CN108431024A - 猪3型圆环病毒免疫原性组合物以及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

从有通常与猪2型圆环病毒(PCV2)感染相关的临床症状的母猪和流产胎儿中鉴定出一种圆环病毒的新种，即猪3型圆环病毒(PCV3)。分子分析和血清学分析表明PCV3通常在美国猪中传播。本公开提供了免疫组合物以及与这样的组合物的产生和施用相关的方法。

Description

猪3型圆环病毒免疫原性组合物以及其制备和使用方法
本申请涉及美国临时专利申请号62/242,866并且要求美国临时专利申请号62/242,866的优先权，该美国临时专利申请是在2015年10月16日提交的并且以引用的方式整体并入本文。
序列表
本申请含有呈纸质格式和计算机可读格式的序列表，其教导和内容在此以引用的方式并入本文。
背景技术
猪2型圆环病毒(PCV2)最初是在20世纪90年代中期在加拿大患有断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的猪中被零星地鉴定出。与PCV2相关的严重系统性疾病的流行病随后在欧洲和亚洲，继而在北美洲被鉴定出。商业疫苗的广泛使用已经有效地控制了PCV2相关疾病(PCVAD)，所述疾病包括PMWS、肺炎、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)以及繁殖障碍。回顾性研究已经证实，在广泛临床疾病前，PCV2在猪中以不引人注意的方式传播了数十年。显性基因型从PCV2a转变成PCV2b似乎对应于严重的PCVAD。最近，被称作猪3型圆环病毒(PCV3)的一种新的圆环病毒从有通常与PCV2感染相关的临床症状的母猪以及流产胎儿中被鉴定出。
发明内容
从急性死于与PDNS一致的临床症状的有慢性不良繁殖性能的来自养殖场的四只母猪收集组织。对母猪组织进行的病理检查注意到紫色皮肤病变伴有急性坏死性真皮和与出血相关的表皮以及白细胞的血管周积聚。肾脏显示出肾小管扩张，间质组织和肾小球内有淋巴细胞和巨噬细胞簇以及肾小管上皮细胞的轻度非典型性增生。尽管有通常在PCV2感染的情况下发现的宏观病变和微观病变，但是免疫组织化学和定量PCR(qPCR)对于PCV2以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和甲型流感病毒(IAV)呈阴性。同时，从同一养殖场的患有类似的皮肤病变的流产母猪收集到木乃伊化胎儿。同样，qPCR对于PCV2以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪细小病毒(PPV)呈阴性。
如先前所述从三个木乃伊制备组织匀浆池并且对其进行病毒宏基因组测序。在所收集的989,478个读段中，926,380个被定位到参考野猪(Sus scrofa)基因组。未组装读段的从头组装产生27个重叠群。大部分(54％)的读段被定位到1246bp重叠群，所述重叠群通过BLASTN分析与通过宏基因组测序在商业猪肉中所检测到的部分圆环病毒基因组98％相似。其余读段与已知的真核病毒没有显示出相似性。随后对木乃伊池DNA进行滚环扩增，继而使用与圆环病毒重叠群内所含的XhoI位点重叠的引物进行反向PCR。琼脂糖凝胶电泳鉴定出约2kb的单个条带。通过对跨越完整基因组的重叠扩增子进行桑格测序(Sangersequencing)确定了2,000bp基因组(SEQ ID NO.1)。
遗传分析鉴定出编码预测的具有296个氨基酸(aa)的蛋白质(SEQ ID NO.4)的开放阅读框(ORF1；SEQ ID NO.3)，所述蛋白质通过BLASTP分析与圆环病毒科(circoviridae)PorkNW2/USA/2009(登录号ADU77001，221个氨基酸)的部分复制酶(rep)蛋白96％同一并且与从中国的蝙蝠圆环病毒(登录号AIF76248)确定的具有293个氨基酸的rep蛋白54％同一。保守病毒rep结构域和解旋酶结构域分别从SEQ ID NO.1的氨基酸9-93和162-251被鉴定出。类似于PorkNW2/USA/2009，没有鉴定出适当的起始密码子并且提出了替代的GTC起始密码子或从上游ATG剪接。相反取向的第二ORF(ORF2；SEQ ID NO.5)编码预测的具有214个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO.6)，所述蛋白质与PorkNW2/USA/2009的部分衣壳(cap)序列(110个氨基酸)具有87％的同一性并且与PCV2和鸭圆环病毒(分别是233个氨基酸和257个氨基酸)的衣壳具有36％-37％的同一性。类似于其它圆环病毒cap蛋白，N末端由具有约32个氨基酸的长度的高度富含精氨酸的区域组成。编码预测的具有233个氨基酸的蛋白质(SEQ IDNO.8)的第三ORF(ORF3；SEQ ID NO.7)与从碎牛肉中确定的部分圆环病毒基因组中所鉴定的一个ORF具有94％的同一性并且与具有未知功能的鼠科疱疹病毒蛋白具有39％的同一性。预测的复制起点含有茎环结构，所述茎环结构具有与PCV1相同的环九聚体TAGTATTAC(SEQ ID NO.15)，位于rep编码链上rep与cap之间(图1)。鉴于与圆环病毒属的成员具有总体遗传和结构相似性并且与其它物种具有<70％的衣壳氨基酸同一性，所述物种在本申请中被称为猪圆环病毒3(PCV3)。
在MEGA中进行系统发育分析，通过ClustalW比对序列。使用最大似然法，使用最佳拟合LG，用伽玛分布模型，以通过对rep蛋白序列的500次自助抽样所验证的树形拓扑推断系统发育(图2)。示出了代表氨基酸变化的数量的比例尺。基因库登录号示于括号中。在图2中，CaCV是金丝雀圆环病毒；GuCV是鸥圆环病毒；FiCV是雀类圆环病毒；StCV是欧椋鸟圆环病毒；PiCV是鸽圆环病毒；BFDV是喙羽病病毒；DuCV是鸭圆环病毒；GoCV是鹅圆环病毒；SwCV是天鹅圆环病毒；BtCV是蝙蝠圆环病毒；PCV1是猪1型圆环病毒；以及PCV2是猪2型圆环病毒。如图中所示，PCV3与PorkNW2/USA/2009聚类，并且这些与来自中国的蝙蝠圆环病毒是最密切相关的。有趣的是，PCV1和PCV2也与来自缅甸的不同蝙蝠圆环病毒在进化上相关。
用靶向PCV3rep基因的qPCR测定来分析来自三个单个木乃伊的组织匀浆和来自死于PDNS的四只母猪的肺匀浆。木乃伊全部都呈阳性，循环阈值(Ct)是16.7-21.3。四只母猪中的三只也呈阳性，Ct值是27.7-29.7。
为了确定PCV3的发病率，使用靶向rep基因和cap基因的多重化Taqman测定筛查提交用于诊断测试的总共271个猪鼻拭子、口腔液或肺匀浆样品。三十四个(12.5％)样品对于这两个测定呈阳性，具有类似的Ct值。两个样品仅对于靶向PCV3 cap的测定呈阳性。阳性样品的Ct值是20.3-35.8。
涵盖SEQ ID NO.1的cap氨基酸35-214的肽在大肠杆菌中被表达为N末端6×组氨酸融合蛋白并且通过亲和色谱法纯化。变性电泳表明所述蛋白质被表达为二聚体，类似于对于PCV2所观测到。如先前所述进行ELISA。使用来自无特定病原体群的3周大的猪的十八个血清样品作为阴性对照并且得到0.49的平均光密度。阳性临界值被设定为高于平均值三个标准偏差(OD>0.87)。来自同一养殖场的十只经产母猪的血清全部呈阳性，平均OD是1.27。还测试了来自向母猪养殖场供给替代动物的后备母猪养殖场的二十七个血清；十七个(63％)呈阳性。最终，从多个州提交用于诊断测试的83个血清样品(动物年龄未知)的集合中有四十六个(55％)呈阳性。
附图说明
下列附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本公开的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，结合本文所提供的对具体实施方案的详细说明，可以更好地了解本公开。
图1是猪圆环病毒3基因组组织的示意图；并且
图2是圆环病毒复制酶蛋白的系统发育树。
在本申请中，SEQ ID No.1是PCV3基因组的核苷酸序列；SEQ ID No.2是PCV3基因组的氨基酸序列；SEQ ID No.3是PCV3的复制酶(ORF1)的核苷酸序列；SEQ ID No.4是PCV3的复制酶(ORF1)的氨基酸序列；SEQ ID No.5是PCV3的衣壳(ORF2)的核苷酸序列；SEQ IDNo.6是PCV3的衣壳(ORF2)的氨基酸序列；SEQ ID No.7是PCV3的ORF3的核苷酸序列；SEQ IDNo.8是PCV3的ORF3的氨基酸序列；SEQ ID No.9是引物1 PCV3复制酶的核苷酸序列；SEQ IDNo.10是引物2 PCV3复制酶的核苷酸序列；SEQ ID No.11是探针PCV3复制酶的核苷酸序列；SEQ ID No.12是引物1 PCV3衣壳的核苷酸序列；SEQ ID No.13是引物2 PCV3衣壳的核苷酸序列；SEQ ID No.14是探针PCV3衣壳的核苷酸序列；SEQ ID No.15是含有具有环九聚体的茎环结构的复制起点；SEQ ID No.16是内部cap基因引物；SEQ ID No.17是内部cap基因引物；SEQ ID No.18是PCV3基因的编码氨基酸(aa)35-214的部分的引物；并且SEQ ID No.19是PCV3基因的编码氨基酸(aa)35-214的部分的引物。
具体实施方式
以下详细说明和实施例阐述了根据本公开使用的优选的材料和程序。然而，应当了解的是，该说明和这些实施例仅是以说明的方式提供的，并且其中任何内容不应当被认为是对本公开的总体范围的限制。
免疫原性组合物以及制备和使用这样的组合物的方法
本公开的一个方面提供了一种产生和/或回收重组PCV3 ORF2蛋白的方法，所述方法是通过以下步骤实现的：1)用编码PCV3蛋白的重组病毒载体感染培养中的许多易感细胞；2)通过所述重组病毒载体表达PCV3蛋白；3)回收所述PCV3蛋白；以及4)经由分离步骤将细胞碎片与所表达的PCV3蛋白分离。
在本公开的另一个方面，包括灭活步骤是优选的以在回收PCV3蛋白之前将病毒载体灭活，所述PCV3蛋白将被用于免疫原性组合物或免疫组合物，例如疫苗中。除了上述步骤1-4之外，这样的步骤还可以作为步骤5)来进行。
在一些形式中，在即将进行过滤步骤或分离步骤之前或在过滤步骤或分离步骤后立即进行该灭活。可以使用任何常规的灭活方法以实现本公开的目的。因此，可以通过化学处理和/或物理处理来进行灭活。一种代表性的灭活方法包括添加环化的二乙烯亚胺(BEI)。
任选地，上述方法还可以在步骤5)之后包括中和步骤。举例来说，如果灭活剂是BEI，那么添加硫代硫酸钠达到等量是优选的。优选的是，与添加用于灭活的BEI相比，以等量添加硫代硫酸钠。
“免疫原性组合物或免疫组合物”指的是包含至少一种抗原的物质组合物，所述抗原在细胞和/或抗体介导的免疫应答的宿主中引发针对目标组合物或疫苗的免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于以下效应中的一种或多种：特异性针对目标组合物或疫苗中所包括的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、和/或细胞毒性T细胞和/或yd T细胞的产生或激活。优选的是，所述宿主将表现出治疗性或保护性免疫应答以使得对新感染的抗性将得到增强和/或疾病的临床严重程度降低。这样的保护作用将通过通常由受感染的宿主所表现的症状的严重程度或发病率的降低乃至并且包括没有所述症状、恢复时间更快、和/或受感染的宿主的病毒滴度降低来证实。
在优选的形式中并且特别是在将在免疫原性组合物，例如疫苗中使用重组PCV3蛋白的形式中，可以针对灭活对每一批或仅仅所选批次的收获的PCV3蛋白进行测试。因此，本公开的另一个方面涉及一种用于确定重组病毒载体的灭活的有效性的灭活测试，所述测试包括以下步骤：1)使含有所述重组病毒载体的培养流体的至少一部分与灭活剂接触；2)添加中和剂以中和所述灭活剂；以及3)确定残余感染性。
在优选的形式中，用于感染细胞的含有PCV3 DNA并且表达PCV3蛋白质的重组病毒载体是通过将其中已经克隆有PCV3基因的转移载体转染到病毒载体中而产生的。优选的是，仅将转移载体的含有所期望的PCV3DNA，例如编码ORF1、ORF2、或ORF3的DNA的部分转染到病毒载体中。
术语“转染到病毒载体中”意指将异源性DNA“引入”或“克隆”到病毒载体，例如像杆状病毒载体中并且用作它们的同义词。“转移载体”意指DNA分子，它包括至少一个复制起点、异源基因，在本发明的情况下是PCV3的异源基因，将包括允许所述异源基因克隆到病毒载体中的DNA序列。优选的是，允许异源基因克隆到病毒载体中的序列侧接所述异源基因。甚至更优选的是，那些侧接序列至少部分地与病毒载体的序列是同源的。序列同源性然后允许这两个分子，即病毒载体和转移载体的重组以产生含有所述异源基因的重组病毒载体。
在更优选的形式中，本公开的方法将从分离PCV3 DNA开始。可以使用任何PCV3基因以实现本公开的目的。优选地使用PCR方法扩增PCV3DNA。然后将所得DNA克隆到转移载体中。
因此，在本公开的一个方面，提供了一种用于构建含有PCV3 DNA的重组病毒载体的方法。该方法一般包括以下步骤：1)将至少一种重组PCV3基因克隆到转移载体中；以及2)将所述转移载体的含有重组PCV3基因的部分转染到病毒载体中以产生所述重组病毒载体。如上所述，PCV3基因可以编码ORF1、ORF2、或ORF3。
根据另一个方面，可以在步骤1)之前在体外扩增PCV3 DNA，其中修饰PCV3 DNA的侧接序列。用于扩增PCV3 DNA和修饰侧接序列、将体外扩增的PCV3 DNA克隆到转移载体中的体外方法以及合适的转移载体如上所述或是本领域技术人员已知的。因此，根据另一个方面，本公开涉及一种用于构建含有PCV3 DNA并且表达所期望的PCV3蛋白的重组病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：1)在体外扩增PCV3 DNA，其中修饰所述PCV3 DNA的侧接序列；2)将所扩增的PCV3 ORF2 DNA克隆到转移载体中；以及3)将所述转移载体或其含有所述重组PCV3 DNA的部分转染到病毒载体中以产生所述重组病毒载体。在一些方面，PCV3 DNA的侧接序列的修饰是通过引入5'Kozak序列和/或EcoR 1位点来进行的。
本公开的另一个方面涉及一种用于制备包含PCV3蛋白和灭活的病毒载体的组合物的方法。该方法一般包括以下步骤：1)将扩增的PCV3 DNA克隆到转移载体中；2)将所述转移载体的含有重组PCV3 DNA的部分转染到病毒中；3)用所述转染的病毒载体感染在培养基中的细胞；4)使所述转染的病毒载体从所述PCV3 DNA表达所述重组蛋白；5)将细胞与上清液分离；6)回收表达的PCV3蛋白；以及7)灭活所述重组病毒载体。在优选的形式中并且如上文所述，将在步骤7)之后进行步骤8)中和步骤。当然，在步骤1)之前，可以在体外扩增PCV3DNA，优选地使用PCV3 DNA的侧接序列，如上文所述。
在本公开的另一个方面，提供了一种用于制备用于激发针对PCV3的免疫应答的组合物，优选地是免疫原性组合物，例如疫苗的方法。一般来说，该方法包括以下步骤：将构建体转染到病毒中，其中所述构建体包含1)来自PCV3的ORF的重组DNA；2)在生长培养基中用所述转染的病毒感染细胞；3)使所述病毒从PCV3表达重组ORF蛋白；4)回收表达的重组ORF蛋白；5)以及通过将所述回收的蛋白质与合适的佐剂和/或其它药学上可接受的载体组合来制备所述组合物。在一些优选的形式中，所述组合物还包括表达所述PCV3 ORF蛋白的病毒载体的至少一部分和/或细胞培养上清液的一部分。
如本文所用的“佐剂”可以包括氢氧化铝和磷酸铝、皂苷(例如Quil A)、QS-21(马萨诸塞州剑桥的剑桥生物科技公司(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA))、GPI-0100(亚拉巴马州伯明翰的格林制药公司(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL))、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。所述乳液可以特别基于轻液体石蜡油(欧洲药典型)；由烯烃，特别是异丁烯或癸烯的低聚产生的类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯油；含有直链烷基的酸或醇的酯，更特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选地是非离子表面活性剂，特别是脱水山梨糖醇酯、二缩甘露醇酯(例如脱水甘露醇油酸酯)、二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯以及油酸酯、异硬脂酸酯、蓖麻油酸酯或羟基硬脂酸酯，它们任选地是乙氧基化的；以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特别是普朗尼克(Pluronic)产品，特别是L121。参见Hunter等,TheTheory and Practical Application of Adjuvants(《佐剂的理论和实际应用》),(Stewart-Tull,D.E.S.编著).纽约州约翰威利父子公司(JohnWiley and Sons,NY),第51-94页(1995)；以及Todd等,Vaccine15:564-570(1997)。
举例来说，有可能使用“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach(《疫苗设计、亚基以及佐剂方法》)”,M.Powell和M.Newman编著,普莱南出版社(PlenumPress),1995的第147页上描述的SPT乳液；以及该同一本书的第183页上描述的乳液MF59。
佐剂的另一个实例是选自以下的化合物：丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和烯基衍生物的共聚物。有利的佐剂化合物是交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，特别是与糖或多元醇的聚烯基醚交联。这些化合物被称为术语卡波姆(carbomer)(Phameuropa第8卷,第2期,1996年6月)。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462，它描述了这样的与多羟基化合物交联的丙烯酸类聚合物，所述多羟基化合物具有至少3个羟基，优选地不多于8个，至少三个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂族基团置换。优选的基团是含有2个至4个碳原子的那些，例如乙烯基、烯丙基以及其它烯键式不饱和基团。不饱和基团本身可以含有其它取代基，例如甲基。以卡波普(Carbopol)名义销售的产品(美国俄亥俄州的BF Goodrich公司(BF Goodrich,Ohio,USA))是特别适当的。它们与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。其中，可以提到的有卡波普974P、934P以及971P。顺丁烯二酸酐和烯基衍生物的共聚物中有作为顺丁烯二酸酐和乙烯的共聚物的共聚物EMA(孟山都公司(Monsanto))。这些聚合物在水中的溶解产生将被中和，优选地被中和到生理pH值的酸性溶液，以得到免疫原性组合物、免疫组合物或疫苗组合物本身将被并入其中的佐剂溶液。
另外的合适的佐剂包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi公司)、嵌段共聚物(佐治亚州亚特兰大的塞特科公司(CytRx,Atlanta GA))、SAF-M(加利福尼亚州埃默里维尔的Chiron公司(Chiron,Emeryville CA))、单磷酰基脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌的热不稳定性肠毒素(重组或以其它方式)、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽等等。
优选的是，以每剂约100μg至约10mg的量添加佐剂。甚至更优选的是，以每剂约100μg至约10mg的量添加佐剂。甚至更优选的是，以每剂约500μg至约5mg的量添加佐剂。甚至更优选的是，以每剂约750μg至约2.5mg的量添加佐剂。最优选的是，以每剂约1mg的量添加佐剂。
在本公开的另一个方面，用于制备用于激发针对PCV3的免疫应答的免疫原性组合物，例如疫苗的方法包括以下步骤：1)表达和回收PCV3 ORF蛋白；以及2)将所述回收的蛋白质与合适的佐剂混合。优选的是，表达步骤1)包括如对于PCV3蛋白的制备和回收所述的步骤。该方法的另一个任选的步骤包括将扩增的PCV3 ORF DNA克隆到第一载体中；将ORF DNA从该第一载体中切除；以及使用该切除的PCV3 ORF DNA克隆到转移载体中。优选的是，该方法的回收步骤还包括将培养基与细胞和细胞碎片分离的步骤。这可以通过任何常规的方式来进行，其中一种优选的方式包括经由具有尺寸在约0.45μM至约1.0μM的范围的孔的过滤器过滤所述细胞、细胞碎片以及生长培养基。最终，对于该方面，优选的是，在组合物中组合回收的重组PCV3 ORF蛋白之前，包括病毒灭活步骤。当包括灭活步骤时，还优选的是，包括中和步骤，如上文所述。
此外，所述组合物可以包括一种或多种药学上可接受的或兽医学上可接受的载体。如本文所用的“药学上可接受的载体”或“兽医学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等。在一种优选的形式中，本文提供的组合物含有从体外培养的细胞中回收的PCV3 ORF蛋白，其中将所述细胞用含有PCV3 ORF DNA并且表达PCV3 ORF蛋白的重组病毒载体感染，并且其中处理所述细胞培养物以灭活所述病毒载体，并且添加等同浓度的中和剂，并且其中还添加佐剂和生理盐水这两者。如同其它方面一样，PCV3 ORF蛋白可以是ORF1、ORF2、或ORF3。在包括时，生理盐水的量优选地是约50％至约90％(v/v)，更优选地是约60％至80％(v/v)，还更优选地是约70％(v/v)。任选地，该方法还可以包括添加保护剂。如本文所用的保护剂指的是抗微生物活性剂，例如像庆大霉素(Gentamycin)、硫柳汞等。具体来说，对于制备多剂量组合物，添加保护剂是最优选的。那些抗微生物活性剂是以有效防止目标组合物发生任何微生物污染或抑制目标组合物内任何微生物生长的浓度添加的。
本公开的方法还可以包括添加任何稳定剂，例如像糖、海藻糖、甘露糖醇、蔗糖等，以延长和/或维持产品保存期和/或增强稳定性。
在本公开的另一个方面，提供了由如上文所述的方法产生的产物。具体来说，本公开涉及一种物质组合物，所述物质组合物包含重组表达的PCV3 ORF蛋白。在一些优选的形式中，该物质组合物还包含适用于灭活病毒载体的试剂并且包含适用于灭活病毒载体的试剂。这样的产物可用作诱导免疫应答并且更优选地，赋予针对PCV3感染的临床体征的保护性免疫的免疫原性组合物。所述组合物一般包含由ORF1、ORF2、ORF3、或PCV3的这些ORF中的一个或多个的任何组合表达的多肽或其片段作为组合物的抗原组分。当然，应当了解的是，用于根据本公开的免疫原性组合物中的PCV3 ORF多肽可以通过任何方式获得，包括分离和纯化、标准蛋白质合成、以及重组方法。
PCV3感染的临床体征在断奶后约6周-8周大时、以及在生长猪和育成猪中，在12周至14周大时发生，并且在其它年龄组中偶发。临床体征包括在胸部、腹部、大腿以及前腿上出现各种大小和形状的广泛的紫红色略微凸起的斑点。随时间推移，斑点变成由深色痂皮覆盖，然后褪色，留下疤痕。此外，猪有抑郁症状，可能有高热，它们通常不愿意活动和进食，它们的体重减轻、呼吸沉重或有呼吸窘迫，在四肢上和眼睑周围可以看到水肿或液体，浅表淋巴结可能肿大，它们的毛发可能变得粗糙，它们的皮肤可能变得苍白，它们可能表现出黄疸，并且一些猪患有腹泻。尽管总体死亡率较高，但是大部分有皮肤病变的猪死亡。PCV3感染的进一步证据可以在胃和肠中发现，其中存在胃溃疡和出血，腹部中存在液体，在肺、扁桃体、脾脏、肝、以及肾脏中可以发现病变，这些器官是肿胀的、苍白的并且有斑点的，通过表面显示出许多小的出血。
任何PCV3 ORF作为如本文所用的PCV3 ORF DNA和/或多肽的来源都将是有效的。在优选的形式中，ORF DNA是ORF2。优选的PCV3 ORF2蛋白是SEQ ID NO.6的蛋白，但是本领域技术人员应当了解的是，该序列以及ORF1和ORF3的序列在序列同源性上可以变化多达10％，并且仍保留使它可用于免疫原性组合物中的抗原特征。免疫组合物的抗原特征可以例如通过攻击实验来估计。此外，当与由SEQ ID NO:3、5、或7的多核苷酸序列编码的PCV3ORF蛋白相比，修饰的抗原赋予至少70％，优选地80％，更优选地90％的保护性免疫时，该修饰的抗原的抗原特征仍保留。在一些形式中，使用PCV3 ORF蛋白的免疫原性部分作为所述组合物中的抗原组分。如本文所用的术语“免疫原性部分”分别指的是PCV3 ORF2蛋白和/或多核苷酸的截短和/或取代形式或片段。优选的是，这样的截短和/或取代形式或片段将包含来自全长ORF多肽的至少6个连续氨基酸。更优选的是，截短或取代形式或片段将具有来自全长ORF多肽的至少10个，更优选地至少15个，并且还更优选地至少19个连续氨基酸。应当进一步了解的是，这样的序列可以是更大片段或截短形式的一部分。优选的是，这样的截短或取代形式或片段将包含来自全长ORF核苷酸序列，例如SEQ ID NO:3、5或7的全长ORF核苷酸序列的至少18个连续核苷酸。更优选的是，截短或取代形式或片段将具有来自全长ORF核苷酸序列的至少30个，更优选地至少45个，并且还更优选地至少57个连续核苷酸。
如本领域已知的“序列同一性”指的是两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列，即参考序列与待与所述参考序列比较的给定序列之间的关系。序列同一性是通过在序列已经被最佳比对以产生最高的序列相似度之后将给定序列与参考序列比较来确定的，如通过这些序列串之间的匹配所确定。在这样的比对后，序列同一性是在逐个位置的基础上确定的，例如，序列在特定位置处是“相同的”，如果在该位置处，核苷酸或氨基酸残基是相同的。然后将这样的位置相同的总数除以参考序列中核苷酸或残基的总数以得到序列同一性％。序列同一性可以容易地通过已知的方法计算，包括但不限于以下文献中所述的那些：Computational Molecular Biology(《计算分子生物学》),Lesk,A.N.编著,纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press,New York)(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(《生物计算：信息学和基因组计划》),Smith,D.W.编著,纽约的学术出版社(Academic Press,New York)(1993)；Computer Analysis ofSequence Data(《序列数据的计算机分析》),第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著,新泽西州的胡马纳出版社(Humana Press,New Jersey)(1994)；Sequence Analysis inMolecular Biology(《分子生物学的序列分析》),von Heinge,G.,学术出版社(1987)；Sequence Analysis Primer(《序列分析入门》),Gribskov,M.和Devereux,J.编著,纽约的米斯托克顿出版社(M.Stockton Press,New York)(1991)；以及Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)，这些文献的教导以引用的方式并入本文。用于确定序列同一性的优选方法被设计成在所测试的序列之间给出最大的匹配。确定序列同一性的方法被编入确定给定序列之间的序列同一性的可公开获得的计算机程序中。这样的程序的实例包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.等,Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN以及FASTA(Altschul,S.F.等,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990))。BLASTX程序可从NCBI和其它来源公开获得(BLAST Manual(《BLAST手册》),Altschul,S.等,马里兰州贝塞斯达(Bethesda,MD)的NCVI NLM NIH 20894；Altschul,S.F.等,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)，这些文献的教导以引用的方式并入本文)。这些程序使用默认的空位权重将序列进行最佳比对以在给定序列与参考序列之间产生最高水平的序列同一性。作为说明，通过具有与参考核苷酸序列具有至少例如85％，优选地90％，甚至更优选地95％“序列同一性”的核苷酸序列的多核苷酸，认为给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是相同的，除了给定多核苷酸序列可以包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸最多15个，优选地最多10个，甚至更优选地最多5个点突变。换句话说，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85％，优选地90％，甚至更优选地95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中最多15％，优选地10％，甚至更优选地5％的核苷酸可以缺失或被另外的核苷酸取代，或占参考序列中总核苷酸的最多15％，优选地10％，甚至更优选地5％的数量的核苷酸可以插入参考序列中。参考序列的这些突变可以发生于参考核苷酸序列的5'末端或3'末端位置处或那些末端位置之间的任何位置处，单独散布在参考序列中的核苷酸之间或以一个或多个连续组的形式散布在参考序列内。类似地，通过具有与参考氨基酸序列具有至少例如85％，优选地90％，甚至更优选地95％序列同一性的给定氨基酸序列的多肽，认为所述多肽的给定氨基酸序列与参考序列相同，除了所述给定多肽序列可以包括参考氨基酸序列的每100个氨基酸最多15个，优选地最多10个，甚至更优选地最多5个氨基酸改变。换句话说，为了获得与参考氨基酸序列具有至少85％，优选地90％，甚至更优选地95％序列同一性的给定多肽序列，参考序列中最多15％，优选地最多10％，甚至更优选地最多5％的氨基酸残基可以缺失或被另外的氨基酸取代，或占所述参考序列中氨基酸残基总数的最多15％，优选地最多10％，甚至更优选地最多5％的数量的氨基酸可以插入所述参考序列中。参考序列的这些改变可以发生于所述参考氨基酸序列的氨基末端位置或羧基末端位置处或那些末端位置之间的任何位置处，单独散布在参考序列中的残基之间或以一个或多个连续的组的形式散布在参考序列内。优选的是，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。然而，当确定序列同一性时，保守取代不作为匹配被包括在内。
如本文所用的“序列同源性”指的是确定两个序列的相关性的方法。为了确定序列同源性，将两个或更多个序列最佳比对，并且如果需要的话，引入空位。然而，与“序列同一性”相反，当确定序列同源性时，保守氨基酸取代作为匹配被计算在内。换句话说，为了获得与参考序列具有95％序列同源性的多肽或多核苷酸，参考序列中85％，优选地90％，甚至更优选地95％的氨基酸残基或核苷酸必须匹配或包含被另外的氨基酸或核苷酸的保守取代，或占参考序列中总氨基酸残基或核苷酸的最多15％，优选地最多10％，甚至更优选地最多5％的数量的氨基酸或核苷酸(不包括保守取代)可以插入所述参考序列中。优选的是，同源序列包含至少一段50个，甚至更优选地100个，甚至更优选地250个，甚至更优选地500个核苷酸。
“保守取代”指的是氨基酸残基或核苷酸被具有包括尺寸、疏水性等类似特征或特性的另外的氨基酸残基或核苷酸取代以使得总体功能不发生显著变化。
“分离的”意指“通过人的手”改变它的天然状态，即如果它存在于自然界中，那么它已经被改变或从它的原始环境中取出、或两者兼有。举例来说，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是与它的天然状态的共存材料分开的相同的多核苷酸或多肽是“分离的”，如该术语在本文所用的那样。
在本公开的另一个方面，提供了一种有效用于减轻与PCV3感染相关的临床症状的严重程度的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含PCV3 ORF蛋白。优选的是，所述PCV3ORF2蛋白选自由以下各项组成的组：1)包含SEQ ID NO:4、6、8或其任何组合的序列的多肽；2)与1)的多肽至少90％同源的任何多肽；3)1)和/或2)的多肽的任何免疫原性部分；4)3)的免疫原性部分，其包含SEQ ID NO:4、6、或8的序列中所包括的至少10个连续氨基酸；5)(由于遗传密码的简并)等同于由包含SEQ ID NO:3、5或7的序列的DNA编码的多肽的多肽；6)由与5)的多核苷酸至少80％同源的多核苷酸编码的任何多肽；7)由5)和/或6)的多核苷酸编码的多肽的任何免疫原性部分；或8)7)的免疫原性部分，其中编码所述免疫原性部分的多核苷酸包含SEQ ID NO:3、5、或7的序列中所包括的至少30个连续核苷酸。
在优选的形式中，这些免疫原性部分将具有由SEQ ID NO:3、5或7的序列编码的PCV3 ORF蛋白的免疫原性特征。
根据另一个方面，PCV3 ORF2蛋白是以有效诱导所期望的免疫应答，即降低由PCV3感染引起的临床体征的发病率或减轻所述临床体征的严重程度的抗原包括水平提供于所述免疫组合物中的。优选的是，PCV3 ORF2蛋白包括水平是每毫升最终免疫原性组合物至少0.2μg的抗原(μg/ml)，更优选地是约0.2μg/ml至约400μg/ml。
所述多肽被并入可以向易受PCV3感染的动物施用的组合物中。在优选的形式中，所述组合物还可以包括本领域技术人员已知的另外的组分(还参见Remington'sPharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)(1990).第18版,伊斯顿的麦克出版社(Mack Publ.,Easton))。
本领域技术人员将了解的是，本文的组合物可以包含已知的可注射的生理学上可接受的无菌溶液。为了制备用于肠胃外注射或输注的即用型溶液，水性等渗溶液，例如盐水或相应的血浆蛋白溶液是容易获得的。此外，本公开的免疫原性组合物和疫苗组合物可以包括稀释剂、等渗剂、稳定剂、或佐剂。稀释剂可以包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等渗剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇、以及乳糖等等。稳定剂包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐等等。合适的佐剂是上述的那些。
根据另一个方面，本公开的免疫原性组合物进一步包含生理学上可接受的浓度的药学上可接受的盐，优选地是磷酸盐。优选的是，所述免疫原性组合物的pH值被调节到生理pH值，这意指约6.5至7.5。
本文所述的免疫原性组合物可以进一步包括一种或多种其它免疫调节剂，例如白细胞介素、干扰素、或其它细胞因子。所述免疫原性组合物还可以包括庆大霉素和硫柳汞。在另一个优选的实施方案中，本公开考虑了包含约1μg/ml至约60μg/ml的抗生素，并且更优选地少于约30μg/ml的抗生素的疫苗组合物。
将发现的是，如本文所提供的包含重组PCV3 ORF蛋白的免疫原性组合物在降低与PCV3感染相关的临床体征的严重程度或发病率乃至并且包括预防这样的体征方面是非常有效的。
本公开的另一个方面涉及一种试剂盒。一般来说，所述试剂盒包括包含至少一次剂量的如本文所提供的PCV3 ORF蛋白的免疫原性组合物的容器，其中一次剂量包含至少2μg的PCV3 ORF蛋白。所述容器可以包含1次至250次剂量的所述免疫原性组合物。在一些优选的形式中，所述容器包含1次、10次、25次、50次、100次、150次、200次、或250次剂量的PCV3ORF蛋白的免疫原性组合物。优选的是，包含多于一次剂量的PCV3 ORF蛋白的免疫原性组合物的容器中的每一个进一步包含抗微生物活性剂。那些药剂是例如包括庆大霉素和硫柳汞等的抗生素。因此，本公开的一个方面涉及一种容器，所述容器包含1次至250次剂量的PCV3ORF蛋白的免疫原性组合物，其中一次剂量包含至少2μg的PCV3 ORF蛋白、以及庆大霉素和/或硫柳汞，优选地约1μg/ml至约60μg/ml的抗生素，并且更优选地少于约30μg/ml。在优选的形式中，所述试剂盒还包括说明手册，包括关于向动物，优选地猪和仔猪肌内施用至少一次剂量的PCV3 ORF蛋白的免疫原性组合物以降低与PCV3感染相关的临床症状的发病率和/或严重程度的信息。此外，根据另一个方面，所述说明手册包含了至少一次剂量的PCV3 ORF2的免疫原性组合物的第二次或进一步施用的信息，其中第二次施用或任何进一步施用是在首次或任何前一次施用后至少14天后进行的。在一些优选的形式中，所述说明手册还包括施用免疫刺激剂的信息。优选的是，所述免疫刺激剂应当给予至少两次。优选的是，至少3天，更优选地至少5天，并且甚至更优选地至少7天介于免疫刺激剂的第一次施用与第二次或任何进一步施用之间。优选的是，在PCV3 ORF蛋白的免疫原性组合物的首次施用之后至少10天，优选地15天，甚至更优选地20天，并且还甚至更优选地至少22天后给予免疫刺激剂。应当了解的是，还可以使用本领域技术人员已知的任何免疫刺激剂。如本文所用的“免疫刺激剂”意指可以引发一般免疫应答，优选地不会引发或增加特异性免疫应答，例如针对特定病原体的免疫应答的任何药剂或组合物。进一步说明以合适的剂量施用免疫刺激剂。所述试剂盒还可以包括第二容器，所述第二容器包括至少一次剂量的免疫刺激剂。
本公开的另一个方面涉及如上文所述的试剂盒，所述试剂盒包括如本文所提供的PCV3 ORF的免疫原性组合物和说明手册，其中所述说明手册进一步包括与包含另外的抗原的、有效降低与另外的猪病原体相关的临床体征的严重程度或发病率的免疫原性组合物一起或大约同时施用PCV3 ORF免疫原性组合物的信息。优选的是，所述手册含有何时施用含有PCV3 ORF的组合物和包含另外的抗原的免疫原性组合物的信息。
另一个方面涉及本文提供的组合物中的任一种用作药物，优选地用作兽用药物，甚至更优选地用作疫苗的用途。此外，本公开还涉及本文所述的组合物中的任一种用于制备用于减轻与PCV3感染相关的临床症状的严重程度的药物的用途。优选的是，所述药物用于在猪中，甚至更优选地在仔猪中预防PCV3感染。
另一个方面涉及一种方法，所述方法用于在受试者中(1)预防PCV3感染或再次感染或(2)降低由PCV3所引起的临床症状的发病率或严重程度或消除所述临床症状，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所提供的免疫原性组合物中的任一种。优选的是，所述受试者是猪。应当了解的是，所述降低是与没有接受本公开的组合物的施用的受试者相比的。优选的是，施用一次剂量或两次剂量的免疫原性组合物，其中一次剂量优选地包含至少约2μg的PCV3 ORF蛋白。另一个方面涉及如上文所述的治疗方法，其中施用所述免疫原性组合物的第二次施用。优选的是，所述第二次施用是用相同的免疫原性组合物进行的，所述免疫原性组合物优选地具有相同量的PCV3 ORF蛋白。优选的是，第二次施用是在首次施用之后至少14天后，甚至更优选地在首次施用之后至少4周后进行的。在优选的形式中，所述方法在仅仅单次剂量的免疫原性组合物之后是有效的并且不需要第二次或后续的施用以对受试者赋予保护性益处。
根据另一个方面，本公开提供了一种多价组合疫苗，所述多价组合疫苗包括有效降低PCV3感染的发病率或减轻PCV3感染的严重程度的免疫剂、以及针对猪中另外的致病性生物体的至少一种免疫活性组分。
具体来说，有效降低PCV3感染的发病率或减轻PCV3感染的严重程度的免疫剂是PCV3抗原。优选的是，所述PCV3抗原是如本文所提供的PCV3 ORF蛋白、或包含PCV3 ORF蛋白的如上文所述的任何免疫原性组合物。PCV3 ORF蛋白可以是ORF1、ORF2、ORF3、或其任何组合。举例来说，ORF1与ORF2的组合、ORF2与ORF3的组合、ORF1与ORF3的组合、以及ORF1、ORF2、以及ORF3的组合是可以在单个免疫原性组合物中组合的PCV3 ORF的每一种可能的组合。在优选的形式中，ORF是ORF2或包括ORF2的组合。
如本文所用的术语“免疫原性蛋白”、“免疫原性多肽”或“免疫原性氨基酸序列”指的是在宿主中引发针对包含所述免疫原性蛋白、免疫原性多肽或免疫原性氨基酸序列的病原体的免疫应答的任何氨基酸序列。如本文所用的“免疫原性蛋白”、“免疫原性多肽”或“免疫原性氨基酸序列”包括任何蛋白质的全长序列、其类似物、或其免疫原性片段。“免疫原性片段”意指蛋白质的包括一个或多个表位并且因此引发针对相关病原体的免疫应答的片段。这样的片段可以使用本领域公知的许多表位定位技术来鉴定。参见例如EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology(《分子生物学方法中的表位定位方案》),第66卷(Glenn E.Morris编著,1996)新泽西州托托瓦的胡马纳出版社(HumanaPress,Totowa,New Jersey)。举例来说，线性表位可以通过例如在固体载体上同时合成大量的肽(所述肽对应于蛋白质分子的部分)并且在所述肽仍与载体连接时，使所述肽与抗体反应来确定。这样的技术是本领域已知的并且描述于例如美国专利号4,708,871；Geysen等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002；Geysen等(1986)Molec.Immunol.23:709-715中。类似地，构象表位容易诸如通过例如X射线结晶学和二维核磁共振来确定氨基酸的空间构象来鉴定。参见例如Epitope Mapping Protocols(《表位定位方案》)(同上)。合成抗原也被包括在所述定义内，例如多表位、侧接表位、以及其它重组或合成衍生的抗原。参见例如Bergmann等(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781；Bergmann等(1996),J.Immunol.157:3242-3249；Suhrbier,A.(1997),Immunol.and Cell Biol.75:402-408；Gardner等,(1998)瑞士日内瓦的第12届世界AIDS大会(12th World AIDS Conference,Geneva,Switzerland),1998年6月28日-7月3日。
优选的是，猪中的其它致病性生物体选自由以下各项组成的组：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia)；腺病毒；甲病毒属(Alphavirus)，如东方马脑炎病毒；支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)；短螺旋体属菌种(Brachyspiraspp.)，优选地是猪痢疾短螺旋体(B.hyodyentheriae)；大肠柔毛短螺旋体(B.piosicoli)；猪布鲁氏菌(Brucella suis)，优选地是生物变种1、2、以及3；猪瘟病毒；梭菌属菌种(Clostridium spp.)，优选地是艰难梭菌(Cl.difficile)、产气荚膜梭菌(Cl.perfringens)A型、B型、以及C型、诺维氏梭菌(Cl.novyi)、腐败梭菌(Cl.septicum)、破伤风梭菌(Cl.tetani)；冠状病毒，优选地是猪呼吸道冠状病毒；猪附红细胞体(Eperythrozoonosis suis)；红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhsiopathiae)；大肠杆菌；副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，优选地是亚型1、7以及14；血凝性脑脊髓炎病毒；乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)；细胞内劳索尼亚氏菌(Lawsoniaintracellularis)；钩端螺旋体属菌种(Leptospira spp.)，优选地是南方钩端螺旋体(Leptospira australis)；犬型钩端螺旋体(Leptospira canicola)；流感伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)；黄疸出血型钩端螺旋体(Leptospiraicterohaemorrhagicae)；以及问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)；波摩那型钩端螺旋体(Leptospira pomona)；塔拉索夫型钩端螺旋体(Leptospira tarassovi)；分枝杆菌属菌种(Mycobacterium spp.)，优选地是鸟分枝杆菌(M.avium)；细胞内分枝杆菌(M.intracellulare)；以及牛分枝杆菌(M.bovis)；猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)(M hyo)；多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)；猪巨细胞病毒；猪细小病毒；猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒；伪狂犬病病毒；轮状病毒；沙门氏菌属菌种(Salmonella spp.)；优选地是鼠伤寒沙门氏菌(S.thyhimurium)；和猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)；猪葡萄球菌(Staph.hyicus)；葡萄球菌属菌种(Staphylococcusspp.)，优选地是链球菌属菌种(Streptococcus spp.)，优选地是猪链球菌(Strep.suis)；猪疱疹病毒；猪流感病毒；猪痘病毒；猪痘病毒；水疱性口炎病毒；猪水疱疹病毒；哈德焦钩端螺旋体(Leptospira Hardjo)；和/或猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynoviae)。
如本文所用的“免疫活性组分”意指如下的组分，所述组分在所述组分施用至的动物中诱导或刺激免疫应答。根据一个优选的实施方案，所述免疫应答是针对所述组分或包含所述组分的微生物。根据另一个优选的实施方案，免疫活性组分是减毒的微生物，包括修饰的活病毒(MLV)、杀死的微生物或微生物的至少免疫活性部分。
如本文所用的“微生物的免疫活性部分”意指微生物的含有蛋白质、糖、和/或糖蛋白的级分，所述级分包含至少一种抗原，所述抗原在所述组分施用至的动物中诱导或刺激免疫应答。根据一个优选的实施方案，所述免疫应答是针对微生物的所述免疫活性部分或包含所述免疫活性部分的微生物。
在本公开的另一个方面，提供了可用作疫苗的猪圆环病毒(PCV3)的感染性嵌合DNA克隆和衍生自所述DNA克隆的活嵌合病毒。新的活嵌合遗传无毒病毒是由非病原性PCV1基因组结构制成的，其中病原性PCV3株的免疫原性基因置换PCV1的基因，通常在相同的相应位置中。本公开涵盖了含有本文所述的新的重组核酸分子的生物功能性质粒、病毒载体等、由包含所述DNA的载体转染的合适的宿主细胞以及免疫原性多肽表达产物。在本公开的范围内包括一种保护猪或提供保护作用防止上述病毒感染或临床体征以及由PCV3所引起的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、肺炎、繁殖障碍、以及猪皮炎和肾病综合征(PDNS)的新型方法，所述方法包括向需要这样的保护作用的猪施用免疫有效量的疫苗，所述疫苗包含例如质粒中的克隆的嵌合DNA、衍生自嵌合DNA克隆的嵌合病毒、从本文所述的DNA表达的多肽产物、或其任何组合。本公开的另一个方面涉及PCV3免疫原性衣壳基因和蛋白的新型突变体以及在嵌合克隆中引入所述突变以促进细胞培养物生长和确保疫苗安全性。在又另一个方面，本公开提供了新的感染性PCV3分子DNA和PCV的相互嵌合DNA克隆，它们可用作实验模型以获得或表征新型无毒病毒疫苗。
根据本公开的一个方面，提供了猪圆环病毒(PCV)的感染性分子和嵌合核酸分子、由所述嵌合核酸分子产生的活嵌合病毒以及用于保护猪防止由PCV3所引起的病毒感染、肺炎、繁殖障碍、PMWS、和/或PDNS的兽用疫苗。本公开进一步提供了可以用作疫苗的免疫原性多肽表达产物。PCV(PCV1-3)的新的无毒的感染性嵌合DNA分子包含编码感染性非病原性PCV1的核酸分子，所述核酸分子含有病原性PCV3的免疫原性开放阅读框(ORF)基因代替PCV1基因组中的ORF基因。所述感染性嵌合PCV1-3DNA克隆优选地含有克隆在感染性非病原性PCV1 DNA克隆的基因组骨架中的PCV3 DNA的免疫原性衣壳基因(ORF2)。一般来说，PCV3DNA的衣壳基因置换非病原性PCV1基因组结构中PCV1 DNA的ORF2基因，但是可以预期的是，多种位置置换可以经由遗传工程化来构建以获得其它无毒的或减毒的嵌合DNA克隆。PCV1与PCV3之间的相互嵌合感染性PCV3-1 DNA克隆作为对照被公开以分析本公开的嵌合PCV1-3克隆并且是通过在病原性PCV3感染性DNA克隆的骨架中用PCV1的衣壳基因置换PCV3的衣壳基因来构建的。除了作为实验模型之外，相互嵌合PCV3-1DNA克隆还可以用于制备特别定制的疫苗。
在其它形式中，PCV3的ORF3可以取代PCV1-3或PCV3-1感染性克隆的ORF2或ORF3。在另外的其它优选的形式中，PCV3的ORF1和ORF3可以取代PCV1-3或PCV3-1感染性克隆的PCV3的ORF2。
在被转染到PK-15细胞中和给予猪时，本文所述的PCV3的克隆的基因组DNA将被证实在体外和体内具有感染性。感染性PCV3 DNA克隆将在猪中产生PMWS和/或PDNS特征性的病理病变，从而允许对临床疾病的改进的表征以及对组织细胞中的病毒分布的了解。这种新的容易再现的病原体适用于开发合适的疫苗接种计划以在猪中预防PMWS和/或PDNS。
新型嵌合PCV1-3 DNA克隆也将通过体外转染PK-15细胞和向猪体内施用而具有感染性。在转染的PK-15细胞中，一种优选的嵌合PCV1-3 DNA克隆将表达PCV3 ORF2衣壳抗原(PCV3的免疫原性衣壳蛋白)，而相互嵌合PCV3-1 DNA克隆将表达PCV1衣壳抗原，这可以使用对PCV1衣壳抗原或PCV3衣壳抗原具有特异性的抗体通过免疫荧光测定(IFA)来证实。向PCV3特异性抗体的血清转化在接种了感染性PCV3克隆以及嵌合PCV1-3克隆的猪中将是可检测到的。检测向PCV3特异性抗体的血清转化将确定嵌合PCV1-3 DNA克隆在受感染的猪中诱导PCV3特异性抗体，并且因此，将用于保护接受接种的猪防止PCV3的感染。
惊人和有利的是，具有克隆到非病原性PCV1基因组骨架中的病原性PCV3的免疫原性衣壳基因(ORF2)的嵌合PCV1-3感染性DNA克隆将在猪中诱导针对病原性PCV3衣壳抗原的特异性抗体应答，而它独特地保留了PCV1的非病原性质。接种了所述嵌合PCV1-3感染性DNA克隆的动物将产生类似于接种了PCV1的动物的轻度感染，同时向针对病原性PCV3的ORF2衣壳蛋白的抗体进行血清转化。在接种了PCV1和嵌合PCV1-3的动物中所观测到的病毒血症的平均长度将短于在接种了病原性PCV3的动物中所观测到的平均长度。在一些接受接种的动物中没有可检测的嵌合PCV1-3病毒血症将不会影响接种了PCV1-3的猪中向针对PCV3 ORF2衣壳蛋白的抗体的血清转化。所述结果将表明，即使嵌合PCV1-3病毒血症在一些接受接种的动物中是短暂的或不可检测的，嵌合PCV1-3病毒也将能够诱导针对PCV3 ORF2衣壳蛋白的抗体应答。嵌合PCV1-3感染性DNA克隆诱导对病原性PCV3免疫原性ORF2衣壳蛋白具有特异性的免疫应答、而对猪仍是非病原性的特殊能力将使得(一种或多种)嵌合PCV1-3克隆特别可用作遗传工程活减毒疫苗和其它类型的疫苗。含有所述嵌合核酸分子的合适的细胞将独特地产生活的感染性的嵌合猪圆环病毒。在一些优选的形式中，活的感染性的嵌合病毒将通过经由体外和体内转染对PK-15细胞进行转染而从嵌合DNA克隆衍生。本公开进一步设想了所述嵌合病毒衍生自所述嵌合核苷酸序列的互补链或与所述嵌合核苷酸序列具有至少90％，更优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的高度同源性的核苷酸序列。
在本公开的范围内还包括了含有本文所述的新的重组核酸分子的生物功能性质粒、病毒载体等、由包含所述嵌合和分子DNA克隆的载体转染的合适的宿主细胞以及免疫原性多肽表达产物。一些特别优选的免疫原性蛋白将具有SEQ ID NO:4、6、或8所示的氨基酸序列。其生物活性变体进一步由本公开所涵盖。本领域的普通技术人员将知晓如何对多肽序列的一个或多个氨基酸进行修饰、取代、缺失等并且产生保留与亲本序列相同的、或基本上相同的活性的生物活性变体而无需过多的努力。
为了产生本公开的免疫原性多肽产物，所述方法可以包括以下步骤：在合适的营养条件下，以允许所述多肽产物表达的方式，培养用本文所述的新的重组核酸分子转染的原核或真核宿主细胞；以及通过本领域已知的标准方法分离所述核酸分子表达的所期望的多肽产物。预期免疫原性蛋白可以通过例如像生物化学合成等其它技术来制备。
本公开的另一个实施方案涉及PCV3免疫原性衣壳基因和蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列的新型突变。PCV3是PMWS、PDNS、肺炎、以及繁殖障碍的致病因子，而源自于PK-15细胞培养物的猪I型圆环病毒(PCV1)对猪是非病原性的。可以通过常规程序在细胞培养物中进一步测试含有突变的PCV1-3疫苗以选择促进细胞培养物生长或在对猪进行疫苗接种时由于PCV3毒性特性(如有任何存留)的进一步减弱而确保改进的安全性措施的组合。虽然PCV1-3嵌合体的益处在于它的天然无毒性状，但是替代使用突变的PCV3 ORF2来制备PCV1-3嵌合体提供了本公开的另一个实施方案，如果保证天然活嵌合体疫苗的进一步安全，那么该实施方案是可用的。
在本公开的范围内还包括了嵌合病毒和分子DNA克隆的疫苗以及使用它们的方法。接受接种的猪被保护而防止由PCV3所引起的严重的病毒感染、肺炎、繁殖障碍、PDNS、以及PMWS。所述新型方法保护需要防止病毒感染、肺炎、繁殖障碍、PDNS、或PMWS的保护作用的猪，这是通过向所述猪施用免疫有效量的根据本公开的疫苗来实现的，例如像包含免疫原性量的嵌合PCV1-3 DNA、克隆的嵌合病毒、含有PCV1-3的嵌合DNA的质粒或病毒载体、多肽表达产物、重组PCV3 DNA等的疫苗。可以同时向所述猪给予其它抗原(如上述那些)和免疫刺激剂以提供防止感染的广谱保护作用。这样的同时施用可以在不同的和分开的施用中提供或组合成单一多价组合物。
所述疫苗包含例如感染性嵌合PCV1-3 DNA、合适的质粒或载体(例如像pSK载体)中克隆的PCV嵌合DNA基因组、无毒的活嵌合病毒、灭活的嵌合病毒等与无毒的生理学上可接受的载体以及任选的一种或多种佐剂的组合，如上文所述。所述疫苗还可以包含本文所述的感染性PCV3分子DNA克隆。本公开的无毒的活病毒疫苗与传统病毒疫苗相比提供了优势，所述传统病毒疫苗使用有恢复到毒性状态的风险的减毒的活病毒或可能不能诱导足够的抗体免疫应答以提供防止病毒性疾病的保护作用的杀死的细胞培养物繁殖的全病毒。
尽管活病毒疫苗具有一些优势，但是可以使用其它类型的疫苗以用本文所述的新的嵌合病毒和其它抗原对猪进行接种。为了制备灭活的病毒疫苗，例如，通过本领域已知的或本文所述的方法来从感染性DNA克隆进行病毒繁殖。然后通过本领域的普通技术人员一般已知的方案来优化连续病毒灭活。
灭活的病毒疫苗可以通过用灭活剂，例如福尔马林或疏水性溶剂、酸等、通过用紫外光或X射线辐照、通过加热等来处理衍生自克隆的PCV DNA的分离的病毒或嵌合病毒来制备。以本领域了解的方式进行灭活。如果所述病毒不能感染易受感染的细胞，那么所述病毒被认为是灭活的。
为了从病原性克隆制备减毒疫苗，首先通过本领域已知的方法来使适应组织培养的活的病原性PCV3减毒(使其成为非病原性的或无害的)，这通常是通过经由细胞培养进行连续传代来进行的。还可以通过基因缺失或产生病毒的基因突变来使病原性克隆减毒。然后，可以使用减毒的PCV3病毒来经由重组技术构建保留PCV1的非病原性表型，但是在选自PCV3基因组的免疫原性性状的强度方面可以变化的另外的嵌合PCV1-3病毒。
本公开还涉及疫苗，所述疫苗包含PCV3的基因组的核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQID No.3、SEQ ID No.5、SEQ Id No.7、或其同源物或片段、以及可接受的药物媒介物或兽用媒介物。在本公开的一个实施方案中，所述核苷酸序列选自、或其同源物或片段。在本公开的另一个实施方案中，所述同源物与SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或SEQ IDNo.8具有至少90％的序列同一性。在又另一个实施方案中，所述疫苗进一步包含佐剂。
本公开的另一个方面涉及疫苗，所述疫苗包含载体和可接受的药物媒介物或兽用媒介物，所述载体包含PCV3的基因组的核苷酸序列，例如SEQ ID NO.2、4、6、8、或其任何组合、或其同源物或片段。
本公开还涉及疫苗免疫原性组合物，其包含细胞和可接受的药物载体或兽用载体，其中所述细胞用PCV3的基因组的核苷酸序列或其同源物或片段转化。
再此外，本公开涉及疫苗或免疫原性组合物，其包含药学上可接受的媒介物和单一多肽，其中所述单一多肽由SEQ ID No.2、4、6、或8组成。
此外，本公开涉及针对PCV3对哺乳动物进行免疫的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的上述疫苗或免疫原性组合物。
本公开涉及选自序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或它们的片段之一的PCV3的基因组的核苷酸序列。
本公开同样涉及核苷酸序列，所述核苷酸序列的特征在于它们选自：a)序列SEQID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或它们的片段之一的特异性片段的核苷酸序列；b)与诸如a)中所定义的核苷酸序列同源的核苷酸序列；c)与诸如a)或b)中所定义的核苷酸序列互补的核苷酸序列、以及它们相应的RNA的核苷酸序列；d)能够在严格条件下与诸如a)、b)或c)中所定义的序列杂交的核苷酸序列；e)包含诸如a)、b)、c)或d)中所定义的序列的核苷酸序列；以及f)由诸如a)、b)、c)、d)或e)中所定义的核苷酸序列修饰的核苷酸序列。
根据本公开，核苷酸、多核苷酸或核酸序列将被理解成意指呈单体形式和二聚体(所谓的串联)形式的双链DNA或单链DNA这两者以及所述DNA的转录产物。
必须理解的是，本公开不涉及在其天然环境中获取，也就是说处于天然状态的基因组核苷酸序列。它涉及已经有可能被分离、纯化或部分纯化的序列，这是从分离方法开始的，例如像离子交换色谱、通过基于分子尺寸的排阻、或通过亲和力、或可选择地基于在不同溶剂中的溶解度的分级分离技术；或从遗传工程化的方法开始，例如扩增、克隆以及亚克隆，本公开的序列有可能由载体携带。
本公开的序列的互补核苷酸序列被理解为意指核苷酸与本公开的序列的那些互补并且取向相反(反平行序列)的任何DNA。
在严格条件下与根据本公开的核苷酸序列杂交被理解为意指在以这样的方式选择的温度和离子强度的条件下杂交，所述方式使得它们允许维持互补DNA的两个片段之间的杂交。
在根据本公开的核苷酸序列中，可以用作允许获得根据本公开的同源序列的方法中的引物或探针的那些核苷酸序列同样是优选的，这些方法诸如聚合酶链反应(PCR)、核酸克隆和测序，是本领域技术人员公知的。
在所述根据本公开的核苷酸序列中，可以用作允许诊断PCV3或它的变体之一(如下文所定义)的存在的方法中的引物或探针的那些核苷酸序列再次是优选的。
能够调节、抑制或诱导PCV3基因的表达和/或能够调节PCV3在宿主细胞和/或生物体中的复制周期的根据本公开的核苷酸序列同样是优选的。复制周期将被理解为表示PCV3的侵入和增殖、以及它在宿主生物体中从宿主细胞到宿主细胞的繁殖。
在所述根据本公开的核苷酸序列当中有对应于被称为ORF序列的开放阅读框并且分别编码例如像序列SEQ ID No.4(ORF1)、SEQ ID No.6(ORF2)以及SEQ ID No.8(ORF3)的多肽的那些。根据本公开的核苷酸序列片段可以例如通过特异性扩增(例如PCR)，或在用适当的限制性内切酶消化根据本公开的核苷酸序列之后获得，这些方法特别描述于Sambrook等,1989的著作中。所述代表性片段同样可以通过化学合成(当它们的尺寸不是非常大时)以及根据本领域技术人员公知的方法来获得。
修饰的核苷酸序列将被理解为意指根据本领域技术人员公知的技术通过诱变获得的任何核苷酸序列，并且所述核苷酸序列相对于根据本公开的正常序列含有修饰，例如多肽表达的调节序列和/或启动子序列中的突变，特别是引起所述多肽的表达速率的改变或复制周期的调节。
修饰的核苷酸序列将同样被理解为意指编码如下文所定义的修饰的多肽的任何核苷酸序列。
本公开涉及根据本公开的PCV3的核苷酸序列，特征在于它们选自序列SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、或它们的片段之一。
本公开同样涉及核苷酸序列，所述核苷酸序列的特征在于它们包含选自以下各项的核苷酸序列：a)核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQID No.9、或它们的片段之一；b)诸如a)中所定义的序列的特异性片段的核苷酸序列；c)与诸如a)或b)中所定义的序列具有至少80％同一性的同源核苷酸序列；d)对应于诸如a)、b)或c)中所定义的序列的互补核苷酸序列或RNA序列；以及e)被诸如a)、b)、c)或d)中所定义的序列修饰的核苷酸序列。
就关注与核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、或它们的片段之一的同源性而言，与序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.7之一、或它们的片段之一具有至少80％，优选地90％或95％的同一性百分比的同源序列，特别是特异性序列是优选的。所述特异性同源序列可以包含例如对应于PCV3的序列ORF1、ORF2、ORF3的序列。以相同的方式，这些特异性同源序列可以对应于与PCV3株内的突变相关的变异并且特别是对应于至少一个核苷酸的截短、取代、缺失和/或添加。
本公开包含由根据本公开的核苷酸序列编码的多肽，优选地是序列由片段，特别是特异性片段表示的多肽，这六个氨基酸序列对应于可以根据序列SEQ ID No.1或序列SEQID No.2的三个可能的阅读框之一编码的多肽。
本公开同样涉及多肽，所述多肽的特征在于它们包含选自氨基酸序列SEQ IDNo.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、或它们的片段之一的多肽。
本公开还涉及多肽，所述多肽的特征在于它们包含选自以下各项的多肽：a)根据本公开的氨基酸序列的多肽的至少5个氨基酸的特异性片段；b)与诸如a)中所定义的多肽同源的多肽；c)诸如a)或b)中所定义的多肽的特异性生物活性片段；以及d)被诸如a)、b)或c)中所定义的多肽修饰的多肽。
在根据本公开的多肽中，氨基酸序列SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6以及SEQ ID No.8的多肽也是优选的，这些多肽特别能够特异性识别在PCV3感染期间产生的抗体。这些多肽因此具有对PCV3具有特异性的表位并且因此可以特别用于诊断领域或用作免疫原性剂以在猪中赋予防止PCV3感染的保护作用。
在本说明中，术语多肽、肽以及蛋白质是可互换的。
必须了解的是，本公开不涉及呈天然形式的多肽，也就是说，它们不是在它们的天然环境中获取的，但是它们可以通过从天然来源纯化来分离或获得，或者通过遗传重组获得，或可选择地通过化学合成获得，并且它们因此可以含有非天然氨基酸，如下文所将描述的那样。
根据本公开的多肽片段被理解为表示含有至少5个连续氨基酸，优选地10个连续氨基酸或15个连续氨基酸的多肽。
在本公开中，特异性多肽片段被理解为表示由根据本公开的特异性片段核苷酸序列编码的连续多肽片段。
同源多肽将被理解为表示相对于天然多肽具有某些修饰，诸如特别是至少一个氨基酸的缺失、添加或取代、截短、延长、嵌合融合、和/或突变的多肽。在同源多肽中，氨基酸序列与根据本公开的多肽的氨基酸序列具有至少80％，优选地90％同源性的那些是优选的。
特异性同源多肽将被理解为表示诸如上文所定义并且具有根据本公开的多肽的特异性片段的同源多肽。
在取代的情况下，一个或多个连续的或不连续的氨基酸被“等同”氨基酸置换。表述“等同”氨基酸在此旨在表示下述任何氨基酸，所述氨基酸能够被基本结构的氨基酸之一取代，然而基本上不会改变相应肽的生物活性并且它们将由以下定义。这些等同氨基酸可以通过根据它们与它们所取代的氨基酸的结构同源性或根据能够进行的在不同多肽之间生物活性的比较测试的结果来确定。举例来说，将提到能够进行而不会造成相应修饰的多肽的生物活性的广泛改变的取代的可能性，例如亮氨酸被缬氨酸或异亮氨酸置换、天冬氨酸被谷氨酸置换、谷氨酰胺被天冬酰胺置换、精氨酸被赖氨酸置换等，反向取代在相同的条件下自然是可设想的。
特异性同源多肽同样对应于由诸如上文所定义的特异性同源核苷酸序列编码的多肽并且因此在本定义中包含突变的或对应于可以存在于PCV3中的变体的多肽，并且特别是对应于至少一个氨基酸残基的截短、取代、缺失和/或添加的多肽。
根据本公开的多肽的特异性生物活性片段将特别被理解为表示诸如上文所定义的具有根据本公开的多肽的特征中的至少一个的特异性多肽片段，特别是其中它：能够诱导针对PCV3的免疫原性反应；和/或能够由根据本公开的多肽的特异性抗体识别；和/或能够与PCV3的多肽或核苷酸序列连接；和/或能够发挥生理活性，即使是部分的，例如像传播或结构(衣壳)活性；和/或能够调节、诱导或抑制PCV3基因或它的变体之一的表达；和/或能够调节PCV3在细胞和/或宿主生物体中的复制周期。
根据本公开的多肽片段可以对应于天然存在于PCV3中的分离或纯化的片段或对应于可以通过切割所述多肽而获得的片段，所述切割经由蛋白水解酶，例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶或胶原酶、或经由化学试剂，例如溴化氰(CNBr)或可选择地经由将所述多肽放置在非常酸性的环境中，例如在pH 2.5。这样的多肽片段同样可以很容易地通过化学合成、从由根据本公开的表达载体转化的宿主来制备，所述表达载体含有允许所述片段表达的核酸，处于适当的调节元件和/或表达元件的控制之下。
根据本公开的多肽的“修饰的多肽”被理解为表示通过遗传重组或通过化学合成获得的多肽，如下文所将描述的那样，其相对于正常序列具有至少一个修饰。这些修饰将特别能够位于根据本公开的多肽的特异性、病原性和/或毒力的起源处的氨基酸、或结构构象起源处的氨基酸和膜插入能力的起源处的氨基酸。因此将有可能产生具有等同的、增加的或降低的活性的、以及具有等同的、更窄的或更宽的特异性的多肽。在修饰的多肽中，有必要提到其中最多5个氨基酸可以被修饰、在N末端或C末端处被截短、或甚至缺失或添加的多肽。
如所指示，多肽的修饰将特别具有以下各项作为目的：为了使它能够调节、抑制或诱导PCV3基因的表达和/或能够调节PCV3在细胞和/或宿主生物体中的复制周期、能够允许它并入疫苗组合物中、和/或能够改变它作为用于治疗用途的化合物的生物利用度。
允许证实对真核细胞或原核细胞的所述调节的方法是本领域技术人员公知的。同样应当充分理解的是，将有可能使用编码所述修饰的多肽的核苷酸序列用于所述调节，例如经由根据本公开和下文所述的载体以例如预防或治疗与感染相关的病变。
前述修饰的多肽可以通过使用组合化学来获得，其中有可能系统地改变所述多肽的部分，之后在例如模型、细胞培养物或微生物上对它们进行测试，以选择最具活性或具有所寻求的特性的化合物。
化学合成同样具有能够使用非天然氨基酸或非肽键的优势。因此，为了提高根据本公开的多肽的寿命期限，可能关注的是，使用例如呈D型的非天然氨基酸或例如氨基酸类似物，特别是含硫形式。
最终，将有可能将根据本公开的多肽、它的特异性或修饰的同源形式的结构整合成多肽类型或其它类型的化学结构。因此，可能关注的是，在N末端和C末端处提供不被蛋白酶识别的化合物。
编码根据本公开的多肽的核苷酸序列同样是本公开的一部分。
本公开同样涉及可用作引物或探针的核苷酸序列，所述核苷酸序列的特征在于所述序列选自根据本公开的核苷酸序列。
对PCV3进行克隆和测序已经允许在与其它猪圆环病毒的核苷酸序列进行比较分析之后在这些核酸的片段的序列中鉴定出对PCV3具有严格特异性的那些和对应于非PCV3的猪圆环病毒的共有序列的那些。同样非常需要可用作对全部其它已知的和非病原性的猪圆环病毒具有特异性的引物或探针的核苷酸序列。
应当充分理解的是，本公开同样涉及非PCV3的已知猪圆环病毒的特异性多肽，所述多肽是由所述共有核苷酸序列编码的，能够通过从天然多肽纯化、通过遗传重组或通过化学合成，通过本领域技术人员公知的程序获得并且如下文具体描述的那样。以相同的方式，针对由所述共有核苷酸序列编码的所述特异性多肽的标记或未标记的单克隆抗体或多克隆抗体也是本公开的一部分。
将有可能将所述共有核苷酸序列、所述相应的多肽以及针对所述多肽的所述抗体用于诸如下文所述的用于检测和/或鉴定的程序或套装中，作为对PCV3A型和/或B型具有特异性的根据本公开的核苷酸序列、多肽或抗体的代替或补充。
这些方案已经被改进用于差异检测复制中病毒粒子或DNA的特定复制形式的圆环单体形式和所谓的串联分子构建体中存在的二聚体形式。
本公开另外涉及根据本公开的核苷酸序列用作引物或探针以用于检测和/或扩增核酸序列的用途。
根据本公开的核苷酸序列因此可以用于扩增核苷酸序列，特别是通过PCR技术(聚合酶链反应)来扩增(Erlich,1989；Innis等,1990；RoIfs等,1991；以及White等,1997)。这些寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸引物有利地具有至少8个核苷酸，优选地至少12个核苷酸，并且甚至更优先地至少20个核苷酸的长度。靶核酸的其它扩增技术可以有利地用作PCR的替代方案。
本公开的核苷酸序列，特别是根据本公开的引物同样可以用于靶核酸的扩增的其它程序，如：TAS技术(基于转录的扩增系统)，由Kwoh等,1989所述；3SR技术(自持序列复制)，由Guatelli等,1990所述；NASBA技术(基于核酸序列的扩增)，由Kievitis等,1991所述；SDA技术(链置换扩增)(Walker等,1992)；TMA技术(转录介导的扩增)。
本公开的多核苷酸也可以作为探针用于核酸的扩增或修饰的技术，如：LCR技术(连接酶链反应)，由Landegren等,1988所述并且由Barany等,1991改进，其使用热稳定的连接酶；RCR技术(修复链反应)，由Segev,1992所述；CPR技术(循环探针反应)，由Duck等,1990所述；使用Q-β复制酶的扩增技术，由Miele等,1983所述并且特别由Chu等,1986；Lizardi等,1988，然后由Burg等以及Stone等,1996改进。
在其中待检测的靶多核苷酸可能是RNA，例如MRNA的情况下，在借助于根据本公开的至少一种引物使用扩增反应或借助于本公开的至少一种探针使用检测程序之前，将有可能使用逆转录酶类型的酶以从生物样品中所含的RNA获得cDNA。所获得的cDNA因此将用作在根据本公开用于扩增程序或检测程序中使用的引物或探针的靶标。
检测探针将是以这样的方式选择的，所述方式使得它与靶序列或由靶序列产生的扩增子杂交。作为序列，这样的探针将有利地具有至少12个核苷酸，特别是至少20个核苷酸，并且优选地至少100个核苷酸的序列。
本公开还包含可用作根据本公开的探针或引物的核苷酸序列，所述核苷酸序列的特征在于它们是用放射性化合物或非放射性化合物标记的。未标记的核苷酸序列可以直接用作探针或引物，尽管所述序列一般是用放射性元素(32P、35S、3H、125I)或非放射性分子(生物素、乙酰氨基芴、地高辛、5-溴脱氧尿苷、荧光素)标记的以获得可用于许多应用的探针。核苷酸序列的非放射性标记的实例描述于例如法国专利号78.10975或Urdea等或Sanchez-Pescador等,1988中。在后一种情况下，还将有可能使用专利FR-2422 956和FR-2 518 755中所述的标记法之一。
杂交技术可以通过各种方式进行(Matthews等,1988)。最一般的方法在于将细胞的核酸提取物固定到载体(例如硝化纤维素、尼龙、聚苯乙烯)上以及在明确限定的条件下，将固定的靶核酸与探针一起孵育。在杂交之后，消除过量的探针并且通过适当的方法(测量与探针相关的放射性、荧光或酶活性)检测形成的杂交分子。
本公开同样包含根据本公开的核苷酸序列，所述核苷酸序列的特征在于它们被共价或非共价固定在载体上。
根据使用根据本公开的核苷酸序列的另一种有利的方式，后者可以用于被固定在载体上并且因此可以用来通过特异性杂交捕捉从待测试的生物样品中所获得的靶核酸。如果需要的话，将固体载体与样品分离，然后借助于第二探针检测所述捕捉探针与靶核酸之间形成的杂交复合物，所述第二探针是所谓的检测探针，用容易检测的元素标记。
本公开的另一个主题是一种用于克隆和/或表达序列的载体，所述载体的特征在于它含有根据本公开的核苷酸序列。
根据本公开的载体的特征在于它们含有允许所述核苷酸序列在确定的宿主细胞中表达和/或分泌的元件，所述载体同样是本公开的一部分。所述载体然后必须含有启动子、翻译起始和终止信号、以及适当的转录调节区域。它必须能够稳定维持在宿主细胞中并且可以任选地具有指定翻译蛋白分泌的特定信号。这些不同的元件是随所使用的宿主细胞变化来选择的。为此，可以将根据本公开的核苷酸序列插入所选宿主内的自主复制载体或所选宿主的整合载体中。这样的载体将根据本领域技术人员目前使用的方法来制备，并且将有可能通过标准方法，例如像脂质体转染、电穿孔以及热冲击将由其产生的克隆引入适当的宿主中。根据本公开的载体是例如质粒或病毒来源的载体。用于表达本公开的多肽的优选的载体是杆状病毒。
这些载体可用于转化宿主细胞以克隆或表达本公开的核苷酸序列。本公开同样包含通过根据本公开的载体转化的宿主细胞。这些细胞可以通过将插入诸如上文所定义的载体中的核苷酸序列引入宿主细胞中，然后在允许转染的核苷酸序列复制和/或表达的条件下培养所述细胞而获得。所述宿主细胞可以选自原核系统或真核系统，例如像细菌细胞(Olins和Lee,1993)，但是同样可以选自酵母细胞(Buckholz,1993)以及动物细胞，特别是哺乳动物细胞的培养物(Edwards和Aruffo,1993)，并且特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，但是同样可以选自其中有可能使用例如利用杆状病毒的程序(Luckow,1993)的昆虫细胞。用于表达本公开的蛋白质的优选的宿主细胞由sf9昆虫细胞构成。
本公开同样涉及包含根据本公开的所述转化细胞之一的动物。根据本公开的过表达PCV3基因中的一个或多个或所述基因的一部分的转基因动物的获得将优选地在大鼠、小鼠或兔中根据本领域技术人员公知的方法，如通过病毒转染或非病毒转染来进行。将有可能通过在具有普遍存在性质或对一种类型的组织具有选择性的强启动子的控制下转染所述基因的多个拷贝来获得过表达所述基因中的一个或多个的转基因动物。同样将有可能通过在胚胎细胞株中进行同源重组，将这些细胞株转移到胚胎，在生殖系的水平上选择受影响的嵌合体，并且培养所述嵌合体来获得转基因动物。根据本公开的转化细胞以及转基因动物可用于制备重组多肽的程序中。
现在有可能通过使用通过根据本公开的表达载体转化的细胞或使用根据本公开的转基因动物进行遗传工程化来以相对大的量产生重组多肽。用于制备呈重组形式的本公开的多肽的程序的特征在于它们使用载体和/或通过根据本公开的载体转化的细胞和/或包含根据本公开的所述转化细胞之一的转基因动物，所述程序本身被包含在本公开中。在所述用于制备呈重组形式的本公开的多肽的程序中，使用含有根据本公开的编码PCV3多肽的核苷酸序列的载体和/或由所述载体转化的细胞和/或包含所述转化细胞之一的转基因动物的制备程序是优选的。如上文所示所获得的重组多肽可以同样以糖基化形式以及非糖基化形式存在并且可以具有或不可以具有天然三级结构。
优选的变体在于产生用于“载体”蛋白(嵌合蛋白)的重组多肽。该系统的优势在于它允许使重组产物稳定和减少重组产物的蛋白水解、增加体外复性过程中的溶解度和/或当融合配偶体对特异性配体具有亲和力时简化纯化。
更具体来说，本公开涉及一种用于制备本公开的多肽的程序，所述程序包括以下步骤：a)在允许根据本公开的核苷酸序列表达重组多肽的条件下培养转化的细胞；b)如果需要的话，回收所述重组多肽。
当用于制备本公开的多肽的程序使用根据本公开的转基因动物时，然后从所述动物提取所述重组多肽。
本公开还涉及一种能够通过诸如先前所述的本公开的程序获得的多肽。
本公开还包含一种用于制备合成多肽的程序，所述程序的特征在于它使用根据本公开的多肽的氨基酸序列。本公开同样涉及一种合成多肽，所述合成多肽是通过根据本公开的程序获得的。
根据本公开的多肽同样可以通过肽合成领域中常规的技术制备。该合成可以在均相溶液中或在固相中进行。举例来说，可以参考由Houben-Weyl,1974所述的在均相溶液中合成的技术。该合成方法在于按所需的顺序依次两个两个地连续缩合连续的氨基酸或在于缩合先前形成的并且已经按适当的顺序含有几个氨基酸的氨基酸和片段或可选择地先前以这种方式制备的几个片段，应当了解的是，将需要提前保护由这些氨基酸或片段所携带的所有反应性官能团，除了一个的胺官能团和另一个的羧基之外或反之亦然，根据肽合成中公知的方法，它们通常必须参与肽键的形成，特别是在羧基官能团活化之后。根据本公开的另一种优选的技术，将依据由Merrifield所述的技术。为了根据Merrifield程序制备肽链，依靠非常多孔的聚合物树脂，在它上面固定了所述链的第一个C末端氨基酸。该氨基酸是经由它的羧基固定在树脂上的并且它的胺官能团受保护。将要形成肽链的氨基酸因此一个接着一个地被固定在已经形成的并且与树脂连接的肽链的部分的氨基上，所述氨基每次都提前脱保护。当整个所期望的肽链已经形成时，消除形成肽链的不同氨基酸的保护基并且借助于酸使肽从树脂脱离。
本公开另外涉及杂合多肽，所述杂合多肽具有根据本公开的至少一种多肽和能够在人类或动物中诱导免疫应答的多肽的序列。
有利的是，抗原决定簇能够诱导体液应答和/或细胞应答。对于这样的决定簇，将有可能的是包含呈糖基化形式的根据本公开的多肽，以用于获得能够诱导合成针对多个表位的抗体的免疫原性组合物。所述多肽或它们的糖基化片段同样是本公开的一部分。这些杂合分子可以部分地由与可能的免疫原性部分缔合的根据本公开的多肽载体分子或其片段形成，所述免疫原性部分特别是白喉毒素、破伤风毒素、乙型肝炎病毒的表面抗原(专利79 21811)、脊髓灰质炎病毒的VP1抗原或任何其它病毒或细菌毒素或抗原的表位。用于合成杂合分子的程序涵盖了用于遗传工程化以用于构建编码所寻求的多肽序列的杂合核苷酸序列的方法。将可能例如有利地参考由Minton,1984所述的用于获得编码融合蛋白的基因的技术。所述编码杂合多肽的杂合核苷酸序列以及根据本公开的杂合多肽(其特征在于它们是通过使所述杂合核苷酸序列表达所获得的重组多肽)同样是本公开的一部分。
本公开同样包含载体，所述载体的特征在于它们含有所述杂合核苷酸序列之一。由所述载体转化的宿主细胞、包含所述转化细胞之一的转基因动物以及使用所述载体、所述转化细胞和/或所述转基因动物制备重组多肽的程序当然同样是本公开的一部分。
根据本公开的多肽、下文所述的根据本公开的抗体以及根据本公开的核苷酸序列可以有利地用于在含有它们的生物样品(生物组织或流体)中检测和/或鉴定PCV3或除PCV3以外的猪圆环病毒的程序中。根据将使用的根据本公开的多肽、抗体以及核苷酸序列的特异性，这些程序将特别能够检测和/或鉴定PCV3或除PCV3以外或不同于PCV3的猪圆环病毒。
根据本公开的多肽可以有利地用于在能够含有PCV3的生物样品(生物组织或流体)中检测和/或鉴定PCV3的程序中，所述程序的特征在于它包括以下步骤：a)使该生物样品与根据本公开的多肽或它的片段之一接触(在允许所述多肽与所述生物样品中可能存在的抗体之间发生免疫反应的条件下)；以及b)证实可能形成的抗原抗体复合物。优选的是，所述生物样品由流体，例如猪血清、全血或活检形成。可以使用任何常规程序来进行这样的对可能形成的抗原抗体复合物的检测。举例来说，优选的方法利用根据ELISA技术的免疫酶促过程、通过免疫荧光、或放射免疫方法(RIA)或它们的等同方案。
因此，本公开同样涉及根据本公开的多肽，所述多肽借助于诸如酶类型、荧光类型或放射性类型的适当的标记进行标记。这样的方法包括例如以下步骤：1)将确定量的根据本公开的多肽组合物沉积在微量滴定板的孔中；2)向所述孔中引入递增稀释度的血清或必须分析的不同于先前所定义的生物样品；3)孵育所述微孔板；以及4)向所述微量滴定板的孔中引入针对猪免疫球蛋白的标记抗体，这些抗体的标记已经借助于酶来进行，所述酶选自能够通过改变底物至少在确定的波长处，例如在550nm处对辐射的吸收来水解底物的那些，所述改变通过与对照测试比较所水解底物的量。
本公开同样涉及一种用于检测和/或鉴定PCV3的试剂盒或套装，其特征在于它包括以下元件：1)根据本公开的多肽；2)如果需要的话，用于形成有利于免疫反应或特异性反应的培养基的试剂；3)如果需要的话，允许检测通过本公开的一种或多种多肽与生物样品中可能存在的抗体之间的免疫反应产生的抗原抗体复合物的试剂，这些试剂同样能够携带标记或被标记的试剂依次识别，更特别是在其中根据本公开的多肽没有被标记的情况下；4)如果需要的话，没有由根据本公开的多肽识别的抗体的生物参考样品(阴性对照)；以及5)如果需要的话，含有预定量的由根据本公开的多肽识别的抗体的生物参考样品(阳性对照)。
根据本公开的多肽允许制备单克隆抗体或多克隆抗体，所述抗体的特征在于它们特异性识别根据本公开的多肽。将有利地有可能根据由Kohler和Milstein,1975所述的技术从杂交瘤制备单克隆抗体。将有可能制备多克隆抗体，这例如是通过用与免疫应答的佐剂缔合的根据本公开的多肽或DNA对动物，特别是小鼠进行免疫接种，然后在亲和柱上纯化接受免疫接种的动物的血清中所含的特异性抗体来实现的，在所述亲和柱上，用作抗原的多肽先前已经被固定。根据本公开的多克隆抗体还可以通过在亲和柱上纯化通过PCV3感染的猪的血清中所含的抗体来制备，在所述亲和柱上，根据本公开的多肽先前已经被固定。
本公开同样涉及单克隆抗体或多克隆抗体或它们的片段、或嵌合抗体，它们的特征在于它们能够特异性识别根据本公开的多肽。本公开的抗体同样将可能以与先前对于本公开的核酸探针所述的方式相同的方式进行标记，如酶类型、荧光类型或放射性类型的标记。
本公开另外涉及一种用于在生物样品中检测和/或鉴定PCV3的程序，所述程序的特征在于它包括以下步骤：a)使所述生物样品(生物组织或流体)与根据本公开的单克隆抗体或多克隆抗体接触(在允许所述抗体与所述生物样品中可能存在的PCV3多肽(包括ORF1、ORF2、和/或ORF3)之间发生免疫反应的条件下)；以及b)证实可能形成的抗原抗体复合物。
同样在本公开的范围内的是一种用于检测和/或鉴定PCV3的试剂盒或套装，其特征在于它包括以下组分：a)根据本公开的多克隆抗体或单克隆抗体，如果需要的话，所述抗体被标记；b)如果需要的话，用于形成有利于进行免疫反应的培养基的试剂；c)如果需要的话，允许检测由所述免疫反应产生的抗原抗体复合物的试剂，该试剂同样能够携带标记或能够被标记的试剂依次识别，更特别是在其中所述单克隆抗体或多克隆抗体没有被标记的情况下；以及d)如果需要的话，用于进行所测试的样品的细胞裂解的试剂。
本公开同样涉及一种用于在生物样品中检测和/或鉴定PCV3的程序，所述程序的特征在于它使用根据本公开的核苷酸序列。更具体来说，本公开涉及一种用于在生物样品中检测和/或鉴定PCV3的程序，所述程序的特征在于它含有以下步骤：a)如果需要的话，从待分析的生物样品中分离DNA；b)借助于根据本公开的至少一种引物或一对引物特异性扩增所述样品的DNA；以及c)证实扩增产物。这些可以例如通过利用根据本公开的核酸探针的分子杂交技术来检测。该探针将有利地用非放射性元素(低温探针)或放射性元素标记。
出于本公开的目的，“生物样品的DNA”或“生物样品中所含的DNA”将被理解为意指存在于所考虑的生物样品中的DNA或可能是在逆转录酶类型的酶作用于所述生物样品中所存在的RNA之后所获得的cDNA。
本公开的另一个目的在于根据本公开的程序，所述程序的特征在于它包括以下步骤：a)使根据本公开的核苷酸探针与生物样品在允许所述探针与所述样品的DNA杂交的条件下接触，如果需要的话，所述生物样品中所含的DNA先前已经被变成可用于杂交；以及b)证实所述核苷酸探针与所述生物样品的DNA之间形成的杂交体。
本公开还涉及根据本公开的程序，所述程序的特征在于它包括以下步骤：a)使根据本公开的固定在载体上的核苷酸探针与生物样品在允许所述探针与所述样品的DNA杂交的条件下接触，如果需要的话，所述样品的DNA先前已经被变成可用于杂交；b)使所述固定在载体上的核苷酸探针与所述生物样品中所含的DNA之间形成的杂交体与根据本公开标记的核苷酸探针接触，如果需要的话，在消除所述生物样品的没有与所述探针杂交的DNA之后进行接触；以及c)证实步骤b)中形成的新型杂交体。根据先前所定义的用于检测和/或鉴定的程序的一个有利的实施方案，其特征在于在步骤a)之前，首先借助于根据本公开的至少一种引物来扩增所述生物样品的DNA。
本公开另外涉及一种用于检测和/或鉴定PCV3的试剂盒或套装，其特征在于它包括以下元件：a)根据本公开的核苷酸探针；b)如果需要的话，进行杂交反应所需的试剂；以及c)如果需要的话，根据本公开的至少一种引物以及DNA的扩增反应所需的试剂。
本公开同样涉及一种用于检测和/或鉴定PCV3或除PCV3以外的猪圆环病毒的试剂盒或套装，其特征在于它包括以下组分：a)根据本公开的被称作捕捉探针的核苷酸探针；b)根据本公开的被称作揭示探针的寡核苷酸探针；以及c)如果需要的话，根据本公开的至少一种引物以及DNA的扩增反应所需的试剂。
本公开还涉及一种用于检测和/或鉴定PCV3的试剂盒或套装，其特征在于它包括以下元件：a)根据本公开的至少一种引物；b)如果需要的话，进行DNA扩增反应所需的试剂；以及c)如果需要的话，允许验证扩增片段的序列的组分，更特别是根据本公开的寡核苷酸探针。
本公开另外涉及根据本公开的核苷酸序列、根据本公开的多肽、根据本公开的抗体、根据本公开的细胞、和/或根据本公开转化的动物用于选择能够调节、诱导或抑制基因表达和/或改变PCV3的细胞复制或能够诱发或抑制病变(包括降低与PCV3感染相关的临床体征的发病率和严重程度)的有机化合物或无机化合物的用途。
本公开同样包含一种选择如下化合物的方法，所述化合物能够结合根据本公开的多肽或它的片段之一、能够结合根据本公开的核苷酸序列、或能够识别根据本公开的抗体、和/或能够调节、诱导或抑制基因表达、和/或改变PCV3的细胞复制或能够诱发或抑制病变，包括降低与PCV3感染相关的临床体征的发病率和严重程度，所述方法的特征在于它包括以下步骤：a)使所述化合物与所述多肽、所述核苷酸序列、或根据本公开转化的细胞接触和/或向根据本公开转化的动物施用所述化合物；以及b)确定所述化合物结合所述多肽或所述核苷酸序列、或调节、诱导或抑制基因表达、或调节PCV3的生长或复制、或在所述转化的动物中诱发或抑制与PCV3感染相关的病变的能力(所述化合物的指定活性)。能够被选择的化合物可以是有机化合物，如多肽或碳水化合物或已经已知的任何其它有机化合物或无机化合物、或通过分子建模技术精心设计并且通过化学合成或生物化学合成获得的新型有机化合物，这些技术是本领域技术人员已知的。将有可能使用所述所选择的化合物调节PCV3的细胞复制并且因此控制该病毒的感染，允许确定所述调节的方法是本领域技术人员公知的。该调节可以例如通过能够结合蛋白质并且因此抑制或增强它的生物活性的试剂、或能够结合所述病毒的外表面的包膜蛋白并且阻止所述病毒穿透到宿主细胞中或有利于受感染的生物体的免疫系统针对所述病毒的作用的试剂来进行。该调节同样可以通过能够结合所述病毒的DNA的核苷酸序列并且阻止例如多肽表达的试剂来进行，所述多肽的生物活性或结构活性是为所述病毒在宿主动物中从宿主细胞到宿主细胞的复制或增殖所必需的。
本公开涉及能够通过根据本公开的选择方法选择的化合物。
本公开同样涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含选自以下化合物的化合物：a)根据本公开的核苷酸序列；b)根据本公开的多肽；c)根据本公开的载体、病毒颗粒或转化的细胞；d)根据本公开的抗体；以及e)能够通过根据本公开的选择方法选择的化合物；可能与药学上可接受的载体以及(如果需要的话)与适当免疫力的一种或多种佐剂组合。
本公开还涉及一种免疫原性组合物和/或疫苗组合物，所述组合物的特征在于它包含选自以下化合物的化合物：a)根据本公开的核苷酸序列；b)根据本公开的多肽；c)根据本公开的载体或病毒颗粒；以及d)根据本公开的细胞。
在一个实施方案中，根据本公开的疫苗组合物的特征在于它包含上文所述化合物a)、b)、c)以及d)中的至少两种的混合物并且两种所述化合物中的一种与PCV3有关。
在本公开的另一个实施方案中，所述疫苗组合物的特征在于它包含上述与PCV3有关的至少一种化合物a)、b)、c)、或d)。在再另一个实施方案中，所述疫苗组合物的特征在于它包含上述与PCV3 ORF2有关的至少一种化合物a)、b)、c)、或d)。
与PCV3有关的化合物在此被理解为分别表示从PCV3的基因组序列和/或PCV3的ORF1、ORF2、以及ORF2获得的化合物。
本公开另外旨在一种免疫原性组合物和/或疫苗组合物，其特征在于它包含以下化合物中的至少一种：1)核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.7或它们的片段或同源物之一；2)序列SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.8或它们的片段之一的多肽或其修饰；3)包含核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或它们的片段或同源物之一的载体或病毒颗粒；4)能够表达序列SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8或它们的片段之一的多肽或其修饰的转化细胞；或5)所述化合物中的至少两种的混合物。
本公开还包含根据本公开的免疫原性组合物和/或疫苗组合物，其特征在于它包含所述化合物中的至少两种的所述混合物作为组合产品以用于针对预防或治疗PCV3感染的同时、单独或长期使用。
在一个优选的实施方案中，根据本公开的疫苗组合物包含以下化合物的混合物：1)含有序列SEQ ID No.1的核酸的pcDNA3质粒；2)含有序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、或SEQ ID No.7的核酸的pcDNA3质粒；3)含有编码GM-CSF蛋白的核酸的pcDNA3质粒；4)含有序列SEQ ID No.1的核酸的重组杆状病毒；5)含有序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、或SEQ IDNo.7的核酸的重组杆状病毒；以及6)如果需要的话，适当免疫力的佐剂，特别是佐剂AIFTM。
本公开同样涉及用于预防或治疗PCV3感染的根据本公开的药物组合物。
应当了解的是，如本公开中所用的“预防”包括完全预防PCV3感染，但是还涵盖了降低与PCV3感染相关或由PCV3感染引起的临床体征的严重程度或发病率。这样的预防在本文也被称为保护作用。
本公开同样涉及根据本公开的组合物用于制备预期用于预防或治疗PCV3感染的药物的用途。
在另一个方面，本公开涉及用于通过基因治疗来治疗和/或预防疾病的根据本公开的载体、病毒颗粒或细胞。
最终，本公开包含根据本公开的载体、病毒颗粒或细胞用于制备预期用于通过基因治疗来治疗和/或预防疾病的药物的用途。
进入根据本公开的免疫原性组合物或疫苗组合物中的本公开的多肽可以通过本领域技术人员已知的技术，例如像根据所述多肽刺激T细胞的能力来选择，所述能力是例如通过它们的增殖或白细胞介素的分泌来解释的并且引起针对所述多肽的抗体的产生。
在猪中，如同在小鼠中，其中施用与用于人类的剂量相当的疫苗组合物的重量剂量，通过获取血清，继而根据常用技术对所述血清中存在的抗体与疫苗组合物的抗原之间复合物的形成进行研究来测试抗体反应。
根据本公开的药物组合物将含有有效量的本公开的化合物，也就是说，以允许获得所期望的作用的充分数量的一种或多种所述化合物，所述作用例如像调节PCV3的细胞复制。本领域技术人员将知晓如何随着例如待治疗的个体的年龄和体重、病变的进展状态、可能的副作用的变化并且借助于评价在群体范围内所获得的作用的测试来确定该量，这些测试是这些应用领域中已知的。
根据本公开，所述疫苗组合将优选地与药学上或兽医学上可接受的载体以及(如果需要的话)与适当免疫力的一种或多种佐剂组合。
现在，各种类型的疫苗可用于保护动物或人类防止感染性疾病：减毒活微生物(用于结核病的牛分枝杆菌(M.bovis)——BCG)、灭活的微生物(流感病毒)、细胞提取物(用于百日咳的百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis))、重组蛋白质(乙型肝炎病毒的表面抗原)、多糖(肺炎球菌)。由合成肽或表达异源抗原的遗传修饰的微生物制备的疫苗正处在实验过程中。最近，还已经提出了携带编码保护性抗原的基因的重组质粒DNA作为替代疫苗策略。这种类型的疫苗接种是用源自于不在体内复制并且唯独编码疫苗接种蛋白质的大肠杆菌质粒的特定质粒进行的。已经通过简单地将裸质粒DNA注射到肌肉中来对动物进行免疫接种。该技术引起疫苗蛋白在原位表达以及细胞型(CTL)和体液型(抗体)的免疫应答。这种对免疫应答的双重诱导是用裸DNA的疫苗接种技术的主要优势之一。
根据本公开的疫苗组合物的组成型核苷酸序列可以在已经与有利于该多核苷酸穿透到细胞内部或它向细胞核的转运的化合物偶联之后向宿主注射。所得缀合物可以被封装在聚合物微粒中，如国际申请号WO 94/27238(Medisorb Technologies International公司)中所述。
依据根据本公开的疫苗组合物的另一个实施方案，核苷酸序列(优选地是DNA)与DEAE-葡聚糖(Pagano等,1967)或与核蛋白(Kaneda等,1989)、与脂质(Felgner等,1987)复合或被封装在脂质体中(Fraley等,1980)，或以促进它转染到细胞中的凝胶形式引入(Midoux等,1993；Pastore等,1994)。根据本公开的多核苷酸或载体也可以悬浮在缓冲溶液中或与脂质体组合。
有利的是，这样的疫苗将根据由Tacson等或Huygen等,1996所述的技术或可选择地根据由Davis等在国际申请号WO 95/11307中所述的技术来制备。
这样的疫苗同样可以含有根据本公开的载体的组合物的形式制备，所述载体处在允许它在人类或动物中表达的调节元件的控制之下。将有可能例如经由所关注的多肽抗原的体内表达载体而使用质粒pcDNA3或质粒pcDNA1/neo，这两者都由英杰公司(Invitrogen)(英国阿宾登的R&D系统公司(R&D Systems,Abingdon,United Kingdom))销售。还有可能使用由Shiver等,1995所述的质粒V1Jns.tPA。除了重组载体之外，这样的疫苗还将有利地包含盐水溶液，例如氯化钠溶液。
就关注疫苗制剂而言，这些可以包含本领域技术人员已知的适当免疫力的佐剂，例如像上述那些。
这些化合物可以通过全身途径，特别是通过静脉内途径、通过肌内、真皮内或皮下途径、或通过口服途径来施用。以更优选的方式，包含根据本公开的多肽的疫苗组合物将通过肌内途径、经由食物或通过雾化施用数次(随时间交错进行)。
它们的施用方式、剂量以及最佳的药物形式可以根据在建立适合动物的治疗中一般考虑的标准来确定，例如像年龄或体重、它的一般病况的严重性、对治疗的耐受性以及所注意到的副作用。优选的是，本公开的疫苗以保护性的或提供防止PCV3感染的保护作用的量施用。
举例来说，在包含由PCV3的基因组的核苷酸序列或其同源物或片段编码的多肽的根据本公开的疫苗的情况下，所述多肽将被施用一次或数次(随时间推移而延展)，直接或借助于能够表达所述多肽的转化细胞来施用，以每公斤动物体重约0.1μg至10μg，优选地约0.2μg/kg至约5μg/kg，更优选地约0.5μg/kg至约2μg/kg的量作为剂量。
本公开同样涉及根据本公开的PCV3的核苷酸序列用于构建自复制型逆转录病毒载体的用途以及这些的治疗应用，特别是在体内基因治疗领域中。
向人类应用基因治疗的可行性不再需要被证实并且这涉及许多治疗应用，像遗传性疾病、感染性疾病以及癌症。现有技术的许多文献描述了使用基因治疗的手段，特别是经由病毒载体。一般来说，载体是通过被具有治疗意义的基因置换的至少一些病毒基因的缺失来获得的。这样的载体可以在互补细胞系中繁殖，所述互补细胞系反式供应缺失的病毒功能以产生用于复制但是能够感染宿主细胞的缺陷型病毒载体颗粒。迄今为止，逆转录病毒载体是当中最广泛使用的并且它们的感染方式广泛地描述于本领域技术人员可获得的文献中。
基因治疗的原理是递送功能性基因，它被称作所关注的基因，其中RNA或相应蛋白将在靶向的细胞或组织中产生所期望的生物化学作用。一方面，插入基因允许复杂和不稳定的分子，例如RNA或蛋白质的延长表达，这些分子可能非常难或甚至不可能获得或直接施用。另一方面，所期望的基因向靶向的特定细胞内部的受控插入允许在限定的组织中调节表达产物。为此，有必要能够将所期望的治疗性基因插入所选细胞的内部并且因此获得能够特异性靶向所选的细胞或组织的插入方法。用于本公开的一些优选的所关注的基因是编码ORF1、ORF2或ORF3的基因。
在插入基因的方法中，例如像显微注射，特别是注射裸质粒DNA、电穿孔、同源重组，使用病毒颗粒，例如逆转录病毒是广泛的。然而，在体内应用时，重组逆转录病毒类型的基因转移系统同时具有弱的感染能力(病毒颗粒的浓度不足)并且对所选的靶细胞没有特异性。
具有组织特异性向性并且其所关注的基因可以由靶细胞充分翻译的细胞特异性病毒载体的产生是可实现的，例如通过使靶宿主细胞的特异性配体与PCV3的包膜的表面蛋白的N末端部分融合来实现。有可能提到例如在包膜的表面上具有CD4分子以靶向受HIV病毒感染的人类细胞的逆转录病毒颗粒、具有与包膜蛋白融合的肽激素以特异性感染表达相应受体的细胞的病毒颗粒、或可选择地具有能够在表皮生长因子(EGF)的受体上固定的融合多肽的病毒颗粒的构建。在另一种方法中，通过与包膜蛋白的N末端部分融合来插入针对靶细胞的表面抗原的抗体的单链片段。
出于本公开的目的，用于本公开中的所关注的基因可以是通过任何常规技术从真核生物体或原核生物体或从病毒获得的。它优选地能够产生具有治疗作用的表达产物并且它可以是与细胞宿主同源或可选择地异源的产物。在本公开的范围内，所关注的的基因可以编码(1)宿主细胞的细胞内产物或(2)宿主细胞的表面上存在的膜产物或(3)分泌到宿主细胞外部的产物。它因此可以包含适当的另外的元件，例如像编码分泌信号的序列。这些信号是本领域技术人员已知的。
根据本公开追求的目标，所关注的基因可以编码对应于在自然界中发现的天然蛋白质的全部或一部分的蛋白质。它同样可以是嵌合蛋白，例如由各种来源的多肽的融合或具有改进的和/或改变的生物特性的突变体产生。这样的突变体可以通过常规的生物技术，通过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加来获得。
本公开因此涉及载体，所述载体的特征在于它们包含根据本公开的PCV3的核苷酸序列并且它们另外包含所关注的基因。
本公开同样涉及由所述根据本公开的载体产生的病毒颗粒。它另外涉及用于制备根据本公开的病毒颗粒的方法，所述方法的特征在于它们使用根据本公开的载体，包括病毒拟颗粒(VLP，病毒样颗粒)。
本公开同样涉及由根据本公开的载体转染的动物细胞。同样包含在本公开中的是由根据本公开的病毒颗粒感染的动物细胞，特别是哺乳动物细胞。
一种优选的疫苗使用活的嵌合病毒DNA克隆，特别是含有克隆在非病原性PCV1的骨架中的PCV3的免疫原性基因的克隆。有利的是，当经由遗传工程化来构建时天然无毒的活嵌合病毒不需要耗时的减毒程序。所述病毒独特地用作活的但是非病原性的复制病毒，它在病毒复制期间产生针对PCV3的免疫原性蛋白，然后可以诱发全范围的针对病原性PCV3的免疫应答。
作为另一个益处，本公开的活嵌合病毒提供了比其它类型的减毒疫苗更容易制备、储存以及递送的遗传稳定的疫苗。基于嵌合病毒的无毒疫苗或减毒疫苗一般被认为与传统修饰的活疫苗相比，即使不是更安全的，也是同样安全的。举例来说，针对乙型脑炎病毒(JEV)的ChimeriVax-JE疫苗是黄热病毒疫苗YFV17D的遗传工程衍生物，其中编码YFV17D的结构蛋白质prM和E的基因被减毒的JEV SA14-14-2株的相应基因置换，所述ChimeriVax-JE疫苗已经被证实为在体外和体内在长期传代后是遗传稳定的。另一种针对2型登革热病毒的嵌合病毒疫苗ChimeriVax-D2是减毒的嵌合黄热病(YF)-2型登革热(登革热-2)病毒，其也已经发现是遗传稳定的；据报道，它的序列在Vero细胞中18次传代之后没有变化。
本公开的另一种优选的疫苗利用合适的质粒向猪递送非病原性嵌合DNA克隆。与使用活的或灭活的细胞培养物繁殖的全病毒的传统疫苗相反，本公开提供了用含有感染性嵌合病毒基因组的质粒DNA对猪进行直接接种。
在本公开中所期望的另外的遗传工程疫苗是通过本领域已知的技术产生的。这样的技术包括但不限于进一步操纵重组DNA、重组蛋白的氨基酸序列的修饰或取代等。基于重组DNA技术的遗传工程疫苗是例如通过鉴定编码负责在猪中诱导更强的免疫应答或保护性应答的蛋白质(例如衍生自ORF1、ORF2、ORF3的蛋白质)的病毒基因的选择性部分来制备的。可以将这样的所鉴定的基因或免疫优势片段克隆到标准蛋白质表达载体，例如杆状病毒载体中，并且用于感染适当的宿主细胞。培养所述宿主细胞，从而表达所期望的疫苗蛋白，可以将所述疫苗蛋白纯化到所期望的程度并且配制成合适的疫苗产品。
如果所述克隆保留任何引起疾病的不期望的天然能力，那么还有可能查明病毒基因组中产生任何残留毒力的核苷酸序列，并且经由例如定点诱变将所述病毒遗传工程化成无毒的。定点诱变能够添加、缺失或改变一个或多个核苷酸。合成含有所期望的突变并且与单链病毒DNA的一部分退火的寡核苷酸。使用由该程序产生的杂合分子来转化细菌。然后，使用经过分离而含有适当的突变的双链DNA通过与全长DNA的限制性片段连接来产生所述全长DNA，随后将其转染到合适的细胞培养物中。将基因组连接到用于转移的合适的载体中可以经由本领域的普通技术人员已知的任何标准技术来实现。将载体转染到宿主细胞中以产生病毒后代可以使用常规方法中的任一种来进行，例如磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、原生质体融合以及其它公知的技术。克隆的病毒然后表现出所期望的突变。或者，可以合成含有适当的突变的两种寡核苷酸。这些可以被退火以形成双链DNA，该双链DNA可以插入病毒DNA中以产生全长DNA。
可用于疫苗的遗传工程蛋白例如可以在昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。可以通过常规方法纯化或分离的遗传工程蛋白可以直接接种到猪中以赋予防止由PCV3所引起的病毒感染或断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的保护作用。昆虫细胞系(例如HI-FIVE)可以用含有从病毒获得或从编码病毒的免疫优势蛋白中的一种或多种的病毒基因组拷贝的核酸分子的转移载体转化。转移载体包括例如含有所期望的多核苷酸的线性化杆状病毒DNA和质粒。宿主细胞系可以用线性化杆状病毒DNA和质粒共转染以制备重组杆状病毒。
或者，可以将来自患有肺炎、繁殖障碍、PDNS和/或PMWS的猪的编码一种或多种衣壳蛋白的DNA、感染性PCV3分子DNA克隆、或克隆的PCV嵌合DNA基因组插入活载体，例如痘病毒或腺病毒中并且用作疫苗。
向需要防止病毒感染、肺炎、繁殖障碍、PDNS和/或PMWS的保护作用的猪施用免疫有效量的本公开的疫苗或免疫原性组合物。对猪进行接种的免疫有效量或免疫原性量可以通过常规测试容易地确定或容易地滴定。有效量是其中获得足够的针对疫苗的免疫应答以保护暴露于引起PMWS的病毒的猪的量。优选的是，将猪保护到其中病毒性疾病的不利生理症状或影响中的一种乃至全部显著减轻、改善或完全预防的程度。
所述疫苗可以单次剂量或重复剂量施用，其中单次剂量是优选的。单次剂量疫苗在单次剂量之后提供保护作用而不需要任何加强剂量或后续剂量。保护作用可以包括完全预防感染的临床体征、或减小感染的一个或多个临床体征严重程度、持续时间、或表现可能性。剂量可以在例如约1微克至约1,000微克含有感染性嵌合DNA基因组的质粒DNA的范围内(取决于疫苗的免疫活性组分的浓度)，优选地是100微克至200微克的嵌合PCV1-3 DNA克隆，但是不应当含有足以引起不良反应或病毒感染的生理症状的量的基于病毒的抗原。用于确定或滴定活性抗原剂的合适剂量以基于猪的体重、抗原的浓度以及其它典型的因素找到最低有效剂量的方法是本领域已知的。优选的是，使用感染性嵌合病毒DNA克隆作为疫苗，或可以体外产生活的感染性嵌合病毒，然后使用所述活的嵌合病毒作为疫苗。在那种情况下，可以向猪给予例如约50至约10,000的50％组织培养感染剂量(TCID50)的活嵌合病毒。
理想的是，向尚未暴露于PCV病毒的猪施用疫苗。含有嵌合PCV1-3感染性DNA克隆或它的其它抗原形式的疫苗可以方便地通过鼻内、透皮(即在皮肤表面上或皮肤表面处施用以用于全身吸收)、肠胃外等方式施用。肠胃外施用途径包括但不限于肌内途径、静脉内途径、腹膜内途径、真皮内途径(即注射或以其它方式置于皮肤下)等。由于肌内和真皮内接种途径在使用病毒感染性DNA克隆的其它研究中已经获得成功，因此除了实际的鼻内施用途径之外，这些途径也是最优选的。尽管不太方便，但是还考虑了经由淋巴内接种途径向猪给予疫苗。一种独特的优选的施用方法包括直接将含有PCV1-3嵌合体的质粒DNA通过肌内、真皮内、淋巴内等方式注射到猪中。
当作为液体施用时，本发明的疫苗可以被制备成水溶液、糖浆、酏剂、酊剂等形式。这样的制剂是本领域已知的并且通常通过将抗原和其它典型的添加剂溶解在适当的载体或溶剂体系中来制备。合适的载体或溶剂包括但不限于水、盐水、乙醇、乙二醇、甘油等。典型的添加剂是例如认证的染料、调味剂、甜味剂以及抗微生物防腐剂，例如硫柳汞(乙基汞硫代水杨酸钠)。这样的溶液可以例如通过添加部分水解的明胶、山梨糖醇或细胞培养基来稳定化，并且可以通过常规的方法，使用本领域已知的试剂，例如磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、其混合物等来缓冲。
液体制剂还可以包括含有助悬剂或乳化剂与其它标准共配制剂(co-formulant)组合的悬浮液和乳液。这些类型的液体制剂可以通过常规方法来制备。悬浮液例如可以使用胶体磨来制备。乳液例如可以使用均化器来制备。
被设计用于注射到体液系统中的肠胃外制剂需要适当的等渗性和pH值缓冲到猪体液的相应水平。等渗性可以根据需要用氯化钠和其它盐适当调节。可以使用诸如乙醇或丙二醇的合适的溶剂来提高成分在制剂中的溶解度和液体制品的稳定性。可以用于本发明的疫苗中的另外的添加剂包括但不限于右旋糖、常规的抗氧化剂以及常规的螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)。肠胃外剂型在使用之前还必须被灭菌。
在本公开的另一个实施方案中，提供了由嵌合DNA分子编码的蛋白质。该蛋白可以单独施用或除本文所述的其它组合物之外另外施用。在优选的形式中，所述蛋白质是以约0.2μg/ml至约400μg/ml范围的量施用的。嵌合DNA分子优选地如本文所述。
如本文所述构建PCV3的感染性DNA克隆以可以产生生物学上纯的和均匀的感染性病毒原液以用于发病机制研究和开发非病原性嵌合疫苗。与过去已经观测到的相比，通过使用该分子DNA克隆和衍生自所述分子DNA克隆的生物学上纯的和均匀的感染性PCV3病毒原液，与PCV3感染相关的临床疾病过程、病毒分布以及病理学病变被更明确地表征，这适用于开发本公开的所期望的疫苗产品。
PCV3分子克隆是通过将完整PCV3基因组的两个拷贝串联连接到pSK载体中而产生。与本领域公开的单拷贝基因组形成鲜明对比，通过本文所述的方法制备的感染性DNAPCV3克隆含有以串联重复方式连接在一起的PCV3基因组的两个完整拷贝。使基因组的两个拷贝串联连接提供了模拟PCV3的常见的环状基因组的类似的环状基因组。在感染性DNAPCV3克隆中具有串联的基因组的两个拷贝的优势是在体外和体内转染感染性DNA克隆时能够使复制达到最大。因此，本公开的克隆比先前的单拷贝基因组更高效和有效地运行。
用分子病毒克隆感染动物对于研究宿主中病毒复制和毒力的遗传决定因素是非常有用的。PCV3已经被显示为是肺炎、繁殖障碍、PMWS、以及PDNS的致病因子。PMWS和PDNS是猪的复杂疾病综合征并且多种因素可能涉及PMWS和/或PDNS的临床表现。然而，由于患病的猪的组织匀浆中其它常见的猪因子的存在而难以产生PCV3的生物学上纯的形式已经妨碍了明确表征仅可归因于PCV3感染的临床疾病和病理学病变。这将是首次构建PCV3的感染性分子DNA克隆并且将其用于通过用所述分子克隆直接体内转染猪来对与PCV3感染相关的疾病和病理学病变进行表征。
当被转染到PK-15细胞中时，源自于所述分子克隆的均匀PCV3活病毒原液将被证实为在体外具有感染性。当被直接注射到无特定病原体(SPF)猪的肝脏和浅表髂淋巴结中时，克隆的PCV3基因组DNA也将具有感染性。接受克隆的PCV3质粒DNA注射的动物将产生与通过用均匀的感染性的PCV3活病毒原液鼻内接种所诱发的感染和疾病类似的感染和疾病。在接种后35天(DPI)时在来自接种组的大部分猪中，向PCV3特异性抗体的血清转化将是可检测的。
在接种了嵌合PCV1-3 DNA克隆的猪中病毒血症的发病时间和持续时间将类似于接种了非病原性PCV1 DNA克隆的猪的那些，而接种了PCV3克隆的猪中的病毒血症将更早出现并且持续时间更长。从14DPI开始并且持续约2周-6周，病毒血症在大部分接种了PCV3的动物中将是可检测的。类似地，在35DPI时尸检的大部分接受接种的猪将已经血清转化成PCV3抗体。将在接受接种的猪的各种组织和器官中检测到PCV3抗原。肉眼病变将局限于肺和淋巴结，并且将特征在于全身肿大的棕褐色淋巴结、肺不能萎陷以及轻度多灶棕褐色实变病灶。在接种了非病原性PCV1和嵌合PCV1-3的猪中影响淋巴结的肉眼病变将是轻度的并且仅限于几只动物，而接种了病原性PCV3的猪将具有更高发病率的淋巴组织中度至重度肿胀和变色。统计分析将揭示，接种了嵌合PCV1-3的动物的淋巴结中的肉眼病变的分数将类似于接种了非病原性PCV1的猪中的那些。在21 DPI时，接种了PCV3的猪将比接种了PCV1和嵌合PCV1-3的猪具有在统计学上更严重的肉眼病变。将在接受接种(感染)的猪的包括脑、肺、心脏、肾脏、扁桃体、淋巴结、脾脏、回肠以及肝脏的许多组织和器官中检测到组织病理学病变和PCV3特异性抗原。类似于PMWS的那些的多种组织和器官中的组织病理学病变将用PCV3分子DNA克隆以及在体外从所述分子DNA克隆制备的感染性病毒再现。在显微镜下，在21 DPI和49DPI时，接种了嵌合PCV1-3的动物将比接种了PCV3的动物具有统计学上更少的显微镜下病变。接种了嵌合PCV1-3的猪的淋巴结中的显微镜下病变分数将类似于非病原性PCV1、相互嵌合PCV3-1以及未接种的对照动物的那些。将在接种了病原性PCV3的动物的包括肺、肝脏、淋巴、脾脏、脑、心脏、肾脏以及扁桃体组织在内的多种组织中发现中度至重度的显微镜下病变。然而，在接种了嵌合PCV1-3的动物中，轻度至中度的显微镜下病变将仅局限于肝脏、淋巴结以及肾脏组织。
本文所述的PCV3的感染性DNA克隆的可用性使得开发用于在猪中预防PCV3感染以及PDNS和PMWS的遗传工程减毒疫苗是可行的。
由于本文所述的PCV3、PCV1、嵌合PCV1-3、以及相互嵌合PCV3-1感染性DNA克隆的可用性，因此PCV基因的结构关系和功能关系被更好地理解。
在本公开的背景下感染性PCV3分子DNA克隆的构建以及通过将克隆的PCV3质粒DNA直接注射到猪的肝脏和淋巴结中来演示感染对于PCV3研究将是有利的。使用体外构建的重组质粒，该体内转染系统将增强对PCV3基因的结构关系和功能关系的研究以测试PCV3的不同区域或基因在宿主中的病毒复制和发病机制中的作用。可以在体内研究PCV3的复制和发病机制而不必通过使PCV3在细胞培养物中繁殖来产生感染性病毒原液。这是有利的，这是因为连续细胞培养传代可以选择病毒变体。使用克隆的PCV3基因组DNA代替活病毒进行动物研究的另一个优势是它相对容易定量接种剂量。用于动物接种的克隆的PCV3 DNA的量可以容易地通过分光光度计来确定，而活PCV3病毒的剂量需要在细胞培养物中进行感染性滴定以及通过IFA确认感染。向动物直接注射克隆的PCV3质粒DNA消除了在动物研究中与组织匀浆接种物中存在其它固有的猪因子相关的问题。
在本公开的一个方面，免疫原性ORF2衣壳基因在病原性PCV3与非病原性PCV1之间转换以产生嵌合PCV1-3感染性DNA克隆的独特结构。惊人和有利的是，所述嵌合PCV1-3感染性克隆将在体外和体内复制、表达免疫原性ORF2衣壳抗原，并且诱导针对PCV3 ORF2的特异性抗体应答，但是保留PCV1的非病原性质。嵌合PCV1-3感染性DNA克隆将具有诱导针对PCV3的强烈免疫应答，而仅诱发类似于非病原性PCV1的具有轻度病理学病变的有限感染的能力。对于疫苗开发，克隆的DNA的相对容易储存和稳定性、以及大规模重组PCV3质粒DNA和嵌合PCV1-3 DNA克隆生产的经济性将提供一种向猪递送活的感染性病毒DNA疫苗或遗传工程减毒病毒疫苗的有吸引力的手段。因此，在本公开中教导的嵌合PCV1-3感染性DNA克隆是一种针对PCV3感染.和PMWS的有用的疫苗候选者。
应当了解的是，本文所用的所有科学和技术术语具有与本领域的普通技术人员通常所了解的含义相同的含义。出于本公开的目的，术语“感染性”意指病毒在猪中复制，而不论所述病毒是否引起任何疾病。“SPF”指的是无特定病原体的猪。
“限菌”猪意指无菌猪。术语“PCV3质粒DNA”、“PCV3基因组DNA”以及“PCV3分子DNA”可互换地用于指的是相同的克隆的核苷酸序列。
以下实施例说明了本公开的某些方面。然而，应当了解的是，这些实施例仅用于说明而不意图完全限定本公开的条件和范围。应当了解的是，当已经给出典型的反应条件(例如温度、反应时间等)时，也可以使用高于和低于指定范围的条件，尽管一般方便性相对更弱。所述实施例是在室温(约23℃至约28℃)下和在大气压下进行的。除非另外说明，否则本文所提到的所有份数和百分比都是按重量计的并且所有温度都是以摄氏度表示的。此外，除非另外指出，否则本公开的所有组分都应当被理解成被公开以涵盖“包含”、“基本上由……组成”、以及“由……组成”权利要求语言，这是因为这些术语通常用于专利权利要求书中。
本公开的另一个方面是一种或多种组合疫苗或免疫原性组合物的制备。这样的组合可以在本文所述的不同疫苗组分之间。举例来说，本公开的疫苗可以包括PCV3的蛋白质部分和DNA部分这两者，如本文所述，它们被同时或分开施用。此外，所述组合可以在本文所述的PCV3疫苗组分与其它致病生物体的抗原之间，如上述那些。
根据另一个方面，首先将所述疫苗或免疫原性组合物脱水。如果首先通过其它方法将所述组合物冻干或脱水，则在疫苗接种之前，将所述组合物在水性溶液(例如盐水、PBS(磷酸盐缓冲盐水))或非水性溶液(例如油乳液(基于矿物油或植物油/可代谢的油/基于单乳液或双乳液)、基于铝、基于卡波姆的佐剂)中再水化。
根据本公开，向猪施用有效量的组合疫苗提供了防止由PCV3和至少一种另外的病原体引起的微生物感染的有效免疫力或保护作用。用于治疗和预防猪的微生物疾病的优选的抗原组合列于上文中。
根据另一个实施方案，以约2周至4周的时间间隔按一次或两次剂量向猪施用组合疫苗。举例来说，当动物约2周至3周至约8周大时，进行第一次施用。在第一次疫苗接种的第一次施用之后约1周至约4周进行第二次施用。根据另一个实施方案，在施用第二次剂量之后3个月至12个月的时间间隔内进行疫苗再接种。后续疫苗剂量的施用优选地在6个月至每年的基础上进行。在另一个优选的实施方案中，在约2周至3周大之前接受疫苗接种的动物应当接受疫苗再接种。后续疫苗剂量的施用优选地在每年的基础上进行。如果组合疫苗的组分之一在仅仅单次剂量之后就是有效的，那么这样的组分仅需要施用一次，而一种或多种其它组分根据它们的优选方案施用。
组合疫苗的有效量取决于疫苗的成分和施用方案。通常，当在组合疫苗中使用灭活病毒或修饰的活病毒制品时，疫苗的量含有每剂约102至约109TCID50，优选地每剂约103至约108TCID50，更优选地每剂约104至约108TCID50。一般来说，灭活抗原通常以比活修饰病毒更高的量使用。通常，当在组合疫苗中使用细菌抗原时，疫苗含有每剂约103个至约109个菌落形成单位(CFU)，优选地每剂约104至约108(CFU)，更优选地每剂约105至约106(CFU)的量。通常以下列抗原包括水平施用亚单位疫苗：每剂至少0.2μg抗原，优选地每剂约0.2μg至约400μg，还更优选地每剂约0.3μg至约200μg，甚至更优选地每剂约0.35μg至约100μg，还更优选地每剂约0.4μg至约50μg，还更优选地每剂约0.45μg至约30μg，还更优选地每剂约0.6μg至约15μg，甚至更优选地每剂约0.75μg至约8μg，甚至更优选地每剂约1.0μg至约6μg，并且还更优选地每剂约1.3μg至约3.0μg。举例来说，PCV3 ORF2抗原，优选地如本文所提供的PCV3 ORF2蛋白质的抗原包括水平含有约2μg至约150μg，优选地约2μg至约60μg，甚至更优选地约2μg至约50μg，甚至更优选地约2μg至约40μg，甚至更优选地约2μg至约30μg，甚至更优选地约2μg至约25μg，甚至更优选地约2μg至约20μg，甚至更优选地约4μg至约20μg，并且甚至更优选地约4μg至约16μg。
根据本公开的组合物可以真皮内、气管内或阴道内施用。所述组合物优选地可以肌内或鼻内施用。在动物体中，经由静脉内注射或通过直接注射到目标组织中来施用如上文所述的药物组合物可以被证实是有利的。对于全身施用，静脉内途径、血管内途径、肌内途径、鼻内途径、动脉内途径、腹膜内途径、口服途径、或鞘内途径是优选的。更局部的施用可以皮下、真皮内、皮内、心内、小叶内、髓内、肺内或直接在待治疗的组织(结缔组织、骨组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织)中或附近实现。根据治疗的所期望的持续时间和有效性，根据本公开的组合物可以施用一次或数次，也可以间歇施用，例如在每天的基础上施用数天、数周或数月，并且以不同的剂量施用。
实施例1
本实施例开发了用于特异性检测PCV3衣壳基因的qPCR。
使用MagMax-96总核酸分离试剂盒，根据制造商的方案从临床标本中分离病毒DNA。用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒，如制造商(加利福尼亚州瓦伦西亚的快而精公司(Qiagen,Valencia,CA))所说明来提取来自福尔马林固定的石蜡包埋的组织的核酸。5'-核酸酶测定被设计成靶向样品中PCV3 cap基因核酸的112bp区域：探针：5'-FAM-ACC CCATGG-Zen-CTC AAC ACA TAT GAC C-Iowa Black-3'(SEQ ID NO.14)；正向：5'-AGT GCT CCCCAT TGA ACG-3'(SEQ ID NO.13)；反向：5'-ACA CAG CCG TTA CTT CAC-3'(SEQ IDNO.12)。使用Qiagen Quantitect PCR试剂盒，在以下条件下进行定量PCR：95℃，15分钟；以及45个循环的94℃(15秒)和60℃(60秒)。使用含有克隆到pSF-CMV-AMP(英国的OxfordGenetics公司(Oxford Genetics,UK))中的整个PCV3 cap基因的质粒(pSF-CMV-cap)的稀释系列和从细胞培养物中提取的PCV2核酸来确定测定的灵敏度和特异性。使用从质粒稀释系列确定的循环阈值(Ct)来产生用于计算的标准曲线以确定基因组拷贝数/毫升(gc/ml)。
使用以表1中所示的引物产生的四个重叠扩增子的桑格测序，从来自PDNS暴发的养殖场的胎儿组织匀浆池以及发病率研究中的样品确定PCV3的完整基因组。使用TaKaRaTaqTM如下进行PCR：94℃，4分钟；继而是40个循环的94℃，20秒；50℃，30秒；72℃，1分钟；以及72℃，5分钟。使用330bp内部cap基因引物组进行测序以确认所选择的PCV3阳性样品：5'-CCA CAG AAG GCG CTA TGT C-3'(SEQ ID NO.16)和5'-CCG CAT AAG GGT CGT CTT G-3'(SEQ ID NO.17)。使用TaKaRa TaqTM，如上文所概述来进行cap基因PCR反应。对PCR产物进行桑格测序来进行验证。
实施例2
本实施例分离了病毒。
在补充有L-谷氨酰胺和5％胎牛血清的最低必需培养基(MEM)中维持的猪睾丸细胞(ST)和猪肾细胞(PK-15)上尝试病毒分离。将细胞接种到6孔板上(60％-80％汇合)并且将100μl的样品接种到1ml病毒置换培养基中，该培养基由MEM和青霉素-链霉素溶液组成。针对细胞病变效应每天观测细胞并且通过qPCR和免疫荧光监测PCV3生长。
实施例3
本实施例展示了PCV3衣壳蛋白的克隆、表达以及纯化。
为了产生重组PCV3 cap构建体，设计引物以扩增PCV3基因的编码氨基酸(aa)35-214的部分：正向：5'-AAA AAA GCT AGC GCT GGA ACA TAC TAC ACA-3'(SEQ ID NO.18)；反向：5'-AAA AAA GAA TTC TTA GAG AAC GGA CTTGTA ACG-3'(SEQ ID NO.19)。正向引物和反向引物的5'末端分别含有NheI限制性酶切位点和EcoRI限制性酶切位点(加下划线)。将PCR产物克隆到pET28a(威斯康辛州麦迪逊的Novagen公司(Novagen,Madison,WI))载体中以使得能够在大肠杆菌中将N末端截短型PCV3 cap表达成N末端6×组氨酸(His)融合蛋白。如先前所述将pET28a-cap质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中并且表达。在表达之后，通过离心收获细菌并且使用B-PER试剂(伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯公司(Pierce,Rockford,IL))裂解，之后如制造商所说明，完成Ni-NTA琼脂糖(加利福尼亚州瓦伦西亚的快而精公司)纯化。通过在变性条件下进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并且通过蛋白质印迹法检测重组蛋白的N末端处的His标签来评估重组蛋白的纯度和身份。
实施例4
本实施例展示了抗PCV3衣壳单克隆抗体的产生和体外表征。
用纯化的截短的衣壳蛋白(35-214 aa)对BALB/c小鼠进行免疫接种。用50μg与弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant)混合的抗原每两周一次对小鼠进行接种，持续总共八周。随后，将小鼠脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合。通过免疫荧光抗体测定(IFA)，使用表达天然PCV3 cap的HEK293细胞来鉴定对PCV3具有特异性的单克隆抗体(MAb)。将6孔板上维持在含有5％胎牛血清(FBS)和抗生素(环丙沙星(ciprofloxacin)、青霉素、链霉素以及庆大霉素)的MEM中的HEK293细胞用pSF-CMV-AMP或含有克隆到XhoI限制性酶切位点中的完整PCV3 cap基因的源自于pSF-CMV-AMP的质粒(pSF-CMV-cap)转染。在6孔板上，按照制造商的说明书，将106个细胞用LipofectamineTM 2000(英杰公司)和10μg的DNA转染。在48小时之后，在室温(RT)下将板用80％丙酮固定10分钟并且干燥。将转染的细胞与未稀释的抗PCV3-cap MAb一起在37℃孵育1小时，继而用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次，并且与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的山羊抗小鼠IgG(宾夕法尼亚州西格罗夫的杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.West Grove,PA))(在PBS中1:100稀释)一起在37℃孵育1小时。在最后的洗涤之后，使用Eclipse TE2000-U倒置荧光显微镜(尼康公司(Nikon))将细胞可视化。使用以PCV2感染的ST细胞来评价PCV3 MAb的特异性。
实施例5
本实施例展示了在PDNS病例上的PCV3检测和免疫组织化学。
将组织在室温下在10％中性缓冲福尔马林中固定并且将组织切片包埋在石蜡中直到切片为止。经由标准方案进行免疫组织化学并且使用LSM700共聚焦扫描显微镜(蔡司公司(Zeiss))将载片可视化。
实施例6
本实施例展示了重组PCV3衣壳ELISA的开发。
类似于先前所述的测定，使用每孔2μg/ml的纯化的重组PCV3衣壳蛋白包被康宁(Corning)EIA/RIA高结合板进行ELISA(33-35)。
实施例1-6的结果
将用于系统发育分析的PCV3的全基因组序列以登录号KT869077(PCV3株29160)和KX458235(PCV3株2164)提交给基因库。用于系统发育分析的先前公开的序列包括：鲃鱼(Barbel)圆环病毒(BarCV)GU799606；蝙蝠圆环病毒-1(BtCV-1)JX863737；蝙蝠圆环病毒-2(BtCV-2)KC339249；蝙蝠圆环病毒-3(BtCV-3)JQ814849；喙羽病病毒(BFDV)AF080560；金丝雀圆环病毒(CaCV)AJ301633；犬圆环病毒(CanineCV)KC241983；黑猩猩粪便相关圆环病毒(ChfaCV)GQ404851；鸭圆环病毒(DuCV)AY228555；欧洲鲶鱼圆环病毒(EcatfishCV)JQ011377；雀类圆环病毒(FiCV)DQ845075；鹅圆环病毒(GoCV)AJ304456；鸥圆环病毒(GuCV)DQ845074；人类粪便相关圆环病毒(HufaCV)GQ404856；貂圆环病毒(MiCV)KJ020099；鸽圆环病毒(PiCV)AF252610；猪圆环病毒1(PCV1)Y09921；猪圆环病毒2(PCV2)AF027217；PorkNW2/USA/2009HQ738638；乌鸦圆环病毒(RaCV)DQ146997；欧椋鸟圆环病毒(StCV)DQ172906；天鹅圆环病毒(SwCV)EU056309；斑胸草雀圆环病毒(ZfiCV)KP793918。
在商业母猪养殖场中PDNS样疾病暴发的临床和组织学发现。
在2015年6月期间，与历史养殖场平均值相比，商业猪场由于PDNS的暴发而遭受了母猪死亡率的10.2％增加和受孕率的0.6％降低。在临床上，患病的母猪是厌食的，并且呈现多灶性丘疹、斑块以及浅表性皮炎。将组织样品提交给ISUVDL以进行诊断测试。在组织学上，皮肤病变的特征在于急性坏死性皮炎以及与淋巴浆细胞性血管周围套相关的表皮炎。肾表现出皮质小管扩张、小管内层上皮的变薄和再生、以及弥漫浸润皮质间质组织和肾小球的淋巴细胞和巨噬细胞的大团簇。养殖场遭受了比历史平均流产率高出每窝1.19个流产的木乃伊化胎儿的增量。流产的同窝仔猪含有不同胎龄的木乃伊化胎儿，这与先前在PCV2相关流产中所述的那些相一致。虽然在母猪中所观测到的肉眼病变和组织学病变以及流产的存在与PCVAD相一致，但是包括肾脏、淋巴结、肺以及皮肤在内的所有母猪组织通过IHC和qPCR测试为对于PCV2、PRRSV以及IAV呈阴性。此外，通过qPCR，胎儿组织对于PCV2、PRRSV以及PPV呈阴性。
宏基因组测序
通过病毒宏基因组测序来分析从三个胎儿制备的组织匀浆池。Miseq运行产生了989,478个总读段，其中926,380个定位到宿主基因组野猪(Sus scrofa)。从头组装其余的读段，从而产生27个重叠群。约54％的读段定位到1,246bp重叠群，当通过BLASTN分析时，该重叠群与在商业碎猪肉中鉴定的部分圆环病毒基因组PorkNW2/USA/2009(登录号HQ738638)98％相似。其余读段显示与任何已知的真核病毒没有相似性。
还对来自有PDNS样病变的母猪的汇集的组织匀浆进行宏基因组测序。没有定位到野猪参考序列的序列的从头组装产生了735个重叠群，通过BLASTN对这些重叠群进行分析。两个重叠群与细环病毒1(torque teno virus 1，TTV-1)具有约97％的同一性。使用PCV3参考(KT869077)的组装鉴定出定位到基因组的四个读段。其余读段显示与已知的真核病毒没有同源性。
遗传分析
对所得的扩增子进行滚环扩增，继而进行PCR和桑格测序允许从胎儿组织匀浆组装2,000个核苷酸(nt)的环状基因组。ORF分析鉴定出编码大于200个氨基酸(aa)的蛋白质的三个ORF，其中通过BLASTP，两个ORF与圆环病毒rep蛋白和cap蛋白显示出同源性，以相反方向取向(图1)。在rep基因链上rep与cap ORF之间的235 nt 5'-基因间区内是具有与PCV1相同的9nt茎和环九聚体(TAGTATTAC)(SEQ ID NO.15)的预测的茎环结构。遵循惯例，环九聚体中位置8处的“A”残基被定义为基因组中的位置“1”。
最大的ORF编码预测的具有297个氨基酸的蛋白质，所述蛋白质通过BLASTP与圆环病毒科PorkNW2/USA/2009(登录号ADU77001，221个氨基酸)的部分复制酶蛋白69.4％同一并且与来自中国的蝙蝠圆环病毒(登录号AIF76248，293个氨基酸)54％同一。PorkNW2/USA/2009基因组是从商业猪肉制品中获得的并且编码在组织和序列上与圆环病毒最相似的完整复制酶和部分衣壳基因。通过BLASTP，分别从rep ORF中的aa 9-93和162-251鉴定出保守的圆环病毒复制酶结构域和解旋酶结构域。对rep ORF蛋白质序列的进一步研究揭示了类似于GoCV和PiCV的保守滚环复制(RCR)基序和P环基序。在圆环病毒中保守的三个RCR基序中，在PCV3中，FTLNN(SEQ ID NO.20)基序含有单一突变，作为FTINN(SEQ ID NO.21)存在。该突变在诸如GoCV的其它圆环病毒中被看到。其它两个RCR基序HLQG(SEQ ID NO.22)和YCKK(SEQ ID NO.23)也存在于PCV3中。此外，在圆环病毒复制酶蛋白中保守，但是具有未知功能的三个基序在PCV3中被鉴定出，包括WWDGY(氨基酸196-200)(SEQ ID NO.24)、DDFYGWVP(氨基酸209-216)(SEQ ID NO.25)、以及DRYP(氨基酸225-228)(SEQ ID NO.26)。有趣的是，没有鉴定出经典起始密码子。GTC(SEQ ID NO.27)密码子(编码缬氨酸)存在于ORF的5'末端处，最接近的框内ATG(SEQ ID NO.28)存在于下游约400bp处。该替代性起始密码子也在PorkNW2/USA/2009中被看到。已经提出了许多禽类圆环病毒的替代性起始密码子，包括鹅圆环病毒、鸽圆环病毒以及喙羽病病毒。
与rep呈相反取向的推定的cap ORF编码具有214个氨基酸的蛋白质，通过BLASTP，所述蛋白质与PorkNW2/USA/2009的部分衣壳序列(110个氨基酸)87％同一并且与PCV2和鸭圆环病毒(分别是233个氨基酸和257个氨基酸)36％-37％同一(图1)。类似于其它圆环病毒衣壳蛋白，N末端含有许多精氨酸残基并且是高度碱性的。通过BLASTP从aa 26-173鉴定出保守的圆环病毒衣壳结构域。此外，PCV3 cap蛋白没有预测的N连接的糖基化位点，但是在aa 146和150(分别是S和T)处具有两个预测的O连接的糖基化位点。这与具有两个通过实验验证的N连接的糖基化位点的PCV2相反。
与预测的rep在同一条链上取向的第三ORF编码具有231个氨基酸的蛋白质，所述蛋白质与在PorkNW2/USA/2009中所鉴定的ORF具有94％的同一性并且与鼠疱疹病毒M169(未知功能的蛋白质)具有39％的同一性。类似于rep，ORF3的起始密码子尚不清楚。5'末端处的密码子是TCG(编码丝氨酸)。ORF3 aa 55处的甲硫氨酸是将产生具有177个氨基酸的蛋白质的替代的可能的起始位点。
由于与圆环病毒属的遗传相似性和结构相似性以及与其它物种具有<70％的衣壳氨基酸同一性，因此该新种被提出为猪圆环病毒3(PCV3)。PCV3基因组序列以登录号KT869077和KX458235提交给基因库。
系统发育分析
为了研究PCV3与圆环病毒科的其它成员的进化关系，分析了来自所述家族的二十三个成员和两个PCV3基因组的基因组序列。对全圆环病毒基因组的分析将这两个PCV3序列分组到与所述属的所有其它成员分离的具有PorkNW2/USA/2009的进化枝中(图2)。系统发育表明PCV3与犬圆环病毒(KC241983)最密切相关，然而，该关系缺乏强有力的自展支持。系统发育还表明PCV3和犬CV与含有PCV1、PCV2以及BatCV-2(KC339249)的进化枝共有共同的祖先。除了人类圆环病毒(HufaCV，GQ404856)之外，哺乳动物圆环病毒和禽类圆环病毒属于单独的得到很好支持的进化枝。
通过PCR检测PCV3
为了确认猪样品中PCV3的存在，设计了5'-核酸酶测定来确定PCV3 cap基因的存在。来自暴发的养殖场的胎儿组织匀浆样品对于PCV3呈强阳性，其中Ct值是16.7至21.3，对应于约1.88×108gc/ml至7.55×106gc/ml的高水平的PCV3。来自有PDNS样病变的母猪中的三只的组织对于PCV3呈阳性，具有2.13×104gc/ml至8.62×104gc/ml。此外，通过qPCR针对PCV3来分析提交给ISUVDL的30个血清样品。所述血清样品对于PCV3呈阳性，具有5.63×102gc/ml至2.28×104gc/ml。使用具有最高PCV3滴度的血清样品，通过PCR扩增以产生重叠扩增子以获得第二完整PCV3基因组，其与来自具有暴发的养殖场的原始PCV3具有99.0％的同一性。该第二PCV3基因组以登录号KX458235提交给基因库。
此外，为了研究PCV3的发病率，通过qPCR分析提交给ISUVDL用于进行呼吸系统疾病诊断测试的总共271个样品。所述样品中的三十四个(12.5％)呈阳性，具有3.00×102gc/ml-1.52×107gc/ml的滴度。
PCV3-cap MAb14的表征
将用pSF-CMV-cap转染的HEK293细胞分别与四种不同MAb克隆细胞上清液一起孵育并且通过IFA筛查。如所预期，由于预测的高度碱性核定位信号，因此对于克隆14(MAb14)观测到定位到核的荧光。对于用pSF-CMV-Amp转染的细胞没有观测到荧光。此外，用PCV2感染的ST细胞没有可检测的荧光。
病毒分离
对ST细胞和PK-15细胞尝试病毒分离。将细胞用过滤的胎儿组织匀浆接种并且传代三次。随着每一次连续传代，细胞病变效应不明显并且Ct值增加。通过使用MAb14的IFA，荧光不明显。
PDNS病例中与PCV3抗原的存在相关的组织学病变
通过H&E染色和IHC使用PCV3 MAb14检查来自有PDNS样病变的母猪和存档的PDNS病例的组织样品。肺显示出不同程度的支气管间质性肺炎，偶尔并发继发性化脓性支气管肺炎。小尺寸和中等尺寸的气道和小血管被淋巴细胞和浆细胞的细支气管周围和血管周围的聚集体包裹。相邻的肺泡隔被淋巴细胞和浆细胞浸润。在肺泡腔内存在与中等数量的泡沫状巨噬细胞、稀少的多核巨细胞、以及小团簇的中性粒细胞相互混合的大量的腔内水肿。偶见的淋巴细胞和散在的巨噬细胞显示出针对PCV3的中度胞质内免疫染色。在皮肤切片中，真皮和皮下组织具有特征性的坏死性血管炎，伴有纤维蛋白样改变和透壁中性粒细胞浸润、出血、以及纤维蛋白渗出。炎性浸润常常延伸到周围的真皮和皮下组织。也有散在淋巴浆细胞聚集体偶尔在血管和真皮附件周围包裹。偶尔，表皮增生，伴有轻度的正角化性过度角化。真皮淋巴细胞浸润显示出针对PCV3的显著的胞质内免疫染色。当用PBS替换PCV3MAb14时，最小背景染色是明显的。淋巴结显示出弥漫性肉芽肿性淋巴结炎。皮质滤泡有中度的淋巴损耗并且被组织细胞和大量多核巨细胞浸润。皮质下窦和髓窦因中等程度的水肿和出血而扩张，与大量巨噬细胞和浆细胞相互混合。与其中用PBS或来自PCV3 qPCR阴性猪的淋巴结组织替换PCV3 MAb14的背景染色相比，滤泡和滤泡周围淋巴细胞群体显示出针对PCV3的弥漫性强烈的胞质内染色。
肾切片的特征在于弥漫性膜增生性肾小球肾炎的存在。存在严重的肾小球硬化并且鲍曼氏囊(Bowman's capsule)常常增厚，并且皮质小管变稀薄并且与可变间质纤维化相关。肾小球系膜细胞过多并且因无定形嗜酸性物质而增厚。小管偶尔会发生扩张，由变薄的上皮内衬并且偶尔存在明显的蛋白质沉积。在整个切片中散在的是间质组织中淋巴细胞和浆细胞的小尺寸至中等尺寸的团簇。小管上皮显示出针对PCV3的阳性染色的随机区域。对于用PBS和山羊抗小鼠FITC模拟染色的载片或来自PCV3 qPCR阴性猪的肾组织观测到最小背景荧光。
在有PDNS病变的组织中检测PCV3核酸
为了进一步研究PCV3在PDNS中的病因学作用，评价了先前通过IHC测试为对于PCV2呈阴性的有与PDNS一致的组织学病变的48例病例。通过qPCR针对PCV3测定来自石蜡包埋的组织块的组织卷。所述病例中有45例(93.8％)对于PCV3呈阳性，具有病毒滴度1.60×104gc/ml-3.47×104gc/ml。为了确认这些结果，使用靶向cap基因的330bp片段的PCR分析具有最高病毒滴度的样品中的五个。在所评价的所有样品中扩增靶扩增子并且扩增子产物序列与PCV3基因组序列显示出100％同一性。通过PCV3-IHC测试来自五例PCV3 PCR阳性病例的组织。五例中有三例是阳性的。
PCV3血清阳性率
通过ELISA，使用rPCV3-cap抗原检查猪血清中抗PCV3 cap抗体的出现率。使用来自从被测试为PCV3 qPCR阴性的无特定病原体群获得的3周大的猪的十八个血清样品作为阴性对照并且具有0.49的平均吸光度。区分阳性血清和阴性血清的临界值被确定在阴性对照的平均值之上三个标准偏差(0.87)。在PDNS暴发之后三个月收集的来自暴发养殖场的十只母猪的血清全部呈阳性，具有1.27的平均吸光度。此外，还测试了来自向所述母猪养殖场供应替代动物的养殖场的后备母猪的27个血清，其中十七只动物(63％)具有0.88-1.37的吸光度。在来自多个州的提交用于无关诊断测试的83个样品中的47个(56.6％)中检测到抗PCV3 cap抗体。在阳性样品中，13个源自于爱荷华州，1个源自于印地安那州，5个源自于墨西哥州，4个源自于北卡罗来纳州，5个源自于内布拉斯加州，1个源自于俄克拉何马州并且18个源自于未知来源。
讨论
首次在1993年在欧洲被描述，PDNS已经在世界范围内许多国家被报道。尽管在畜群内疾病的发病率通常是低的(<1％)，但是患病猪的死亡率可以是高的。PDNS的发病率在欧洲和英国可能超过PMWS的发病率。尽管PDNS的病因学是未知的，但是使用qPCR在患病的猪中通常检测到PCV2核酸，而PCV2抗原被不一致地检测到。这已经引起了有关PCV2在PDNS中的作用的猜测。在此，被称为PCV3的猪圆环病毒的一种高度不同的新种从有PDNS样病变的母猪流产的木乃伊化胎儿以及急性死亡而有与PDNS一致的临床体征的母猪中被鉴定出。PCV3是通过对汇集的胎儿组织进行宏基因组测序所鉴定的唯一的病毒，这通过qPCR确认。胎儿组织池中16.7-21.3的循环阈值表明了样品的7.55×106gc/ml-1.88×108gc/ml的高病毒滴度。胎儿中的PCV2滴度与繁殖疾病之间存在相关性，其中PCV2水平是每500ng胎儿组织107个PCV2 DNA拷贝，或与包括木乃伊化的PCV2相关繁殖障碍更相关。基于在该暴发期间所检测到的PCV3核酸的量和组织分布，PCV3与繁殖障碍存在类似的相关性。
还通过PCR和IHC在有PDNS样病变的母猪的皮肤、肺、肾脏、以及淋巴结中检测到PCV3。PCR、IHC以及宏基因组测序均未能在从暴发养殖场收集的样品中鉴定出PCV2。这些结果显示PCV3感染导致了PDNS样病变和流产的存在，并且胎儿中的PCV3是垂直传播的结果。为了支持PCV3在PDNS病变中的这一病因学作用，筛查存档的PCV2IHC阴性PDNS病例发现PCV3核酸是高度流行的(93.8％)并且通过IHC针对PCV3检查的五例病例中有三例呈阳性。应当指出的是，组织中PCV3的相对低的滴度可能限制了一致的检测。
试图通过实验用PCV2再现PDNS未获得成功，然而，PDNS已经通过实验在不存在PCV2的情况下使用PRRSV和含有TTV的组织匀浆来再现。关于TTV感染的临床意义知之甚少。在世界范围内，TTV在猪中是普遍存在的。虽然TTV通常在健康的猪中被检测到，但是几项研究已经表明TTV感染在合并感染期间缓和了疾病严重程度。举例来说，用含有TTV的组织匀浆，继而用PCV2对猪进行接种会引起PMWS，而单一感染则不会。患有PDNS的来自暴发养殖场的母猪感染了PCV3和TTV1这两者。TTV1合并感染的影响是未知的。尚不清楚合并感染遗传多样性小环状DNA病毒，例如TTV1(指环病毒科(Anelloviridae))、PCV2以及PCV3是否影响PDNS的发展。对于PMWS已经证实了与PCV2合并感染对疾病严重程度的累加效应。PPV和PCV2的合并感染已经被证实会加剧疾病。PCV2和PRRSV合并感染是猪呼吸系统疾病综合征的重要组成部分。畜群感染了这些致病因子会引起严重的呼吸系统疾病以及经济灾难性的母猪流产和死亡。
包括特征性坏死性血管炎的PDNS的发病机制被认为是涉及PCV2的免疫复合物介导的病症的表现。在病例对照研究中，有PDNS的临床体征的所有猪都是PCV2-PCR阳性的并且具有显著高于临床上正常的猪的PCV2抗体滴度。检查PDNS阳性猪的肾脏发现与临床上正常的猪相比，肾小球中的纤维蛋白样沉积物增加，所述沉积物由IgG1、IgG2、IgM、以及补体因子C1q和C3的积聚组成。尽管通过IHC在这些PDNS猪的肺组织中鉴定出PCV2抗原，但是在免疫复合物中没有鉴定出PCV2抗原。该结果类似于由其他人报道的在PDNS猪的肾组织中PCV2的不一致的检测。已知病毒感染会导致免疫病症，其中由阿留申水貂病病毒(AleutianMink Disease Virus，AMDV)所引起的阿留申水貂病(AMD)与PDNS具有相似的发病机制。AMD的发病机制已经与AMDV特异性IgG抗体的过量产生相关。PCV3在引起PDNS的发病机制的可能的免疫复合物介导的病症中的作用需要进一步研究。
PCV2是世界范围内最具经济意义的猪病毒病原体之一。与PCVAD相关的最常见的基因型是PCV2a和PCV2b。在2003年之前，PCV2a是在美国和加拿大鉴定出的主要基因型，尽管PCV2a和PCV2b这两者都在国际上被发现。在约2003年，在全球范围内PCV2基因型频率发生从PCV2a到PCV2b的急剧转变，这与和PCV2b相关的严重全身性疾病相一致。随着已经被证实为具有交叉保护性的含有PCV2a抗原的商业疫苗的发展，所述世界范围内的流行病被成功控制。最近，在1999年在瑞士首次检测到的新基因型PCV2d传播到中国，继而传播到美国。类似于在PCV2b的情况下所看到的，流行病学研究表明基因型转变正在进行，随之而来的是关于PCV2疫苗失败和临床疾病增加的报道。PCV2d已经牵涉到更严重的临床体征和病变。
圆环病毒具有遗传多样性并且通过记录的跨物种传播感染广泛的宿主。系统发育分析表明PCV3与犬CV之间有最接近的进化关系。有趣的是，犬CV在表现出坏死性血管炎和肉芽肿性淋巴结炎的狗的肝脏中被鉴定出，其中这两者都在感染了PCV3的母猪中被观测到以及在PCV2感染中被报道。尚不清楚PCV3是否已在一段时间内未检测到的猪中进化或它是经由跨物种传播而起源还是经由未鉴定的亲本圆环病毒之间的重组而产生。PCV2能够跨越物种障碍，在除猪以外的物种中引起致命性疾病；最近的报道在中国死于腹泻的六只貂中鉴定出PCV2。
在PDNS和繁殖障碍中具有可能的病因学作用的新型猪圆环病毒的发现是令人不安的。回顾性研究表明在20世纪90年代后期变成流行病之前，PCV2早在1985年就引起了偶发性全身性疾病。PCV3处于类似轨迹的可能性值得进一步研究和产生本公开的免疫原性组合物。重要的是，鉴于PCV2衣壳蛋白与PCV3衣壳蛋白之间约30％的同一性，交叉保护似乎不太可能。
结论
猪圆环病毒2是世界范围内最重要的猪病原体之一。在此，猪圆环病毒的高度不同的新种PCV3从遭受流产并且表现出PDNS的母猪中被鉴定出，后者是通常与PCV2感染相关的临床表现。PCV3基因组包括ORF1、ORF2、以及ORF3。通过宏基因组测序没有检测到其它病毒并且PCR对于PCV2、PPV、PRRSV以及IAV是阴性的。这联同木乃伊组织中的高病毒载量表明了PCV3可以引起类似于PCV2的临床疾病。针对PCV3的分子测定和血清学测定还表明所述病毒通常在美国猪群中传播。由于在变成全球流行病之前，PCV2感染最初是亚临床的并且仅零星地引起疾病，因此PCV3值得进一步研究。
以下参考文献的教导和内容在此以引用的方式并入本文。
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序列表
<110> 堪萨斯州立大学研究基金会
B·豪泽
<120> 猪3型圆环病毒免疫原性组合物以及其制备和使用方法
<130> 40405-PRO
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2000
<212> DNA
<213> 猪3型圆环病毒
<400> 1
acccggcacc tcggaacccg gatccacgga ggtctgtagg gagaaaaagt ggtatcccat 60
tatggatgct ccgcaccgtg tgagtggata taccgggcag tggatgatga agcggcctcg 120
tgttttgatg ccgcaggacg gggactggat aactgagttt ttgtggtgct acgagtgtcc 180
tgaagataag gacttttatt gtcatcctat tctaggtccg gagggaaagc ccgaaacaca 240
ggtggtgttt tacgataaac aactggaccc cgaccgagtg ggaatctatt gtggagtgtg 300
gaggcagtat agcgagatac cttattatcg gcaaagaggt tggaaaaagc ggtaccccac 360
acttgcaagg gtacgtgaat ttcaagaaca aaaggcgact cagctcggtg aagcgcttac 420
ccggatttgg tcgggcccat ctggagccgg cgagggggag ccacaaagag gccagcgagt 480
attgcaagaa agagggggat tacctcgaga ttggcgaaga ttcctcttcg ggtaccagat 540
cggatcttca agcagcagct cggattctga cggagacgtc gggaaatctg actgaagttg 600
cggagaagat gcctgcagta tttatacgct atgggcgggg tttgcgtgat ttttgcgggg 660
tgatggggtt gggtaaaccg cgtgatttta aaactgaagt ttatgttttt attggtcctc 720
caggatgcgg gaaaacgcgg gaagcttgtg cggatgcggc tgcgcgggaa ttgcagttgt 780
atttcaagcc acgggggcct tggtgggatg gttataatgg ggagggtgct gttattttgg 840
atgattttta tgggtgggtt ccatttgatg aattgctgag aattggggac aggtaccctc 900
tgagggttcc tgttaagggt gggtttgtta attttgtggc taaggtatta tatattacta 960
gtaatgttgt accggaggag tggtattcat cggagaatat tcgtggaaag ttggaggcct 1020
tgtttaggag gttcactaag gttgtttgtt ggggggaggg gggggtaaag aaagacatgg 1080
agacagtgta tccaataaac tattgatttt atttgcactt gtgtacaatt attgcgttgg 1140
ggtgggggta tttattggga gggtgggtgg gcagccccct agccacggct tgtcgccccc 1200
accgaagcat gtgggggatg gggtccccac atgcgagggc gtttacctgt gcccgcaccc 1260
gaagcgcagc gggagcgcgc gcgaggggac acggcttgtc gccaccggag gggtcagatt 1320
tatatttatt ttcacttaga gaacggactt gtaacgaatc caaacttctt tggtgccgta 1380
gaagtctgtc attccagttt tttccgggac ataaatgctc caaagcagtg ctccccattg 1440
aacggtgggg tcatatgtgt tgagccatgg ggtgggtctg gagaaaaaga agaggctttg 1500
tcctgggtga gcgctggtag ttcccgccag aagtggtttg ggggtgaagt aacggctgtg 1560
ttttttttta gaagtcataa ctttacgagt ggaactttcc gcataagggt cgtcttggag 1620
ccaagtgttt gtggtccagg cgccgtctag atctatggct gtgtgcccga acatagtttt 1680
tgtttgctga gccggagaaa ttacagggct gagtgtaact ttcattttta gtatcttata 1740
atattcaaag gtaattgcag tttcccattc gtttaggcgg gtaatgaagt ggttggcgtg 1800
ccagggcttg ttattctgag gggttccaac ggatatgacg ttcattgtgg agtatttctt 1860
tgtgtagtat gtgccagctg tgggcctcct aatgaatagt cgtcttctgg catagcgcct 1920
tctgtggcgt cgtcgtctcc ttgggcgggg tcttcttctg aatatagctc tgtgtctcat 1980
tttggtgccg ggctagtatt 2000
<210> 2
<211> 646
<212> PRT
<213> 猪圆环病毒
<400> 2
Thr Arg His Leu Gly Thr Arg Ile His Gly Gly Leu Gly Glu Lys Val
1 5 10 15
Val Ser His Tyr Gly Cys Ser Ala Pro Cys Glu Trp Ile Tyr Arg Ala
20 25 30
Val Asp Asp Glu Ala Ala Ser Cys Phe Asp Ala Ala Gly Arg Gly Leu
35 40 45
Asp Asn Val Phe Val Val Leu Arg Val Ser Arg Gly Leu Leu Leu Ser
50 55 60
Ser Tyr Ser Arg Ser Gly Gly Lys Ala Arg Asn Thr Gly Gly Val Leu
65 70 75 80
Arg Thr Thr Gly Pro Arg Pro Ser Gly Asn Leu Leu Trp Ser Val Glu
85 90 95
Ala Val Arg Asp Thr Leu Leu Ser Ala Lys Arg Leu Glu Lys Ala Val
100 105 110
Pro His Thr Cys Lys Gly Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Asp Ser Ala
115 120 125
Arg Ser Ala Tyr Pro Asp Leu Val Gly Pro Ile Trp Ser Arg Arg Gly
130 135 140
Gly Ala Thr Lys Arg Pro Ala Ser Ile Ala Arg Lys Arg Gly Ile Thr
145 150 155 160
Ser Arg Leu Ala Lys Ile Pro Leu Arg Val Pro Asp Arg Ile Phe Lys
165 170 175
Gln Gln Leu Gly Phe Arg Arg Arg Arg Glu Ile Leu Lys Leu Arg Arg
180 185 190
Arg Cys Leu Gln Tyr Leu Tyr Ala Met Gly Gly Val Cys Val Ile Phe
195 200 205
Ala Gly Trp Gly Trp Val Asn Arg Val Ile Leu Lys Leu Lys Phe Met
210 215 220
Phe Leu Leu Val Leu Gln Asp Ala Gly Lys Arg Gly Lys Leu Val Arg
225 230 235 240
Met Arg Leu Arg Gly Asn Cys Ser Cys Ile Ser Ser His Gly Gly Leu
245 250 255
Gly Gly Met Val Ile Met Gly Arg Val Leu Leu Phe Trp Met Ile Phe
260 265 270
Met Gly Gly Phe His Leu Met Asn Cys Glu Leu Gly Thr Gly Thr Leu
275 280 285
Gly Phe Leu Leu Arg Val Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Arg Tyr Tyr
290 295 300
Ile Leu Leu Val Met Leu Tyr Arg Arg Ser Gly Ile His Arg Arg Ile
305 310 315 320
Phe Val Glu Ser Trp Arg Pro Cys Leu Gly Gly Ser Leu Arg Leu Phe
325 330 335
Val Gly Gly Arg Gly Gly Arg Lys Thr Trp Arg Gln Cys Ile Gln Thr
340 345 350
Ile Asp Phe Ile Cys Thr Cys Val Gln Leu Leu Arg Trp Gly Gly Gly
355 360 365
Ile Tyr Trp Glu Gly Gly Trp Ala Ala Pro Pro Arg Leu Val Ala Pro
370 375 380
Thr Glu Ala Cys Gly Gly Trp Gly Pro His Met Arg Gly Arg Leu Pro
385 390 395 400
Val Pro Ala Pro Glu Ala Gln Arg Glu Arg Ala Arg Gly Asp Thr Ala
405 410 415
Cys Arg His Arg Arg Gly Gln Ile Tyr Ile Tyr Phe His Leu Glu Asn
420 425 430
Gly Leu Val Thr Asn Pro Asn Phe Phe Gly Ala Val Glu Val Cys His
435 440 445
Ser Ser Phe Phe Arg Asp Ile Asn Ala Pro Lys Gln Cys Ser Pro Leu
450 455 460
Asn Gly Gly Val Ile Cys Val Glu Pro Trp Gly Gly Ser Gly Glu Lys
465 470 475 480
Glu Glu Ala Leu Ser Trp Val Ser Ala Gly Ser Ser Arg Gln Lys Trp
485 490 495
Phe Gly Gly Glu Val Thr Ala Val Phe Phe Phe Arg Ser His Asn Phe
500 505 510
Thr Ser Gly Thr Phe Arg Ile Arg Val Val Leu Glu Pro Ser Val Cys
515 520 525
Gly Pro Gly Ala Val Ile Tyr Gly Cys Val Pro Glu His Ser Phe Cys
530 535 540
Leu Leu Ser Arg Arg Asn Tyr Arg Ala Glu Cys Asn Phe His Phe Tyr
545 550 555 560
Leu Ile Ile Phe Lys Gly Asn Cys Ser Phe Pro Phe Val Ala Gly Asn
565 570 575
Glu Val Val Gly Val Pro Gly Leu Val Ile Leu Arg Gly Ser Asn Gly
580 585 590
Tyr Asp Val His Cys Gly Val Phe Leu Cys Val Val Cys Ala Ser Cys
595 600 605
Gly Pro Pro Asn Glu Ser Ser Ser Gly Ile Ala Pro Ser Val Ala Ser
610 615 620
Ser Ser Pro Trp Ala Gly Ser Ser Ser Glu Tyr Ser Ser Val Ser His
625 630 635 640
Phe Gly Ala Gly Leu Val
645
<210> 3
<211> 891
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒ORF1
<400> 3
gtccggaggg aaagcccgaa acacaggtgg tgttttacga taaacaactg gaccccgacc 60
gagtgggaat ctattgtgga gtgtggaggc agtatagcga gataccttat tatcggcaaa 120
gaggttggaa aaagcggtac cccacacttg caagggtacg tgaatttcaa gaacaaaagg 180
cgactcagct cggtgaagcg cttacccgga tttggtcggg cccatctgga gccggcgagg 240
gggagccaca aagaggccag cgagtattgc aagaaagagg gggattacct cgagattggc 300
gaagattcct cttcgggtac cagatcggat cttcaagcag cagctcggat tctgacggag 360
acgtcgggaa atctgactga agttgcggag aagatgcctg cagtatttat acgctatggg 420
cggggtttgc gtgatttttg cggggtgatg gggttgggta aaccgcgtga ttttaaaact 480
gaagtttatg tttttattgg tcctccagga tgcgggaaaa cgcgggaagc ttgtgcggat 540
gcggctgcgc gggaattgca gttgtatttc aagccacggg ggccttggtg ggatggttat 600
aatggggagg gtgctgttat tttggatgat ttttatgggt gggttccatt tgatgaattg 660
ctgagaattg gggacaggta ccctctgagg gttcctgtta agggtgggtt tgttaatttt 720
gtggctaagg tattatatat tactagtaat gttgtaccgg aggagtggta ttcatcggag 780
aatattcgtg gaaagttgga ggccttgttt aggaggttca ctaaggttgt ttgttggggg 840
gagggggggg taaagaaaga catggagaca gtgtatccaa taaactattg a 891
<210> 4
<211> 296
<212> PRT
<213> 猪圆环病毒ORF1
<400> 4
Val Arg Arg Glu Ser Pro Lys His Arg Trp Cys Phe Thr Ile Asn Asn
1 5 10 15
Trp Thr Pro Thr Glu Trp Glu Ser Ile Val Glu Cys Gly Gly Ser Ile
20 25 30
Ala Arg Tyr Leu Ile Ile Gly Lys Glu Val Gly Lys Ser Gly Thr Pro
35 40 45
His Leu Gln Gly Tyr Val Asn Phe Lys Asn Lys Arg Arg Leu Ser Ser
50 55 60
Val Lys Arg Leu Pro Gly Phe Gly Arg Ala His Leu Glu Pro Ala Arg
65 70 75 80
Gly Ser His Lys Glu Ala Ser Glu Tyr Cys Lys Lys Glu Gly Asp Tyr
85 90 95
Leu Glu Ile Gly Glu Asp Ser Ser Ser Gly Thr Arg Ser Asp Leu Gln
100 105 110
Ala Ala Ala Arg Ile Leu Thr Glu Thr Ser Gly Asn Leu Thr Glu Val
115 120 125
Ala Glu Lys Met Pro Ala Val Phe Ile Arg Tyr Gly Arg Gly Leu Arg
130 135 140
Asp Phe Cys Gly Val Met Gly Leu Gly Lys Pro Arg Asp Phe Lys Thr
145 150 155 160
Glu Val Tyr Val Phe Ile Gly Pro Pro Gly Cys Gly Lys Thr Arg Glu
165 170 175
Ala Cys Ala Asp Ala Ala Ala Arg Glu Leu Gln Leu Tyr Phe Lys Pro
180 185 190
Arg Gly Pro Trp Trp Asp Gly Tyr Asn Gly Glu Gly Ala Val Ile Leu
195 200 205
Asp Asp Phe Tyr Gly Trp Val Pro Phe Asp Glu Leu Leu Arg Ile Gly
210 215 220
Asp Arg Tyr Pro Leu Arg Val Pro Val Lys Gly Gly Phe Val Asn Phe
225 230 235 240
Val Ala Lys Val Leu Tyr Ile Thr Ser Asn Val Val Pro Glu Glu Trp
245 250 255
Tyr Ser Ser Glu Asn Ile Arg Gly Lys Leu Glu Ala Leu Phe Arg Arg
260 265 270
Phe Thr Lys Val Val Cys Trp Gly Glu Gly Gly Val Lys Lys Asp Met
275 280 285
Glu Thr Val Tyr Pro Ile Asn Tyr
290 295
<210> 5
<211> 645
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒ORF2
<400> 5
atgagacaca gagctatatt cagaagaaga ccccgcccaa ggagacgacg acgccacaga 60
aggcgctatg ccagaagacg actattcatt aggaggccca cagctggcac atactacaca 120
aagaaatact ccacaatgaa cgtcatatcc gttggaaccc ctcagaataa caagccctgg 180
cacgccaacc acttcattac ccgcctaaac gaatgggaaa ctgcaattac ctttgaatat 240
tataagatac taaaaatgaa agttacactc agccctgtaa tttctccggc tcagcaaaca 300
aaaactatgt tcgggcacac agccatagat ctagacggcg cctggaccac aaacacttgg 360
ctccaagacg acccttatgc ggaaagttcc actcgtaaag ttatgacttc taaaaaaaaa 420
cacagccgtt acttcacccc caaaccactt ctggcgggaa ctaccagcgc tcacccagga 480
caaagcctct tctttttctc cagacccacc ccatggctca acacatatga ccccaccgtt 540
caatggggag cactgctttg gagcatttat gtcccggaaa aaactggaat gacagacttc 600
tacggcacca aagaagtttg gattcgttac aagtccgttc tctaa 645
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> 猪圆环病毒ORF2
<400> 6
Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu Phe Ile Arg Arg
20 25 30
Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val
35 40 45
Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His
50 55 60
Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Thr Phe Glu Tyr
65 70 75 80
Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro
85 90 95
Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp
100 105 110
Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu
115 120 125
Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr
130 135 140
Phe Thr Pro Lys Pro Leu Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly
145 150 155 160
Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr
165 170 175
Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro
180 185 190
Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile
195 200 205
Arg Tyr Lys Ser Val Leu
210
<210> 7
<211> 696
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒ORF3
<400> 7
tcgtcttctg gcatagcgcc ttctgtggcg tcgtcgtctc cttgggcggg gtcttcttct 60
gaatatagct ctgtgtctca ttttggtgcc gggctagtat tacccggcac ctcggaaccc 120
ggatccacgg aggtctgtag ggagaaaaag tggtatccca ttatggatgc tccgcaccgt 180
gtgagtggat ataccgggca gtggatgatg aagcggcctc gtgttttgat gccgcaggac 240
ggggactgga taactgagtt tttgtggtgc tacgagtgtc ctgaagataa ggacttttat 300
tgtcatccta ttctaggtcc ggagggaaag cccgaaacac aggtggtgtt ttacgataaa 360
caactggacc ccgaccgagt gggaatctat tgtggagtgt ggaggcagta tagcgagata 420
ccttattatc ggcaaagagg ttggaaaaag cggtacccca cacttgcaag ggtacgtgaa 480
tttcaagaac aaaaggcgac tcagctcggt gaagcgctta cccggatttg gtcgggccca 540
tctggagccg gcgaggggga gccacaaaga ggccagcgag tattgcaaga aagaggggga 600
ttacctcgag attggcgaag attcctcttc gggtaccaga tcggatcttc aagcagcagc 660
tcggattctg acggagacgt cgggaaatct gactga 696
<210> 8
<211> 231
<212> PRT
<213> 猪圆环病毒ORF3
<400> 8
Ser Ser Ser Gly Ile Ala Pro Ser Val Ala Ser Ser Ser Pro Trp Ala
1 5 10 15
Gly Ser Ser Ser Glu Tyr Ser Ser Val Ser His Phe Gly Ala Gly Leu
20 25 30
Val Leu Pro Gly Thr Ser Glu Pro Gly Ser Thr Glu Val Cys Arg Glu
35 40 45
Lys Lys Trp Tyr Pro Ile Met Asp Ala Pro His Arg Val Ser Gly Tyr
50 55 60
Thr Gly Gln Trp Met Met Lys Arg Pro Arg Val Leu Met Pro Gln Asp
65 70 75 80
Gly Asp Trp Ile Thr Glu Phe Leu Trp Cys Tyr Glu Cys Pro Glu Asp
85 90 95
Lys Asp Phe Tyr Cys His Pro Ile Leu Gly Pro Glu Gly Lys Pro Glu
100 105 110
Thr Gln Val Val Phe Tyr Asp Lys Gln Leu Asp Pro Asp Arg Val Gly
115 120 125
Ile Tyr Cys Gly Val Trp Arg Gln Tyr Ser Glu Ile Pro Tyr Tyr Arg
130 135 140
Gln Arg Gly Trp Lys Lys Arg Tyr Pro Thr Leu Ala Arg Val Arg Glu
145 150 155 160
Phe Gln Glu Gln Lys Ala Thr Gln Leu Gly Glu Ala Leu Thr Arg Ile
165 170 175
Trp Ser Gly Pro Ser Gly Ala Gly Glu Gly Glu Pro Gln Arg Gly Gln
180 185 190
Arg Val Leu Gln Glu Arg Gly Gly Leu Pro Arg Asp Trp Arg Arg Phe
195 200 205
Leu Phe Gly Tyr Gln Ile Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp
210 215 220
Gly Asp Val Gly Lys Ser Asp
225 230
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCV3复制酶引物
<400> 9
aggagtggta ttcatcggag a 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCV3复制酶引物
<400> 10
aaacaacctt agtgaacctc ct 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCV3 5' HEX/ZEN/3' IBFQ复制酶探针
<400> 11
acaaggcctc caactttcca cga 23
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCV3衣壳引物
<400> 12
acacagccgt tacttcacc 19
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCV3衣壳引物
<400> 13
agtgctcccc attgaacg 18
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCV3 5' 6-FAM/ZEN/3' IBFQ衣壳探针
<400> 14
accccatggc tcaacacata tgacc 25
<210> 15
<211> 9
<212> DNA
<213> 猪3型圆环病毒
<400> 15
tagtattac 9
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内部cap基因引物
<400> 16
ccacagaagg cgctatgtc 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内部cap基因引物
<400> 17
ccgcataagg gtcgtcttg 19
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
aaaaaagcta gcgctggaac atactacaca 30
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
aaaaaagaat tcttagagaa cggacttgta acg 33
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 滚环复制基序
<400> 20
Phe Thr Leu Asn Asn
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 滚环复制基序
<400> 21
Phe Thr Ile Asn Asn
1 5
<210> 22
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 滚环复制基序
<400> 22
His Leu Gln Gly
1
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 滚环复制基序
<400> 23
Tyr Cys Lys Lys
1
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知来源基序
<400> 24
Trp Trp Asp Gly Tyr
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知来源基序
<400> 25
Asp Asp Phe Tyr Gly Trp Val Pro
1 5
<210> 26
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知来源基序
<400> 26
Asp Arg Tyr Pro
1
<210> 27
<211> 3
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经典起始密码子
<400> 27
gtc 3
<210> 28
<211> 3
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 起始密码子
<400> 28
atg 3

Claims (45)

1.一种组合物，其包含：
选自由以下各项组成的组的至少一种猪3型圆环病毒蛋白质：ORF1、ORF2、以及ORF3；以及
选自由以下各项组成的组的兽医学上可接受的载体：溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗微生物剂、抗真菌剂、等渗剂、以及吸附延迟剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述蛋白质是由与选自由以下各项组成的组的序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列编码的：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.7、以及其任何组合。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述蛋白质与选自由以下各项组成的组的序列具有至少90％的序列同源性：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、以及其任何组合。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述兽医学上可接受的载体包含稳定剂和/或防腐剂和/或抗微生物剂。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述蛋白质以0.2μg/ml至约400μg/ml的量存在于最终组合物中。
6.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含免疫刺激剂。
7.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含针对猪中另外的致病性生物体的至少一种免疫活性组分。
8.如权利要求7所述的组合物，其中来自猪中另外的致病性生物体的所述免疫活性组分选自由以下各项组成的组：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia)；腺病毒；甲病毒属(Alphavirus)，例如东方马脑炎病毒；支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)；短螺旋体属菌种(Brachyspira spp.)，优选地是猪痢疾短螺旋体(B.hyodyentheriae)；大肠柔毛短螺旋体(B.piosicoli)；猪布鲁氏菌(Brucella suis)，优选地是生物变种1、2、以及3；猪瘟病毒；梭菌属菌种(Clostridium spp.)，优选地是艰难梭菌(Cl.difficile)、产气荚膜梭菌(Cl.perfringens)A型、B型、以及C型、诺维氏梭菌(Cl.novyi)、腐败梭菌(Cl.septicum)、破伤风梭菌(Cl.tetani)；冠状病毒，优选地是猪呼吸道冠状病毒；猪附红细胞体(Eperythrozoonosis suis)；红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhsiopathiae)；大肠杆菌(Escherichia coli)；副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，优选地是亚型1、7以及14；血凝性脑脊髓炎病毒；乙型脑炎病毒；细胞内劳索尼亚氏菌(Lawsonia intracellularis)；钩端螺旋体属菌种(Leptospira spp.)；优选地是南方钩端螺旋体(Leptospira australis)；犬型钩端螺旋体(Leptospira canicola)；流感伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)；黄疸出血型钩端螺旋体(Leptospiraicterohaemorrhagicae)；以及问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)；波摩那型钩端螺旋体(Leptospira pomona)；塔拉索夫型钩端螺旋体(Leptospira tarassovi)；分枝杆菌属菌种(Mycobacterium spp.)，优选地是鸟分枝杆菌(M.avium)；细胞内分枝杆菌(M.intracellulare)；以及牛分枝杆菌(M.bovis)；猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)(M hyo)；多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)；猪巨细胞病毒；猪细小病毒；猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒；伪狂犬病病毒；轮状病毒；沙门氏菌属菌种(Salmonella spp.)；优选地是鼠伤寒沙门氏菌(S.thyhimurium)；和猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)；猪葡萄球菌(Staph.hyicus)；葡萄球菌属菌种(Staphylococcusspp.)，优选地是链球菌属菌种(Streptococcus spp.)，优选地是猪链球菌(Strep.suis)；猪疱疹病毒；猪流感病毒；猪痘病毒；猪痘病毒；水疱性口炎病毒；猪水疱疹病毒；哈德焦钩端螺旋体(Leptospira Hardjo)；和/或猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynoviae)。
9.一种组合物，其包含：
选自由以下各项组成的组的至少一种猪3型圆环病毒核苷酸序列：编码ORF1的核苷酸序列、编码ORF2的核苷酸序列、以及编码ORF3的核苷酸序列；以及
选自由以下各项组成的组的兽医学上可接受的载体：溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂、以及吸附延迟剂。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述核苷酸序列编码与选自由以下各项组成的组的序列具有至少90％序列同源性的序列：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、以及其任何组合。
11.如权利要求9所述的组合物，其中所述核苷酸序列与选自由以下各项组成的组的序列具有至少90％的序列同源性：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、以及其任何组合。
12.如权利要求9所述的组合物，其中所述兽医学上可接受的载体包含稳定剂和/或防腐剂和/或抗微生物剂。
13.如权利要求9所述的组合物，其中所述核苷酸序列以0.2μg/ml至约400μg/ml的量存在于最终组合物中。
14.如权利要求9所述的组合物，其进一步包含免疫刺激剂。
15.如权利要求9所述的组合物，其进一步包含针对猪中另外的致病性生物体的至少一种免疫活性组分。
16.如权利要求15所述的组合物，其中来自猪中另外的致病性生物体的所述免疫活性组分选自由以下各项组成的组：胸膜肺炎放线杆菌；腺病毒；甲病毒属，例如东方马脑炎病毒；支气管炎博德特氏菌；短螺旋体属菌种，优选地是猪痢疾短螺旋体；大肠柔毛短螺旋体；猪布鲁氏菌，优选地是生物变种1、2、以及3；猪瘟病毒；梭菌属菌种，优选地是艰难梭菌、产气荚膜梭菌A型、B型、以及C型、诺维氏梭菌、腐败梭菌、破伤风梭菌；冠状病毒，优选地是猪呼吸道冠状病毒；猪附红细胞体；红斑丹毒丝菌；大肠杆菌；副猪嗜血杆菌，优选地是亚型1、7以及14；血凝性脑脊髓炎病毒；乙型脑炎病毒；细胞内劳索尼亚氏菌；钩端螺旋体属菌种；优选地是南方钩端螺旋体；犬型钩端螺旋体；流感伤寒型钩端螺旋体；黄疸出血型钩端螺旋体；以及问号钩端螺旋体；波摩那型钩端螺旋体；塔拉索夫型钩端螺旋体；分枝杆菌属菌种，优选地是鸟分枝杆菌；细胞内分枝杆菌；以及牛分枝杆菌；猪肺炎支原体(M hyo)；多杀性巴氏杆菌；猪巨细胞病毒；猪细小病毒；猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒；伪狂犬病病毒；轮状病毒；沙门氏菌属菌种；优选地是鼠伤寒沙门氏菌；和猪霍乱沙门氏菌；猪葡萄球菌；葡萄球菌属菌种，优选地是链球菌属菌种，优选地是猪链球菌；猪疱疹病毒；猪流感病毒；猪痘病毒；猪痘病毒；水疱性口炎病毒；猪水疱疹病毒；哈德焦钩端螺旋体；和/或猪滑液支原体。
17.一种组合物，其包含：
嵌合DNA分子，所述嵌合DNA分子包括含有猪1型圆环病毒DNA的一部分和猪3型圆环病毒DNA的一部分的质粒DNA；以及
选自由以下各项组成的组的兽医学上可接受的载体：溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂、以及吸附延迟剂。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述猪3型圆环病毒DNA与选自由以下各项组成的组的序列具有至少90％的序列同源性：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、以及其任何组合。
19.如权利要求17所述的组合物，其中所述猪3型圆环病毒DNA编码与选自由以下各项组成的组的序列具有至少90％序列同源性的蛋白质：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.8、以及其任何组合。
20.如权利要求17所述的组合物，其中所述兽医学上可接受的载体包含稳定剂和/或防腐剂和/或抗微生物剂。
21.如权利要求17所述的组合物，其中所述嵌合DNA分子以1微克至约1,000微克的含有所述嵌合DNA分子的所述质粒DNA的量存在于最终组合物中。
22.如权利要求17所述的组合物，其进一步包含免疫刺激剂。
23.如权利要求17所述的组合物，其进一步包含针对猪中另外的致病性生物体的至少一种免疫活性组分。
24.如权利要求23所述的组合物，其中来自猪中另外的致病性生物体的所述免疫活性组分选自由以下各项组成的组：胸膜肺炎放线杆菌；腺病毒；甲病毒属，例如东方马脑炎病毒；支气管炎博德特氏菌；短螺旋体属菌种，优选地是猪痢疾短螺旋体；大肠柔毛短螺旋体；猪布鲁氏菌，优选地是生物变种1、2、以及3；猪瘟病毒；梭菌属菌种，优选地是艰难梭菌、产气荚膜梭菌A型、B型、以及C型、诺维氏梭菌、腐败梭菌、破伤风梭菌；冠状病毒，优选地是猪呼吸道冠状病毒；猪附红细胞体；红斑丹毒丝菌；大肠杆菌；副猪嗜血杆菌，优选地是亚型1、7以及14；血凝性脑脊髓炎病毒；乙型脑炎病毒；细胞内劳索尼亚氏菌；钩端螺旋体属菌种；优选地是南方钩端螺旋体；犬型钩端螺旋体；流感伤寒型钩端螺旋体；黄疸出血型钩端螺旋体；以及问号钩端螺旋体；波摩那型钩端螺旋体；塔拉索夫型钩端螺旋体；分枝杆菌属菌种，优选地是鸟分枝杆菌；细胞内分枝杆菌；以及牛分枝杆菌；猪肺炎支原体(M hyo)；多杀性巴氏杆菌；猪巨细胞病毒；猪细小病毒；猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒；伪狂犬病病毒；轮状病毒；沙门氏菌属菌种；优选地是鼠伤寒沙门氏菌；和猪霍乱沙门氏菌；猪葡萄球菌；葡萄球菌属菌种，优选地是链球菌属菌种，优选地是猪链球菌；猪疱疹病毒；猪流感病毒；猪痘病毒；猪痘病毒；水疱性口炎病毒；猪水疱疹病毒；哈德焦钩端螺旋体；和/或猪滑液支原体。
25.一种诱导针对猪3型圆环病毒的免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：
向有需要的动物施用选自由以下各项组成的组的组合物：如权利要求1所述的组合物、如权利要求9所述的组合物、如权利要求17所述的组合物、以及其组合。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述组合物包括如权利要求1所述的组合物，并且其中如权利要求1所述的蛋白质是由与选自由以下各项组成的组的序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列编码的：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、以及其任何组合。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述组合物包括如权利要求9所述的组合物，并且其中如权利要求9所述的核苷酸序列是与选自由以下各项组成的组的序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、以及其任何组合。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述组合物包括如权利要求17所述的组合物，并且其中如权利要求17所述的DNA分子包括与选自由以下各项组成的组的序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、以及其任何组合。
29.如权利要求26所述的方法，其中如权利要求1所述的蛋白质与选自由以下各项组成的组的序列具有至少90％的序列同源性：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、以及其任何组合。
30.如权利要求25所述的方法，其中所述兽医学上可接受的载体包含稳定剂和/或防腐剂和/或抗微生物剂。
31.如权利要求26所述的方法，其中所述蛋白质以0.2μg/ml至约400μg/ml的量存在于最终组合物中。
32.如权利要求25所述的方法，所述方法进一步包括免疫刺激剂。
33.如权利要求25所述的方法，所述方法进一步包括针对猪中另外的致病性生物体的至少一种免疫活性组分。
34.如权利要求33所述的方法，其中来自猪中另外的致病性生物体的所述免疫活性组分选自由以下各项组成的组：胸膜肺炎放线杆菌；腺病毒；甲病毒属，例如东方马脑炎病毒；支气管炎博德特氏菌；短螺旋体属菌种，优选地是猪痢疾短螺旋体；大肠柔毛短螺旋体；猪布鲁氏菌，优选地是生物变种1、2、以及3；猪瘟病毒；梭菌属菌种，优选地是艰难梭菌、产气荚膜梭菌A型、B型、以及C型、诺维氏梭菌、腐败梭菌、破伤风梭菌；冠状病毒，优选地是猪呼吸道冠状病毒；猪附红细胞体；红斑丹毒丝菌；大肠杆菌；副猪嗜血杆菌，优选地是亚型1、7以及14；血凝性脑脊髓炎病毒；乙型脑炎病毒；细胞内劳索尼亚氏菌；钩端螺旋体属菌种；优选地是南方钩端螺旋体；犬型钩端螺旋体；流感伤寒型钩端螺旋体；黄疸出血型钩端螺旋体；以及问号钩端螺旋体；波摩那型钩端螺旋体；塔拉索夫型钩端螺旋体；分枝杆菌属菌种，优选地是鸟分枝杆菌；细胞内分枝杆菌；以及牛分枝杆菌；猪肺炎支原体(M hyo)；多杀性巴氏杆菌；猪巨细胞病毒；猪细小病毒；猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒；伪狂犬病病毒；轮状病毒；沙门氏菌属菌种；优选地是鼠伤寒沙门氏菌；和猪霍乱沙门氏菌；猪葡萄球菌；葡萄球菌属菌种，优选地是链球菌属菌种，优选地是猪链球菌；猪疱疹病毒；猪流感病毒；猪痘病毒；猪痘病毒；水疱性口炎病毒；猪水疱疹病毒；哈德焦钩端螺旋体；和/或猪滑液支原体。
35.如权利要求25所述的方法，其中所述免疫应答包括猪3型圆环病毒感染的临床体征的严重程度降低或发病率降低。
36.如权利要求25所述的方法，其中所述组合物在动物接受单次剂量的所述组合物之后在所述动物中有效诱导所述免疫应答。
37.如权利要求25所述的方法，其中所述组合物被全身施用。
38.一种组合物，其包含所述由如权利要求17所述的嵌合DNA分子编码的蛋白质；以及
选自由以下各项组成的组的兽医学上可接受的载体：溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂、以及吸附延迟剂。
39.如权利要求38所述的组合物，其中所述蛋白质的一部分是由与选自由以下各项组成的组的序列具有至少90％序列同源性的猪3型圆环病毒DNA编码的：SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.7、以及其任何组合。
40.如权利要求39所述的组合物，其中所述猪3型圆环病毒DNA编码与选自由以下各项组成的组的序列具有至少90％序列同源性的蛋白质：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.8、以及其任何组合。
41.如权利要求38所述的组合物，其中所述兽医学上可接受的载体包含稳定剂和/或防腐剂和/或抗微生物剂。
42.如权利要求38所述的组合物，其中所述蛋白质以0.2μg/ml至约400μg/ml的量存在于最终组合物中。
43.如权利要求38所述的组合物，其进一步包含免疫刺激剂。
44.如权利要求38所述的组合物，其进一步包含针对猪中另外的致病性生物体的至少一种免疫活性组分。
45.如权利要求44所述的组合物，其中来自猪中另外的致病性生物体的所述免疫活性组分选自由以下各项组成的组：胸膜肺炎放线杆菌；腺病毒；甲病毒属，例如东方马脑炎病毒；支气管炎博德特氏菌；短螺旋体属菌种，优选地是猪痢疾短螺旋体；大肠柔毛短螺旋体；猪布鲁氏菌，优选地是生物变种1、2、以及3；猪瘟病毒；梭菌属菌种，优选地是艰难梭菌、产气荚膜梭菌A型、B型、以及C型、诺维氏梭菌、腐败梭菌、破伤风梭菌；冠状病毒，优选地是猪呼吸道冠状病毒；猪附红细胞体；红斑丹毒丝菌；大肠杆菌；副猪嗜血杆菌，优选地是亚型1、7以及14；血凝性脑脊髓炎病毒；乙型脑炎病毒；细胞内劳索尼亚氏菌；钩端螺旋体属菌种；优选地是南方钩端螺旋体；犬型钩端螺旋体；流感伤寒型钩端螺旋体；黄疸出血型钩端螺旋体；以及问号钩端螺旋体；波摩那型钩端螺旋体；塔拉索夫型钩端螺旋体；分枝杆菌属菌种，优选地是鸟分枝杆菌；细胞内分枝杆菌；以及牛分枝杆菌；猪肺炎支原体(M hyo)；多杀性巴氏杆菌；猪巨细胞病毒；猪细小病毒；猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒；伪狂犬病病毒；轮状病毒；沙门氏菌属菌种；优选地是鼠伤寒沙门氏菌；和猪霍乱沙门氏菌；猪葡萄球菌；葡萄球菌属菌种，优选地是链球菌属菌种，优选地是猪链球菌；猪疱疹病毒；猪流感病毒；猪痘病毒；猪痘病毒；水疱性口炎病毒；猪水疱疹病毒；哈德焦钩端螺旋体；和/或猪滑液支原体。
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