CN112402599A - 一种犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗及其制备方法，涉及疫苗制备方法，该疫苗的有效成分包括灭活犬瘟热病毒CDV‑LG株和灭活犬细小病毒CPV‑W株，安全性试验表明，使用本发明的二联灭活疫苗接种犬未见任何不良反应发生；效力试验表明，单剂量接种疫苗后6个月内，可使犬免于犬瘟热、细小病毒病检验用强毒的攻击，获得保护。本发明的二联灭活疫苗采用犬瘟热病毒和犬细小病毒灭活工艺，可用于同时预防犬的犬瘟热、细小病毒病二种疾病，实现“一针防两病”，具有广阔的应用前景。

Description

一种犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及疫苗制备方法，具体涉及一种犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
犬瘟热是由副黏病毒科麻疹病毒属犬瘟热病毒引起的急性、热性、高度接触性传染病，其主要特征是以侵害黏膜系统为主，出现双相体温升高，伴有卡他性肺炎、胃肠炎，偶有神经症状，容易继发其他细菌病毒的混合感染和二次感染，死亡率可高达80％。带毒动物是最危险的传染源，通过眼及鼻分泌物、唾液、尿、粪便排出病毒，主要经消化道、呼吸道传染，近几年来，随着我国军犬、警犬、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅度增加，以及异地交流的增多，在我国犬中的发病率和致死率均有升高的趋势。
犬细小病毒病是由细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属的(Parvovirus)犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)感染导致的呈世界分布的高度接触性传染病，主要引起犬急性出血性肠炎或新生犬急性心肌炎，呈现较高的发病率和死亡率。CPV能感染不同年龄和不同品种的犬，但幼犬的易感性更高。发病犬的临床症状主要为体温升高、剧烈呕吐、肠炎和白细胞显著减少，康复犬仍可通过粪便长期向外排毒。犬细小病毒的高感染率及致死率对养犬业和经济动物的养殖造成了巨大的损失。
目前，犬瘟热、犬细小病毒病二联苗绝大部分为弱毒活疫苗，活疫苗一方面存在散毒风险，另一方面，对于可能存在母源抗体的幼犬的免疫，活疫苗的免疫可能会受其影响，在实际应用中，对于断奶前后的幼犬，采用活疫苗免疫难以把握免疫时机，母源抗体处于较高水平时免疫，活疫苗的免疫效果将大打折扣，母源抗体处于较低水平时免疫，可能在免疫前已发生潜在感染；灭活疫苗的免疫相比活疫苗，较少受到母源抗体的影响，因此，研制出安全、有效、保存期长、容易储存运输的犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗是控制幼犬犬瘟热、细小病毒病的有效方法，实现“一针防两病”，是行业和市场的迫切需求，具有广阔的市场前景。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗及其制备方法，本发明的二联灭活疫苗可用于同时预防犬瘟热、细小病毒病两种疾病。
为了达到上述目的，本发明采用的技术手段为：
首先，本发明提供了一种犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗，该疫苗的有效成分包括灭活犬瘟热病毒CDV-LG株和灭活犬细小病毒CPV-W株。
所述犬瘟热病毒CDV-LG株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存日期2019年06月12日，保藏编号CGMCC No.17989，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述犬细小病毒CPV-W株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存日期2019年06月12日，保藏编号CGMCC No.17990，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
第二，本发明还提供了上述犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)将犬瘟热病毒CDV-LG株接种于非洲绿猴肾细胞Vero细胞上进行病毒扩增培养，待细胞病变达到80％时收获病毒液；
(2)将犬细小病毒CPV-W株接种于猫肾细胞F81上进行病毒扩增培养，待细胞病变达到80％时收获病毒液；
(3)将步骤(1)、(2)收获的病毒液分别加入BEI溶液进行灭活，加入硫代硫酸钠溶液中和BEI，中止灭活，得到犬瘟热病毒CDV-LG株灭活病毒液和犬细小病毒CPV-W株灭活病毒液；将免疫佐剂与制备的两种灭活病毒液混合均匀，即得到犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗。
所述犬瘟热病毒CDV-LG株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存日期2019年06月12日，保藏编号CGMCC No.17989，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述犬细小病毒CPV-W株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存日期2019年06月12日，保藏编号CGMCC No.17990，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述BEI代表二乙烯亚胺。
步骤(1)所述非洲绿猴肾细胞Vero细胞采用微载体悬浮培养。
步骤(1)、(2)所述收获的病毒液，需要进行病毒含量测定，并且保证病毒含量≥107.0TCID50/ml。
步骤(1)所述收获的病毒液，需要进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，并且保证无菌检验、支原体检验和外源病毒检验均应为阴性。
步骤(1)所述收获病毒液，采用反复冻融的方法收获。
步骤(2)所述猫肾细胞F81采用微载体悬浮培养。
步骤(2)所述收获的病毒液，需要进行病毒含量测定，并且保证病毒含量≥107.0TCID50/ml。
步骤(2)所述收获的病毒液，需要进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，并且保证无菌检验、支原体检验和外源病毒检验均应为阴性。
步骤(3)所述加入BEI溶液进行灭活，加入后BEI的终浓度为0.002mol/L。
步骤(3)所述灭活，灭活温度为30℃，灭活时间为28小时。
步骤(3)所述灭活，灭活期间每2小时混匀1次。
步骤(3)所述加入硫代硫酸钠溶液中和BEI，加入的形式为向灭活体系中加入1mol/L硫代硫酸钠溶液，硫代硫酸钠实际加入的质量为体系中加入的BEI质量的10％。
步骤(3)所述免疫佐剂为MONTANIDETM GEL02佐剂。
步骤(3)所述将免疫佐剂与制备的两种灭活病毒液混合，其中，制备的两种灭活病毒液体积比为1:1，所述免疫佐剂的体积与两种病毒液体积之和的比例为1:9。
有益效果
本发明的二联灭活疫苗经安全性试验结果表明，经过单剂量、单剂量重复和10倍剂量接种中华田园犬，体温、食欲、精神状态及接种部位等均表现正常，无任何临床症状，剖检观察接种犬主要脏器均无病变，接种部位无明显炎症，证明犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗对犬安全；
效力试验表明，免疫接种1头份/只犬，免疫接种21天采血分离血清，检测犬瘟热病毒中和抗体和犬细小病毒HI抗体，均可达到1：64以上，采用犬瘟热病毒、细小病毒检验用强毒的攻击，100％达到了保护，有效预防犬瘟热、细小病毒的发生。免疫接种6个月，犬对检验用强毒犬瘟热病毒的保护率为100％，对犬细小病毒检验用强毒的保护率为100％。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗的制备
(1)将犬瘟热病毒CDV-LG株接种于非洲绿猴肾细胞Vero细胞上进行病毒扩增培养，待细胞病变达到80％时收获病毒液；
(2)将犬细小病毒CPV-W株接种于猫肾细胞F81上进行病毒扩增培养，待细胞病变达到80％时收获病毒液；
具体为：
生产用毒种制备
毒种繁殖
犬瘟热病毒CDV-LG株 将毒种用MEM培养基稀释，按MOI为0.1～0.3接种量吸附接种Vero细胞，37℃培养24小时，换维持液，于33℃培养，当细胞病变达80％以上时，冻融收毒，放-20℃以下保存。
犬细小病毒CPV-W株 将毒种用MEM培养基稀释，按MOI为0.03～0.05接种量同步接种F81细胞，于33℃培养，当细胞病变达80％以上时，冻融收毒，放-20℃以下保存。
毒种鉴定 将毒种按现行《中国兽药典》进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，应符合规定。符合以上标准的毒种作为生产用种子。
毒种保存 -20℃以下保存，可保存6个月。
毒种继代 应不超过5代。
制苗用细胞
选择生长良好的非洲绿猴肾传代细胞系Vero和F81细胞作为制苗材料。细胞应符合现行《中国兽药典》中规定的生产用细胞标准，Vero、F81细胞生产可使用代次控制在25代以内。
制苗毒液的制备
犬瘟热病毒CDV-LG株病毒液的制备
制苗用细胞复苏后用培养瓶静止培养或转瓶培养方式进行适当增殖后，采用微载体悬浮培养，病毒液的接种、培养与收获按下述方法进行：
犬瘟热病毒CDV-LG株病毒液制备 在含有5g/L微载体的DMEM培养基中接种Vero细胞(30-40cells/球)，设定pH、温度、溶氧值和搅拌转速分别为7.2，37℃，50％和55rpm，培养方式为批次培养+灌流培养组合方式，培养Vero细胞2-4d或细胞密度达到200cells/球以上时；按照MOI＝0.0001～0.001吸附接毒，调低温度(33℃)继续培养48-96h，即可获得高滴度病毒液(107.5-108.5TCID50/mL)，即为犬瘟热弱CDV-LG株病毒液。
犬细小病毒CPV-W株的制备 在含有5g/L微载体的DMEM培养基中接种F81细胞(40-50cells/球)，设定pH、温度、溶氧值和搅拌转速分别为7.2，37℃，50％和55rpm，培养方式为批次培养+灌流培养组合方式，培养F81细胞2-4d或细胞密度达到100cells/球以上时；按照MOI＝0.0001～0.001同步接毒，调低温度(33℃)继续培养48-96h，即可获得高滴度病毒液(108.0-108.5TCID50/mL)，即为犬细小病毒CPV-W株病毒液。
收获的各种病毒液放-20℃以下保存。
半成品检验
无菌检验 各种病毒液分别取样，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
病毒含量测定 CDV-LG株每毫升病毒含量应不低于107.0TCID50。CPV-W株每毫升病毒含量应不低于107.0TCID50。
(3)将步骤(1)、(2)收获的病毒液分别加入BEI溶液进行灭活，加入硫代硫酸钠溶液中和BEI，中止灭活，得到犬瘟热病毒CDV-LG株灭活病毒液和犬细小病毒CPV-W株灭活病毒液；将免疫佐剂与制备的两种灭活病毒液混合均匀，即得到犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗。
具体为：
灭活
将收获的CDV-LG株病毒液和CPV-W株病毒液分开灭活，将病毒液中加入终浓度为0.002mol/LBEI进行灭活，灭活温度为30℃，灭活时间为28h，灭活完后向灭活体系中加入1mol/L硫代硫酸钠溶液，硫代硫酸钠实际加入的质量为体系中加入的BEI质量的10％。
灭活检验
分别取灭活CDV-LG株病毒液和CPV-W株病毒液用无血清MEM 1:5(v:v)稀释后分别同步接种Vero细胞和F81细胞各2瓶，每瓶0.5ml，置37℃下培养，24小时后换维持液，继续培养3日后再传1代，观察有无细胞病变，未见细胞病变即判定灭活合格。
配苗分装
配苗
将收获的犬瘟热病毒CDV-LG株液和犬细小病毒CPV-W株病毒液按1：1(v:v)的比例混合均匀，按疫苗体积总量的10％vol加入MONTANIDETM GEL02佐剂，混匀乳化后即为疫苗液。
分装 以每头份1.0ml定量分装。
成品检验
性状 粉红色混悬液，摇匀后即成均匀混悬液。
装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
安全检验 用2-3月龄健康易感犬5只，各肌肉注射10头份疫苗，逐日观察14天，精神、食欲、体温与粪便性状均应正常。
效力检验
犬瘟热部分，下列方法任择其一
(1)血清学方法
用1-2月龄健康易感犬5只，每只肌肉注射疫苗1头份，21天后分别采血，分别用100TCID50的犬瘟热CDV-LG株培养物与各试验犬血清于37℃作用1小时，按现行《中国兽药典》附录测定血清中犬瘟热病毒中和抗体，中和抗体效价不低于1:40
(2)免疫攻毒法
用2～3月龄健康易感犬10只，5只各肌肉注射疫苗1头份，另5只作对照，接种21日，每只犬攻击犬瘟热强毒3ml，观察14日，对照犬应全部发病，免疫组应全部保护。
犬细小病毒部分，下列方法任择其一
血清学方法
按现行《中国兽药典》附录，用4单位血凝素分别与各免疫犬血清于37℃作用1小时，然后测定各免疫犬血清的HI效价，5/5犬抗犬细小病毒HI抗体应≥1:32。
免疫攻毒法
用2～3月龄健康易感犬10只，5只各肌肉注射疫苗1头份，另5只作对照，接种21日，每只犬各攻击犬细小病毒5ml，观察14日，对照犬应全部发病，免疫犬应全部保护。
实施例2犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗的安全性试验
取检验合格的犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗3批(实施例1方法制备)，接种健康易感犬，设单剂量组、单剂量重复组和超剂量(10倍)免疫组，同时设不接种疫苗犬作为对照。疫苗接种后，连续观察14天，观察犬的体温、食欲、精神状态、粪便等有无异常，试验结果表明，犬经单剂量、单剂量重复和超剂量接种后，各项临床指标均正常，未表现出任何临床症状，剖检观察接种比格犬主要脏器无病变，接种部位无明显炎症反应。说明犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗对犬安全。
实施例3犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗的效力试验
1、方法
(1)取犬瘟热病毒中和抗体、犬细小病毒血凝抑制抗体阴性的犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗3批(实施例1方法制备)，接种抗体阴性犬，每只1头份，同时设接种细胞培养液对照组，免疫后每3月采血、分离血清，用于中和抗体、血凝抑制抗体检测。
(2)犬接种3个月、6个月和9个月后，犬用检验用犬瘟热、细小病毒强毒分别进行攻毒接种，攻毒剂量为每种强毒均含100个LD50/只。每天观察攻毒犬体温、食欲、粪便、精神状态等临床症状。
2、结果
免疫接种21天后采血测定犬瘟热病毒中和抗体和犬细小病毒HI抗体，犬瘟热病毒中和抗体效价均在1:45以上，犬细小病毒HI抗体均在1:32以上。
免疫接种后3个月血清犬瘟热病毒中和抗体效价均≥1:40，血清犬细小病毒HI抗体效价均≥1:40，接种后6个月，犬血清犬瘟热病毒中和抗体效价≥1:32，犬血清犬细小病毒HI抗体效价均≥1:32，接种后9个月，90％犬血清犬瘟热病毒中和抗体效价≥1:32，90％犬血清犬细小病毒HI抗体效价≥1:32。
犬免疫接种3个月后，犬对犬瘟热病毒和细小病毒检验用强毒的保护率均为100％；犬免疫接种6个月后，犬对犬瘟热病毒、细小病毒检验用强毒的保护率均为100％。犬免疫接种9个月后，犬对犬瘟热病毒、细小病毒检验用强毒的保护率均为90％和90％。

Claims (10)

1.一种犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗，其特征在于：该疫苗的有效成分包括灭活犬瘟热病毒CDV-LG株和灭活犬细小病毒CPV-W株。
2.根据权利要求1所述的犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗，其特征在于：所述犬瘟热病毒CDV-LG株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.17989；所述犬细小病毒CPV-W株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.17990。
3.一种权利要求1-2任一项所述的犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将犬瘟热病毒CDV-LG株接种于采用微载体悬浮培养的非洲绿猴肾细胞Vero细胞上进行病毒扩增培养，待细胞病变达到80％时收获病毒液；
(2)将犬细小病毒CPV-W株接种于采用微载体悬浮培养的猫肾细胞F81上进行病毒扩增培养，待细胞病变达到80％时收获病毒液；
(3)将步骤(1)、(2)收获的病毒液分别加入BEI溶液进行灭活，加入硫代硫酸钠溶液中和BEI，中止灭活，得到犬瘟热病毒CDV-LG株灭活病毒液和犬细小病毒CPV-W株灭活病毒液；将免疫佐剂与制备的两种灭活病毒液混合均匀，即得到犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗。
4.根据权利要求3所述的犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述犬瘟热病毒CDV-LG株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存日期2019年06月12日，保藏编号CGMCC No.17989，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述犬细小病毒CPV-W株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存日期2019年06月12日，保藏编号CGMCC No.17990，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
5.根据权利要求3所述的犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(1)或步骤(2)所述非洲绿猴肾细胞Vero细胞或猫肾细胞F81采用微载体悬浮培养。
6.根据权利要求3所述的犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(1)或步骤(2)所述收获的病毒液，需要进行病毒含量测定，并且保证病毒含量≥107.0TCID50/ml；并且需要进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，并且保证无菌检验、支原体检验和外源病毒检验均应为阴性。
7.根据权利要求3所述的犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述加入BEI溶液进行灭活，加入后BEI的终浓度为0.002mol/L；步骤(3)所述加入硫代硫酸钠溶液中和BEI，加入的形式为向灭活体系中加入1mol/L硫代硫酸钠溶液，硫代硫酸钠实际加入的质量为体系中加入的BEI质量的10％。
8.根据权利要求3或7所述的犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述灭活，灭活温度为30℃，灭活时间为28小时。
9.根据权利要求3所述的犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述免疫佐剂为MONTANIDETM GEL02佐剂。
10.根据权利要求3或9所述的犬用犬瘟热、细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述将免疫佐剂与制备的两种灭活病毒液混合，其中，制备的两种灭活病毒液体积比为1:1，所述免疫佐剂的体积与两种病毒液体积之和的比例为1:9。
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