CN113265426B - 一种稳定表达猪圆环病毒2型orf3蛋白细胞株的构建及应用 - Google Patents

一种稳定表达猪圆环病毒2型orf3蛋白细胞株的构建及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建及应用，属于生物技术检测领域。构建方法包括以下步骤：（1）在pLVZG‑CMV‑copGFP‑Puro载体的NheI和BamHI多克隆位点插入PCV2 ORF3基因；（2）用构建好的pLVZG‑CMV‑ORF3‑copGFP‑Puro重组质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞，培养、出毒、收取病毒上清、过滤得重组慢病毒液；（3）将包装好的重组慢病毒感染PK‑15细胞，通过嘌呤霉素筛选及鉴定，得稳定表达PCV2 ORF3蛋白细胞株。本发明利用重组慢病毒系统制备一种融合标签蛋白并能稳定表达PCV2 ORF3蛋白的细胞株，该细胞株为研究PCV2致病机理研究提供平台，有利于猪圆环病毒2型的深层次的致病机制研究。

Description

一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建及应用
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建及应用。
背景技术
猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）是猪圆环病毒病（porcinecircovirus disease, PCVD）的病原，引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征（postweaningmultisystemic wasting syndrome, PMWS），目前PMWS已成为全球范围内危害猪群健康的重要疾病。PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子大小为17 – 22 nm，呈对称的二十面体，无囊膜，基因组大小约1.7 kb，包含11个开放阅读框（open reading frames，ORFs），目前己报道5个ORF编码蛋白及其功能研究，即ORF1、ORF2、ORF3、ORF4和ORF5。PCV2感染导致PCVD的典型组织病理学症状是淋巴细胞损伤和组织细胞浸润，感染PCV2发病猪出现显著凋亡坏死的细胞是淋巴细胞，使机体出现免疫抑制状态，因此认为PCV2致病机制与其对免疫器官的损伤密切相关。研究发现ORF3的缺失并不能影响病毒的复制，而ORF3基因表达的细胞出现了与PCV2病毒感染类似的细胞凋亡现象。因此，ORF3诱导淋巴细胞凋亡造成体内淋巴细胞数量减少可能是PCV2引起猪机体免疫抑制的重要原因，但是ORF3如何诱导细胞凋亡有待验证。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建及应用，利用重组慢病毒系统制备一种融合标签蛋白并能稳定表达PCV2 ORF3蛋白的PK-15细胞株，该细胞株为研究PCV2 ORF3蛋白的生物学功能提供一个很好的工具。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下；
所述细胞株购买于中国典型培养物保藏中心，购买的细胞株编号为：CCTCC NO：GDC0061，本发明所提供的稳定表达PCV2 ORF3蛋白细胞株的构建方法，包括如下步骤：
（1）PCV2 ORF3基因的扩增；
（2）将PCV2 ORF3基因与载体pLVZG-CMV-copGFP-Puro双酶切后连接，构建重组慢病毒表达质粒pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro；
（3）将重组慢病毒表达质粒pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro与慢病毒包装质粒（三种辅助质粒）共转染293T细胞，48 h后，收集细胞上清液，并根据细胞生长状况适当补充新鲜细胞培养基，72 h再次收集一次细胞上清液，将收集的细胞上清液用0.45 μm 滤器过滤，4℃储存；然后将收集的细胞上清液，4°C ，3000 rpm ，离心20 min，去除细胞碎片；然后收集上清液置于新的离心管中，加入适量慢病毒浓缩液，4°C沉淀4 h， 8000 × g ，离心30min，去上清，PBS洗涤沉淀，最后加入5 mL PBS溶解；将溶解液加入预先消毒处理的超滤浓缩管中进一步浓缩和纯化，5000× g，离心15 min，获得小于1 mL的病毒浓缩液，用PBS补足至5 mL，再次离心置换缓冲液，此步骤重复3次，最后在病毒浓缩液中加入适量病毒稀释液（DMEM培养液）稀释至1.2 mL；-80°C冰箱保存，备用；
（4）将包装好的重组慢病毒转染PK-15细胞，通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株，对阳性细胞株进行细胞免疫荧光和qPCR鉴定，获得稳定表达PCV2 ORF3蛋白细胞株。
进一步地，所述的步骤（1）设计PCV2 ORF3-F和PCV2 ORF3-R为特异性引物，添加酶切位点NheI和BamHI，以感染PCV2的PK-15细胞DNA为模板，进行PCR扩增；所述的特异性引物PCV2 ORF3-F的序列见序列表SEQ ID 1，PCV2 ORF3-R的序列见序列表SEQ ID 2。
进一步地，所述的步骤（1）PCR扩增体系为：模板1 μl，Primer F(10 μM) 1 μL，Primer R(10 μM) 1 μl，PCR Mix（2×）25 μl，ddH2O 补充至 50 μl；PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共循环35次，最后72℃再延伸10min；PCR结束后，取10μL扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，分离、回收纯化。
进一步地，步骤(2)中链接体系为：目的基因 13 μL，载体DNA 4 μL，T4 DNALigase 1 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，16℃过夜连接过夜。
进一步地，步骤(3)中，所述的慢病毒包装质粒是pMDLg/pRRE，pRSV-Rev，pMD2.G。
进一步地，步骤(4)中所述的qPCR鉴定的特异性检测引物ORF3-F和ORF3-R的序列见序列表SEQ ID 4和SEQ ID 5，特异性检测引物GAPDH-F和GAPDH-R的序列见序列表SEQ ID6和SEQ ID 7。
本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理地构建了插入PCV2 ORF3基因的慢病毒系统表达质粒pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro，之后将该质粒转化入Stbl2感受态细胞大量扩增，与pMDLg/pRRE，pRSV-Rev，pMD2.G三种辅助质粒共转染293T细胞进行慢病毒的包装，用收集的慢病毒感染PK-15细胞，成功感染的话，慢病毒载体会将携带的PCV2 ORF3基因和载体上的嘌呤霉素抗性基因一起整合入PK-15细胞基因组，经一定浓度的嘌呤霉素加压筛选，并通过克隆纯化获得稳定表达PCV2 ORF3蛋白的带有嘌呤霉素抗性的重组细胞系，可用于PCV2 ORF3蛋白功能检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1.本发明以重组慢病毒为载体，将其感染PK-15细胞，筛选获得能稳定表达PCV2ORF3蛋白的PK-15细胞株，所述PCV2 ORF3蛋白融合表达Flag标签，方便PCV2 ORF3蛋白表达的检测。
2.本发明建立了一种带有标签的能稳定表达PCV2 ORF3蛋白的PK-15细胞株，为PCV2 ORF3蛋白生物学特性及功能的研究提供一个良好的工具，为进一步深入研究PCV2ORF3蛋白的生物学特性和感染途径及为阐明PCV2的免疫抑制机理垫定理论基础。
附图说明
图1是本发明构建的重组表达载体pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro结构示意图。
图2是重组表达载体pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro经Nhe I和BamH I双酶切鉴定电泳图（M：DNA Marker；泳道1：pLVZG-CMV-copGFP-Puro空载体酶切后仅观察到8kb大小左右的载体条带；泳道2：重组表达载体pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro酶切后可产生8kb大小的载体条带和315bp大小的目的条带）。
图3 PK15-ORF3稳转株细胞荧光显微镜下观察结果（100×）（A：白光下细胞形态；B：绿色荧光下细胞形态）。
图4 PK15-ORF3稳转株细胞ORF3 mRNA相对表达量。
具体实施方式
下面将通过附图和具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
实施例1 PCV2 ORF3基因扩增
1、PCV2 ORF3基因PCR扩增根据NCBI中PCV2 ORF3基因序列（No：AY686763），利用软件primer 5设计PCV2 ORF3基因的特异性引物PCV2 ORF3-F和PCV2 ORF3-R，添加酶切位点NheI和BamH I，为方便后续的鉴定，在基因3＇末端添加Flag标签序列（序列见列表SEQ ID3）。以感染PCV2的PK-15细胞DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系为：模板 1 μl，PrimerF(10 μM) 1 μL，Primer R(10 μM) 1 μl，PCR Mix（2×） 25 μl，ddH2O up to 50 μl；PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共循环35次，最后72℃再延伸10min。PCR结束后，取10μL扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行DNA回收。
实施例2重组表达载体pLVZG-CMV-copGFP-Puro的构建
重组慢病毒表达质粒的构建：将实施例1中得到的PCR产物与pLVZG-CMV-copGFP-Puro分别进行NheI和BamHI酶切，酶切体系于37℃水浴过夜，电泳，将正确的目的条带进行凝胶回收。酶切体系如下：ddH2O:11ul；NheI:1.5ul；BamH I:1.5ul；DNA:1ul(1ug/ul)；Enzyme Buffer:5ul；总体系：20ul，温度37℃，反应时间：30min。在16℃反应24h，构建重组慢病毒表达质粒，构建重组慢病毒表达质粒pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro(见图1)。重组载体经NheI和BamHI双酶切之后经琼脂糖凝胶电泳鉴定可观察到8kb大小的载体条带和305bp大小的目的条带，而pLVZG-CMV-copGFP-Puro空载体双酶切后仅观察到8kb大小的载体条带(见图2)。重组质粒转化感受态大肠杆菌E.coli DH 5α，质粒提取试剂提取重组质粒，用NanoDrop测定OD 260及OD 280，计算质粒纯度及浓度。
实施例3重组慢病毒CMV-ORF3-copGFP-Puro的获得
1.慢病毒包装
293T细胞种于10cm培养皿中，置于37°C，5 % CO2的培养箱中，传代12h后细胞融合度达到80%左右。质粒共转体系：pMDLg/pRRE 6 μg，pRSV-Rev 3 μg，pMD2.G 2 μg，穿梭质粒9 μg，Lipo3000 40 μL。转染前1h，更换不含双抗，含10%FBS的培养基；转染后6 h，更换含10% FBS的新鲜培养基。转染后48h，收集细胞上清液，并根据细胞生长状况适当补充新鲜细胞培养基，72h再次收集一次细胞上清液；将收集的细胞上清液（DMEM培养液）用0.45 μm 滤器过滤，4℃储存备用；
2.病毒浓缩和纯化
将收集的细胞上清液，4°C ，3000 rpm ，离心20 min，去除细胞碎片；然后收集上清液置于新的离心管中，加入适量慢病毒浓缩液，4°C沉淀4 h，8000 × g，离心30 min，去上清，PBS洗涤沉淀，最后加入5 mL PBS溶解；将溶解液加入预先消毒处理的超滤浓缩管中进一步浓缩和纯化，5000× g，离心15 min，获得小于1 mL的病毒浓缩液，用PBS补足至5mL，再次离心置换buffer，此步骤重复3次，最后在病毒浓缩液加入适量病毒稀释液稀释至1.2 mL； -80°C冰箱保存，备用。
3.慢病毒滴度检测
将生长状态良好的293T细胞消化后，按1.5×104/孔，加入96孔板中，置于37°C，5% CO2 培养箱中培养。24 h后准备8个1.5 mL EP管，每管加入216 μL完全培养基，第一个EP管中加入24 μL病毒液（冻融一次），然后做10倍梯度稀释，共8个稀释度。48 h后，加入完全培养基100 μL，避免吹起细胞。72 h后，用荧光显微镜对阳性细胞进行计数，数出最后两个稀释度能观察到荧光的孔内荧光细胞数，计算每个稀释度2个复孔内的平均荧光细胞数，设为X（倒数第二个稀释度孔的荧光细胞平均数）和Y（倒数第一个稀释度孔的荧光细胞平均数）。
慢病毒滴度 (TU/mL) = {[（X+Y×10）/2] /X孔病毒量}×1000
滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
实施例4稳定转染细胞株的筛选
1.嘌呤霉素筛选浓度的确定：
在24孔板内接种PK-15细胞，共11孔，传代12 h细胞融合度至80％～90％，依次给每孔换上加入了嘌呤霉素的完全培养基(10％FBS-DMEM)，分别为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μg/mL的浓度梯度，每隔2天观察细胞存活状态（细胞飘起即为死亡），每隔2天更换0.75mL含相应浓度嘌呤霉素的培养基。筛选5～7天内使细胞全部死完的最低嘌呤霉素浓度，即为筛选浓度。第5天，含有5μg/mL嘌呤霉素的孔内的PK-15细胞死完，确定含有5μg/mL的嘌呤霉素完全培养基为之后的筛选培养基。
2.稳定转染细胞株筛选
在24孔板内接种PK-15细胞，传代12 h细胞融合度至80％～90％，接种病毒，病毒液滴度5× 107TU/mL，病毒量15μL。在感染细胞72小时后，通过加入并维持5μg/mL的嘌呤霉素杀死未被有效感染的细胞；每隔2-3天换一次新鲜培养基；倒置荧光显微镜下观察，进行亚克隆筛选，挑选出正常生长细胞群传代，逐步放大培养；从而在嘌呤霉素的维持下筛选阳性细胞株。
3、阳性细胞株的检测
用荧光显微镜对阳性细胞进行免疫荧光鉴定，观察到明显绿色荧光（见图3），该结果显示细胞系PK-ORF3可以成功表达ORF3蛋白。重组细胞系的qPCR鉴定：使用RNA提取试剂盒提取细胞系PK-ORF3的RNA，反转录为cDNA，采用SYBR Green染料检测ORF3的表达，用特异性引物（ORF3检测引物见SEQ ID 4和5，GAPDH检测引物见SEQ ID 6和7）进行qPCR扩增，结果显示重组细胞系PK-ORF3在转录水平成功表达ORF3基因（见图4）。
序列表
<110> 龙岩学院
<120> 一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建及应用
<130> 2021
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctagcatgg taaccatccc a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatccttac tgatcgaatg t 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttgtcgtca tcgtctttgt agtc 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcacgcttct gcattttccc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacaacggag tgacctgtct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcggagtgaa cggatttggc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgacaagctt cccgttctcc 20

Claims (1)

1.一种稳定表达猪圆环病毒2型ORF3蛋白细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）PCV2 ORF3基因的扩增：
设计PCV2 ORF3-F和PCV2 ORF3-R为特异性引物，添加酶切位点NheI和BamHI，以感染PCV2的PK-15细胞DNA为模板，进行PCR扩增； 特异性引物PCV2 ORF3-F的序列见序列表SEQID 1，PCV2 ORF3-R的序列见序列表SEQ ID 2；PCR扩增体系为：模板 1 μL，10 μM Primer F1 μL，10 μM Primer R 1 μL，2×PCR Mix 25 μL，ddH2O up to 50 μL；PCR反应程序：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共循环35次，最后72℃再延伸10min；PCR结束后，取10μL扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，分离、回收纯化；
（2）将PCV2 ORF3基因与载体pLVZG-CMV-copGFP-Puro双酶切后连接，构建重组慢病毒表达质粒pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro；
连接体系为：目的基因 13 μL，载体DNA 4 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，10×T4 DNALigase Buffer 2 μL，16℃连接过夜；
（3）将重组慢病毒表达质粒pLVZG-CMV-ORF3-copGFP-Puro与慢病毒包装质粒共转染293T细胞，48 h后，收集细胞上清液，并根据细胞生长状况适当补充新鲜细胞培养基，72 h再次收集一次细胞上清液，将收集的细胞上清液用0.45 μm 滤器过滤，4℃储存；再将收集的细胞上清液离心，去除细胞碎片；然后收集上清液置于新的离心管中，加入慢病毒浓缩液，4°C沉淀4 h， 8000 × g ，离心30 min，去上清，PBS洗涤沉淀，最后加入5 mL PBS溶解；将溶解液加入预先消毒处理的超滤浓缩管中进一步浓缩和纯化，5000× g，离心15 min，获得小于1 mL的病毒浓缩液，用PBS补足至5 mL，再次离心置换缓冲液，此步骤重复3次，最后在病毒浓缩液中加入DMEM培养液稀释至1.2 mL；-80°C冰箱保存，备用；
所述的慢病毒包装质粒是pMDLg/pRRE，pRSV-Rev，pMD2.G；
（4）将包装好的重组慢病毒转染PK-15细胞，通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株，对阳性细胞株进行细胞免疫荧光和qPCR鉴定，获得稳定表达PCV2 ORF3蛋白细胞株；
其中，qPCR鉴定的引物为特异性检测引物ORF3-F、ORF3-R以及特异性检测引物GAPDH-F、GAPDH-R，所述特异性检测引物ORF3-F和ORF3-R的序列见序列表SEQ ID 4和SEQ ID 5，特异性检测引物GAPDH-F和GAPDH-R的序列见序列表SEQ ID 6和SEQ ID 7。
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