CN103235127A - 马立克氏病病毒快速检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种快速检测马立克氏病病毒MDV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，所述纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹，以及含有抗MDV抗体的检测印迹，所述抗MDV抗体为抗MDV的单克隆抗体或多克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗MDV的多克隆抗体或单克隆抗体。该试纸条检测的特异性强、敏感性高，操作简便，快速，结果显示直观、准确，检测成本较低，适合马立克氏病病毒的现场快速检测；使用范围广，便于推广应用。

Description

马立克氏病病毒快速检测试纸条

技术领域

本发明涉及一种检测马立克氏病的器具，特别是涉及一种快速检测马立克氏病病毒的胶体金试纸条。

技术背景

马立克氏病（Marek’s disease，MD）是由马立克氏病病毒（Marek’s disease virus，MDV）引起的一种禽类高度接触性、传染性、淋巴组织增生性肿瘤病。该病以外周神经、性腺、虹膜、各种内脏器官、肌肉和皮肤单核细胞的浸润和肿瘤形成为主要特征。临床上MD发病鸡群表现为生长不均匀、极度消瘦、死亡等症状，最常见的病变是神经损害和多种实质脏器的淋巴肿瘤，以肝脏、脾脏肿瘤最为多见，因神经损害导致的不对称性进行性麻痹, 最终可引起单个或多个肢体的完全性麻痹。根据症状和病变发生部位, MD在临床上分为四种类型，即神经型、内脏型、眼型和皮肤型，有时也可混合发生。MDV主要危害鸡，鹌鹑、山鸡也有发病。 

MDV有三种不同血清型，不同血清型毒株既含有共同抗原, 也含有特异性抗原。近年来MDV的毒力呈不断增强趋势，至今已发生三次大的毒力变异。 MD免疫的失败在世界各地屡有发生，我国也存在类似情况。因此，及时对临床病例进行快速诊断，对该病的有效防控具有重要意义。 

MD的诊断主要有病毒分离培养、血清学检测、病毒核酸检测和病理组织观察、DNA 探针技术、端粒酶活性检测等手段，目前临床上最常用的是前三种。病毒分离鉴定不但对临床诊断很有价值，对流行病学及病原学研究亦至关重要，但该方法检测周期长，约需 1-2个月，同时细胞培养的操作要求高，局限性较大。血清学检测方法包括荧光抗体法（FA）、免疫过氧化酶法、琼脂扩散试验（AGP）及酶联免疫吸附试验（ELISA）。这些方法都需要在实验室内由专业技术人员操作，主要用于检测毛囊上皮、溶细胞感染的淋巴细胞组织及细胞培养物等样品，但在淋巴瘤和潜伏感染的组织中很难检测到MDV抗原。病毒核酸检测主要是用PCR技术检测组织样本或细胞培养物中的MDV病毒基因组DNA，可以用于鉴别诊断致弱毒株和野毒株。与病毒分离培养相似，分子生物学检测方法操作复杂、需要特殊仪器及专业技术人员。血清学方法虽然相对简便，但仍需要荧光显微镜、酶标仪和许多配套试剂，以及较复杂的操作步骤和实验室工作环境，不适合生产或现场的快速诊断，因此，该方法难以在生产基层或兽医临床上推广应用。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种简便、准确、结果直观、肉眼可判的快速检测马立克氏病病毒的试纸条，与其他检测方法相比，该试纸条特异性强、灵敏度高、操作简便、结果显示快，检测成本低廉。 

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案： 

一种快速检测马立克氏病病毒MDV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，所述纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹，以及含有抗MDV抗体的检测印迹，所述抗MDV抗体为抗MDV的单克隆抗体或多克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗MDV的多克隆抗体或单克隆抗体。

所述纤维素膜层由硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜制成；所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。 

所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成；所述吸水层用吸水纸制成；所述金标抗体纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。 

在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜，且在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附纤维层一侧0.3～0.7 cm处印制有样品标记线，检测印迹与对照印迹的排列组合为“‖”、“/ /”、“＋＋”、“┴┴”、“┬ ┬”、“├├”中的一种。 

所述胶体金标记的抗MDV的单克隆抗体是通过以下方法制备的： 

筛选抗MDV的单克隆细胞株，扩大培养，用PBS洗涤后1000 r/min离心10 min，PBS洗2遍，收集细胞，以每只1×10⁶～2×10⁶个细胞量对经产母鼠进行腹腔注射，10～20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min离心10 min后取上清，得到单克隆抗体腹水；

用柠檬酸钠还原法制备金溶胶：在50～100 mL沸腾的0.01%～0.05%（wt）氯金酸水溶液中加入2～4 mL的0.5% -2 %（wt）柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为15-20 nm的胶体金溶胶；以0.1mol/L的K₂CO₃ 调节胶体金溶胶的pH值至8.5-9.5，以1:1000～1:1300的印迹比将所述的单克隆抗体腹水加入胶体金溶胶中，印迹10 min后，加20 %（wt）的PEG-10000至PEG-10000的终浓度为0.05 %（wt），4℃下、1500～3000 r/min离心20 min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃下、15000 r/min离心1 h，弃上清液，获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物；然后用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，得到胶体金印迹的抗MDV单抗。

所述抗MDV的单克隆细胞株是由以下方法制备的： 

用原核表达MDV囊膜糖蛋白gB的重组质粒PET-28a-gB转化大肠杆菌BL-21，挑取阳性克隆菌株；阳性菌液经IPTG诱导表达和培养，上清液经超声波裂解后过镍柱纯化，得到纯化的重组gB 蛋白；

将纯化的重组gB 蛋白以20～30 μg/只的剂量用福氏佐剂乳化制备免疫原免疫6周龄Balb/c系小鼠三次，每次间隔15～30 d；最后一次加强免疫后3～4 d，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死后置于75%（v）酒精溶液中浸泡5～10 min，无菌取其脾细胞，剪碎并经100目尼龙网过滤，用GNK 洗液混悬脾细胞，1000 r/min离心10 min，收集脾细胞；将1×10⁸个脾细胞与2×10⁷～5×10⁷个NS0骨髓瘤细胞混合，再用GNK 洗液混悬后，1000 r/min离心10 min，弃上清，将细胞沉淀于37℃水浴中，在1 min内缓缓加入0.7～1.0 mL的pH为8.5～pH 9.0的PEG-1500中，边加边摇晃，然后再缓慢加入GNK 洗液15 ml，37℃水浴5 min后补足GNK洗液至总体积为40 ml，1000 r/min离心10 min，弃上清；将细胞沉淀重悬于1640/HAT选择培养基中，最后以200 μL/孔铺板至96孔培养板，置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养7~10 d，杂交瘤的培养上清用间接免疫荧光试验检测，挑选荧光较强的细胞克隆，用有限稀释法连续进行三次细胞亚克隆，最后筛选得到特异性的抗MDV的单抗杂交瘤细胞株。

所述GNK 洗液是由以下方法制备的：称取NaCl 24g、KCl 1.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 10.68g、NaH₂PO₄·2H₂O 2.34g、葡萄糖 6g、苯酚红0.03g，混合后加双蒸水至3000 ml，115℃灭菌15 min。 

本发明的有益效果： 

（1）本发明根据ELISA的基本原理，用免疫层析试纸检测病毒，利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，将抗原-抗体反应由ELISA的传统液相环境转到固相滤膜上快速进行，并采用胶体金印迹代替酶印迹，凭肉眼直接观察胶体金的显色状况，即时获得检测结果，因此该方法比ELISA等血清学方法更为简便、快速。

（2）检测特异性强，敏感性高。试纸条以胶体金印迹高亲和力的特异性单抗/多抗为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单抗/多抗特异性和亲和力（结合力）影响很小，且具有较高的印迹率。 

（3）操作简便，快速。使用本发明试纸条时无需附加任何其它仪器和试剂，只要将其测试端插入待检样品液中30秒左右，在1-5分钟内即可判定检测结果。 

（4） 结果显示直观、准确。试纸条以显示棕红色的检测印迹和对照印迹作为检测的阳性和阴性印迹，即在纤维素膜上显示两条棕红色印迹，表示病毒在被检测样品液中被检出，结果为阳性；在纤维素膜上只显示一条棕红色对照印迹C，表示病毒在被检测样品液中未检出，结果为阴性。结果判定直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性的误判。 

（5）减少投资和检测成本。使用该试纸条不需另配其它仪器、设备和试剂，节省大量仪器、设备和附加试剂费用，专业和非专业人士均可随时随地进行现场检测，无需支付专家诊断检查费或送样品去诊断室的路费，节省检测成本。使用该试纸条检测每份样品仅需人民币3～5元，比用通常的仪器分析（每份样品300元左右）和进口ELISA试剂盒（每份样品30元左右）的检测费大幅下降。 

（6）应用范围广，便于普遍推广。本发明操作简单，成“一步式”或“傻瓜式”，而且方便携带和保存，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖和个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。 

附图说明

图1为本发明试纸条的俯视结构示意图。 

图2为图1的试纸条的侧面结构示意图。 

图中1为支撑层，2为样品吸附纤维层，3为金标抗体纤维层，4为纤维素膜层，5为吸水层，6为检测印迹，7为对照印迹，8-1为测试端保护膜，8-2为手柄端保护膜，9为印迹线。 

具体实施方式

实施例1：一种快速检测马立克氏病病毒（MDV）的试纸条，参见图1、图2。支撑层1以塑胶薄片条制成，样品吸附纤维层2以玻璃棉制成，金标抗体纤维层3上附着有胶体金标记的抗MDV单克隆抗体的玻璃棉制成的金标抗体，纤维素膜层4为硝酸纤维素制成，吸水层5由吸水滤纸制成，将编号2、3、4、5各层依次粘贴在支撑层1上，彼此拼接的交界处纤维互相交叉渗透。纤维素膜层4上设有抗MDV多克隆抗体IgG溶液标记检测印迹6（代号T），以及以羊（兔）抗小鼠IgG溶液标记出对照印迹7（代号C）；检测印迹与对照印迹的排列形式为“｜｜”。测试端保护膜8-1覆盖在样品吸附纤维层2和金标抗体纤维层3上面，在测试端保护膜8-1上偏向于样品吸附纤维层2的一侧0.5cm处印有印迹线9，印迹线右端印有箭头及MAX字样，吸水层5上覆盖有其它颜色（如黄色或蓝色）的手柄端保护膜8-2。 

用于对照印迹的羊（或兔）抗小鼠IgG 抗体，及用于检测印迹和金标抗体纤维层的抗MDV的多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法如下： 

（1）羊（或兔）抗小鼠IgG的制备

以饱和硫酸铵法提取小鼠血清中的IgG：取1份血清加2份PBS液（pH 7.2）混匀，再加等体积的饱和硫酸铵液混匀，置4℃冰箱内2 h，在4℃、10000 r/min离心15 min，弃上清液；以适量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵液至其最终浓度为33%，置4℃冰箱内2小时，在4℃、10000 r/min条件下离心15 min，弃上清液，以少量PBS液（pH7.2）溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS液（pH7.2）过夜透析，换液2～3次，在4℃、10000 r/min条件下离心15min，收集上清液，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度。按 50 μg/kg～100 μg/kg体重的剂量经皮下或肌肉注射IgG至抗体阴性健康羊或家兔3～4次，末次免疫20 d后静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1:2000以上，心脏采血或颈动脉放血，分离制备高免血清。以饱和硫酸铵法提取羊（或兔）抗小鼠的IgG（其提取方法与上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述），用于标记本发明试纸条的对照印迹。

（2）抗MDV单克隆抗体细胞株的制备 

用原核表达MDV囊膜糖蛋白B（Glycoprotein B，gB）的重组质粒PET-28a-gB转化大肠杆菌BL-21，挑取阳性克隆菌株，接种于5 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。取5 mL 培养物转接于100 mL LB液体培养基中，37℃培养约3 h，达到对数生长期，即OD₆₀₀约0. 8～1. 2，按照每毫升培养基加入10 μl 100 mmol/L IPTG至终浓度为1. 0 mmol/L诱导表达，28℃条件下缓慢振荡培养4～5 h。在4℃、5000 r/min条件下离心15～20 min，弃上清，按1 g湿重菌体/2～5 ml平衡缓冲液的比例充分悬浮菌体沉淀。用超声波裂解仪裂解，直至云雾状的菌液变得比较清亮，4℃、15000 rpm离心15 min，收集上清液备用。

将上清液上样至用平衡缓冲液（NaCl 500 mmol/L、PB 20 mmol/L、咪唑5 mmol/L，pH 8.0)平衡的镍离子亲和层析柱，再依次分别用含30 mmol/L、50 mmol/L、75 mmol/L 咪唑的洗脱缓冲液（NaCl 500 mmol/L、PB 20 mmol/L，pH7.4）进行分阶段洗脱，收集各阶段洗脱液。将各阶段洗脱峰进行SDS-PAGE分析，电泳完毕后用考马斯亮蓝G2250（甲醇∶水∶冰乙酸 = 4. 5∶4. 5∶1）室温染色2 h，用脱色液（40%甲醇、10%冰乙酸）脱色至背景清晰，观察纯化结果表明：重组菌经IPTG 诱导后有明显的与预期大小相符的目的蛋白条带，说明gB蛋白在E. coli中获得了大量表达，经亲和层析的重复洗脱液中，前两次洗脱的纯化蛋白含量最大，此后洗脱液中含量迅速减少，电泳与浓度测定结果一致，表明洗脱液中的MDV gB表达蛋白纯度较高，可满足单抗制备免疫原的需要。 

将纯化的gB表达蛋白以20～30 μg/只的剂量用福氏佐剂乳化制备免疫原，免疫6周龄Balb/c系小鼠三次，每次间隔15-30天；最后一次加强免疫3～4天后，将免疫小鼠眼球放血，拉颈处死，于75%（v）的酒精溶液中浸泡5～10 min，无菌取其脾细胞、剪碎并经100目尼龙网过滤，用GNK洗液（NaCl 24g、KCl 1.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 10.68g、NaH₂PO₄·2H₂O 2.34g、葡萄糖 6g、苯酚红0.03g，混合后加双蒸水至3000 ml，115℃灭菌15 min）混悬脾细胞，1000 r/min离心10 min，收集脾细胞；将1×10⁸的脾细胞与2×10⁷～5×10⁷的NS0骨髓瘤细胞混合，再用GNK 洗液混悬后，1000 r/min离心10 min，弃上清，细胞沉淀于37℃ 的水浴中，在1 min内缓缓加入0.7～1.0 mL的PEG-1500（pH 8.5～9.0），边加边摇，然后缓慢加入GNK 洗液15 ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5 min后补加GNK 洗液至总体积40 ml，1000 r/min离心10 min 弃上清，将细胞沉淀重悬于1640/HAT选择培养基中，以200 μL/孔铺板至96孔细胞培养板，置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养7～10 d，用间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay，IFA）检测细胞培养上清，挑选荧光较强的细胞克隆，用有限稀释法连续进行三次细胞亚克隆，最后筛选得到特异性的抗MDV的单抗杂交瘤细胞株。 

（3）抗MDV金标单克隆抗体和金标单克隆抗体纤维膜的制备 

将筛选到的特异性抗MDV的单抗细胞株扩大培养，PBS洗2遍后1000 r/min离心10 min，收集细胞并以1×10⁶～2×10⁶个/只的细胞量腹腔注射经产母鼠，10～20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min离心10 min，上清即为所需的单克隆抗体腹水。以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在50～100 mL沸腾的0.01%～0.05%（wt）氯金酸水溶液中加入2～4 mL的0.5%～2%（wt）柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径15 nm 左右的胶体金。以0.1 mol/L的K₂CO₃ 调胶体金pH值至8.5～9.5，以1:1000～1:1300的印迹比将待印迹的抗MDV的单抗腹水加入pH8.5～9.5 的金溶胶中，印迹10 min后，加20%（wt）的PEG-10000至PEG-10000终浓度达到0.05%，4℃、1500～3000 r/min条件下离心20 min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000 r/min条件下离心1 h，弃上清液，获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得胶体金印迹的抗MDV单抗。将1:100～1:500稀释的胶体金印迹的上述单克隆抗体吸附于精制玻璃棉（尼龙纤维或聚酯纤维）中，4℃下低温真空干燥，即制得抗MDV金标单克隆抗体纤维膜。

（4）抗MDV多克隆抗体的制备 

差速离心或蔗糖密度梯度离心对MDV CEF细胞毒进行浓缩、纯化，甲醛灭活后用福氏佐剂乳化制备免疫抗原，单独多次免疫接种抗体阴性健康羊或兔。末次免疫20 d后静脉采血，以IFA 检测其血清抗体效价在1:2000以上时，心脏采血或颈动脉放血，分离制备高免血清，以饱和硫酸铵法提取血清中IgG抗体（方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述）。

（5）试纸条的检测操作方法 

a、样品液的制备  无菌取病鸡的全血，以抗凝剂生理盐水作1:10~1:50 倍稀释，离心分离血液淋巴细胞悬液待检。若取病鸡的组织（如羽髓、肝脏、脾脏等）将其剪碎、研磨，以生理盐水制成1:2～1:5的待检测样品悬液，置4℃澄清或离心。 

b、检测操作  将试纸条测试端插入待检测样品上清中，插入深度不超过印迹线（MAX），约30 s后取出试纸条，水平放置约1～5 min，同时观察结果。 

c、结果判断  如果在试纸条纤维素膜上只显示出一条棕红色对照印迹C，表示测检结果呈阴性，说明在被检样品液中未检测出MDV；如果检测试纸条上的纤维素膜上出现棕红色的对照印迹C和检测印迹T，表示检测结果呈阳性，即在待检样品中检测出MDV；如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作有误。 

（6）本发明试纸条的灵敏性、特异性试验 

a、灵敏性试验。将MDV的CEF细胞培养液用PBS（PH7.4）或双蒸水分别配制成不同病毒滴度的病毒溶液（100 PFU/mL、50 PFU/mL、25 PFU/mL、12.5 PFU/mL），-20℃反复冻融3次后，将试纸条测试端插入病毒液中，插入深度不超过印迹线（MAX），约30 s后取出试纸条，水平放置约1～5 min，同时观察结果。插入100 PFU/mL和50PFU/mL病毒液中的试纸条均出现棕红色的对照印迹C和检测印迹T，即检测结果为阳性；插入25 PFU/mL病毒液的试纸条出现棕红色的对照印迹C，但检测印迹T的棕红色较弱，即检测结果为弱阳性；插入12.5 PFU/mL病毒液的试纸条只显示出一条棕红色对照印迹C，即检测结果为阴性。由此可见，该试纸条对MDV具有较高的灵敏度，检测MDV的最低病毒滴度为25 PFU/mL。

b、特异性试验。用本发明的试纸条检测与MD同类的家禽免疫抑制病病毒如禽白血病病毒（ALV）、网状内皮组织增生症病毒（REV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）的病毒培养液，结果显示该试纸条的检测结果均为阴性，说明该试纸条用于检测MDV具有良好的特异性，可用于MDV的快速检测。 

（7）上述试纸条的测试原理 

当该试纸条测试端（样品吸附带）插入待检测样品溶液后，待检溶液通过层析作用带动待检病鸡病料中的MDV病毒粒子及金标抗体纤维膜中的金标抗体一起向纤维素膜层扩散，并最终渗入手柄端吸水层中，扩散过程中待检MDV可与相对应的金标单抗相结合，进而与纤维素膜上检测印迹中的抗MDV的多抗IgG结合，从而显示出棕红色的检测印迹T；而对照印迹中的羊抗或兔抗小鼠IgG则可与金标单抗结合，形成棕红色对照印迹C。如果待检样品液中没有MDV，试纸条只显示出一条棕红色对照印迹C；如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作失误。

实施例2：检测马立克氏病病毒的试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于：由尼龙纤维制成的金标抗体纤维层3上附着以胶体金标记的抗MDV金标多克隆抗体；在硝酸纤维素制成的纤维素膜层4上设有以抗MDV单克隆抗体IgG 溶液喷涂的检测印迹T，以羊（兔）抗小鼠IgG溶液喷涂的对照印迹C。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同，不重述。 

实施例3：检测马立克氏病病毒的试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于：由聚酯纤维制成的金标抗体纤维层3上附着有抗MDV金标单克隆抗体；在聚偏二氟乙烯制成的纤维素膜层4上以对应的抗MDV多克隆抗体IgG溶液标记出检测印迹，以羊（兔）抗小鼠IgG溶液印上对照印迹C。 

实施例4：检测马立克氏病病毒的试纸条，其结构、制备方法与实施例3基本相同，不同之处在于：由尼龙纤维制成的金标抗体纤维层3上附着抗MDV金标多克隆抗体；聚偏二氟乙烯制成的纤维素膜层4上以对应的抗MDV单克隆抗体IgG溶液标记出检测印迹，以羊（兔）抗小鼠IgG溶液标记出对照印迹C。 

实施例5：检测马立克氏病病毒的试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于：由尼龙纤维制成的金标抗体纤维层3上附着有抗MDV金标单克隆抗体；在聚偏二氟乙烯制成的纤维素膜层4上以识别另一表位的抗MDV单克隆抗体IgG溶液印制出检测印迹，以羊（兔）抗鼠IgG溶液标记出对照印迹C，检测印迹与对照印迹的排列组合为“/ /”、“＋＋”、“┴┴”、“┬ ┬”、“├├”中的任意一种。 

实施例6：试纸条结构和实施例1基本相同，不同之处在于：支撑层1由不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2由尼龙纤维制成，纤维素膜层4用纯纤维素膜制成。 

实施例7：试纸条结构和实施例1基本相同，不同之处在于：样品吸附纤维层2由聚酯纤维膜制成，纤维素膜层4用羧化纤维素膜制成。 

实施例8：试纸条结构和实施例1基本相同，不同之处在于：样品吸附纤维层2用尼龙纤维制成，纤维素膜层4用聚偏二氟乙烯（PVDF）纤维膜制成。 

实施例9：试纸条结构和实施例1基本相同，不同之处在于：样品吸附纤维层2采用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。 

  

Claims (10)

1.一种快速检测马立克氏病病毒MDV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，其特征在于：所述纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹，以及含有抗MDV抗体的检测印迹，所述抗MDV抗体为抗MDV的单克隆抗体或多克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗MDV的多克隆抗体或单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述纤维素膜层由硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜制成。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成；所述吸水层用吸水纸制成。

5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述金标抗体纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。

6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于: 在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜，且在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附纤维层一侧0.3～0.7 cm处印制有样品标记线。

7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：检测印迹与对照印迹的排列组合为“‖”、“/ /”、“＋＋”、“┴┴”、“┬ ┬”、“├├”中的一种。

8.根据权利要求1～7任一项所述的试纸条，其特征在于：所述胶体金标记的抗MDV的单克隆抗体是通过以下方法制备的：

筛选抗MDV的单克隆细胞株，扩大培养，用PBS洗涤后1000 r/min离心10 min，PBS洗2遍，收集细胞，以每只1×10⁶～2×10⁶个细胞量对经产母鼠进行腹腔注射，10～20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min离心10 min后取上清，得到单克隆抗体腹水；

用柠檬酸钠还原法制备金溶胶：在50～100 mL沸腾的0.01%～0.05%（wt）氯金酸水溶液中加入2～4 mL的0.5% -2 %（wt）柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为15-20 nm的胶体金溶胶；以0.1mol/L的K₂CO₃ 调节胶体金溶胶的pH值至8.5-9.5，以1:1000～1:1300的印迹比将所述的单克隆抗体腹水加入胶体金溶胶中，印迹10 min后，加20 %（wt）的PEG-10000至PEG-10000的终浓度为0.05 %（wt），4℃下、1500～3000 r/min离心20 min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃下、15000 r/min离心1 h，弃上清液，获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物；然后用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，得到胶体金印迹的抗MDV单抗。

9.根据权利要求8所述的试纸条，其特征在于：所述抗MDV的单克隆细胞株是由以下方法制备的：

用原核表达MDV囊膜糖蛋白gB的重组质粒PET-28a-gB转化大肠杆菌BL-21，挑取阳性克隆菌株；阳性菌液经IPTG诱导表达和培养，上清液经超声波裂解后过镍柱纯化，得到纯化的重组gB 蛋白；

将纯化的重组gB 蛋白以20～30 μg/只的剂量用福氏佐剂乳化制备免疫原免疫6周龄Balb/c系小鼠三次，每次间隔15～30 d；最后一次加强免疫后3～4 d，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死后置于75%（v）酒精溶液中浸泡5～10 min，无菌取其脾细胞，剪碎并经100目尼龙网过滤，用GNK 洗液混悬脾细胞，1000 r/min离心10 min，收集脾细胞；将1×10⁸个脾细胞与2×10⁷～5×10⁷个NS0骨髓瘤细胞混合，再用GNK 洗液混悬后，1000 r/min离心10 min，弃上清，将细胞沉淀于37℃水浴中，在1 min内缓缓加入0.7～1.0 mL的pH为8.5～pH 9.0的PEG-1500中，边加边摇晃，然后再缓慢加入GNK 洗液15 ml，37℃水浴5 min后补足GNK洗液至总体积为40 ml，1000 r/min离心10 min，弃上清；将细胞沉淀重悬于1640/HAT选择培养基中，最后以200 μL/孔铺板至96孔培养板，置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养7~10 d，杂交瘤的培养上清用间接免疫荧光试验检测，挑选荧光较强的细胞克隆，用有限稀释法连续进行三次细胞亚克隆，最后筛选得到特异性的抗MDV的单抗杂交瘤细胞株。

10.根据权利要求9所述的试纸条，其特征在于：所述GNK 洗液是由以下方法制备的：称取NaCl 24g、KCl 1.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 10.68g、NaH₂PO₄·2H₂O 2.34g、葡萄糖 6g、苯酚红0.03g，混合后加双蒸水至3000 ml，115℃灭菌15 min。

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