CN111973600B - 霉酚酸或其衍生物在制备犬瘟热病毒抑制剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了霉酚酸或其衍生物在制备犬瘟热病毒抑制剂或犬瘟热病治疗药物中的用途，体外抗病毒细胞试验结果表明：霉酚酸能显著改善犬瘟热病毒导致的正常Vero细胞病变，且对Vero细胞无明显毒性作用，其对犬瘟热病毒的抑制EC₅₀值为2.752μM。因此，霉酚酸及其衍生物在抑制犬瘟热病毒方面效果确切，可单独或与其它抗犬瘟热病毒药物组合后用于制备犬瘟热病毒抑制剂或犬瘟热病治疗药物。

Description

霉酚酸或其衍生物在制备犬瘟热病毒抑制剂中的用途

技术领域

本发明涉及霉酚酸及其衍生物在制备治疗犬瘟热药物中的用途。

背景技术

犬瘟热(CD)，也称为卡雷氏病，是一种多系统性传染病，会影响多种食肉动物。该疾病通常是致命的，并引起复杂的临床体征，包括呼吸道，胃肠道和神经系统症状。在大多数易感动物中，犬瘟热病毒(CDV)感染的致死率在30％至80％之间，在雪貂中高达100％。最近，CDV的天然宿主被广泛扩展，即使在非人类灵长类动物中也存在。在广西省和中国北京发现恒河猴自然感染了CDV，死亡率为5％至30％。最近还报到了CDV存在许多濒危物种的身上，包括阿穆尔虎，埃塞俄比亚狼和大熊猫。CDV是麻疹病毒(MV)的近亲，是一种有包膜的单股负链RNA病毒，属于是副粘病毒科中麻疹病毒属的成员。CDV基因组编码六个结构蛋白：血凝素蛋白(H)，融合蛋白(F)，膜蛋白(M)，磷蛋白(P)，大蛋白(L)和核衣壳蛋白(N)。自上世纪50年代以来，改良活疫苗的广泛应用无疑降低了该疾病的发病率。然而，CDV仍然是狗的主要传染病，并且在过去的几十年中，已经报道了几次狗和野生动物的暴发。尽管已证明疫苗能成功控制犬中CDV的传播，但该疗法主要是基于临床症状的控制。目前，尚未批准抗病毒药物用于限制CDV在感染犬中的治疗。

霉酚酸(MPA)具有抗菌，抗真菌，抗病毒，免疫抑制和抗癌特性。它能在体内通过抑制次黄〔嘌呤核〕苷酸脱氢酶的作用阻断嘌呤核苷酸的合成。阻止T细胞，淋巴细胞的分裂及B细胞中抗体的形成从而作为一种免疫抑制因子。在分子生物学中用于筛选含大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的细胞。临床上已经使用了MPA的两种衍生物：霉酚酸酯(MMF)和霉酚酸钠(MPS)，它们作为主要的免疫抑制剂已被国内外广泛应用于预防、治疗移植器官急性排异反应。

查阅相关资料可知，目前仍未见霉酚酸及其衍生物在抑制犬瘟热病毒方面的相关报道。因此，将霉酚酸及其衍生物引入抑制犬瘟热病毒中，具有重大现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供霉酚酸及其衍生物在抑制犬瘟热病毒中的新应用。

体外抗病毒细胞试验结果表明：(1)霉酚酸能显著改善犬瘟热病毒导致的正常Vero细胞病变，且对Vero细胞无明显毒性作用，其CC₅₀大于100μM。

(2)霉酚酸对犬瘟热病毒的抑制EC₅₀值为2.752μM，霉酚酸在5μM、2.5μM、1.25μM、0.725μM、0.363μM、0μM时的TCID₅₀分别为10^-1.78/mL、10^-3.85/mL、10^-4.30/mL、10^-6.02/mL、10^-6.24/mL、10^-6.30/mL。在5μM可以下降4.5个滴度，大于7μM时病毒的毒价已经检测不出来。

(3)对病毒活性的间接免疫荧光和Western Blot的测定结果进一步证明了霉酚酸对犬瘟热病毒的抑制作用。

因此，霉酚酸及其衍生物在抑制犬瘟热病毒方面效果确切，可单独或与其它抗犬瘟热病毒药物组合后用于制备犬瘟热病毒抑制剂或犬瘟热病治疗药物，当然，改药物还可包含药学上可接受的辅料。

附图说明

图1是霉酚酸在细胞水平对病毒的抑制效果。

图2是霉酚酸对细胞毒性作用的CC₅₀的测定。

图3是霉酚酸及其衍生物抗病毒活性TCID₅₀的测定。

图4是霉酚酸及其衍生物抗病毒活性EC₅₀的测定。

图5是霉酚酸及其衍生物抗病毒活性间接免疫荧光测定。

图6是霉酚酸及其衍生物抗病毒活性Western Blot鉴定。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进行详细说明。需要说明的是，本发明的实施例仅限于对本发明进行说明，而没有限制作用。实施例中所涉及的有关试验方法和其它各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。

试验材料：Vero细胞(非洲绿猴肾细胞，购自ATCC细胞库)；霉酚酸(购自TargetMOI公司)；犬瘟热病毒(华中农业大学赵凌老师赠与)。

实施例1霉酚酸对犬瘟热病毒的抑制效果

试验方法：

1)将生长状态良好的Vero细胞按照1×10⁵/mL的量接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃5％CO₂培养箱中培养；

2)提前准备好样品，并做好标记，分别为空白组、病毒组和药物组。具体来说，空白组是细胞维持液，病毒组是含有0.1MOI病毒的细胞维持液，药物组是含有50μM霉酚酸和0.1MOI病毒的细胞维持液；

3)14h后，取出96孔板弃去培养基，用无菌PBS清洗三次，甩干后加入已经稀释好的样品；

4)96h后，用倒置荧光显微镜观察细胞的形态。

试验结果：

如图1所示，镜下可以观察到正常的Vero细胞生长状态良好，形态完整，界限清晰。病毒组中，3天后出现典型“蜘蛛样”病变，可见短梭形细胞变圆，胞质内颗粒增多，部分细胞坏死脱落，单层细胞出现拉网状，病变非常明显。药物组中，Vero细胞界限清晰，细胞生长良好。

实施例2霉酚酸对细胞活性的检测

试验方法：

1)取生长状态良好的Vero细胞进行消化传代，用细胞生长液调整细胞密度为1×10⁵/mL，接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃、5％CO₂培养箱培养14h；

2)14h后，取出96孔板，弃去孔中培养基，用无菌PBS清洗三次；

3)将霉酚酸用细胞维持液稀释成100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.13μM、1.5μM和0.75μM，然后依次加入到Vero细胞中，并用一纵列加入100μL细胞维持液做为对照。

4)96h后，用CellTiter-

试剂进行细胞活力检测。

试验结果：

测定细胞存活率能反应霉酚酸及其衍生物对细胞的毒性作用，根据公式计算出细胞存活率(％)＝经过化合物处理的细胞发光值平均值/细胞对照组发光值平均值。如图2所示，霉酚酸及其衍生物对Vero细胞的毒性作用较小，其CC₅₀大于100μM。

实施例3霉酚酸对病毒活性TCID₅₀及其EC₅₀的测定

试验方法：

1)将Vero细胞进行消化传代，用细胞生长液调整细胞密度为1×10⁵/mL，接种12孔板1mL/孔，37℃、5％CO₂培养箱培养14h；

2)14h后，取出12孔板，做好标记，分别为20μM、10μM、7μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.725μM和0.363μM。准备EP管，加入细胞维持液与药物，使药物终浓度为上述8个浓度，振荡器上混匀至少5s；

3)弃去12孔板孔中培养基，用无菌PBS清洗三次，甩干后加入已经稀释好的化合物。置于37℃、5％CO₂培养箱孵育1h；

4)1h后，取出12孔板，每孔接种0.01MOI的病毒，轻晃12孔板混匀，每块12孔板设置病毒对照与细胞对照。于37℃、5％CO₂培养箱培养；

5)约72h后，病毒对照出现70％病变，将12孔板转移至-80℃超低温冰箱冻融一次；

6)收集每孔液体至EP管中，4000rpm离心10min后收集上清测毒价。

7)准备生长状态良好的细胞，待长到80％左右后用胰酶消化，铺到96孔板中；

8)待96孔板中的细胞长到80％左右时，将病毒在灭菌的2mL EP管中进行10倍倍比稀释(首次用10^-1到10^-12)，每孔病毒悬液量为100μL，每个稀释度作8孔，并做好对照孔；

9)操作需在冰上进行，保证毒价的稳定，并且要震荡均匀，防止病毒聚团，导致测出的毒价偏差较大；

10)平稳地将96板移至含有5％CO₂，37℃细胞培养箱；

11)72h后观察结果，取出96孔板在显微镜上看细胞病变，并记录结果；

12)按Reed和Muench两氏法计算病毒TCID₅₀和EC₅₀。

试验结果：

如图3所示，TCID₅₀检测霉酚酸及其衍生物在5μM、2.5μM、1.25μM、0.725μM、0.363μM、0μM时的TCID₅₀分别为10^-1.78/mL、10^-3.85/mL、10^-4.30/mL、10^-6.02/mL、10^-6.24/mL、10^-6.30/mL。在5μM可以下降4.5个滴度，大于7μM时病毒的毒价已经检测不出来。

如图4所示，半最大效应浓度(EC₅₀)能反应霉酚酸及其衍生物对病毒的抑制效果，即能达到50％最大生物效应(抑制病毒)对应的药物浓度。从图4的EC₅₀曲线图可知霉酚酸及其衍生物对犬瘟热病毒的抑制EC₅₀值为2.752μM。

实施例4霉酚酸及其衍生物对病毒活性的间接免疫荧光检测

试验方法：

1)取生长状态良好的Vero细胞进行消化传代，用细胞生长液调整细胞密度为1×10⁵/mL，接种于96孔板100μL/孔，置于37℃、5％CO₂培养箱培养14h；

2)14h后细胞长满单层，取出96孔板用无血清DMEM培养基清洗两遍，换成细胞维持液，加入化合物进行2倍倍比稀释，同时加入0.01MOI病毒液，使化合物终浓度为20μM、10μM、7μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.725μM和0.363μM，同时设置病毒对照组和细胞对照组；

3)待细胞出现60％病变，弃掉孔中培养基，用PBS清洗2遍后加入4％多聚甲醛室温作用10min；

4)弃掉废液，用PBS洗2次后加入含1％BSA的PBST的封闭液，在37℃静置作用1h；

5)PBS洗2次后加入1:300稀释的一抗(N蛋白鼠单克隆抗体)，37℃静置作用1h；

6)PBST洗4次后加入1：2000加入羊抗鼠荧光二抗，37℃避光静置作用1h；

7)弃掉二抗，用PBST洗4次，置于荧光显微镜下观察拍照。

试验结果：

如图5所示，IFA检测可以看出霉酚酸及其衍生物在2.5μM时，基本没检测到犬瘟热病毒。随着药物浓度的下降，检测到的犬瘟热病毒不断增加，在0.363μM时，可以在细胞中检测到大量的犬瘟热病毒。

实施例5霉酚酸及其衍生物对病毒活性Western Blot的测定

试验方法：

1)待细胞病变约70％，先弃掉细胞培养液，用预冷的PBS洗一次细胞，吸干PBS后，再用1mL(6孔板)的PBS重悬细胞，装入2mL的EP管中；

2)4℃4000r/min离心5min，弃掉上清，加入120μL(6孔板)的细胞裂解液，重悬，在4℃旋转作用25min；

3)4℃12000r/min离心20min，收集上清，加入5×loading buffer，沸水中煮10min后冰上10min，4℃保存；

4)制备12％分离胶，混匀后加入玻璃板中，并在分离胶上加入一层去离子水，置于通风橱中室温放置30min左右；

5)待分离胶完全聚合后，将配置好的5％的浓缩胶加入分离胶之上，插入梳子，于通风橱中室温放置30min左右；

6)将配制好的聚丙烯酰胺凝胶置于垂直电泳槽中，往中间槽及外槽加入适量的1×SDS-PAGE电泳缓冲液，于点样孔中加入适量体积的处理好的蛋白样品和蛋白Marker；

7)接上电源80V 30mim，再120V 1h 20min进行电泳；

8)转膜：SDS-PAGE电泳结束后，根据目的蛋白的分子量，以蛋白Marker为对照进行切胶并裁剪合适大小的滤纸和PVDF膜。将切好的滤纸放入电转缓冲液中，将切好的PVDF膜放入甲醇中浸泡，然后分别放入纯水和电转缓冲液中浸泡，放入转膜槽中以120V电压转膜，根据蛋白大小，转膜时间50min；

9)封闭：转膜完成后，将膜取出置于事先配好的封闭液中，于室温摇床上封闭2h；轻轻用镊子将膜转入一个干净的平皿内，加入适量的封闭液(5％脱脂牛奶)，置于摇床温育2h；

10)一抗孵育：将膜用TBST涮洗一下，放入含事先稀释好一抗的平皿中，于室温摇床上孵育2.5h；

11)二抗孵育：将膜用TBST洗3次，每次15min，然后将膜放入含事先稀释好二抗的平皿中，于室温摇床上孵育2h，孵育完后将膜用TBST洗六遍，每次5min；

12)显色：将A液和B液等体积混匀，于显色仪器中显色；

13)显色拍照后用TBST将膜清洗六遍，每次5min。同样方法孵育GAPDH一抗与羊抗鼠二抗，显色后拍照保存。

试验结果：

如图6所示，Western blot检测可以看出随着药物浓度增加，细胞中检测到的病毒蛋白量不断减少，有明显剂量依耐性。在2.5μM药物浓度下，基本检测不到病毒蛋白。

Claims (2)

1.霉酚酸在制备犬瘟热病毒抑制剂中的用途。

2.霉酚酸在制备犬瘟热病治疗药物中的用途。

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