KR900007262B1 - 신(腎)증후성 출혈열 비루스 항원의 제조방법, 및 그 항원을 함유하는 백신 및 신증후성 출혈열 진단제 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

신(腎)증후성 출혈열 비루스 항원의 제조방법, 및 그 항원을 함유하는 백신 및 신증후성 출혈열 진단제

본 발명은, 신(腎)증후성 출혈열 비루스 항원의 제조방법, 및 그 제조방법에 의해서 얻어지는 항원을 함유하는 백신 및 신증후성 출혈열 진단제에 관한 것이다. 상세히는, 신증후성 출혈열 백신의 유효성분으로서, 또 신중후성 출혈열 진단용 및 신증후성 출혈열 비루스 항체 제작용 항원으로서 유용한 신증후성 출혈열 비루스 항원의 제조방법을 제공하는 것이다.

특히, 신증후성 출혈열 백신을, 생물위험의 관점에서 안전하게, 그리고 생산수율이 안정된 제조공정하에서 제조하는 방법 및 안전하고도 유효하고, 그리고 균질한 신중후성 출혈열 백신을 제공하는 것이다.

[신증후성 출혈열의 정의] : 신증후성 출혈열[hemorrhagic fever with renal syndorome(이하「HFRS」라고 약칭한다)]은, 그 병원체의 보유 동물인 쥐나 래트 등 설치류(Rodent)가 매개하는 HFRS비루스(이하「HFRSV」라고 약칭한다)의 감염이 원인이 되어 발생하는 심각한 전염병이여, 그 감염은 HFRSV보유 설치류의 배설물 또는 그와 같은 배설물로 심하게 오염된 물질로부터 생기는 에어로졸 또는 먼지를 흡입하므로서 감염된다고 생각된다. HFRS의 주된 유행지역은 일본을 포함하는 극동아시아제국가로부터, 서쪽으로는 발칸제국이나 스칸디나비아 제국 등에 걸친 유라시아대륙 북부의 폭넓은 벨트지역, 또한, 알래스카, 콜롬비아 등, 세계에 널리 분포하고 있다. HFRS는, 금세기초부터 세계 각지에서 지방병적인 발생이 알려져 있었으므로, 유행지마다 각양의 명칭, 예를들면, 구 만주 및 중국에서는 유행성 출혈열(epidemic hemorrhagic fever : EHF), 한국에서는 한국형 출혈열(Korean hemorrhagic fever : KHF), 극동시베리아에서는 신중신염 (epidemic hemorrhagic nephrosonephritis . HNN) 내지는 신증후성 출혈열(hemorrhagic fever with renal syndorome), 또 북구에서는 유행성 신증(nephropathia epidemia : NE)등으로 불리고 있다.

그리고 1982년. 이들 전염병에 관한 세계보건기구(WHO)의 국제회의가 개최되어, 그와같은 역학적으로 관련된 비루스에 기인하는 질환을 신증후성 출혈열(hemorrhagic fever with renal sylldorome : HFRS)로 통일하여 호칭하는 제안이 나왔다.(Bulletin of WHO,61,269∼275 1983).

따라서, 본 발명에서 사용되고 있는 용어 「HFRS」는, WHO의 상기 제안에 의거하는 뜻을 갖는다.

[HFRS백신 등의 필요성] : HFRS의 역학적 특징은 증상이나 치사율이 유행지마다 크게 상이하고 다양하다는데 있으며, 한편, 그 임상상의 공통적인 주된 특징으로서, 출혈 경향 및 신장해를 수반하는 고열이 알려져 있다. 예를들어, 한국형 출혈열의 경우, HFRSV감염후 2∼4주간의 잠복기를 거쳐, 돌연, 오한 전율을 수반하는 39℃ 전후의 밭열이 생기고, 그것이 3∼7일(평균 5일)간 지속한다. 그리고 경증예에서는, 3일정도에서 돌연 해열되나, 그 유열기간중, 환자는 심한 전신권태, 쇠약, 심한 병세, 빈발하는 심한 두통, 상복부통, 요배골 등의 근육통 등을 호소하며, 안면 홍조, 결막의 충혈, 또한 광범위한 피부에 점 모양의 출혈이 나타나고, 식욕부진, 오심, 구토, 설사 등의 위장 증상이 나타난다.

그와같은 증상은 3∼4주간 후에 대체로 치유된다. 이에 대하여, 중증예에서는 제5∼7일만에 갑자기 해열되고, 그 직후부터 급격한 혈압저하 내지는 쇼크증상에 빠지며, 두통의 경감을 보이면서 의식 장해가 출현해서 사망하는 일이 많고, 치사율이 15%나 달한다. 그리고, 전 환자수에 대한 경증예의 비율은 약 70%, 중증예는 약 30%이다. 이와같이 HFRS는 매우 무서운 전염병일 뿐아니라, HFRSV에 대한 구체적인 예방 및 치료수단은 아직 확립되지 않았으며, 더우기 현실적으로는 유행지가 해마다 확대일로에 있고, 또, 세계각지의 항만지대에서 쥐의 유행 소굴이 발견되고 있어, 독이 강한 HFRSV를 보유하는 쥐의 광역 이동에 의한 HFRS의 세계적 유행마저 염려되고 있다. 또한, 동물 실험시설에서의 실험용 래트로부터의 감염예가 근 10수년 동안, 산발적으로 보고되고 있으므로, HFRS는 일반인 뿐만 아니라, 설치류를 사용해서 동물시험을 하는 연구자들에게도 빈틈없는 감염예방 대책을 요하는 전염병이다. 따라서, HFRS예방을 위한 백신, HFRS치료용의 면역글로불린, 및 고품질의 HFRS진단제의 실용화는 급선무의 과제이다.

[HFRS항원의 안전한 제법의 필요성] : 상술한 바와같이, HFRS가 독하고 치명적이라는 것은, 그 병원체인 HFRSV의 병원성이 매우 높고 또한 위험하다는데 기인하고 있다.

고로, HFRSV의 기초연구에는 생물위험 대책의 관점에서 고도의 격리무균시설, 및 세심한 숙달된 지식, 기술 및 조작을 요하기 때문에, HFRSV를 사용하는 시험연구는 그와 같은 제약을 만족시킬 수 있는 고도의 설비와 인재를 가지는 국한된 연구기관에서만 행하여지고 있다. 따라서, HFRS백신이나 HFRS진단제 등을 대량 생산하여, HFRS의 방역 대책에 기여하기 위해서는, 고순도의 HFRS비루스 항원을 안전하고 또 대량으로 제조하기 위한 제조방법의 확립이 필요하다.

[HFRSV항원 제조상의 기타 문제점] : 상기에서 명백한 바와같이, HFRS는 유행지역에서 뿐만 아니라, 세계적 규모로 신중하게 대처해야 할 전염병인고로, 세계각지, 특히 일본, 한국, 중국, 북구 제국가, WHO등에서 연구와 조사가 정력적으로 진행되고 있다. 그 현상 내용과 과제에 대해서는 문헌[Progress in Medical Virology,26,96~113(1982)[S.Karger발행] ; 및 비루스,36,(2),233~251(1986)등에서 상세히 층설되고 있다. HFRSV는, 엔벨롭을 가지는 직경 80∼115mm의 구형 RNA형 비루스이며, 그 비루스의 증식가능한 감수성 숙주세포로서는, 생쥐나 래트 등 설치류의 뇌, 페, 신장, 비장, 간장 등의 여러 장기, 마크로파지, 및 Vero E6세포나 A-519세포 등의 배양세포가 알려져 있다.

또, HFRSV는 4∼25℃에서는 비교적 장시간 감염성이 지속되고, 열에 대해서 상당히 안정되어 있다고 보고되고 있다. 또한 HFRSV의 항원성은, 교차면역 점착혈구 응집시험에 의하여 그 유래 숙주인 쥐의 종류에 따라, 대략 4개의 항원형으로 분류되고 있다. 그러나, 상술한 숙주세포 감수성, 온도 안정성, 항원성, 및 병원성은 HFRSV주의 차이에 의하여, 상당히 다르다. 예를들면, 생쥐 뇌속에서의 증식이 양호한 쥐와 양호하지 않는 쥐가 존재한다는 것 : HFRSV주간의 항원성 차이는 교차면역 점착혈구 응집시험에 의한 값에 20∼2,000이나 되는 차가 있다는 것 ; 집 쥐(Rattus)로부터 분리된 HFRSV주에 비하여 들 쥐(Apodemus)로부터 분리된 HFRSV주의 항원성은 넓고 또한 병원성이 높다는 것(Joumal of Infectious Diseases,150,889∼894,1984) ; 극동의 HFRS에 비하여 북구나 동구의 것은 경증이라는 것등을 들수 있다. 한편, 그와같은 현상하에서, 이미 HFRSV항원의 개발에 관한 보고가 다소나마 있으나, 아직 실용화되지는 못하였다. 예를들어 생쥐 뇌를 배양숙주로서 사용하는 HFRSV진단용 항원의 제작이 보고되고 있다(Journal of Infectious Diseases,150,895 ∼ 898,1984).

이 방법에서는, 코발트-60의

선 조사에 의한 HFRSV불활화법을 채용하고 있으나, 이

선 조사에 의한 방법은 대량의 HFRSV의 불활화 공정에는 부적당하며, 또한 HFRSV항원이 사탕-아세톤 추출에 의한 조 정제물에 불과하고, 고도 정제가 달성되지 못하였기 때문에, 생쥐 뇌유래 항원에 의한 비특이적 반응의 출현이 예측되므로, 고품질의 진단제로서 실용적이 아니다. 또, 사람 태아 페 2배체세포(2BS세포주)를 배양 숙주로서 사용하는 HFRSV항원의 제작이 보고되고 있으나(Chinese Journal of Microbiology and Immunology,4,124∼127,1984), 이 방법에 의하면, 비루스 입자의 생산량이 배양액 1ml당 10만개 이하이며, 생산수율이 낮기 때문에, 불활화 항원의 대량생산 관점에서는 실용적이 못된다. 또한, 생쥐 뇌를 배양숙주로서 사용하는 HFRSV백신의 시험제작이 보고되고 있다(Chinese Journal of Virology,1,25∼29,1985).

이에 의하면, 생쥐 뇌유제를 저속 원심한 후, 그 상층액을 채취하여, 얻어진 HFRSV항원을 포르말린 또는 열로 불활화하고, 이것을 백신으로 하여 생쥐에 접종하여, 그와 같은 피접종 생쥐에 있어서 HFRSV항체가 생산되었다는 보고가 있기는 하다.

그러나, 생쥐 뇌유제중의 HFRSV는 4℃의 저온에서 조차도 안정하지 못하고, 그 감염치가 시간당 오더 단위로 실활하고 저하한다는 사실에서 HFRSV의 고도 정제가 달성되지 못하였고, 또한 백신의 감염 방어 효과가 HFRSV강 독성주의 직접 공격법 등에 의하여 확인되지 않았으므로, 백신의 필수요건인 안정성, 유효성, 및 균질성에 관해서는 모두 불충분하며, 아직 예비실험의 영역에 머물고 있으며, 실용화에는 아직 요원한 단계에 있다.

이상의 현상에 감하여, HFRSV항원을 효율적으로 대량 제조하기 위해서는, 전술한 HFRSV주간의 불규칙한 데이터를 충분히 음미하고 비교 검토하여, 안정된 고 생산수율을 확보하기 위한 제조 제반공정의 확립이 필요하다. 이것을 달성하기 위하여는, 대량생산에 적합하며, 또한 주간에서 교차하는 폭넓은 공통의 항원성을 가지는 HFRSV주의 취득과 함께, 그 주의 대량 배양이 가능한 숙주세포의 선정 ; 제조 공정하에서의 HFRSV의 안정화 ; 나아가서는 HFRSV항원의 고도 정제의 달성등 어려운 문제를 해결할 필요가 있다.

본 발명자는, 전술한 종래기술의 문제점을 극복하기 위하여, 예의 연구를 거듭한 결과, 안전. 유효하며 또한 균질한 HFRSV항원을 얻음과 동시에, 고순도의 그 항원을 생물위험의 관점에서 안전하며, 또한 경제성의 관점에서 안정되고 또 높은 생산수율로 제조하는 방법을 발견하였다. 즉, 생쥐 뇌속에서 HFRSV의 계대배양을 반복 시행하므로써, 생쥐 뇌세포 순화 HFRSV주의 제작과 취득에 성공하였다. 그리고, 놀랍게도, 그와같은 생쥐 뇌세포 순화주는, 종래의 비루스주에 비하여 생쥐 뇌속에서 매우 양호하게 증식시키기 위해서 이것을 사용하면 HFRSV항원을 높은 생산 수량으로서 얻을 수가 있다는 것, 그리고 이 항원이 타 HFRSV주와의 사이에서 교차하는 폭넓은 공통 항원을 유지하고 있음을 발견하였다. 또, HFRSV항원의 채취 공정인 생쥐의 뇌유제 조제시에, HFRSV의 안정화제로서 효소 저해제를 첨가 혼합하므로서, HFRSV를 실활시키지 않고, 고농도로 채취 가능함을 발견하였다. 또한, 생물위험 대책의 관점에서 HFRSV의 항원성 내지는 면역원성을 손상함이 없이, 정제공정전의 뇌유제 상층액 조원액 단계에서,HFRSV를 알데히드로서 불활화하므로서 그 감염성을 소실시켜, 이후의 제조 제반공정의 안정성을 확보할 수 있다는 것도 발견하였다. 본 발명은 이들 지식에 의거하여 완성된 것이다.

즉, 본 발명에 의하면, HFRSV의 생쥐 뇌세포 순화주를 생쥐 뇌속에서 배양한후, 그 생쥐 뇌를 채취해서, 여기에 효소 저해제 함유용액을 생쥐 뇌 : 효소 저해제 함유용액 중량비가 약 5 : 95∼약 30 : 70이 되도록 첨가하여 그 생귀 뇌를 파쇄 현탁하여 약 5∼약 30w/w% 뇌유제를 조제하고, 이어서, 뇌유제를 원심분리해서 상층액을 채취하여, 그 상층액에 HFRSV불활화제 용액을 첨가 혼합하여 HFRSV를 불활화한 다음, 얻어지는 혼합물로부터 HFRSV항원을 정제함을 특징으로 하는 HFRSV항원의 제조방법이 제공된다.

또, 본 발명에 의하면, 상기 제조방법에 의해서 얻어지는 HFRSV항원을, 면역효과가 있는 양으로 함유하는 백신이 제공된다.

또한, 본 발명에 의하면, 상기 제조방법에 의해서 얻어지는 HFRSV항원을, 항원 항체 반응이 검출되는양만큼 함유하는 진단제가 제공된다.

이하, 본 발명에 관해서 상술한다.

(I) HFRSV의 생쥐 뇌세포순화주의 제작 :

공지의 HFRSV분리용 재료, 즉, HFRS발열환자의 혈액, HFRSV를 보유하는 래트 및 생쥐 등의 설치류의 폐, 취장 및 이식 가능성 종양 등의 조직으로부터, 야생의 HFRSV주를 분리할 수 있다. 이경우, 설치류로서는 HFRSV의 지속감염이 성립되기 쉽고 비교적 대량의 HFRSV를 보유하므로, HFRSV의 분리수율을 높히기 위하여는, 높은 항체가를 나타내는 설치류의 성숙 개체 유래의 상술 조직 사용이 바람직하다. 상기 분리용 재료의 조직 유제를 공지의 감수성 숙주세포, 즉, Vero E6세포, A-549세포 등에 접종시킨 다음, 약 2∼약 4주간 간격으로 그 세포를 계대하므로서 HFRSV주를 분리할 수 있다. 분리된 HFRSV주는 공지의 면역학적 동정법, 예를들면, HFRS환자 혈청을 사용하는 형광 항체법, ELISA등에 의하여 동정된다. 이어서 HFRSV임이 동정 및 확인된 HFRSV주의 배양액을 생쥐 뇌속에 생쥐 당 약 5∼약 3μl씩 접종한다.

그리고, 상기 야생주 대신에 이미 분리된 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉숀(ATCC)에 기탁되어 있는 Hantaan주(ATCC VR-938)등을 사용할 수도 있다. 피접종 생쥐는 생물위험 안전 캐비넷안에서 사육 관찰하여, HFRSV를 배양한다. 접종으로부터 약 3∼약 21일째에 생쥐 심장부를 절개하여 방혈하고, 이어서, 생쥐 두부로부터 무균적으로 뇌를 적출한다. 이 뇌를 평량한 다음, 여기에 효소 저해제 함유용액(이하, 왕왕「비루스 희석액」이라 칭한다)을 생쥐 뇌 : 효소 저해제 함유용액 중량비가 약 5 : 95∼약 30 : 70이 되도록 가하고, 공지의 수단, 즉, 초음파 발생장치, 균등기 등에 의하여, 뇌조직을 파쇄 또는 마쇄하여 현탁질로 만들고, 약 5∼약 30w/w% 뇌유제를 조제한다. 이어서, 이것을 저속원심하고, 그 상층액을 채취하며, 그 상층액을 비루스 희석액으로 1∼약 1,000배로 희석한후, 다음 생쥐 뇌속에 접종하는데 사용한다. 이와같이 하여 비루스의 접종, 배양 및 분리를 반복하므로서 HFRSV의 계대배양을 반복하고, HFRSV를 생쥐 뇌세포에 순화시킨다.

이경우, HFRSV의 배양 숙주로서 사용하는 생쥐에는, 그 계동, 성별, 년령에 관하여 특정 제한은 없으나, 건강한 어미 생쥐로부터 출생한 생후 24시간이내에서 약 10일령까지의 건강한 생쥐를 사용하는 것이 바람직하다. 또, 생쥐 뇌에 의한 HFRSV항원의 대량생산에 적합한 HFRSV의 생쥐 뇌세포 순화주의 제작은, 생쥐 뇌내에서의 HFRSV를 적어도 3대 이상, 바람직하게는 10대이상, 계대배양하므로서 달성된다. 이경우, 계대수의 증가에 따라, HFRSV의 생쥐 병원성이 높아지는 경향을 볼수가 있다. 즉, 계대에 의한 순화가 진행됨에 따라서, 피접종 생쥐는 사육게이지내에서 1개소에 모이지 않고 각 개체가 분산하는 경향을 나타내며, 과민 입모, 보해곤난, 발육불량 등의 임상증상이 점차로 현저하게 되어, 그와같은 발증을 거쳐, 피접종 생쥐의 사망율은 상승한다. 그리고, 상기 증상은 후술(II)에서 기재되는 HFRSV항원의 제조에서, 사망전의 발증 생쥐를 선별 채취하기 위한 중요한 마커가될 수 있다.

뇌유제중의 HFRSV는 불안정하며, 실활해서 그 감염치가 급속히 저하하므로, 뇌유제의 조제에 사용하는 상술한 비루스 희석액은, 비루스 안정와제로서 효소 저해제를 함유하고 있다. 그 용매로서는, 공지의 생리적 염 용액, 즉, 인산염 완충액, 인산염 완충염화나트륨액 등이 사용된다. 또, 효소 저해제로서는, 공지 또는 시판의 것, 예를들면, EDTA따위의 킬레이트제, 염기성 아미노산, SH기 저해시약, 유기산염, 피로인산염, 베스타핀, 카제인, 페닐메틸술포닐플루오라이드, 페프스타틴, 아프로티닌, 류페프틴, 마크로글로불린, 포스포라미돈 등이 사용된다.

상기 용액중의 효소 저해제 농도는 사용하는 효소 저해제의 종류나 피 저해효소의 최적 pH따위에 따라서 다르고 한정적은 아니나, 일반적으로 예컨대 EDTA와 같은 킬레이트제나 유기산염 등 비교적 저분자의 효소 저해제의 경우는 약 0.1∼100mM, 카제인이나 마크로글로불린 따위 고분자 물질의 경우는 시판품에 첨부된 사용설명서 또는 카타로그에 준하여 사용하나, 일반적으로는 약 1∼1,000㎍/ml의 농도로 사용할 수있다.

(II) HFRSV제조용 주의 배양에 의한 HFRSV항원의 생산 :

상기(I)에서 제작한 생쥐 뇌세포 순화주를 HFRSV항원의 제조용주로서 사용한다. 우선, 제조용주의 뇌유제를 상기(I)와 같은 방법으로 조제하고 그 저속원심 상층액을 채취하여, 시드 비루스액으로 한다. 그 시드 비루스액을, 다시 비루스 희석액으로 약 50∼약 l0,000배로 희석한 다음, 이것을 생쥐 뇌속에 생쥐당 약 5∼약 30μl씩 접종한다. 피접종 생쥐는 생물위험 안전 캐비넷내에서 사육 관찰하여, HFRSV제조용 주를 배양한다. 접종으로부터 약 3∼약 21일째에 과민 입모, 보행곤난, 발육불량 등의 임상증상을 명료하게 나타낸 생쥐를 선별 채취하고, 그와같은 생쥐의 심장부를 절개하여 방혈한 다음, 그 생쥐 두부로부터 뇌를 채취한다. 이 뇌를 평량한 다음, 약 5∼약 30w/w% 뇌유제가 되도록 비루스 희석액을 가하고, 공지의 수단, 즉, 초음파 발생장치, 균등기 등에 의하여, 뇌조직을 파쇄 또는 마쇄하여 현탁질로 하고, 뇌유제를 조제한다. 이어서, 이것을 저속원심시킨 다음, 그 상층액을 채취하여, 하기(III)에 기재한 HFRSV항원 조원액의 조제에 사용한다. 또한, HFRSV제조용 주의 배양 숙주로서 사용하는 생쥐에는, 그 계통, 성멸 및 년령에 관해서 특정 제한은 없으나, 건강한 어미 생쥐로부터 출생한 생후 24시간 이내로부터 약 10일령까지의 건강한 생쥐를 사용하는 것이 바람직하다. 또, 뇌유제중의 HFRSV는 불안정하며, 실활하여 그 감염가가 급속히 저하하므로, 뇌 유제의 조제에 사용하는 상술한 바의 비루스 희석액으로서는, 효소 저해제를 안정화제로서 함유하는 용액을 사용한다. 그리고, 그와같은 희석액의 용매로서는, 공지의 생리적염 용액, 예를들면, 인산염 완충액, 인산염 완충염화나트륨액 등이 사용된다. 또, 효소 저해제로서, 공지 또는 시판의 것, 예를들면, EDTA따위 킬레이트제, 염기성 아미노산, SH기 저해시약, 유기산염, 피로인산염, 베스타틴, 카제인, 페닐메틸술포닐플루오라이드, 페프스타틴, 아프로티닌, 류페프린, 마크로글로불린, 포스포라미돈 등이 사용된다. 또, 상기 이외의 공지의 효소 저해제에 대해서도, 본 발명에 관한 최종제품의 품질에 지장을 주는 독성을 가지지 않는한 사용가능하다. 사용하는 비루스 희석액의 효소 저해제 농도에 관해서는 전기(I)에서 설명한 바와같다.

(Ⅲ) HFRSV항원의 뇌유제 조원액의 조제와 불활화 :

조원액은, 상술한 HFRSV항원 뇌유제중에 함유되는 생쥐 뇌유래의 불순물질을 분리제거하여 조제한다. 그와 같은 불순물질의 분리와 제거에는, 공지의 방법, 즉 황산암모늄, 에탄올, 리바놀 등을 사용하는 침전법, 인산칼슘겔, 프로타민, 아가로스겔 등을 사용하는 흡착법 등과, 원심법이나 여과법을 조합하여서 사용할 수 있다. 이어서, 조원액조제후, 즉시 HFRSV의 불활화를 행한다. HFRSV의 불활화법으로서는, 공지의 상법, 즉, 포름알데히드, 글루타르디알데히드, 에틸렌옥사이드, β-프로피오락톤, 카르보디이미드

선, 자외선 등에 의한 불활화법의 사용이 가능하다. 그러나, 이들중, 독이 강한 HFRSV의 감염성을 완전히 실활시키고, 이후의 제조공정의 안정성을 확보함과 동시에, HFRSV본래의 항원성과 그 높은 면역원성을 함께 가지는 제품을 얻기 위해서는, 알데히드의 사용이 바람직하다. 불활화제의 사용량은 불활화제의 종류에 따라 다르기 때문에 한정적은 아니나, 예로서, 시판의 포르말린(37w/v% 포픔알데히드 수용액)을 사용하는 경우, 조원액 1ℓ에 대하여 그 포르말린을 약 0.1∼약 1ml첨가 혼합한다. 첨가 혼합후, 얻어지는 혼합물은 약 4∼약 37℃에서 약 5∼약 90일간 보존한다. 그리고, 포르말린의 첨가 농도, 불활화 보존의 온도와 일수의 3요소는 각각, 상술한 범위내에서 여러가지로 설정 가능하며, 또, 이들의 각 요소는 각종 설정조건을 상호 조합시켜서 채용할 수도 있다.

예를들면, (a) 조원액 1ℓ에 대해서 포르말린을 0.3ml첨가 혼합하고, 20℃에서 약 3일간 보존한후, 다시, 포르말린 0.15ml를 추가해서 첨가 혼합하고, 이후는 5℃에서 약 15∼약 25일간 보존하고 불활화를 행한다 : (b) 조원액 1ℓ에 대하여 포르말린을 0.4ml 첨가 혼합하고, 10℃에서 약20∼약45일간 보존하여 불활화를 행한다 : (c) 조원액 1ℓ에 대하여 포르말린 0.25ml첨가 혼합하고, 4℃에서 약 25∼약 45일간 보존하여 불활화를 행하는 등, 각종 불활화 방식을 채용할 수가 있다. 또, 불활화 개시와 동시에, 이와 평행해서, 불활화의 진행상황을 추적하기 위하여, 불활화 보존중의 포르말린 첨가 혼합 조원액으로부터 그 일부를 1∼7일마다 샘플링하여, 샘플링한 피검체의 각각에 대해서, 공지의 생리적 염용액을 외액으로 하는 투석에 의하여 포름알데히드를 제거한후,HFRSV감염가를 측정한다. 이어서, 얻어진 각 측정치를 플롯하여 불활화 곡선을 작성하고, 그 원액중의 HFRSV생잔량의 경시적 변화를 추적한다. 그와같은 불활화 곡선의 작성은, 불활화 진행상황의 파악에 의하여, HFRSV의 완전한 불활화 달성과 그 시기를 확인하고, 이후의 제조공정 및 최종 제품에 관한 안전성을 확보하는데 매우 중요하다. 그리고 HFRSV의 감염치는, 공지의 상법으로 측정을 할수 있다. 예로서 HFRSV감수성 숙주세포인 Vero E6세포주나 A-549세포주 등을 플레이트내에 미리 배양하여 두고, 여기에 세포배양용 유지액으로 단계 희석한 투석완료 피검체를 접종한후, 메틸셀룰로오즈 함유의 유지배지를 첨가하여, 37℃탄산가스 보온기내에서 4∼7일간 배양한다. 이어서, HFRSV단일클론 항체를 사용하는 형광항체법에 의하여 포커스(세포 증식소)를 계수하고, 그 계수치를 감염가로 한다. 또, 그 불활화는 통상, 상기 불활화 곡선에서의 HFRSV감염가가 0이된 보존일수의 3∼5배의 시기로서 완료한다. 예를들면, 불활화 개시일로부터 10일째에 샘플링한 피검체에 대해서 HFRSV감염가가 0을 표시하는 경우에는, 불활화 개시일로부터 30∼50일째에 불활화를 완료한다.

불활화 완료후의 조원액에 관해서는, 다시, 그 일부를 샘플링하여, 이것을 불활화 확인시험에 사용한다. 불활화 확인시험은, 불활화 완료의 조원액에서의 HFRSV의 생잔을 부정하기 위하여 실시한다. 그 시험은 불활화 곡선 작성시에 사용한 HFRSV감염가의 측정과 같은 방법으로 행할 수가 있다.

한편, 피검체를 접종한 HFRSV감수성 숙주세포의 세포배양에 관해서는, 접종일로부러 약 7∼14일째에 그 일부를 사용해서 상술한 형광항체법 등에 의하여 비루스 항원 양성세포가 없음을 확인한다. 다시, 접종일로부터 약 5∼10일째에 그 세포배양의 일부를 계대배양하고, 계대 개시로부터 약 7∼14일째에 그 계대된 세포배양의 일부에 관해서 상기와 같이 비루스 항원 양성세포가 없음을 확인한다. 그와같은 세포배양의 계대배양과 비루스 항원 양성세포의 존재 부정의 확인을 다시 2회 반복하여 행하고, 불활화 확인시험에 합격한 조원액을 하기의 정제공정에 사용한다.

(IV) HFRSV항원의 정제 :

이 공정에서는 불활화가 확인된 조원액중의 HFRSV의 고도 정제를 행한다. 정제법으로서는 공지의 기술, 즉, 흡착제나 침전제를 사용하는 방법, 또, 저속원심, 초원심, 여과, 한외여과, 겔여과, 전기영동, 컬럼 크로마토그래피 등의 정제용 기기장치를 사용하는 정제기술을 적절히 선택하여, 이들을 조합시켜서 사용할 수 있다. 그 구체적 예로서는 초원심법과 한외여과법을 조합하여 사용하는 방법을 들수 있다. 즉, 평형 밀도 구배 원심분리나 연속 또는 불연속의 밀도 구배 원심분리 내지는 조날(zonal)원심분리에 의한HFRSV항원 분획의 채취 및 시판의 한외여과 장치에 의한 HFRSV항원액의 투석과 농축에 의하여 정제를 행할수가 있다. 그와같은 원심분리의 밀도 컬럼이나 밀도 구배 컬럼을 조제하는 물질로서는 예로서 세슘 클로라이드, 브롬화칼륨, 사탕, 주석산칼륨, 글리세롤, 피콜(Pharmacia Fine Chemical AB,Sweden제)등, 공지의 일도 컬럼 작성용 물질을 사용할 수 있다. 그리고, 사탕을 사용하는 경우에는, 상기 컬럼을 정제하는 담체 용매중에서의 사탕 농도가 약 5∼약 60w/v%의 범위내가 되도록 조제한다. 또, 그와 같은 원심분리를 담체 용매의 밀도, 즉, 용질농도를 적절히 변경해서 2회 이상, 반복 실사하므로서 HFRSV의 순도를 고도로 높일 수가 있다. 예를들면, 밀도 구배 원심분리를 반복하는 경우에는 1회째의 원심에 비하여 2회째의 원심에서 사용하는 컬럼의 밀도 구배의 폭을 좁히면은 효과적이다. 또, 원심조건으로서는 통상, 약 20,000∼약 40,000rpm에서 약 2∼약 30시간 행하는 것이 요망된다.

이상의 방법으로 분획하고 농축하여 HFRSV항원의 정제 농축액을 얻고, 이것을 HFRSV백신 원액 또는HFRSV항원 원액으로서 사용한다.

(V) HFRSV백신의 제조 :

전술한 바와 같이해서 얻어지는 HFRSV백신 원액을 공지의 상법으로 제균 여과하고, 여과액을 채취한후, 이것을 생리적 염 용액으로 희석하여 로우리(Lowry)법에 의한 단백 함량의 측정치가 약 1∼약 500㎍/ml가 되도록 조제한다. 이어서, 보조약으로서 수산화알루미늄겔을 최종농도가 약 0.1∼약 1mg/ml가 되도록 첨가 혼합하여 보조약에 HFRSV항원을 흡착시킨다.

그리고, 상기 수산화알루미늄겔 이외에 예컨데, 인산칼슘겔, 벤토나이트, 알루미나, 무라밀펩티드 유도체등, 공지의 다른 보조약도 사용할 수 있다. 또, HFRSV항원의 안정화를 도모하기 위하여 시판의 젤라틴,젤라딘 가수분해물, 알부민, 당류, 아미노산류 등 공지의 안정화제로부터 1종 또는 2종 이상을 적절히 선택하여 이들은 조합해서 첨가 혼합할 수가 있다. 이어서 이것을 앰플 또는 바이알병 등의 작은 용기에 분주하여 밀봉하므로서 침강정제 HFRSV백신을 얻는다. 그리고, 제품이 열대등의 악조건하에서의 보존과 수송에 견디도록 HFRSV항원의 안정화를 더욱 시도하기 위해서는 동결건조를 행한다. 예를들면, 상기의 분주가 완료된 백신을 상법에 의하여 동결건조시킨 다음, 각 작은 용기를 밀봉하므로서 건조 침강정제 HFRSV백신을 조제할 수 있다. 그리고, 백신의 적격성에 관해서는 후생성고시 제159호「생물학적 체제기준」에 규정된 「닛뽕 뇌염백신」,「건조 닛뽕 뇌염백신」 및 「침강정제 백일해 백신」에 준거하여 각종 시험을 행하여 판정한다. 또, 본 발명에 관한 HFRSV항원은 혼합 백신으로서도 사용된다. 이경우에는 상술한 보조액에 흡착완료한 HFRSV항원을 별종의 백신용 항원, 예를들면 일본뇌염 비루스, 인플루엔자 비루스, 파라인플루엔자 비루스, B형간염 비루스, 뎅그열 비루스, 에이즈 비루스, 백일해균, 디프테리아균, 파상풍균, 수막염균, 폐염구균 등에 유래하는 여러 항원으로부터 적절히 선택된 1종 이상의 항원과 혼합하므로서 상기와 같이하여 액상 또는 건조혼합 백신을 조제할 수 있다. 이들 백신의 사용량은 그 종류에 따라서 다르나 통상 단백농도를 각각 약 1㎍/ml∼약 10mg/ml가 되도록 첨가혼합할 수가 있다.

본 발명의 백신은 앰플 또는 바이알병 따위의 용기내에서 밀봉된 상태로 액상 백신, 침강보조약 백신, 또는 건조 백신으로서 제공된다. 액상 및 침강 백신의 경우에는 그대로 사용하고, 건조 백신의 경우에는 멸균 증류수 등으로 용해하고 건조전의 체적으로까지 복귀시켜서 사용한다. 또, 그와같은 백신은 통상, 피접종자당 0.5ml씩 피하에 접종한다. 접종은 통상 14회, 3주간∼2년의 간격을 두고 행하여진다.

또, 본 발명의 HFRSV항원은 진단제로서, 바이알병 또는 소형 시험관내에서 액상 또는 건조된 상태에서 밀봉되거나, 혹은 상용되고 있는 여과지, 막 또는 마이크로플레이트의 표면에 흡착시킨 상태에서 제공된다. 그와같은 진단제는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 적혈구 응집저지테스트 등, 각종의 항원항체 반응측정의 상투수단에 따라 사용된다. 그리고, 진단제로서 사용하는 경우의 사용량은 그 진단에 사용되는 수단에 의해서 다르나, 일반적으로 0.1∼10㎍/ml의 농도의 용액을 조제하여 사용할 수가 있다. 또, 본 발명의 HFRSV항원은 HFRSV항체작제용의 항원으로서 바이알병 또는 소형 시험관내에서 액상 또는 건조원 상태로 밀봉되어 제공된다. 그와같은 HFRSV항체작제용의 항원은 단일클론 항체나 다클론 항체의 제작의 상투수단에 따라 사용된다. 또, 얻어지는 단일클론 항체나 다클론 항체를 다시 고도로 정제하여 HFRS치료용 면역글로불린을 제작할 수가 있다.

이하, 본 발명을 참고예 및 실시예에 의하여 상술하거니와, 본 발명은 이하의 참고예 및 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[참고예 1[HFRSV의 분리]]

(가) HFRSV분리용 재료의 조제 :

의과대학으로부터 입수한 HFRS에 걸려 있는 피셔 래트[BIKEN Journal,26,155∼160(1983)]로부터 조직구종을 적출하여 이것을 평량한 다음, 안과용 가위로 그 종양조직을 가능한한 잘게 자른다. 이어서, H-199배지(미국 디프코사제)와 MEM배지(닛스이제약사제)를 등량 혼합한 액에 잘게 자른 종양 조각을 10w/v%가 되도록 부유시킨다. 이것을 주사기로 흡인하여 6주령의 피셔 래트 세마리의 각각의 등 피하에 0.2ml씨 접종하여 이식한다. 피이식 래트는 3주간에 걸쳐 생물위험 안전 캐비넷내에서 사육 관살하고, 접종 부위에서 종양조직이 새끼손가락 끝만큼 증식하여 비대하여진 시점에서 꼬리 정맥으로부터 소량 채혈하고 얻어진 혈청의 HFRSV항체가를 측정한다. 항체가는 HFRSV Hantaan주(ATCC VR-938)[Journal of Infectious Diseases, 제137권, 298∼308페이지(1978)]항원 및 풀루오레세인 이소티오시아네이트(이하「FITC」라고 약칭한다)표식 항 래트 IgG염소혈청 등을 사용하는 간접형광 항체법에 의하여 측정한다. 상기 각 래트의 혈청에 관해서 측정한 후의 항체가가 각각 1 : 8,000이상으로 상승한 것을 확인한후, 각 래트를 에테르 마취하고 심장으로부터 채혈하고, 이어서 무균적으로 개복하여 종양조직, 폐, 비장, 신장을 적출하여서 비루스 분리의 출발 재료로 한다. 그 출발 재료의 각각의 일부에 관해서 증식배지를 첨가후, 균등기로 10w/w% 조직유제를 조제함과 동시에 나머지 각각의 일부에 대해서 안과용 가위로 lmm³각의 세편으로 세분하고, 이들을 HFRSV분리재료로 하여 하기(다)의 비루스 분리에 사용한다. 그러고, 증식배지는 M-199배지와 MEM배지와의 등량 혼합액에 소 태아 혈청, 카나마이신 및 에리트로마이신을 각각 최종농도가 10v/v%, 100㎍/ml 및 30㎍/ml로 되도록 첨가혼합하여 조제한다(이하 「증식배지」라 한다.)

(나) 비루스 분리용의 세포배양의 조제 :

Vero E6세포주[C-1008(ATCC No.CRL 1586)] 및 A-549세포주(ATCC No.CCL 185)의 각 세포를 상기 증식배지를 사용해서 37℃보온기중에서 증식시킨후, 최종농도 0.1w/v% 트립신 및 0.02w/v% 에틸렌디아민 4아세트산 3나트륨(이하 「EDTA」라 한다)을 함유하는 인산 완충염화나트륨액을 세포소화액(이하「트립신액」이라 한다)으로 사용하여 각각의 세포를 소화시켜, 분산시킨다. 이어서, 저속원심으로 각 세포를 모은 다음 세포수가 Vero E6세포에서는 2.5×10⁵ml, A-549세포에서는 1.0×10⁵m1가 되도록 각각 증식 배지중에 부유시킨다. 그 세포 부유액을 직경 60mm의 페트리접시에 5ml씩 분주한 다음, 각 페트리접시를37℃의 탄산가스 보온기에 넣고 세포배양을 한다. 배양세포는 다음날 하기 (다)의 비루스 분리에 사용한다. 그리고 트립신액에 사용한 인산염 완충염화나트륨액(이하 「PBS」라 약칭한다)은 염화나트륨 8.0g, 염화칼륨 0.2g, 인산 1 수소나트륨 1.15g 및 인산 2수소칼륨 0.2g을 증류수에 용해시켜 총 용적 1ℓ로 하고 이것을 고압 멸균시킨 다음에 사용한다.

(다) HFRSV의 분리 :

신선한 증식배지를 사용하여, 상기 (나)에서 조제한 Vero E6 및 A-549 각 세포배양의 배지교환을 행한후, 페트리접시내의 두 종양세포 배양의 각각에 상기 (가)에서 조제한 각 HFRSV분리용 재료를 하기와 같이 접종시킨 다음, 각 세포배양 페트리접시를 37℃보온기내에 넣고 배양한다.

그룹 I : 상기 (가)에서 조제한 유제를 0.2ml/세포배양 페트리접시씩 접종한 다음, 배양한다 :

그룹 II : 상기 (가)에서 세분화한 조직세편을 10개/세포배양 페트리접시씩 접종한 다음, 배양한다: 그리고

그룹 III : 세포배양되어 있지 않은 신규의 페트리접시에 상기 (가)에서 세분한 조직세편을 l0개/페트리접시 접종후, 증식배지를 첨가하여 배양한다.

상기 그룹 I과 Ⅱ에 관해서는 비루스 분리용재료 접종 다음날, 배지교환을 한다. 즉, 배양액을 흡인 제거한후, 유지배지의 첨가와 흡인제거를 3회 반복하므로서 배양세포의 표면을 세척한다. 그리고, 유지배지는 M-199배지와 MEM배지의 등량 혼합액에 소 태아 혈청 카나마이신 및 에리트로마이신을 각각 최종농도가 3v/v%, 100㎍/ml 및 30㎍/ml로 되드록 첨가혼합해서 조제한다(이하 「유지배지」라 한다). 이어서, 신선한 유지배지를 5.0ml/페트리접시씩 첨가한 다음, 37℃보온기내에서 배양을 계속한다. 신선한 유지배지를 사용하는 배지교환은 배양중의 상기 3그룹의 각 세포배양에 관해서 4∼5일 간격으로 행한다. 비루스 분리용재료의 접종후, 2주일째에서 상기 트립신액으로 세포배양을 소화하여 분산시키고, 그 세포의 계대배양을 함과 동시에 그 일부의 세포를 스포트 슬라이드에 옮기고 간접 형광 항체법에 의한 HFRSV항원검색의 검체에 사용한다. 그리고 1대 계대된 세포는 상술한 바와같이 유지배지에 의한 배지교환을 하면서 배양을 계속한다. 상기 방법에 따라서 세포의 계대배양을 2주일마다 그리고 3회 반복하고 합계 8주간에 걸쳐 4대까지 계대배양한다. 이동안 각 계대의 세포일부를 스포트슬라이드에 옮기고 HFRS환자의 급성기 혈청과 회복기혈청을 사용하는 간접형광 항체법에 의하여 HFRSV항원의 검색을 한다. 그결과 Vero E6세포배양을 사용한 상기 그룹 II에 있어서는 HFRSV항원이 검출되었다. 특히 상술한 세마리중 한마리의 래트에서 유래하는 종양조직 세편으로서 이루어지는 비루스 분리용 재료를 접종한 그룹 II의 2대 계대 Vero E6 세포배양에서는 그 전체세포의 1∼2%에 항원이 검출되고, 또한 그 세포배양의 3대 계대에 있어서는 그 60∼70%의 세포에 Hantaan주와 유사한 세과립상 항원이 세포질에 검출되었다. 이상과 같이, 간접형광 항체법 하에서 HFRS환자의 급성기 및 회복기 혈청과 특이적으로 반응하고, 또한 HFRSV에 유사한 항원이 관찰된 그 Vero E6세포배양에 4대 계대한 것을 하기 (라)의 비루스 동정에 사용한다. 이하, 편의상 Vero E6세포에 4대 계대한 비루스를 「B-1주」라 칭한다.

(라) B-1주의 동정 :

상기 (가)에서 비루스 분리용의 출발재료로서 사용한 HFRS에 걸린 래트의 심장, 간장 및 취장의 절반을 10v/v% 포르말린액에 침지하고, 실온에서 2주간 고정한 다음, 파라핀 봉매 절편을 작성한다. 이 절편의탈 파라핀처리 및 트립신 처리를 행한 다음, HFRS환자의 급성기 및 회복기 혈청과 FITC표식 사람 IgG염 소혈청을 사용하는 간접형광 항체법에 의하여, 상기 조직중의 HFRSV항원의 검색을 행한다.

그결과, HFRSV Hantaan 76-118주(ATCC VR-938)(이하 단순히 「Hantaan주」라 칭한다)의 항원과 유사한 조직 병리학적 소견을 얻는다. 한편, B-1주의 감염배양 세포를 스포트 슬라이드에 배양한후, 아세톤으로 고정하여 비루스를 불활화하므로서 B-1주의 항원을 조제한다. 그 B-1주 항원과 상기 Hantaan주 항원을 써서, 상기와 같은 간접형광 항체법에 의하여, 2예의 HFRS환자 혈청중의 항체가를 측정하고, 이를 두 항원의 혈청학적 상이점을 비교한다. 그결과, HFRS환자의 회복기 혈청은 B-1주에 대해서는 모두 200배 이상의 항체가를 표시하고, 한편 Hantaan주에 대한 항체가는 약 150배였다.

HFRS병력을 갖지 않는 건강한 사람의 혈청은 이들 두 항원에 대하여 전연 반응을 나타내지 않았다. 또한, 널리 실험동물에 잠재 감염하고 있는 것으로 알려져 있는 레오비루스 1,2 및 3형이 잘못 들어가는 것을 검색하기 위하여, 상기 (다)에서 얻은 Vero E6세포배양을 레오비루스 1,2 및 3형의 각 항체를 사용하는 형광 항체법에 사용한다. 그결과, 그 Vero E6세포배양은 형광 항체법에서의 반응이 전부 음성이며, 어떠한 형의 레오비루스에도 오염되어 있지 않다는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 (다)에서 얻은 B-1주를 하기의 참고예 2에 사용한다.

[(참고예 2[B-1주의＜생쥐 뇌에서의 계대]]

(가) 생쥐 뇌에서의 계대용 비루스액의 조제 :

상기 (다)에서 얻은 Vero E6세포배양물을 초음파 처리한후, 저속 원심분리하여, 그 상층액을 채취하고, Vero E6세포로서 4대 계대한 B-1주 비루스액을 조제한다. 이어서, 미리 참고예 1의 (가)에 마라서 조제한 Vero E6세포배양에 그 비루스액을 감염 다중도(MOI)0.01로 접종하고, 37℃에서 60분간 보온하여 비루스를 세포에 흡착시킨 다음, 유지배지를 첨가하고, 37℃에서 배양한다. 배양 개시후 7일째에 배지교환을 하고, 다시 배양을 7일간 계속한후. 배양액을 채취한다. 그 배양액을 저속원심분리(2,000rpm,20분)하여 그상층액을 채취하고 HFRSV B-1주(Vero E6-5대 계대)비루스액으로 만들어 생쥐 뇌속 접종에 사용한다.

그리고, B-1주 대신에 Hantaan주(ATCC VR-938)를 사용하여 상기와 같은 방법으로 제작한 비루스액을 생쥐 뇌속 접종에 사용할 수도 있다.

(나) 생쥐 :

ICR계통의 임신 생쥐[시즈오까 실험동물(닛뽕)사에서 사육 판매]를 생물위험 안전캐비넷 내에서 사육 관찰을 계속하여 출생후 24시간 이내의 신생 생쥐를 사용한다.

(다) 비루스 계대방법 :

최종 농도 2mM EDTA를 함유하는 PBS(이하 「비루스 희석제」라 한다)를 사용하여, 상기 (가)에서 조제한 비루스액을 1∼100배로 희석한다. 이어서, 이것을 7∼11마리의 신생 생쥐의 뇌속에 각각 10μl씩 접종한 다음, 어미 생쥐와 함께 동일 케이지내에서 7∼14일간 사육 관찰을 계속한다. 사육 종료후, 각 피접종생쥐의 심장부를 절개하여 방혈하고 전신을 알코올을 소독액으로 소독한 다음, 해부 용구로 두피와 두개골을 제거하고, 무균적으로 뇌를 적출한다. 적출한 뇌를 모아서 평량한 다음, 상기 비루스 희석액을 첨가하여, 10w/w% 뇌유제를 조제한다. 그리고, 뇌유제의 조제는 초음과 발생장치(KUBOTA 200M)를 사용하여 얼음욕중에서 뇌유제 100ml당 5분의 비율로 초음파 처리하고 뇌를 파쇄 현탁하여서 행한다.

이어서, 그 뇌유제를 12.3×1000g로 30분간 원심분리[히다찌 제작소(닛뽕)제 모델 CR 26H]시킨 다음, 그 상층액을 채취하여, 다음 대에로의 계대용 비루스액으로서 사용한다.

(라) 비루스 감염가의 측정 :

간접형광 항체법에 의하여 하기와 같이 측정한다. 증식배지를 사용하여 조제한 2.0×10⁵세포/ml의 Vero E6세포부유액을 8챔버 플레이트(미국 Lab-Tek Product사제)에 웰당 0.5ml씩 주입한후, 그 플레이트를 37℃의 탄산가스 보온기내에 넣어 세포배양한다. 다음날 각 플레이트중의 배양액을 흡인 제거한후, 세포유지액으로 10배 단계 희석시킨 각 비루스액을 비루스 당 100μl씩 접종하고, 이것을 37℃의 탄산가스 보온기내에 60분간 유지하여 세포에 비루스를 흡착시킨다. 흡착완료후, 각 플레이트중의 접종액을 흡인 제거한다. 이어서, 최종 농도 1w/v% 메틸셀룰로즈를 함유하는 증식배지를 각 플레이트ㆍ웰당 500μl씩 주입한 다음, 각 플레이트를 37℃의 탄산가스 보온기내에 넣고 4∼5일간, 배양한다. 배양 종료후, 메틸셀룰로즈를 제거하기 위하여 각 플레이트에 대한 PBS의 첨가와 흡인제거를 3회 반복하고, 각 웰내의 배양세포를 세척한다. 세척후, 각 웰중의 배양세포에 HFRSV Hantaan주에 대한 단일클론 항체액을 첨가하고, 37℃에서 1시간 항원항체 반응을 행한다. 이어서, 각 웰에 대한 PBS의 첨가와 흡인제거를 3회 반복하여, 상기 항체액을 세척제거한 다음, 다시 각 웰의 배양세포에 FITC표식 항 생쥐 IgG염소혈청을 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨다. 반응종료후, 각 웰의 배양세포를 PBS로 세척하고, 그 배양세포의 각각에 대해서 형광 현미경에 의하여 포커스를 계수한다. 얻어진 포커스 계수치로부터 감염치를 산출한다. 감염가는 포커스 형성단위FFU/ml로서 표시한다.

[실시예 1]

B-1주의 생쥐 뇌세포에 대한순화 :

실시예 2의 기재에 따라 생쥐 뇌속에서의 B-1주의 계대를 계속시키고, 각 계대시의 비루스 감염가를 측정한다. 그 결과를 제1표에 표시한다.

[표 1]

제1표에서 명백한 바와같이 계대의 진행과 함께 비루스 감염가의 상승, 즉, 비루스 항원의 증산이 인정되었다. 또, 계대를 거듭함에 따라 비루스 접종후, 10∼14일째에 임상증상이 출현하기 시작하고, 특히, 9대 계대 이후부터 임상증상이 매우 현저하게 되었다. 즉, 비루스 접종후 대략 10일째부터, 피접종 생쥐는 사육 케이지내에 분산하는 경향을 나타내고, 또한 과민 입모, 발육불량, 보행곤난 등의 증상을 거쳐, 90% 이상의 생쥐가 사망하였다.

한편, 참고예 1의 (다)에서 제조한 B-1주(Vero E6-4대) 및 Hantaan주의 비루스를 각각 별개로 등량 ICR계통 생쥐 뇌속에 접종하고, 생쥐의 사망율을 관찰한다. 그결과 Hantaan주의 접종에서는 접종후, 3주간 이내에 99.5%의 생쥐가 사망하였다. 이에 대하여, B-1주[Vero E6-4대)접종의 경우에는 접종후 3주일 이내에 27.3%의 생쥐가 사망하고, 또 접종후 2주일 이내에는 임상증상은 전연 보이지 않았다.

이상의 결과에 의거하여 즉, 생쥐 뇌속에서의 비루스 계대의 진행에 따르는 비루스 감염가의 상승과 비루스 항원의 증산, 또한 피접종 생쥐에서의 임상증상의 촉진과 증강으로부터 종합적으로 판만하여 생쥐 뇌속 계대에 의한 비루스주의 그 뇌세포에 대한 순화를 확인한다. 이에 의하여 생귀 뇌속 계대 10대 이후의 HFRSV B-1주를 생쥐 뇌세포 순화주로서 HFRSV항원의 제조에 사용한다.

[실시예 2]

불활화 HFRSV항원의 제조 :

실시예 1에서 얻은 생쥐 뇌세포 순화주, 즉, B-1주의 생쥐 뇌속 계대 10대(이하 「B-1주(V5M 10)주」라 한다), 20대(이하 「B-1(V5M 20)주)라 한다) 및 30대(이하 「B-1(V5M 30)주」라 한다)의 각 비루스를 제조용 주로서 사용한다. 또, 그 비루스의 배양 숙주로서, 생후 24시간 이내의 TRC계통 생쥐를 사용한다. 실시예 1에서 제조하여 -70℃에서 보존한 제조용 주 비루스액을 비루스 희석액으로 100배로 희석하여 비루스량 1×105FFU/ml의 시드 비루스액을 제조한다. 이어서, 이것을 50마리의 신생 생쥐의 뇌속에 10μl/생쥐로 접종한다. 피접종 생쥐는 어미 생쥐와 함께 사육 관찰한다. 접종후 10∼12일째에 명료한 임상 증상을 나타내는 생쥐를 선별해서 꺼내어 각 생쥐의 심장을 가위로 절단해서 방혈한후, 두부를 절개하여 뇌를 채취한다. 이것을 평량한후, 10w/w% 뇌유제가 되도록 비루스 희석액을 첨가하고, 초음파 처리에 의하여 뇌를 파쇄 현탁해서 뇌유제를 제조한다.

그 뇌유제를 원심 분리하고, 그 상층액을 채취한다. 이어서 이 상층액에 황산 프로타민을 최종농도 0.75mg/ml이 되도록 첨가 혼합한후, 4℃에서 30분간 교반하고 프로타민에 뇌유래의 산성 단백질을 흡착시킨다. 흡착완료후, 원심분리하여, 그 상층액을 채취한다. 한편, 원심 펠레트를 펠레트의 1/2들이 비루스 희석액으로 재 부유시키고, 이것을 다시 원심분리하여 그 상층액을 채취하고, 첫번에 채취한 상층액과 혼합한다. 그 상층액은 비루스 조원액으로서 사용한다. 조원액에 관해서 비루스 감염가를 측정하기 위하여, 조원액으로부터 10ml를 샘플링한다. 이어서, 포르말린(38w/v% 포름알데히드) :조원액의 용적비가 1 : 4,000가 되도록 조원액에 포르말린을 첨가혼합한후, 30분간 교반한다. 교반 종료후 4℃로 방치 보존하여 불활화를 개시한다.

불활화의 진행 상황을 추적하고, 불활화 완료의 시기를 확인하기 위하여, 하기 요령으로 불활화 곡선을 작성한다. 포르말린 무첨가의 조원액, 및 포르말린 첨가 직후에 샘플링한 상기 조원액을 각각 PBS를 외액으로 하여 투석하고, 포르말린을 제거한 다음, 이들 각 검체의 비루스 감염가를 참고예 1에 기재한 방법에 따라 측정한다. 또한, 불활화 중의 조원액을 매일 10ml씩 샘플링하고, 상기와 같이 투석한후, 각 검체의 비루스 감염가를 측정한다. 비루스 감염가를 종축에, 보존일수를 횡축에 취하고, 각 시점에서 얻어진 감염가 측정치를 플롯하므로서 불활화 곡선을 작성한다. 이결과, 포르말린을 첨가한 상기 조원액의 감염가는 보존일수의 경과와 더불어 점차 저하하고, 4℃불활화 보존 개시후, 7일째에 완전히 소실하였다.

한편, 4℃로 보존한 포르말린 무첨가의 조원액에서는 이동안에 감염가의 저하를 볼수 없었다. 또한 보존을 계속하여 불활화에 소요된 7일간의 약 4∼5배의 일수, 즉, 불활화 개시일로부터 30일째를 불활화 완료일로 하였다.

불활화 완료의 조원액에 대하여, 다음과 같이 불활화 확인시험을 행한다. 불활화 완료의 조원액 10ml를 투석하여 포르말린을 제거한후, 이것을 참고예 1의 기재에 따라 페트리접시 내에서 배양한 Vero E6세포에 접종하고, 유지 배지를 3일마다 교환하여, 10일간 배양한다. 배양 개시로부터 10일째에 그 세포배양의 일부를 취하여 다든 페트리 접시에 계대배양함과 동시에 스포트슬라이드에도 옮겨서 같은 방법으로 배양한다.

스포트슬라이드의 세포는 1일간 배양한후, 참고예 1에 기재된 단일클론 항체를 사용하는 간접형광 항체법에 의하여, 생존 HFRS비루스 유래의 HFRSV항원의 유무를 검색한다. 한편, 페트리접시에 계대한 세포는 유지 배지를 3일마다 교환해서 10일간 배양한다. 계대 배양개시로부터 10일째에 그 계대 세포의 일부를 상기와 같이 스포트슬라이드에 옮겨 배양한후, 간접형광 항체법에 의하여, 생존 HFRS비루스 유래의 HFRSV항원의 유무를 검색한다. 그결과, HFRSV항원은 음성이며, 그 불활화 조원액은 불활화 확인시험에 합격하였다. 동시에 그 불활화 조원액에 대해서는 불활화의 완료가 확인되었다.

불활화의 완료가 확인된 조원액에 대해서, ELISA에 의하여 하기 요령으로 항원량을 측정한다. B-1를 생쥐에 접종하는 비루스로서 사용하는 이외는 문헌[Journal of Virology,45(1),124∼132(1983)]에 기재한 바와같은 방법에 의하여, B-1주에 대한 중화 항체를 생산하는 하이브리드마(B-12)를 작성한다. 그 하이브리드마를 생쥐의 복강에 10⁷세포개로 접종한후, 사육관리하고, 접종일로부터 약 7∼약 14일째에는 그 피접종 생쥐의 복수를 채취한다. 이어서, 복수중의 IgG를 황산 암모늄염석 및 겔여과에 의하여 정제하고, 정제항 HFRSV B-1주 생쥐 IgG를 조제한다. 조제한 정제 IgG를 2등분하여 한쪽 반량으로 윌슨-나까네(Wilson ＆ Nakane)의 방법[Immunofluorescence and related staining techniques, Knapp등 편집, Elsevier/North-Holland사 발간, N. Y., p.215(1978)]에 준거하여 퍼옥시다제 표식항체를 작성 한다. 나머지 한쪽의 반량의 정제 IgG, 미표식 항체는 마이크로플레이트 상에 고정화한다.

그 마이크로 플레이트에 2배 단계 희석한 불활화 완료의 조원액을 첨가하여 반응시킨 다음, 다시, 이 반응계에 상기 퍼옥시다제 표식항체, 기질액(o-phenyl-ene-diamine) 및 반응 정지액(4N염산)의 순으로 각각 첨가하여 반응시킨다. 그리고, 상기 각 반응액에 의한 반응 종료후의 각 단계에 있어서는 최종농도 0.05w/v% Tween-20함유의 PBS를 써서 플레이트를 세척하고, 각 반응액을 제거한다. 또, ELISA의 색표시 반응은 흡광도 O.D.492mm로 측정한다. 각 측정치로부터 표준항원과 검체와의 검량선이 평행관계에 있음을 확인후, 표준항원과 검체의 각 희석배수의 비에서 상대항원가를 산출한다. 그결과, 불활화 완료의 조원액의 상대 항원가는 0.658이었다.

[실시예 3]

HFRSV백신의 제조 :

실시예 2에서 얻은 불활화 완료의 조원액을 초원심기를 사용해서 정제한다. 즉, 사탕 밀도 구배 25∼55w/w%, 회전수 35,000rpm, 불활화 완료의 조원액의 원심기에 대한 유입속도 200ml/분의 조건하에서 조날초원심분리를 행하여 32분획으로 분획화하고, 각 분획에 대해서 사탕 밀도의 측정, 흡광도에 의한 단백량의 측정, 및 ELISA에 의한 항원가의 측정을 하여, 그 결과에 의거 항원가/단백량의 값이 매우 높은 분획을 선별해서 풀(pool)한다. 이어서, 그 풀 분획을 투석하여 사탕을 제거하고, 얻어진 투석완료의 정제 불활화 HFRSV항원액을 초원심법에 의하여 농축한 다음, 제균 여과하여 HFRSV백신 원액으로서 사용한다. 그 HFRSV백신 원액에 관해서 항원량 및 TCA-단백질소농도를 측정한다. 항원량은 4.287, TCA-단백질소 농도는 350㎍/ml였다. 이어서 여기에, 보조약으로서 수산화 알루미늄겔을 최종 농도가 0.5mg/ml로 되도록 첨가 혼합하고, 4℃에서 5시간 교반해서 알루미늄겔에 HFRSV항원을 흡착시킨다. 이것을 10ml들이의바이알 병에 분할ㆍ분주한 다음, 마개를 봉하고, HFRSV백신으로서 사용한다. 그리고, B-1(V5M 10)주, B-1(V5M 20)주, 및 B-1(V5M 30)주를 각각 사용해서 제조한 분할ㆍ분주 후의 각 백신의 일부를 샘플링하고, 후생성 고시 제159호 「생물학적 제제기준」에 규정된 「닛뽕 뇌염백신」 및「침강정제 백일해 백신」에 준거하여 각종 시험검정을 행한다. 그결과, 상기 3백신은 모두 백신으로서의 적합성이 확인되었다.

[실시예 4]

HFRSV백신의 면역원성과 감염 방어 효과 :

면역원성은 항체가의 측정에 의하여, 감염 방어 효과는 생쥐 직접 공격법에 의하여 하기 요령으로 검정한다.

항체가의 측정 : 실시예 3에서 제조한 각 백신을 각각, PBS로 4.10 및 40배로 3단계 희석시킨 다음, 각 희석 백신을 10마리의 6주령 BALB/c생쥐의 복강내에 0.5ml/생쥐로 접종 면역한다. 제1회 면역개시로부터 2주일후에 5마리의 생쥐를 채혈에 사용하였다. 한편, 나머지의 생쥐 5마리에 대해서는 제1회 면역개시로부터 2주째에 다시 백신을0.5ml/생쥐로 접종하고, 제2회째의 면역을 행하고, 제2회 면역개시로부터 2주일 후에 채혈한다. 얻어진 각 생쥐 혈청에 관해서 간접형광항체(이하 「IFA」라 약칭한다) 및 적혈구 응집저지테스트(이하 「HI」라 약칭한다)에 의하여, HFRSV항체가를 측정한다.

IFA는 스포트슬라이드상에서 배양한 B-1주 감염의 A-549세포를 아세톤으로 고정한 것을 항원으로 하고, 또한 상기와 같이 얻어진 생쥐 혈청을 일차 혈청으로 하고, FITC표식항 생쥐 IgG토끼 혈청을 2차 혈청으로 하여 사용하므로서 행하여진다. HI는 B-1주를 Vero E6세포로서 배양하여 얻은 배양 상층액을 농축한후, 아세톤으로 추출한것을 항원으로서 사용하고, pH 5.8의 조건하에서 거위 적헐구를 사용하여서 행한다(Journal of General Virology, 제67권, 149∼156페이지, 1986). B-1(V5M 10)주를 사용해서 제조한 백신에 관한 결과를 제2표에 표시한다. 이 백신에 관해서 우수한 면역 응답이 생긴다는 것이 IFA로부터 확인되었다. 또, B-1(V5M 20)주, 및 B-1(V5M 30)주를 사용해서 제조한 백신에 대해서도 각각, 같은결과가 확인되었다.

[표 2]

생쥐 직접공격법 : 상기의 항체측정과 동일한 방법에 의하여 각 백신 희석당 6마리의 생쥐를 사용하여 백신 접종량 0.5ml/생쥐로서 2주일 간격으로 2회 면역을 행한다. 제 2 회 면역후 5일째에, 상기 각 생쥐 6마리를 2군으로 나누어 각 군 3마리로 한다. 이어서, 각군 생쥐에, HFRSV B-1주, 또는 HFRSV KHF83-61BL주[비루스,36(2),233∼251(1986) 및 소화 59년도 과학 연구비 보조금(종합연구 A)연구보고서 과제번호 59380005호]의 비루스를 1×10⁷FFU/생쥐로 접종하여 공격한다. 공격후 5일째에 면역 생쥐 및 대조생쥐(면역을 하지 않고 공격한 생쥐)로부터 폐와 비장을 적출한후, 참고예 1의 기재에 따라서 각 상기의 10w/w% 유제를 조제한다. 이어서, 각 유제를 저속원심 분리하여, 그 상층액을 채취하고, 이것을 Vero E6세포배양에 접종한후, 배양한다. 배양은 최종농도 1w/v% 메틸셀룰로즈를 함유하는 증식배지를 가하여 5일간 행한다. 배양 종료후, 실시예 2에 기재한 방법에 따라서, IFA법에 의거, 비루스 감염가의 측청을 행한다. 그결과를 제3표에 표시한다. 면역군에서는 백신 10배 희석까지 공격 비루스의 감염이 검출되지 않고, 또, B-1주란 항원성이 다른 KHF 83-61BL주의 공격까지도 방어되었다는 사실에서 B-1(V5M 10)주 백신에 관해서, 높은 감염방어 효과와 폭넓은 항원 스펙트럼이 동시에 확인되었다. 또, B-1(V5M 20)주 및 B-1(V5M 30)주를 사용하여 제조한 백신에 대해서도 각각, 같은 결과가 확인되었다.

[표 3]

[표 3a]

발명의 작용과 효과 :

(1) 매우 병원성이 높은 HFRSV를 제조공정의 조기, 즉 조원액의 제조 공정하에서 불활화하기 위하여, 생물위험의 관점에서, 정제나 백신 조제등, 이후의 공정에서의 안정성이 확보된다. 또, 조원액의 조제후의 제조작업이 용이하게 되고, 또한 고가의 설비기계 등을 요하지 않기 때문에, 능률적이고 또한 경제적이다. 그리고, 정제공정과 품질관리가 용이하여지므로, 균질하고 또한 안전한 HFRSV제품을 제공할 수 있다.

(2) 본 발명에서 사용하는 HFRSV B-1주 생쥐 뇌세포 순화주는 4개의 아군으로 분류되어 있는 타 HFRSV주와의 사이에서 폭넓게 교차하는 우수한 항원성을 유지하고 있으므로, 그 제조용 주로서 사용하여 제조원 HFRSV항원 및 백신은 높은 감염 방어효과와 폭넓은 항원 스펙트럼을 함께 가지고 있다. 따라서, 매우 유효하고 또한 유용한 백신 내지는 진단제로서 세계 각지에서 널리 사용될 수 있다.

(3) 비루스 배양숙주로서, 세포배양에 비하여 현저하게 세포수가 많은 생쥐 뇌를 사용함과 동시에, 비루스 안정화제로서 효소 저해제를 사용하므로서, 뇌유제중에서 불안정한 HFRSV의 안정화를 달성하고 있으므로, 매우 높은 생산수율로 HFRSV항원을 제조할 수 있다. 예를들면 10w/w% 뇌유제를 조제한 경우 10⁸∼10⁹개/ml 씩이나 되는 비루스 입자를 얻을 수가 있다.

(4) 알데히드에 의한 비루스의 불활화는 다른 불활화법에 비하여 불활화 달성의 신뢰성과 확실성이 높기 때문에 안정성이 높은 HFRSV제품을 제공할 수 있다. 또. 이 불활화는 대량생산에 적합하므로, 인력 절약이 되며, 또한 능률적이다.

Claims (5)

1. 신증후성 출혈열 비루스의 생쥐 뇌세포 순화주를 생쥐 뇌내에서 배양한 다음, 그 생쥐 뇌를 채취하여, 여기에 효소 저해제 함유용액을 생쥐 뇌 : 효소 저해제 함유용액 중량비가 약 5 : 95∼약 30 : 70이 되도록 첨가하고 그 생쥐 뇌를 파쇄 현탁하여 약 5∼약 30w/w% 뇌유제를 제조한 다음, 이어서, 뇌유제를 원심분리해서 상층액을 채취하고, 그 상층액에 비루스 불활화제 용액을 첨가 혼합하여 비루스를 불활화시킨후, 얻어진 혼합물로부터 비루스 항원을 정제하는 것을 특징으로 하는 신증후성 출혈열 비루스 항원의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 신증후성 출혈열 비루스의 생쥐 뇌세포 순화주가, 신증후성 출혈열 비루스를 생쥐 뇌속에서 10대 이상 계대배양하므로써 생쥐 뇌세포에 순화시킨 비루스인 제조방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비루스 불활화제가 알데히드인 제조방법.
4. 신증후성 출혈열 비루스의 생쥐 뇌세포 순화주를 생쥐 뇌속에서 배양한 후, 그 생쥐 뇌를 채취하여, 여기에 효소 저해제 함유용액을 생쥐 뇌 : 효소 저해제 함유용액 중량비가 약 5 : 95∼약 30 : 70이 되도록 첨가하고 그 생쥐 뇌를 파쇄 현탁해서 약 5∼약 30w/w% 뇌유제를 제조한 다음, 이어서, 뇌유제를 원심분리시켜 상층액을 채취하여, 그 상층액에 비루스 불활화제 용액을 첨가혼합하여 비루스를 불활화시킨후, 얻어진 혼합물로부터 정제하여 얻어지는 비우스 항원을 면역에 주효한 양으로 함유함을 특징으로 하는 신증후성 출혈열 백신.
5. 신증후성 출혈열 비루스의 생쥐 뇌세포 순화주를 생쥐 뇌속에서 배양후, 그 생쥐 뇌를 채취하고, 여기에 효소 저해제 함유용액을 생쥐 뇌 : 효소 저해제 함유용액 중량비가 약 5 : 95∼약 30 : 70이 되도륵 첨가하고 그 생쥐 뇌를 파쇄 현탁해서 약 5∼약 30w/w% 뇌유제를 제조한 다음, 이어서, 뇌유제를 원심분리시켜 상층액을 채취하고, 그 상층액에 비루스 불활화제 용액을 첨가 혼합해서 비루스를 불활화시킨 다음, 얻어진 혼합물로부터 정제하여 얻어지는 비루스 항원을 항원항체 반응이 검출될 수 있는 양으로 함유함을 특징으로하는 신증후성 출혈열 진단제.