断するための方法であって、
ＰＴＴＶ亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ１／１、およびＯＲＦ２／２からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に従って翻訳されたポリペプチド配列の免疫原性フラグメントまたは完全タンパク質を固定化すること、
ＰＴＴＶ感染が疑われる豚からの血清試料を前記固定化免疫原性フラグメントまたは完全タンパク質と接触させること、および
前記免疫原性フラグメントに特異的な、捕捉された抗体を検出すること
を含む方法。
［付記５６］
前記ポリヌクレオチド配列が、ＰＴＴＶ遺伝子型または亜型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡ、ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡ、ＰＴＴＶ２ｂ−ＶＡ、およびＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１からなる群より選択される、５５に記載の方法。
［付記５７］
前記ポリヌクレオチド配列がＰＴＴＶ遺伝子型ＰＴＴＶ１ａ−ＶＡのＯＲＦ１である、付記５６に記載のワクチン。
［付記５８］
前記ポリヌクレオチド配列がＰＴＴＶ遺伝子型ＰＴＴＶ１ｂ−ＶＡのＯＲＦ１である、付記５６に記載の方法。
［付記５９］
前記ポリヌクレオチド配列がＰＴＴＶ亜型ＰＴＴＶ２ｃ−ＶＡのＯＲＦ１である、付記５６に記載の方法。
［付記６０］
前記ポリペプチド配列が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８に示す配列からなる群より選択される、付記５５に記載の方法。
［付記６１］
前記ポリペプチド配列が配列番号１３に示される、付記６０に記載の方法。
［付記６２］
前記ポリペプチド配列が配列番号１６に示される、付記６０に記載のワクチン。
［付記６３］
前記免疫原性フラグメントが、配列番号１３のＣ末端領域（ａａ３１７−６３５）、配列番号１４のＣ末端領域（ａａ３２２−６３９）、または配列番号１６のＣ末端領域（ａａ３１０−６２５）である、付記６２に記載のワクチン。
［付記６４］
前記ポリペプチド配列が配列番号２０に示される、付記６０に記載のワクチン。
［付記６５］
前記捕捉された抗体の検出がウェスタンブロットによる、付記５５に記載の方法。
［付記６６］
前記捕捉された抗体の検出が酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による、付記５５に記載の方法。

Claims (9)

  1. ＯＲＦ１タンパク質またはＯＲＦ１タンパク質の免疫原性フラグメントを含み、
    前記ＯＲＦ１タンパク質またはＯＲＦ１タンパク質の免疫原性フラグメントは、少なくとも１つの亜型特異的超可変領域（ＨＶＲ）を含み、
    前記亜型特異的超可変領域は、配列番号１３のアミノ酸３８０〜４６０、配列番号１４のアミノ酸３８２〜４６０、配列番号１５のアミノ酸３６３〜３７５、配列番号１５のアミノ酸３８８〜４２３、配列番号１６のアミノ酸３６３〜３７５、および配列番号１６のアミノ酸３８８〜４２３からなる群より選ばれる、
    免疫原性組成物。
  2. 前記少なくとも１つの亜型特異的超可変領域（ＨＶＲ）を含むＯＲＦ１タンパク質またはＯＲＦ１タンパク質の免疫原性フラグメントは、精製細菌またはバキュロウイルス発現組換えタンパク質である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  3. さらにアジュバントを含む、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
  4. 配列番号１３のアミノ酸３１７〜６３５で示されるタンパク質を含む、免疫原性組成物。
  5. 配列番号１４のアミノ酸３２２〜６３９で示されるタンパク質を含む、免疫原性組成物。
  6. 生物学的に機能的なプラスミドまたはバキュロウイルス発現ベクターから発現されたポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは配列番号１３のアミノ酸３８０〜４６０で示されるＰＴＴＶ１−ＨＶＲ３を含む、免疫原性組成物。
  7. 生物学的に機能的なプラスミドまたはバキュロウイルス発現ベクターから発現されたポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは配列番号１４のアミノ酸３８２〜４６０で示されるＰＴＴＶ１−ＨＶＲ３を含む、免疫原性組成物。
  8. 生物学的に機能的なプラスミドまたはバキュロウイルス発現ベクターから発現されたポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは配列番号１５のアミノ酸３６３〜３７５で示されるＰＴＴＶ２−ＨＶＲ１および配列番号１５のアミノ酸３８８〜４２３で示されるＰＴＴＶ２−ＨＶＲ２を含む、免疫原性組成物。
  9. 生物学的に機能的なプラスミドまたはバキュロウイルス発現ベクターから発現されたポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは配列番号１６のアミノ酸３６３〜３７５で示されるＰＴＴＶ２−ＨＶＲ１および配列番号１６のアミノ酸３８８〜４２３で示されるＰＴＴＶ２−ＨＶＲ２を含む、免疫原性組成物。
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