CN111643659A - 一种兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗及其制备方法，所述的抗原为重组兔出血症杆状病毒VP60蛋白，所述疫苗用于预防兔病毒性出血症。本发明的兔出血症病毒抗原生产采用全悬浮细胞培养技术，生产过程不使用强毒，制备的抗原血凝效价高、免疫原性好、生产工艺先进，可在GMP车间大规模生产；兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗制备程序更加简单，易于大规模生产和产品质量控制，生物安全性良好，产品质量更优，生产成本进一步降低，按照此方法制备的疫苗安全性更好，免疫攻毒保护率更高，免疫期和保存期也优于现有技术制备的同类疫苗，满足实际应用需求。

Description

一种兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及及动物疫苗技术领域，更具体为一种兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗及其制备方法。

背景技术

兔病毒性出血症(Rabbithemorrhagicdiease，RHD)是由兔出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseaseviurs，RHDV)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，俗称“兔瘟”。本病常呈暴发性流行，发病率和病死率极高，死亡率高达90％左右。兔多杀性巴氏杆菌病(Pasteurellosis)又称兔出血性败血症 (Hemorrhagicsepticaemia，HS)是由兔多杀性巴氏杆菌 (Pasteurellamultocida，Pm)引起的一种急性、败血性传染病。该病可以分为鼻炎型、肺炎型、中耳炎型等多种病型，各种病型病变不一致，但往往有两种及两种以上病型联合发生。我国分别将兔出血症病毒和巴氏杆菌列为二类病原微生物和三类病原微生物。

兔出血症是严重危害家兔健康养殖的主要疫病，当前的防控措施主要是疫苗免疫。国内虽然已有兔病毒性出血症灭活疫苗，其抗原成分是兔出血症组织毒。但是该疫苗存在有重大缺陷，主要表现在用于制备兔出血症病毒的动物个体差异较大，不利于疫苗抗原的规模化生产，质量控制难以进行，最重要的是疫苗制备过程容易造成强毒扩散，生物安全性差；以上缺陷严重地影响了疫苗质量，制约了企业生产效率。因此，需要提供一种新的技术方案给予解决。

发明内容

本发明的目的在于提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗及其制备方法，该兔出血症病毒抗原生产采用全悬浮细胞培养技术，生产过程不使用强毒，制备的抗原血凝效价高、免疫原性好、生产工艺先进，可在GMP车间大规模生产；兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗制备程序更加简单，易于大规模生产和产品质量控制，生物安全性良好，产品质量更优，生产成本进一步降低，按照此方法制备的疫苗安全性更好，免疫攻毒保护率更高，免疫期和保存期也优于现有技术制备的同类疫苗，满足实际应用需求。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗及其制备方法，包括：抗原和佐剂，其特征在于：所述的抗原为重组兔出血症杆状病毒VP60蛋白，所述疫苗用于预防兔病毒性出血症。

作为本发明的一种优选实施方式，所述兔出血症病毒杆状病毒载体为重组兔出血症病毒VP60杆状病毒BAC-VP60株，保藏编号为：CCTCC V 201833。

作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗是由重组兔出血症杆状病毒 VP60蛋白灭活后制备获得，抗原按每毫升疫苗中含灭活前的VP60蛋白血凝效价不低于1:256的标准进行配苗。

作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗内含有佐剂，且佐剂为氢氧化铝胶，所述佐剂与抗原的比例为1：9。

作为本发明的一种优选实施方式，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：兔病毒性出血症生产用毒种制备：将毒种稀释后接种健康易感染的家兔，无菌采集接种后24～72h濒死或刚死亡的且具有典型病理变化的肝脏组织经检验合格后，保存作为生产用毒种备用；

步骤2：兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液的制备：取生产用毒种进行细胞接种，无菌条件下称量采毒的肝脏组织，加适量的pH7.2磷酸盐缓冲液或生理盐水进行捣碎或研磨、过滤后得组织悬液，按组织悬液总量的 0.1％～0.5％加入甲醛溶液，充分混合后装入无菌容器中，密封后置37℃环境下灭活48h,得到兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液，并进行灭活检验、血凝价检验及病毒含量测定；

步骤3：兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗的配制：抗原含量按每毫升疫苗中含灭活前的VP60蛋白血凝效价不低于1:256的标准进行配苗，先将佐剂加入配苗乳化罐内，然后加入兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液， 1500～3000rpm搅拌5-10min，使其充分混合乳化，既得兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗。

作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤2中的接种细胞为Sf9细胞，所用培养基为昆虫细胞培养基，重组兔出血症病毒VP60杆状病毒接种量为培养基总量的1％，培养条件为温度27～28℃、pH值为6.0～6.2、溶氧(DO)50％～ 60％、搅拌转速50～70r/min；当病变细胞达85％以上即可收获细胞培养物。

作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤2获得兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液之后，需进行血凝效价测定，细胞培养物对1％人“O”型红细胞凝集效价应不低于1:512。

作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤2中，使用甲醛溶液对收获的细胞培养物进行灭活处理；并对灭活后的兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液进行灭活检验：灭活液接种细胞后无细胞病变，红细胞凝集效价测定无血凝性。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明兔出血症病毒抗原生产采用全悬浮细胞培养技术，生产过程不使用强毒，制备的抗原血凝效价高、免疫原性好、生产工艺先进，可在GMP车间大规模生产；兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗制备程序更加简单，易于大规模生产和产品质量控制，生物安全性良好，产品质量更优，生产成本进一步降低。按照此方法制备的疫苗安全性更好，免疫攻毒保护率更高，免疫期和保存期也优于现有技术制备的同类疫苗。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

毒种来源：1兔出血症病毒VP60杆状病毒,由江苏省农业科学院分离提供。

试验动物：2月龄以上对兔病毒性出血症易感健康兔由实验动物房提供。

主要试剂：甲醛溶液、氢氧化铝胶由江苏省农业科学院提供。

实施例1

重组杆状病毒VP60株半成品制备：

毒种繁殖将重组杆状病毒VP60株基础毒种接种生长良好的Sf9细胞，27 ℃培养72～96h，收获病毒液，连传2代，收获第4代病毒液，作为生产用毒种；生产用细胞制备[0107]1)细胞复苏将冻存的Sf9细胞从液氮中取出，立即投入 37℃温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解，将Sf9细胞悬液转移至离心管， 620r/min离心5min，弃上清液，用SF-SFM培养基重悬细胞，置于合适容量的三角瓶，27℃摇床培养，转速为100～105r/min；细胞扩大培养当Sf9细胞密度达到3.0×106个细胞/ml以上时，进行传代，细胞传代至一定数量，接种细胞培养罐，27℃继续培养；细胞接种、接毒及收获选择生长旺盛的Sf9细胞，接种42L细胞培养罐，接种密度为1.5×106～2.0×106个细胞/ml，27℃培养。待细胞密度达到1.5×106～2.0×106个细胞/ml时，接种重组杆状病毒VP60株， 27℃培养72～96h，收获细胞培养物；灭活向细胞培养物中加入2％的BEI溶液，使其终浓度为0.1％，37℃灭活48h；灭活结束后，向细胞培养物中添加 50％的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2％，搅拌1h终止灭活。

表1重组兔出血症病毒VP60杆状病毒细胞培养罐培养产物血凝效价(HA)结果。

培养基体积(升)	收毒时间(日)	HA(1og2)
			5	5	10
5	5	11
			6	4	10
7	5	11
			40	4	10
40	5	11
			50	5	11

表1

实施例2

疫苗制备将灭活检验合格的细胞培养物混合均匀，和灭菌的氢氧化铝胶按 9:1的比例进行配苗，再加入1％的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分搅拌。分装定量分装，加盖密封。分装时，应随时搅拌使其混合均匀。按上述方法连续生产3批疫苗。

疫苗的检验

1、性状静置后，上层为澄清液体，下层有少量沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

2、装量检查、无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均符合规定。

3、安全检验3批实验室制品分别颈部皮下免疫45日龄左右健康易感兔 2.0ml/只，连续观察10日，结果所有试验兔均健活，精神、饮食、体温均正常；接种部位均无肿胀、坏死现象，均未出现其它异常临床症状。

具体结果见表2、3、4。

表2

表3

表4

实施例3

兔出血症病毒杆状病毒载体的免疫期检验。

兔出血症病毒攻毒检验免疫后第3、4、5、6、7个月，分别取每批疫苗免疫兔6只，连同相同条件对照兔6只，分别颈部皮下注射兔出血症病毒皖阜株肝毒1.0ml，连续观察7日，记录死亡与保护的动物数量，对死亡兔进行剖检观察并取肝脏进行人“O”型红细胞凝集试验。结果显示，3批疫苗免疫后免疫兔以兔出血症病毒进行攻毒，免疫兔均全部健活，同类产品免疫兔在免疫后7个月死亡1只，对照兔全部死亡(表5)，死亡兔出现兔病毒性出血症典型的病理变化，对死亡兔肝脏悬液做人“O”型红细胞凝集试验，均为阳性。

表5疫苗免疫持续期试验结果：

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗，包括：抗原和佐剂，其特征在于：所述的抗原为重组兔出血症杆状病毒VP60蛋白，所述疫苗用于预防兔病毒性出血症。

2.根据权利要求1所述一种兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗，其特征在于：所述兔出血症病毒杆状病毒载体为重组兔出血症病毒VP60杆状病毒BAC-VP60株，保藏编号为：CCTCC V201833。

3.根据权利要求1所述一种兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗，其特征在于：所述疫苗是由重组兔出血症杆状病毒VP60蛋白灭活后制备获得，抗原按每毫升疫苗中含灭活前的VP60蛋白血凝效价不低于1:256的标准进行配苗。

4.根据权利要求1所述一种兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗，其特征在于：所述疫苗内含有佐剂，且佐剂为氢氧化铝胶，所述佐剂与抗原的比例为1：9。

5.根据权利要求1所述一种兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：兔病毒性出血症生产用毒种制备：将毒种稀释后接种健康易感染的家兔，无菌采集接种后24 ~ 72h濒死或刚死亡的且具有典型病理变化的肝脏组织经检验合格后，保存作为生产用毒种备用；

步骤2：兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液的制备：取生产用毒种进行细胞接种，无菌条件下称量采毒的肝脏组织，加适量的pH7.2磷酸盐缓冲液或生理盐水进行捣碎或研磨、过滤后得组织悬液，按组织悬液总量的0.1%~0.5%加入甲醛溶液，充分混合后装入无菌容器中，密封后置37°C环境下灭活48h,得到兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液，并进行灭活检验、血凝价检验及病毒含量测定；

步骤3：兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗的配制：抗原含量按每毫升疫苗中含灭活前的VP60蛋白血凝效价不低于1:256的标准进行配苗，先将佐剂加入配苗乳化罐内，然后加入兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液，1500~3000rpm搅拌5-10min，使其充分混合乳化，既得兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗。

6.根据权利要求5所述一种兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤2中的接种细胞为Sf9细胞，所用培养基为昆虫细胞培养基，重组兔出血症病毒VP60杆状病毒接种量为培养基总量的1%，培养条件为温度27～28°C、pH值为6.0～6.2、溶氧(DO)50%～60%、搅拌转速50～70r/min；当病变细胞达85%以上即可收获细胞培养物。

7.根据权利要求5所述一种兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤2获得兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液之后，需进行血凝效价测定，细胞培养物对1%人“O”型红细胞凝集效价应不低于1:512。

8.根据权利要求5所述一种兔出血症病毒杆状病毒载体疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤2中，使用甲醛溶液对收获的细胞培养物进行灭活处理；并对灭活后的兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液进行灭活检验：灭活液接种细胞后无细胞病变，红细胞凝集效价测定无血凝性。