CN114317459B

CN114317459B - 一种犬瘟热病毒株和基于犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联疫苗及应用

Info

Publication number: CN114317459B
Application number: CN202111680628.7A
Authority: CN
Inventors: 夏振强; 张馨月; 石晶; 金宏丽
Original assignee: Changchun Sr Biological Technology Co ltd
Current assignee: Changchun Sr Biological Technology Co ltd
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2024-02-23
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114317459A

Abstract

本发明提供一种犬瘟热病毒株和基于犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联疫苗及应用，属于疫苗技术领域。解决二联疫苗毒种返强的生物安全问题以及幼龄犬存在的免疫保护效果问题。本发明提供一种犬瘟热病毒，所述病毒的命名为犬瘟热病毒CDV‑SN株，保藏号为CGMCC NO.23205，以及一种基于犬瘟热病毒和犬细小病毒病的二联疫苗，包括犬瘟热病毒CDV‑SN的原液和重组杆状病毒CPV‑2b‑VP2的原液，混合比例是1:1。该产品相比目前上市产品“犬瘟热病毒和细小病毒病二联活疫苗”，具有安全性好，抗原浓度和纯度高的优点，可作为幼犬基础免疫首选疫苗，以减少母源抗体对免疫效果的影响。

Description

一种犬瘟热病毒株和基于犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联疫苗及应用

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种犬瘟热病毒株和基于犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联疫苗及应用。

背景技术

目前，犬瘟热疫苗主要的疫苗种类为弱毒疫苗，其主要的优势为不仅能激活机体的体液免疫，还能激活细胞免疫，诱导机体产生免疫记忆，是目前犬和经济动物使用的主要产品。目前，CDV弱毒疫苗的病毒株在犬群中还没有毒力返祖的报道，但在犬和雪貂或原代巨噬细胞组织试验中证实有返祖现象；基因工程疫苗是当前犬瘟热疫苗的研究方向之一，研究人员采用多种方法获得了犬瘟热的亚单位疫苗、重组载体疫苗、核酸疫苗、表位疫苗等新型疫苗，但由于犬瘟热免疫机制较为复杂，加上所制备的新型疫苗免疫效力不佳、制备效率低、成本高，工艺复杂、生产放大不稳定等原因，目前未见广泛应用。

因此，基于种种原因，人们开始重新评估灭活疫苗，特别是幼犬的基础免疫，如何使CDV灭活疫苗在其安全性的基础上激发机体产生更好的免疫效果。除在抗原剂量上加强外，还加入合适的佐剂，使CDV抗原能够持续存在并且缓慢释放，达到良好的免疫效力。

目前，犬细小病毒疫苗免疫是犬有效抵抗细小病毒感染的有效手段，灭活疫苗能够引起接种动物较好的抗体水平，只是在免疫持续期上较弱毒活疫苗短，弱毒活疫苗较广泛用于本病的免疫预防，但CPV弱毒疫苗接种失败的主要原因是受母源抗体水平的干扰，为了避免弱毒活疫苗受母源抗体的干扰，可以采用幼犬在母源抗体含量降低之后再进行免疫接种，但这样给病毒感染留出了免疫空白期，增加了感染风险，同时也是目前幼犬免疫失败的主要原因。在安全性上，肉食兽细小病毒易产生变异，犬细小病毒活疫苗同样存在毒力变异返祖的风险。

当前，犬瘟热、细小病毒病二联苗绝大部分为弱毒活疫苗，弱毒活疫苗为大部分犬提供了良好的免疫保护的同时，也存在着一些不足之处，一方面存在散毒风险，另一方面，对于可能存在母源抗体的幼犬，活疫苗的免疫可能会受其影响较大，在实际应用中，对于断奶前后的幼犬，母源抗体中犬瘟热病毒和犬细小病毒母源抗体的消长规律存在较大差异，犬瘟热病毒母源抗体一般于28日龄达到1:4以下，而犬细小病毒母源抗体一般于60日龄左右转阴(刘彩虹等，2019)，因此采用活疫苗免疫难以把握免疫时机，母源抗体处于较高水平时免疫，活疫苗的免疫效果将大打折扣，而在母源抗体下降的过程中，存在免疫空白期，母源抗体处于较低水平时免疫，可能在免疫前已发生潜在感染，是导致犬瘟热和犬细小病毒病在幼犬中流行的主要原因。当前广泛使用的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗因其存在的潜在的毒种返强等生物安全问题以及对于幼龄犬的免疫效果问题而受到制约。

发明内容

本发明的目的是为了解决二联疫苗毒种返强的生物安全问题以及幼龄犬存在的免疫保护效果的问题。

本发明提供了一种犬瘟热病毒(Canine distemper virus)，所述病毒的命名为犬瘟热病毒CDV-SN株，保藏号CGMCC NO.23205，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏时间2021年12月15日。

本发明提供了一种基于犬瘟热病毒和犬细小病毒病的二联疫苗，所述二联疫苗包括权利要求1所述的犬瘟热病毒CDV-SN的原液和重组杆状病毒CPV-2b-VP2的原液。

进一步地限定，所述犬瘟热病毒CDV-SN原液和重组杆状病毒CPV-2b-VP2原液的体积比为1:1。

进一步地限定，所述犬瘟热病毒CDV-SN原液经过灭活，所述重组杆状病毒CPV-2b-VP2原液经过灭活。

进一步地限定，所述二联疫苗还包括佐剂。

进一步地限定，所述犬瘟热病毒CDV-SN原液和重组杆状病毒CPV-2b-VP2原液混合液与佐剂的体积比为9:1。

进一步地限定，所述重组杆状病毒CPV-2b-VP2的制备方法：

(1)将序列为SEQ ID NO.1的VP2序列进行优化，得到优化后的VP2序列为SEQ IDNO.2，将优化后的VP2序列克隆到载体pUC57上获得重组载体；

(2)以步骤(1)获得重组载体为模板，利用VP2-P10F如SEQ ID NO.3和VP2-P10R如SEQ ID NO.4进行PCR扩增，获得片段1如SEQ ID NO.11所示；

(3)以步骤(1)获得重组载体为模板，利用VP2-PHF如SEQ ID NO.5和VP2-PHR如SEQID NO.6进行PCR扩增，获得片段2如SEQ ID NO.12所示；

(4)将片段1和片段2分别连接到pFastBacDual载体上，获得重组转移载体；

(5)重组转移载体转染Sf9细胞，获得细胞感染物为重组杆状病毒CPV-2b-VP2。

进一步地限定，获得犬瘟热病毒CDV-SN原液的方法：按MOI为0.08±0.01接种犬瘟热病毒CDV-SN株生产毒种到Vero细胞悬液中，收获上清为犬瘟热病毒CDV-SN原液。

进一步地限定，获得重组杆状病毒CPV-2b-VP2的原液的方法：按MOI为0.1～1.0接种重组杆状病毒CPV-2b-VP2病毒毒株到Sf9细胞中，收获细胞培养物为重组杆状病毒CPV-2b-VP2的原液。

本发明提供了上述的一种犬瘟热病毒CDV-SN或上述的二联疫苗在制备治疗或预防感染犬瘟热病毒和犬细小病毒的疾病的药物中的应用。

有益效果：本发明采用自主分离的犬瘟热毒株CDV-SN株和构建的重组杆状病毒CPV-2b-VP2株作为生产用毒株；采用重组杆状病毒表达犬细小病毒VP2蛋白作为犬细小抗原，具有表达产物成本低、生产效率高、免疫原性好等优点；犬瘟热病毒液和犬细小病毒VP2蛋白原液制备工艺分别采用微载体悬浮培养和全悬浮培养工艺，提高了生产效率；犬瘟热病毒液和犬细小病毒VP2蛋白液分别经浓缩和纯化，提高了抗原浓度和抗原纯度，提高了产品的免疫效果和安全性；采用二乙烯亚胺(BEI)对抗原进行核酸灭活，最大限度保留抗原蛋白的空间构象，保证了抗原的免疫原性，同时保证了产品安全性；添加MONTANIDEGEL 02PR水溶性聚合物佐剂，增强了抗原的免疫效果。该产品相比目前上市产品“犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗”，具有安全性好，抗原浓度和纯度高的优点，可作为幼犬基础免疫首选疫苗，以减少母源抗体对免疫效果的影响。

【生物保藏信息】：一种犬瘟热病毒(Canine distemper virus)，犬瘟热病毒的命名为犬瘟热病毒CDV-SN株，保藏号CGMCC NO.23205，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏时间2021年12月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1为pFD-CPV-2b-dVP2载体构建模式图；

图2为重组转移载体的酶切鉴定结果，其中，1：Marker 15000；2：pFD-CPV-2b-dVP2经Not I+Hind III双酶切鉴定；3：pFD-CPV-2b-dVP2经Xho I+Nhe I双酶切鉴定；

图3为重组Bacmid的PCR鉴定结果，其中，1：p10引物PCR扩增产物；2：pH引物PCR扩增产物；3：Marker 15000；

图4为重组病毒感染Sf9细胞的形态(100×)，其中，A为重组杆状病毒感染的Sf9细胞；B为正常Sf9细胞；

图5为重组杆状病毒PCR鉴定结果，其中，图A为p10和pH表达盒特异性引物扩增图：1：p10引物PCR扩增产物；2：pH引物PCR扩增产物；3：Marker 15000；图B为VP2引物扩增图：1：细胞对照；2：PCR扩增产物；3：Marker2000；

图6为免疫荧光染色鉴定VP2表达(100×)，其中，A为重组杆状病毒CPV-2b-VP2株感染的Sf9细胞；B为空白对照Sf9细胞；

图7为CPV VP2结构蛋白鉴定结果，其中，图A为SDS-PAGE图：1为细胞培养物离心后的上清，2为细胞培养物，3为细胞培养物离心后的细胞用NaHCO₃处理并离心后的上清，4为空杆状病毒接种细胞后的细胞培养物对照，5为预染Marker。图B为Western blotting图：1为空杆状病毒接种细胞后的细胞培养物对照，2为细胞培养物，3为预染Marker；

图8为电镜负染观察病毒样颗粒(VLPs)；

图9为试验犬免疫犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗后，不同时间点犬血清中CPVHI抗体效价变化；

图10为犬瘟热病毒分离株CDV-SN H基因核苷酸序列比对结果；

图11为基于犬瘟热病毒H基因的系统进化树分析结果。

具体实施例

1.制苗用Vero细胞标准：细胞形态：用含8％新生牛血清的细胞培养液，置37℃、含5％CO₂培养箱中培养、观察，2～3小时即可贴壁，24～48小时内可长成良好单层。显微镜下观察，该细胞贴壁生长，细胞轮廓清晰、呈上皮样，细胞质清晰。

纯净：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染。

胞核学检查：对处于生长对数期的细胞进行染色体计数，染色体数应为56±3，畸变率应≤0.5％。

致瘤性检验：取裸鼠30只，其中10只皮下接种5×10⁷个Vero细胞，0.2ml/只；10只皮下接种10⁶个BHK21细胞作为阳性对照；10只皮下接种10⁶个鸡胚成纤维细胞(CEF)作为阴性对照。连续观察12周，阳性对照裸鼠接种部位应长出结节，病理检查为成纤维细胞样的新生、幼稚肿瘤细胞，阴性对照裸鼠接种部位无结节，病理检查无肿瘤样病变，试验成立。接种Vero细胞的裸鼠应无结节，病理检查无肿瘤细胞。

细胞代次：基础细胞库为132～136代，生产细胞库为137～140代，生产用最高代次不超过150代。

细胞保存：液氮中长期保存。

2.制苗用Sf9细胞标准

细胞形态：在昆虫细胞培养基中悬浮培养，呈规则的球形，大小均一，折光性和分散性好；用昆虫细胞培养基在27℃下静止培养可贴壁生长，显微镜下观察，应呈大小均一、折光性良好、轮廓清晰的球形细胞。

纯净：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

胞核学检查：对处于生长对数期的细胞进行染色体计数，染色体数应为185±1，畸变率应不高于0.5％。

致瘤性检验：取裸鼠30只，其中10只皮下接种5×10⁷个Sf9细胞，0.2ml/只；10只皮下接种10⁶个BHK21细胞作为阳性对照；10只皮下接种10⁶个鸡胚成纤维细胞(CEF)作为阴性对照。连续观察12周，阳性对照裸鼠接种部位应长出结节，病理检查为成纤维细胞样的新生、幼稚肿瘤细胞，阴性对照裸鼠接种部位无结节，病理检查无肿瘤样病变，试验成立。接种Sf9细胞的裸鼠应无结节，病理检查无肿瘤细胞。

细胞代次：基础细胞库为5～8代，生产细胞库为9～15代，制苗用最高代次不超过30代。

细胞保存：液液氮中长期保存。

犬细小病毒CPV-SD15株记载在赵健,姜旭,倪婷婷,等.犬细小病毒人工感染模型的建立[J].中国兽医学报,2020,40(5):4。

犬瘟热强毒CDV-PS株记载在施鹏飞,程悦宁,罗国良,等.犬瘟热病毒CDV-PS株致病力及基因进化分析[J].特产研究,2019,41(3):4。

实施例.1制备重组杆状病毒CPV-2b-VP2株与鉴定

1.PCR扩增VP2基因

以本公司分离的犬细小病毒(CPV,canine parvovirus)CPV-SD15株VP2序列(SEQID NO:1)为基础，在不改变氨基酸序列的前提下，根据Sf9昆虫细胞密码子偏爱性对CPV-SD15 VP2原始基因进行优化，将优化后的序列CPV-2b-VP2-opti(SEQ ID NO:2)合成到载体pUC57上，命名为pUC-CPV-2b-VP2-opti。以合成的pUC-CPV-2b-VP2-opti质粒为模板，通过VP2-P10F引物和VP2-P10R引物，进行PCR扩增获得PCR产物VP2-2b-opti-p10片段(SEQ IDNO:11)。通过VP2-PHF引物和VP2-PHR引物，进行PCR扩增获得PCR产物VP2-2b-opti-pH片段(SEQ ID NO:12)，引物见表1。反应体系为50μl，组成为：5×HF缓冲液10μl，2.5mmol/L dNTP4μl，上游引物(20μmol/L)1.25μl，下游引物(20μmol/L)1.25μl，模板1μl，高保真DNA聚合酶(2U/μl)0.5μl，补加ddH₂O至50μl。反应程序为：98℃预变性30秒，98℃变性7秒，55℃复性30秒，72℃延伸1分30秒，35个循环，最后72℃延伸10分钟。扩增产物使用1.0％凝胶进行电泳分析。

表1 转移载体构建用引物

2.转移载体的构建与鉴定

将优化后的两个VP2序列分别连接至pFastBacDual转移载体的两个表达盒，示意图见图1。将pFastBacDual和VP2-opti-2b-pH PCR产物分别进行双酶切处理，酶切体系50μl组成：模板2.5μg，Not I和Hind III各2.5μl，10×Green Buffer 5μl，补dd H₂O至50μl。混匀后，在37℃条件下酶切3小时。然后，将纯化后的VP2片段连入双酶切处理的载体中，连接体系5μl组成：T4连接酶buffer 0.5μl，T4连接酶0.5μl，片段3.5μl，载体0.5μl，混匀后，16℃连接8小时。最后，将连接产物与感受态细胞(E.coli DH5a)采用热休克方法进行转化，获得带有VP2-opti-2b-pH PCR的阳性质粒，同样，按照上述方法通过酶切连接将VP2-opti-2b-p10PCR产物基因连接至带有VP2-opti-2b-pH PCR的阳性质粒中的Xho I+Nhe I酶切位点，获得重组转移载体pFD-CPV-2b-dVP2。采用核酸内切酶对pFD-CPV-2b-dVP2双酶切鉴定，获得约为1755bp和6993bp左右的两个目的片段，符合目的片段大小，见图2所示。

3.重组Bacmid的构建与鉴定

将重组转移载体pFD-CPV-2b-dVP2利用热休克方法转化E.coli DH10Bac感受态，条件如下：将感受态细胞从-70℃冰箱内取出至冰上融化，加入2μl pFD-CPV-2b-dVP2混匀后，冰浴30分钟，42℃热应激50秒，再冰浴3分钟，加入1ml无抗性LB培养基，在37℃200r/min条件下培养4小时，菌液做10、100、1000倍比连续稀释，从每种稀释液中分别取出100μl涂布于含有三抗抗性细菌培养板上(含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环霉素、100μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG)，37℃培养48小时后，进行蓝白斑筛选。挑取白斑菌落，划线于三抗抗性细菌培养板上，继续培养48小时之后，挑取白色菌落，接菌至含三抗抗性的液体LB培养基中，在37℃200r/min条件下培养12～16小时之后，采用碱裂解与异丙醇沉淀结合的方法提取重组Bacmid-CPV-2b-dVP2。以p10和pH表达盒特异性引物分别进行PCR鉴定，鉴定引物序列见表2。扩增结果如图3所示，扩增产物分别是3733bp、2578bp左右片段，与设计大小相符。以上结果表明外源基因片段正确重组到杆状病毒基因组的目的位点上。

表2 鉴定引物序列

4.重组杆状病毒的拯救

将提取的重组转移载体pFD-CPV-2b-dVP2转染贴壁Sf9细胞，转染过程如下：将2μg重组DNA加入到100μl和双抗的TNM-FH培养液中，混匀。将9μl Cellfectin Reagent加入到100μl TNM-FH培养液中，混匀。将重组DNA与脂质体混合，室温静止40分钟。将用6孔板培养好的昆虫细胞Sf9(覆盖孔底面积已经达到80％～90％)用TNM-FH培养液轻洗三次，然后，每孔加入1ml TNM-FH培养液，待备用。将重组DNA与脂质体的混合物轻轻加入到每孔细胞中，轻轻混匀，在27℃条件下静止培养5～6小时。将孔中的液体弃掉，加入2ml完全TNM-FH培养液，27℃静止培养5～6天，待细胞肿胀，体积变大，脱落后，收集上清液，命名为重组杆状病毒CPV-2b-VP2株P1代。用其感染新培养的Sf9悬浮细胞，反复接种2代后，收取细胞上清液，4℃或-70℃保存备用。

5.重组杆状病毒的鉴定

(1)病毒培养特性研究

将重组杆状病毒CPV-2b-VP2株感染贴壁培养的Sf9昆虫细胞，将细胞置于27℃温箱内静止培养。接毒后2～4天观察细胞变化，正常未接毒的细胞为大小均一、折光性良好、轮廓清晰的透明球形细胞(见图4A)，而重组病毒感染的Sf9昆虫细胞出现明显的细胞病变，表现为：细胞体积明显增大、细胞脱落、细胞内颗粒增多(见图4B)。

(2)PCR鉴定

收集重组病毒感染3～4日的细胞培养物，按常规法提取病毒基因组DNA，以DNA作为模板，进行PCR扩增鉴定。p10和pH表达盒特异性引物扩增产物与目的大小一致，分别为3733bp和2578bp(图5A)；VP2引物扩增产物与目的大小一致，为1755bp(图5B)，表明双拷贝的VP2基因重组至杆状病毒基因组中。

(3)血凝特性检测

取猪红细胞于阿氏液中保存，用PBS(0.015mol/L，pH6.5)洗涤红细胞三次，最后将红细胞用PBS配成1％悬液，再加入0.5％兔血清。在V形板的每孔加入灭菌的PBS 25μl；用微量移液器取待测样品25μl加入第1孔内，混匀后，吸取25μl后加入到第二孔中，如此连续稀释至第23孔，第23孔吸取25μl液体弃掉；第24孔为PBS对照，阴性细胞培养物按相同方法稀释。每孔补加25μl PBS和50μl 1％猪红细胞悬液，混匀后，4℃下反应60分钟，待对照的红细胞完全沉积后观察结果。结果显示，收获的重组杆状病毒细胞培养物血凝效价可达:1：2¹⁶，将收获的细胞用NaHCO₃处理后离心，收获的上清血凝效价可达到1：2¹⁴。而哺乳动物细胞培养获得的抗原HA效价为1：2¹⁰。表明制备的重组杆状病毒CPV-2b-VP2VLPs(病毒样颗粒)保持了凝集猪红血球的血凝特性，并且表达量远大于哺乳动物细胞培养收获的抗原量。

(4)间接免疫荧光鉴定

采用间接免疫荧光试验检测CPV的VP2蛋白表达情况。取重组杆状病毒CPV-2b-VP2株，将毒种用细胞培养液作20倍稀释，接种已长满80％单层的96孔Sf9细胞培养板，接种3孔，每孔50μl，同时设正常细胞对照。在27℃条件下，细胞静止培养48小时之后，吸掉上清液，每孔加入100μl 80％丙酮溶液，在室温条件下，固定Sf9细胞30分钟，用PBST溶液洗涤3次后，细胞与犬细小病毒阳性血清(兔源)(1:200倍稀释)37℃反应1小时；用PBST溶液洗涤3次后，加入FITC标记的羊抗兔IgG抗体37℃反应1小时，用PBST溶液洗涤3次后，使用荧光显微镜检测结果。实验结果显示，重组病毒感染的Sf9细胞展现出高强度的黄绿色荧光(见图6A)；对照组细胞无可见荧光(见图6B)，表明重组杆状病毒感染Sf9细胞可表达CPV VP2蛋白。

(5)重组杆状病毒病毒含量的测定

使用杆状病毒快速滴定试剂盒测定拯救的重组杆状病毒，病毒含量可达7.86×10⁷IFU/ml。

(6)SDS-PAGE和Western blotting鉴定

为了分析重组杆状病毒感染Sf9细胞后CPV VP2蛋白的表达情况，利用重组杆状病毒以MOI＝0.1感染Sf9细胞，培养96小时之后，收集细胞培养物，5000r/min离心10分钟，分离上清液和细胞，细胞加入与原收获细胞培养物等体积的25mM NaHCO₃悬浮后，至冰上30分钟。5000r/min离心10分钟，获取上清液。各步骤获得的样品取100μl加入25μl 5×上样缓冲液混匀，煮沸5分钟，用于SDS-PAGE和Western blotting检测与分析。在Western blotting实验过程中，封闭液采用5％的脱脂奶粉，室温封闭时间为2小时；一抗采用犬细小病毒阳性血清，室温反应2小时；二抗采用羊抗兔的HRP标记的IgG，室温反应1小时；显色液选用ECL化学发光底物，用全自动化学发光图片分析系统拍照保存结果。结果显示，获得的目的蛋白集中位于65kDa左右(见图7A)，且目的蛋白主要为细胞内表达，将收获的细胞用NaHCO₃处理后，目的蛋白可以分泌到上清中。将收获的细胞NaHCO₃处理后收集上清液进行SDS-PAGE，并将样品转膜，进行Western blotting检测，结果显示目的蛋白样品出现一条特异性条带，分子量大小为65kDa，与CPV VP2(65kDa)蛋白大小相符，表明目的蛋白表达正确(见图7B)。

(7)电镜观察

收集重组病毒感染3～4日的细胞混合物，反复冻融1次后，将样品吸附到金属网上，用1％磷钨酸染色2～3分钟，然后，用滤纸吸掉金属网上的残余染色液，最后，利用电镜(JEM1200EXII)观察。电镜结果显示，从目的蛋白样品中可见到圆形球状VLPs(图8)，直径大小在20nm左右，其形态结构与天然CPV相似。表明重组杆状病毒CPV-2b-VP2株感染的Sf9细胞能够正确表达CPV VP2蛋白，而且，表达的VP2蛋白能够装配成完整的CPV VLPs。

生产重组杆状病毒CPV-2b-VP2株：

病毒培养特性：将重组杆状病毒CPV-2b-VP2株接种已长满80％单层Sf9细胞的24孔培养板3孔，每孔10μl，同时设正常细胞对照。置27℃培养并观察2～4日。接毒细胞出现明显的细胞病变：细胞体积明显增大、细胞脱落、细胞内颗粒增多，正常细胞为大小均一、折光性良好、轮廓清晰的透明球形细胞。

病毒含量：将重组杆状病毒CPV-2b-VP2株用TNM-FH培养基作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5 3个稀释度分别接种长有Sf9细胞的96孔细胞板，10^-3稀释度接种3孔，10^-4、10^-5稀释度分别接种4孔，每孔25ul，同时设正常细胞对照，甲基纤维素覆盖后，27℃继续培养43～47小时。加入预冷丙酮固定细胞，按照免疫染色法测定病毒含量。每毫升病毒含量应不低于10^7.00IFU。

基因鉴定：用PCR方法扩增毒种VP2基因，应能扩增出约1755bp的DNA片段。

特异性：进行检测，置荧光显微镜下观察结果。细胞对照孔应无可见荧光，接种病毒孔应可见明显黄绿色荧光。

表达特性：将毒种按MOI为0.1～1的剂量接种悬浮培养的Sf9细胞，在27℃下以120r/min悬浮培养96小时，收获细胞培养物。将细胞培养物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，在65KDa处应出现一条明显的蛋白条带。测定细胞培养物对猪红细胞的HA效价应不低于2¹⁴。

免疫原性：将毒种按MOI为0.1～1的剂量接种悬浮培养的Sf9细胞，在27℃下以120r/min悬浮培养96小时，收获的细胞培养物5000r/min离心10分钟，弃去上清液，细胞加入与原收获细胞培养物等体积的25mmol/L NaHCO₃悬浮后，置2～8℃裂解30分钟。5000r/min离心10分钟，收集上清，用TNM-FH培养基稀释至HA效价为1：2¹⁴，加入终浓度为0.002mol/L BEI，30℃下灭活24小时后，加入BEI使用量的10％的1mol/L硫代硫酸钠中和，取9份蛋白液和1份Montanide Gel 02 PR佐剂混匀配制成疫苗，颈部皮下注射4～12周龄健康易感犬(CPV HI抗体效价不高于1:8)5只，每只0.5ml，另5只犬颈部皮下接种0.5ml MEM培养液，作为对照犬。21日后，每只犬各灌服犬细小病毒强毒CPV-SD15株(10^6.00TCID₅₀/ml)15ml，分3次灌服，每次间隔4小时，观察9日，对照犬应不少于4只发病，免疫犬应至少4只保护。

基础种子代数：3～4代。

毒种保存：-70℃以下保存，湿毒毒种保存期暂定为36个月。

实施例2.分离犬瘟热病毒CDV-SN的方法与鉴定

1.犬瘟热病毒CDV-SN的分离方法

(1)病料处理和检验：将确诊犬瘟热发病犬血液直接冻融1～2次后，4℃条件下离心，转速为10000r/min，离心时间为20分钟，取上清加入双抗(1000单位/ml)，置超低温冰箱保存备用。无菌检验合格，且犬瘟热抗原检测为阳性病料用作病毒分离。

(2)病毒分离培养按常规方法将Vero细胞复苏，于T25细胞培养瓶中培养，经适当传代扩繁后用作接毒。待细胞状态良好汇合度达70％时接毒，将检验合格的病料接种Vero细胞，每瓶接种0.5ml，33～35℃5％CO₂条件下培养，接种过夜后换液继续培养，每日观察细胞病变(CPE)情况，每天注意观察细胞生长和细胞病变情况。若细胞在接种3～4天内未出现病变则进行盲传，若盲传至第4代仍未出现细胞病变的视为阴性。将出现病变的细胞于接种后4天收获，反复冻融2次置超低温冰箱保存(P1代)，病毒分离的过程中同时设正常细胞作为病变观察对照。将收获的病毒液按5～10％的接种量接种Vero细胞传代，一直传至3代(P3代)。

(3)分离病毒鉴定：对P3代病毒液进行PCR鉴定、同源性分析、间接免疫荧光检测、透射电镜观察、特异性检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验，结果如图10和图11所示，证明分离的病毒为犬瘟热病毒，归属于亚洲Ⅰ型(Asia-1)，与目前我国主要流行的犬瘟热基因型一致。

(4)驯化培养：将经鉴定为犬瘟热病毒的P3代病毒液按适宜的接种量接种长满单层的Vero细胞，33～35℃培养，培养72～96小时，病变达到70％以上即收获，将收获的病毒液冻融1次，继续传代接种Vero细胞，直至传至P20代，命名为犬瘟热毒种CDV-SN株。

2.将犬瘟热毒种CDV-SN株以MOI为0.1～0.3接种量接种已长成单层的Vero细胞，置33～35℃培养24小时后换含2％新生牛血清的细胞维持液，继续培养，培养3～4日，产生融合性CPE，细胞变圆、脱落。

病毒含量：将毒种用MEM培养液作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6 4个稀释度，分别接种已贴壁Vero细胞的96孔细胞培养板，每个稀释度接种8孔，0.1ml/每孔，同时设正常细胞对照，置33～35℃、含5％CO₂细胞培养箱中培养、观察5日，记录细胞病变(CPE)孔，按Reed-Muench法计算TCID₅₀，每毫升病毒含量应不低于10^6.00TCID₅₀。

特异性：将毒种用MEM培养液稀释至2×10³TCID₅₀/ml，与犬瘟热病毒特异性阳性血清(CDV中和抗体效价不低于1:256)等量混匀，37℃下中和1小时后，接种于已贴壁Vero细胞的96孔细胞培养板4孔，0.1ml/孔，同时设立正常细胞对照和病毒对照孔，置33～35℃、含5％CO₂细胞培养箱培养、观察5日。阳性血清中和孔和正常细胞孔均应不出现细胞病变，病毒对照孔均应出现细胞病变。

免疫原性：将毒种用MEM稀释至病毒含量为10^6.00TCID₅₀/ml，加入终浓度为0.002mol/LBEI，30℃下灭活24小时后，加入BEI使用量的10％的1mol/L硫代硫酸钠中和，取9份灭活的病毒液和1份Montanide Gel 02 PR佐剂混合配制成疫苗。颈部皮下接种4～12周龄健康易感犬(CDV中和抗体效价不高于1:8)5只，每只0.5ml，另5只犬颈部皮下接种0.5mlMEM培养液，作为对照犬。21日后，所有犬用犬瘟热强毒CDV-JL株(10^6.50TCID₅₀/ml)攻击，每只颈部皮下注射4.5ml，滴鼻和点眼0.5ml，观察14日，对照犬至少4只发病，免疫犬至少4只保护。

毒种代次：基础毒种代次为21代。

毒种保存：-70℃以下保存，冻干毒种保存期暂定36个月，进行保藏。

实施例3.制备基于犬瘟热病毒和犬细小病毒病的二联疫苗

1.疫苗制造及半成品检验

犬瘟热病毒CDV-SN株：将毒种用MEM培养液稀释，以MOI为0.1～0.3接种量接种已长成单层的Vero细胞。置37℃培养24小时后换含2％新生牛血清的细胞维持液，置33～35℃继续培养，当细胞病变达80％以上时，冻融1次，-20℃以下保存。

重组杆状病毒CPV-2b-VP2株：将Sf9细胞在昆虫细胞培养基、27℃、120r/min条件下培养至细胞数量约2.0×10⁶～2.5×10⁶个/ml时，以MOI为0.1～1.0接种量接入重组杆状病毒CPV-2b-VP2株，27℃继续培养。96～120小时后，收获病毒液，-20℃以下保存。

毒种鉴定：犬瘟热病毒CDV-SN株按犬瘟热病毒的培养特性、病毒含量、特异性进行，重组杆状病毒CPV-2b-VP2株按犬细小病毒的培养特性、病毒含量、特异性进行，应符合规定。符合以上标准的毒种作为生产用种子。

毒种继代：犬瘟热病毒CDV-SN株毒种继代应不超过10代(21～30代)，重组杆状病毒CPV-2b-VP2株应不超过2代(5～6代)。

毒种保存：-70℃以下保存，湿毒毒种保存期暂定36个月。

制苗用细胞：选择生长良好的Vero细胞和Sf9细胞作为制苗材料。

Vero基础细胞库为132～136代、生产细胞库为137～140代，生产用最高使用代次不超过150代。Sf9细胞基础细胞库为5～8代，生产细胞库为9～15代，制苗用最高代次不超过30代。

2.原液制备

(1)犬瘟热病毒原液的制备

Vero细胞制备：从生产细胞库中取出冻存的细胞，置37℃水浴中融化，接入含8％新生牛血清的MEM细胞培养瓶中，置37℃、5％CO₂培养箱中培养，24小时后换液培养2～3日至细胞长成致密单层，用含0.25％的胰酶消化，按1:3或1:4传代，扩大培养。将扩大培养的细胞接种到转瓶中，37℃培养48～72小时，控制转速为8～12转/小时。

悬浮培养用微载体的处理：将干燥的微载体用无Ca²⁺和Mg²⁺的0.01M pH值7.4的磷酸盐缓冲液(D-PBS)室温浸泡水化处理，与适量D-PBS进行高压灭菌(121℃，30分钟，102kPa)，用细胞培养液置换D-PBS，备用。

细胞悬浮培养、接种及收获：将Vero细胞消化后制备成细胞悬液，加入处理好的Cytodex^TM 1微载体和DMEM细胞培养液，使细胞个数:微载体球个数＝25±5:1，微载体终浓度为6g/L；控制发酵罐温度为37±0.2℃，pH值为7.2±0.1，DO值为50％，搅拌初始转速为25r/min，按每日提高10～20转搅拌转速至最终恒定搅拌转速为80r/min，培养2～4日，及时更换新的细胞培养液以保证葡萄糖浓度不低于1g/L，当微载体球面长满细胞时，测定细胞浓度，更换维持液，按MOI为0.08±0.01接种犬瘟热病毒CDV-SN株生产毒种，培养温度为34±1.0℃，pH值为7.1±0.1，每日观察病变情况，当病变率达80％以上时收获，收获液经冻融后去除沉淀，收获上清为犬瘟热病毒CDV-SN株的细胞培养物的上清液为犬瘟热病毒原液。

犬瘟热病毒CDV-SN的原液进行浓缩：将上述收获的犬瘟热病毒CDV-SN株的细胞培养物的上清液进行病毒含量测定，若病毒液病毒含量在10^6.30～10^7.00TCID₅₀/ml之间，采用10KD的超滤膜，进行5～10倍浓缩，直至每毫升病毒含量应不低于10^7.00TCID₅₀。若病毒含量不低于10^7.00TCID₅₀/ml则不需要浓缩。收获的病毒液即为犬瘟热病毒原液，置-20℃以下保存，保存期6个月。

(2)犬细小病毒VP2蛋白原液的制备

Sf9细胞制备：从液氮中取出生产细胞库Sf9细胞种子复苏，加入昆虫细胞培养基，置27℃、120r/min条件下振荡培养48～96小时，待细胞数量达2.0×10⁶～4.0×10⁶个/ml时传代继续培养。将逐级扩大培养达到一定数量的Sf9细胞种子以1.2×10⁶～1.5×10⁶个/ml的细胞数量接种于生物反应器，在27℃、100～110r/min、DO 50％的条件下悬浮发酵培养。

接种及收获：待生物反应器中Sf9细胞数量达到6.0×10⁶～8.0×10⁶个/ml时，按MOI为0.1～1.0接种生产用重组杆状病毒CPV-2b-VP2毒种，在27℃、100～110r/min、DO50％的条件下继续培养。接毒后96～120小时收获重组犬细小病毒CPV-2b-VP2株的细胞培养物为犬细小病毒VP2蛋白原液，收集细胞置于-20℃以下冻存。

重组犬细小病毒VP2蛋白原液的纯化：将收获的重组犬细小病毒CPV-2b-VP2株的细胞培养物，采用750KD超滤中空纤维柱富集细胞，使用25mmol/L NaHCO₃裂解细胞，采用0.65μm微滤中空纤维滤柱去除细胞碎片，收获纯化后的蛋白液，即为犬细小病毒VP2蛋白原液，置-20℃以下保存，保存期为6个月。

3.制苗原液检验

无菌检验：两种病毒液分别取样，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

4.病毒含量测定

犬瘟热病毒原液检验：进行病毒含量测定，每毫升病毒含量应不低于10^7.00TCID₅₀。

犬细小病毒VP2蛋白原液检验按照猪红细胞凝集试验法进行HA效价测定，应不低于1：2¹⁴。

5.半成品制备：将犬瘟热病毒液和犬细小病毒VP2蛋白原液分别加入终浓度为0.002mol/LBEI进行灭活，30℃，灭活24小时，灭活后加入BEI使用量10％的1mol/L硫代硫酸钠中和BEI，即得半成品。

6.半成品检验：

灭活检验：取灭活的犬瘟热病毒半成品和犬细小病毒VP2蛋白半成品用培养基1:5稀释后分别接种长成单层的Vero细胞和Sf9细胞各2瓶，每瓶0.5ml，Vero细胞置33～35℃下培养，24小时后换维持液，继续培养3日后再传1代，Sf9细胞置27℃下培养，培养3日后再传1代，观察两种细胞有无细胞病变，未见细胞病变即判定灭活合格。

纯度检验：取灭活的犬细小病毒VP2蛋白半成品，进行SDS-PAGE检测，在65KD处应出现一条明显的蛋白条带，纯度应不低于30.00％。

7.成品疫苗制备

配苗：将灭活的犬瘟热病毒液和犬细小病毒VP2蛋白液按1:1的比例混合均匀，将混合病毒液与Montanide Gel 02 PR佐剂按9:1比例混匀。

分装：无菌定量分装，加盖密封，即得成品，2～8℃保存。

8.成品检验

性状：置后，下层有少量沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。

无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

安全检验：用4～12周龄健康易感犬5只，每只犬颈部皮下注射2头份(2ml)疫苗，逐日观察14日，精神、食欲、体温与粪便性状均应正常。

利用以下实验验证实验效果：

1.效力检验下列方法：

(1)血清学方法用4～12周龄健康易感犬5只(CDV中和抗体效价不高于1:8，CPVHI抗体效价不高于1:8)，每只皮下注射疫苗1头份(1ml)，21日后采血，分离血清，按下列方法测定血清中犬瘟热病毒中和抗体和犬细小病毒HI抗体效价。

(2)犬瘟热病毒中和抗体测定：分别用100TCID₅₀的犬瘟热病毒CDV-SN株培养物与各试验犬血清于37℃作用1小时，按现行《中国兽药典》附录测定血清中犬瘟热病毒中和抗体。5/5犬抗犬瘟热病毒中和抗体效价应不低于1:32。

(3)犬细小病毒HI抗体测定：分别用4单位血凝素的犬细小病毒CPV-SD15株培养物与各试验犬血清于37℃作用1小时，按现行《中国兽药典》附录，测定各免疫犬血清的CPVHI效价，5/5犬抗犬细小病毒HI抗体效价应不低于1:32。

(4)免疫攻毒法

犬瘟热免疫攻毒：用4～12周龄健康易感犬10只(CDV中和抗体效价不高于1:8)，分为疫苗组和对照组两组，疫苗组各皮下注射疫苗1头份(1ml)，对照组各皮下注射MEM培养液1ml，接种21日后，每只犬各皮下注射注射犬瘟热强毒CDV-PS株病毒液(10^6.50TCID₅₀/ml)4.5ml，滴鼻和点眼0.5ml，观察14日，按照发病和免疫保护判定标准判定，对照组应至少4只发病，免疫组应至少4只保护。

犬细小免疫攻毒：用4～12周龄健康易感犬10只(CPV HI抗体效价不高于1:8)，分为疫苗组和对照组两组，疫苗组各皮下注射疫苗1头份(1ml)，对照组各皮下注射MEM培养液1ml，接种21日后，每只犬各灌服犬细小病毒强毒CPV-SD15株病毒液(10^6.00TCID₅₀/ml)15ml，分3次灌服，每次间隔4小时，观察9日，按照发病和免疫保护判定标准判定，对照组应至少4只发病，免疫组应至少4只保护。

用实验室制备的犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗，分别用0.25ml/只、0.5ml/只、1.0ml/只、2.0ml/只4个剂量免疫犬。免疫后21日检测犬瘟热病毒中和抗体效价和犬细小病毒HI抗体效价并进行攻毒，分析抗体效价与犬免疫攻毒保护的平行相关性。结果显示，犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗的最小免疫剂量为0.5ml/只，推荐免疫剂量为1.0ml/只，抗体效价与犬免疫攻毒保护之间有良好的平行关系，当血清中犬瘟热病毒中和抗体效价不低于1:32时，能获得80％的犬瘟热病毒攻毒保护；血清中犬细小病毒HI抗体效价不低于1:32时，试验犬能获得80％的犬细小病毒攻毒保护。

犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗三个批次进行靶动物免疫攻毒试验。根据攻毒病毒分为犬瘟热病毒组和犬细小病毒组，每组20只犬。又根据批号分为4组，分为A组、B组、C组和发病对照组，每组动物均为5只。A组、B组、C组皮下注射犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗，剂量为1头份/只；发病对照组皮下注射MEM培养液，剂量为1.0ml/只。免疫后21日进行攻毒，犬瘟热病毒攻毒后观察14天试验动物的发病情况和死亡情况，犬细小病毒攻毒后观察9天试验动物的发病情况和死亡情况，计算疫苗组和发病对照组的发病率，以评估制品的效力。

用本发明制备的犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗作为试验疫苗，采用市售的犬瘟热、犬细小病毒病二联活疫苗作为对照疫苗，免疫4～12周龄健康易感犬(CDV中和抗体效价不高于1:8，CPV HI抗体效价不高于1:8)，于免疫后0、7、14、21、30、60、90、120、150、180、210日分别检测免疫动物的血清CDV中和抗体效价和CPV HI抗体效价，同时免疫后150日、180日和210日分别进行CDV和CPV攻毒。

结果显示，3组灭活疫苗试验动物发病率均为0，发病对照组试验动物发病率100％，说明实验室生产的三批犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗均具有良好的免疫攻毒保护力。犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗免疫犬血清犬瘟热中和抗体效价于免疫后30天达到峰值，至免疫后60天开始下降，至免疫后210天，免疫犬血清犬瘟热中和抗体效价均不低于1:32，攻毒后均未发病，保护率不低于80％，达到对犬瘟热的保护效力标准。免疫犬血清CPV HI抗体效价于免疫后30天达到峰值，至免疫后60天开始下降，至免疫后210天，免疫犬血清CPV HI抗体效价均不低于1:32，攻毒后均未发病，保护率不低于80％。

对照组市售的犬瘟热、犬细小病毒病二联活疫苗的结果：如图9所示，活疫苗组免疫犬血清犬瘟热抗体效价免疫后210天抗体水平比灭活疫苗组稍高，CPV HI抗体效价在免疫前期抗体水平稍高一些，免疫后210天和灭活疫苗组抗体水平相当。根据免疫后抗体水平以及攻毒结果可知，免疫后210天对犬瘟热和犬细小有免疫保护作用。

2.疫苗的安全性实验

按照《中华人民共和国农业部公告第683号》评价犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗的安全性，采用3批实验室样品(批号分别为20170801、20170802、20170803)和5批中试样品(批号为20191101、20191102、20191203、20191204、20191205)进行安全性评价，并与市售犬瘟热、犬细小病毒病二联活疫苗进行安全性比较研究，结果表明，一次单剂量注射，一次单剂量重复注射和一次超剂量注射对健康幼犬(4～12周龄)和健康成年犬(12～36个月)安全性均良好，与犬瘟热、犬细小病毒病二联活疫苗安全性相当。一次单剂量注射对最小日龄靶动物(4周龄幼犬)安全性良好。对部分免疫的幼犬进行解剖学和组织学检查，均未出现肉眼可见的病理变化。表明犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗安全性良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 长春西诺生物科技有限公司

<120> 一种犬瘟热病毒株和基于犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联疫苗及应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1755

<212> DNA

<213> canine parvovirus

<400> 1

atgagtgatg gagcagttca accagacggt ggtcagcctg ctgtcagaaa tgaaagagct 60

acaggatctg ggaacgggtc tggaggcggg ggtggtggtg gttctggggg tgtggggatt 120

tctacgggta ctttcaataa tcagacggaa tttaaatttt tggaaaacgg atgggtggaa 180

atcacagcaa actcaagcag acttgtacat ttaaatatgc cagaaagtga aaattataga 240

agagtggttg taaataattt ggataaaact gcagttaacg gaaacatggc tttagatgat 300

actcatgcac aaattgtaac accttggtca ttggttgatg caaatgcttg gggagtttgg 360

tttaatccag gagattggca actaattgtt aatactatga gtgagttgca tttaattagt 420

tttgaacaag aaatttttaa tgttgtttta aagactgttt cagaatctgc tactcagcca 480

ccaactaaag tttataataa tgatttaact gcatcattga tggttgcatt agatagtaat 540

aatactatgc catttactcc agcagctatg agatctgaga cattgggttt ttatccatgg 600

aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attaatacca 660

tctcatactg gaactagtgg cacaccaaca aatatatacc atggtacaga tccagatgac 720

gtccaatttt atactattga aaattctgtg ccagtacact tactaagaac aggtgatgaa 780

tttgctacag gaacattttt ttttgattgt aaaccatgta gactaacaca tacatggcaa 840

acaaatagag cattgggctt accaccattt ctaaattctt tgcctcaagc tgaaggaggt 900

actaactttg gttatatagg agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga 960

aatacaaact atattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca 1020

ccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctat tgcagcagga 1080

cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcaa gcagcagatg gtgatccaag atatgcattt 1140

ggtagacaac atggtcaaaa aactaccaca acaggagaaa cacctgagag atttacatat 1200

atagcacatc aagatacagg aagatatcca gaaggagatt ggattcaaaa tattaacttt 1260

aaccttcctg taacagatga taatgtattg ctaccaacag atccaattgg aggtaaaaca 1320

ggaattaact ataccaatat atttaatact tatggtcctt taactgcatt aaataatgta 1380

ccaccagttt atccaaatgg tcaaatttgg gataaagaat ttgatactga cttaaaacca 1440

agacttcatg taaatgcacc atttgtttgt caaaataatt gtcctggtca attatttgta 1500

aaagttgcgc ctaatttaac aaatgaatat gatcctgatg catctgctaa tatgtcaaga 1560

attgtaactt actcagattt ttggtggaaa ggtaaattag tatttaaagc taaactaaga 1620

gcctctcata cttggaatcc aattcaacaa atgagtatta atgtagataa ccaatttaac 1680

tatgtaccaa gtaatattgg aggtatgaaa attgtatatg aaaaatctca actagcacct 1740

agaaaattat attaa 1755

<210> 2

<211> 1755

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgtctgacg gtgctgtgca gcctgacggc ggtcagccag ctgtgcgtaa cgaacgcgcc 60

actggtagcg gcaacggctc cggtggaggt ggcggcggcg gtagcggcgg tgtgggcatc 120

agcaccggca ccttcaacaa ccagactgaa ttcaagttcc tcgaaaacgg ctgggttgaa 180

atcaccgcca actcctctcg tctggtgcac ctgaacatgc cagagagcga gaactaccgt 240

cgtgtggtgg tgaacaacct ggataagact gctgtgaacg gtaacatggc tctggacgac 300

acccacgctc agatcgtgac cccttggtcc ctggttgacg ctaacgcctg gggagtgtgg 360

ttcaaccctg gtgactggca gctgatcgtg aacaccatgt ccgagctgca cctgatctcc 420

ttcgaacagg aaatcttcaa cgtggtgctg aagaccgtgt ccgaaagcgc cactcagccc 480

cctactaagg tctacaacaa cgacctgacc gcttccctga tggttgctct ggacagcaac 540

aacactatgc ctttcacccc cgctgctatg cgctccgaga cactcggctt ctacccatgg 600

aagcctacca tccccactcc ctggcgctac tacttccagt gggaccgtac cctgatccca 660

tcccacactg gcacttccgg taccccaact aacatctacc acggcactga cccagacgac 720

gtccagttct acacaatcga aaacagcgtg ccagtgcacc tgctgcgtac tggtgacgag 780

ttcgccaccg gaactttctt cttcgactgt aagccttgtc gcctgaccca cacatggcag 840

acaaaccgtg ctctgggact gccccccttc ctgaacagcc tgcctcaggc tgaaggtggt 900

acaaacttcg gttacatcgg cgtgcagcag gacaagcgtc gcggtgtgac ccagatgggt 960

aacactaact acatcaccga agccactatc atgcgccctg ccgaagtggg ttacagcgct 1020

ccctactaca gcttcgaagc ttccactcag ggtccattca agacacctat cgctgccggt 1080

aggggtggtg cccagacaga cgagaaccaa gccgctgacg gtgaccctcg ctacgccttc 1140

ggccgccagc acggccagaa gaccactacc acaggtgaga cccctgagcg tttcacttac 1200

atcgcccacc aagacacagg ccgctaccct gagggcgact ggatccagaa catcaacttc 1260

aacctccccg tgaccgacga caacgtgctg ctgcctaccg accccatcgg aggaaagacc 1320

ggcatcaact acacaaacat cttcaacacc tacggcccac tcacagctct caacaacgtg 1380

ccacccgtgt accctaacgg ccagatctgg gacaaggagt tcgacaccga cctcaagcca 1440

cgcctgcacg tgaacgcccc tttcgtttgc cagaacaact gtcctggcca gctgttcgtg 1500

aaggtggccc ctaacctcac taacgaatac gaccctgacg ctagcgctaa catgtcccgc 1560

atcgtgacct actctgactt ctggtggaag ggcaagctcg tgttcaaggc caagctccgc 1620

gcttcccata cctggaaccc tatccagcaa atgtcaatca acgttgataa ccaattcaac 1680

tacgttccct ccaacatcgg cggtatgaag atcgtctacg aaaagagtca actggctcca 1740

cgtaagctgt actaa 1755

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

taactcgaga tgggcgacgg tgccgtt 27

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tatgctagct tagtacaatt tacggggagc cagc 34

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

taagcggccg catgggcgac ggtgccgtt 29

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tataagcttt tagtacaatt tacggggagc cagc 34

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gttttcccag tcacgac 17

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cggaccttta attcaaccc 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ttcataccgt cccaccat 18

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

caggaaacag ctatgac 17

<210> 11

<211> 1816

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

taactcgaga tgggcgacgg tgccgttatg tctgacggtg ctgtgcagcc tgacggcggt 60

cagccagctg tgcgtaacga acgcgccact ggtagcggca acggctccgg tggaggtggc 120

ggcggcggta gcggcggtgt gggcatcagc accggcacct tcaacaacca gactgaattc 180

aagttcctcg aaaacggctg ggttgaaatc accgccaact cctctcgtct ggtgcacctg 240

aacatgccag agagcgagaa ctaccgtcgt gtggtggtga acaacctgga taagactgct 300

gtgaacggta acatggctct ggacgacacc cacgctcaga tcgtgacccc ttggtccctg 360

gttgacgcta acgcctgggg agtgtggttc aaccctggtg actggcagct gatcgtgaac 420

accatgtccg agctgcacct gatctccttc gaacaggaaa tcttcaacgt ggtgctgaag 480

accgtgtccg aaagcgccac tcagccccct actaaggtct acaacaacga cctgaccgct 540

tccctgatgg ttgctctgga cagcaacaac actatgcctt tcacccccgc tgctatgcgc 600

tccgagacac tcggcttcta cccatggaag cctaccatcc ccactccctg gcgctactac 660

ttccagtggg accgtaccct gatcccatcc cacactggca cttccggtac cccaactaac 720

atctaccacg gcactgaccc agacgacgtc cagttctaca caatcgaaaa cagcgtgcca 780

gtgcacctgc tgcgtactgg tgacgagttc gccaccggaa ctttcttctt cgactgtaag 840

ccttgtcgcc tgacccacac atggcagaca aaccgtgctc tgggactgcc ccccttcctg 900

aacagcctgc ctcaggctga aggtggtaca aacttcggtt acatcggcgt gcagcaggac 960

aagcgtcgcg gtgtgaccca gatgggtaac actaactaca tcaccgaagc cactatcatg 1020

cgccctgccg aagtgggtta cagcgctccc tactacagct tcgaagcttc cactcagggt 1080

ccattcaaga cacctatcgc tgccggtagg ggtggtgccc agacagacga gaaccaagcc 1140

gctgacggtg accctcgcta cgccttcggc cgccagcacg gccagaagac cactaccaca 1200

ggtgagaccc ctgagcgttt cacttacatc gcccaccaag acacaggccg ctaccctgag 1260

ggcgactgga tccagaacat caacttcaac ctccccgtga ccgacgacaa cgtgctgctg 1320

cctaccgacc ccatcggagg aaagaccggc atcaactaca caaacatctt caacacctac 1380

ggcccactca cagctctcaa caacgtgcca cccgtgtacc ctaacggcca gatctgggac 1440

aaggagttcg acaccgacct caagccacgc ctgcacgtga acgccccttt cgtttgccag 1500

aacaactgtc ctggccagct gttcgtgaag gtggccccta acctcactaa cgaatacgac 1560

cctgacgcta gcgctaacat gtcccgcatc gtgacctact ctgacttctg gtggaagggc 1620

aagctcgtgt tcaaggccaa gctccgcgct tcccatacct ggaaccctat ccagcaaatg 1680

tcaatcaacg ttgataacca attcaactac gttccctcca acatcggcgg tatgaagatc 1740

gtctacgaaa agagtcaact ggctccacgt aagctgtact aatatgctag cttagtacaa 1800

tttacgggga gccagc 1816

<210> 12

<211> 1818

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

taagcggccg catgggcgac ggtgccgtta tgtctgacgg tgctgtgcag cctgacggcg 60

gtcagccagc tgtgcgtaac gaacgcgcca ctggtagcgg caacggctcc ggtggaggtg 120

gcggcggcgg tagcggcggt gtgggcatca gcaccggcac cttcaacaac cagactgaat 180

tcaagttcct cgaaaacggc tgggttgaaa tcaccgccaa ctcctctcgt ctggtgcacc 240

tgaacatgcc agagagcgag aactaccgtc gtgtggtggt gaacaacctg gataagactg 300

ctgtgaacgg taacatggct ctggacgaca cccacgctca gatcgtgacc ccttggtccc 360

tggttgacgc taacgcctgg ggagtgtggt tcaaccctgg tgactggcag ctgatcgtga 420

acaccatgtc cgagctgcac ctgatctcct tcgaacagga aatcttcaac gtggtgctga 480

agaccgtgtc cgaaagcgcc actcagcccc ctactaaggt ctacaacaac gacctgaccg 540

cttccctgat ggttgctctg gacagcaaca acactatgcc tttcaccccc gctgctatgc 600

gctccgagac actcggcttc tacccatgga agcctaccat ccccactccc tggcgctact 660

acttccagtg ggaccgtacc ctgatcccat cccacactgg cacttccggt accccaacta 720

acatctacca cggcactgac ccagacgacg tccagttcta cacaatcgaa aacagcgtgc 780

cagtgcacct gctgcgtact ggtgacgagt tcgccaccgg aactttcttc ttcgactgta 840

agccttgtcg cctgacccac acatggcaga caaaccgtgc tctgggactg ccccccttcc 900

tgaacagcct gcctcaggct gaaggtggta caaacttcgg ttacatcggc gtgcagcagg 960

acaagcgtcg cggtgtgacc cagatgggta acactaacta catcaccgaa gccactatca 1020

tgcgccctgc cgaagtgggt tacagcgctc cctactacag cttcgaagct tccactcagg 1080

gtccattcaa gacacctatc gctgccggta ggggtggtgc ccagacagac gagaaccaag 1140

ccgctgacgg tgaccctcgc tacgccttcg gccgccagca cggccagaag accactacca 1200

caggtgagac ccctgagcgt ttcacttaca tcgcccacca agacacaggc cgctaccctg 1260

agggcgactg gatccagaac atcaacttca acctccccgt gaccgacgac aacgtgctgc 1320

tgcctaccga ccccatcgga ggaaagaccg gcatcaacta cacaaacatc ttcaacacct 1380

acggcccact cacagctctc aacaacgtgc cacccgtgta ccctaacggc cagatctggg 1440

acaaggagtt cgacaccgac ctcaagccac gcctgcacgt gaacgcccct ttcgtttgcc 1500

agaacaactg tcctggccag ctgttcgtga aggtggcccc taacctcact aacgaatacg 1560

accctgacgc tagcgctaac atgtcccgca tcgtgaccta ctctgacttc tggtggaagg 1620

gcaagctcgt gttcaaggcc aagctccgcg cttcccatac ctggaaccct atccagcaaa 1680

tgtcaatcaa cgttgataac caattcaact acgttccctc caacatcggc ggtatgaaga 1740

tcgtctacga aaagagtcaa ctggctccac gtaagctgta ctaatataag cttttagtac 1800

aatttacggg gagccagc 1818

Claims

1.一种基于犬瘟热病毒和犬细小病毒病的二联疫苗，其特征在于，所述二联疫苗包括犬瘟热病毒CDV-SN的原液和重组杆状病毒CPV-2b-VP2的原液；所述病毒的命名为犬瘟热病毒CDV-SN株，保藏号CGMCC NO.23205，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏时间2021年12月15日；

重组杆状病毒CPV-2b-VP2的制备方法：

(1)将序列为SEQ ID NO.1的VP2序列进行优化，得到优化后的VP2序列为SEQ ID NO.2，将优化后的VP2序列克隆到载体pUC57上获得重组载体；

(2)以步骤(1)获得重组载体为模板，利用VP2-P10F如SEQ ID NO.3和VP2-P10R如SEQID NO.4进行PCR扩增，获得片段1如SEQ ID NO.11所示；

(3)以步骤(1)获得重组载体为模板，利用VP2-PHF如SEQ ID NO.5和VP2-PHR如SEQ IDNO.6进行PCR扩增，获得片段2如SEQ ID NO.12所示；

重组转移载体转染Sf9细胞，获得细胞感染物为重组杆状病毒CPV-2b-VP2。

2.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述犬瘟热病毒CDV-SN原液和重组杆状病毒CPV-2b-VP2原液的体积比为1:1。

3.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述犬瘟热病毒CDV-SN原液经过灭活，所述重组杆状病毒CPV-2b-VP2原液经过灭活。

4.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述二联疫苗还包括佐剂。

5.根据权利要求4所述的二联疫苗，其特征在于，所述犬瘟热病毒CDV-SN原液和重组杆状病毒CPV-2b-VP2原液混合液与佐剂的体积比为9:1。

6.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，获得重组杆状病毒CPV-2b-VP2的原液的方法：按MOI为0.1～1.0接种重组杆状病毒CPV-2b-VP2病毒毒株到Sf9细胞中，收获细胞培养物为重组杆状病毒CPV-2b-VP2的原液。

7.权利要求2-6任一项所述的二联疫苗在制备治疗或预防感染犬瘟热病毒和犬细小病毒的疾病的药物中的应用。