CN205538991U - 一种检测小鹅瘟病毒的试纸条 - Google Patents

Abstract

一种快速检测小鹅瘟病毒抗体的试纸条，包括支撑层，支撑层一端粘贴样品吸附纤维层，另一端粘贴吸水层，在支撑层的吸附纤维层与吸水层之间的部分粘贴纤维素膜层与金标纤维层，吸附纤维层、金标纤维层、纤维素膜层、吸水层之间彼此拼接的交界处纤维互相交叉渗透。本实用新型至少包含如下有益效果：（1）本实用新型根据ELISA的基本原理，用免疫层析试纸检测病毒，利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，将抗原‑抗体反应由ELISA的传统液相环境转到固相滤膜上快速进行，并采用胶体金印迹代替酶印迹，凭肉眼直接观察胶体金的显色状况，即时获得检测结果，因此该方法比ELISA等血清学方法更为简便、快速。（2）检测特异性强，敏感性高。

Description

一种检测小鹅瘟病毒的试纸条

技术领域

本实用新型涉及一种检测小鹅瘟病毒的器具，特别是涉及一种检测小鹅瘟病毒的试纸条。

背景技术

小鹅瘟病毒(gosling plague virus，GPV)，又称鹅细小病毒，可引起雏鹅的一种急性或亚急性败血症小鹅瘟(gosling plague ，GP)，以 发生渗出性肠炎为主要病理变化。本病主要侵害4-20日龄雏鹅，传染快、病死率高。本病最早由我国学者方定一于1956年在我国扬州地区发现，国内大多数养鹅省区均有发生，给养鹅业造成重要经济损失。

及时、快速诊断GP，是有效控制GP的前提。目前GP的诊断主要有常规实验室检测和分子生物学两大类方法。常规方法主要有病毒分离鉴定和GPV抗体的血清学检测，包括琼脂免疫扩散试验（AGP）、间接免疫荧光抗体试验(IFA)、ELISA等方法。分子生物学方法主要有PCR和核酸探针技术等。但GPV的病毒分离培养、AGP、IFA、ELISA、PCR和核酸探针等检测技术操作复杂，需要昂贵的仪器设备、过程较长、耗时费力，需要特定仪器设备和专业技术人员操作，很难在基层普及，不能满足生产一线或疫病现场的快速诊断需要。因此，研究一种快速检测小鹅瘟病毒感染的检测技术非常重要而迫切。

实用新型内容

本实用新型的一个目的是解决至少上述问题或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本实用新型还有一个目的是提供了一种结果显示直观、准确、快速检测脑脊髓炎的试纸条，与其他检测方法相比，该试纸条特异性强、灵敏度高、操作简便、结果显示快速，检测成本低廉。

为了实现根据本实用新型的这些目的和其它优点，本实用新型提供的技术方案为：

一种快速检测小鹅瘟病毒抗体的试纸条，包括支撑层，支撑层一端粘贴吸附纤维层，另一端粘贴吸水层，在支撑层的吸附纤维层与吸水层之间的部分粘贴纤维素膜层与金标纤维层，吸附纤维层、金标纤维层、纤维素膜层、吸水层之间彼此拼接的交界处纤维互相交叉渗透，纤维素膜层上标记以纯化的小鹅瘟病毒的第二抗体的检测印迹与包含羊/兔抗小鼠免疫球蛋白G的对照印迹，检测印迹与对照印迹并列排列在纤维素膜层上，检测印迹的位置靠近吸附纤维层；金标纤维层为附着有胶体金标记的小鹅瘟病毒的第一抗体的玻璃棉制成；本试纸条设有吸附纤维层的一端为入水端，设有吸水层的一端为握持端，入水端外侧覆盖有白色的第一保护膜，握持端覆盖有黄色的第二保护膜；在吸附纤维层和金标纤维层交界处对应的保护膜上偏向于吸附纤维层一侧0.40cm处印有印迹线，印迹线的右端印有箭头及MAX字样；握持端设有便于握持的凹槽，凹槽标记有大拇指形状，凹槽83向内延伸到吸水层；所述纤维素膜层采用硝酸纤维素膜、纤维素膜、羧化纤维素膜和聚偏二氟乙烯膜中的任意一种制成。

支撑层在入水端设为网格状，其网孔的形状为圆形、正方形、三角形、菱形、六边形。

支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成。

本实用新型至少包含如下有益效果：

（1）本实用新型根据ELISA的基本原理，用免疫层析试纸检测病毒，利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，将抗原-抗体反应由ELISA的传统液相环境转到固相滤膜上快速进行，并采用胶体金印迹代替酶印迹，凭肉眼直接观察胶体金的显色状况，即时获得检测结果，因此该方法比ELISA等血清学方法更为简便、快速。

（2）检测特异性强，敏感性高。该试纸条以胶体金印迹高亲和力的特异性单抗/多抗为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单抗/多抗的特异性和亲和力（结合力）影响很小，且具有较高的印迹率。因此，该试纸条具有较高的特异性和敏感性，可检测到2纳克的相应病毒的蛋白。

（3）操作简便，快速。使用本实用新型试纸条时无需附加任何其它仪器和试剂，只要将其测试端插入待检样品液中30秒左右，然后在5分钟左右即可判定检测结果。

（4）结果显示直观、准确。该试纸条以显示棕红色的检测印迹和对照印迹作为检测的阳性和阴性印迹，即在纤维素膜上显示两条棕红色印迹，表示在被检测样品中有病毒检出，结果为阳性；在纤维素膜上只显示一条棕红色对照印迹C，表示在被检测样品液中未检出病毒，结果为阴性。结果判定直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。

（5）减少投资和检测成本。使用该试纸条，不需另配其它仪器、设备和试剂，节省大量仪器、设备和附加试剂费用；专业和非专业人士均可随时随地进行现场检测，无需支付专家诊断检查费或送样品去诊断室的路费，节省检测成本，检测费用低。

（6）应用范围广，便于普遍推广应用。本实用新型操作简单，成“一步式”或“傻瓜式”，而且方便携带和保存，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。

附图说明

图1为本实用新型试纸条的俯视结构示意图；

图2为本实用新型的俯视示意图；

图3为支撑层的示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

如图1与图2，一种快速检测小鹅瘟病毒抗体的试纸条，包括支撑层1，支撑层1一端粘贴吸附纤维层2，另一端粘贴吸水层5，在支撑层1的吸附纤维层2与吸水层5之间的部分粘贴纤维素膜层4与金标纤维层3，吸附纤维层2、金标纤维层3、纤维素膜层4、吸水层5之间彼此拼接的交界处纤维互相交叉渗透，在纤维素膜层4上标记以纯化的小鹅瘟病毒的第二抗体的检测印迹6与包含羊/兔抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)的对照印迹7，检测印迹6与对照印迹7并列排列在纤维素膜层上，检测印迹6的位置靠近吸附纤维层，检测印迹6的代号为T；对照印迹7的代号为C。

金标纤维层3为附着有胶体金标记的小鹅瘟病毒的第一抗体的玻璃棉制成。

本试纸条设有吸附纤维层2的一端为入水端（也称为测试端），设有吸水层5的一端为握持端，入水端外侧覆盖有白色的第一保护膜81，握持端覆盖有黄色的第二保护膜82。在吸附纤维层2和金标纤维层3交界处对应的保护膜上偏向于吸附纤维层2一侧0.40cm处印有印迹线9，印迹线的右端印有箭头及MAX字样。

事实上，即使设有不同颜色的保护膜，也可能会使检测人员将入水端与握持端混淆，造成检测事故。所以，在握持端设有便于握持的凹槽83或者凸起（图中只画了凹槽），凹槽83或者凸起标记有大拇指形状，这样设置，既能方便检测人员区分水端与握持端，也方便了握持，更符合人体工学。

如果为凹槽83，凹槽83向内延伸到吸水层5或者支撑层1，方便握持。

如果为凸起，凸起可以为弹性材料，方便握持。

支撑层1可由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成。

如图3，支撑层1在入水端设为网格状，其网孔11的形状为圆形、正方形、三角形、菱形、六边形。正常的试纸条检测时，吸水层5只有支撑层1的相对侧可以吸水（溶液），而本实用新型的支撑层1的入水端为网格状，可以使吸水层5在支撑层1的一侧通过网孔11也能吸水，这样以来，吸水层5可以两面吸水，加快了吸水的速度，缩短了检测所用的时间，提高了工作效率。

吸附纤维层2为以玻璃棉制成。

所述结合层3可由例如玻璃棉、尼龙纤维和聚酯纤维中的任意一种制成。

所述纤维素膜层4采用硝酸纤维素膜、纤维素膜、羧化纤维素膜和聚偏二氟乙烯膜中的任意一种制成。

所述第一抗体和所述第二抗体与所述小鹅瘟病毒结合的位点不同，且第抗体与病毒结合不干扰第二抗体与病毒结合；作为优选，所述第一抗体采用小鹅瘟病毒的单克隆抗体时，第二抗体采用小鹅瘟病毒的多克隆抗体，所述第一抗体采用小鹅瘟病毒的多克隆抗体时，所述第二抗体为小鹅瘟病毒的单克隆抗体。这样，第一抗体和第二抗体可分别与小鹅瘟病毒的不同位点结合。即使第一抗体和小鹅瘟病毒特异性结合后，由于结合位点不同，也不影响第二抗体与小鹅瘟病毒的特异性结合。

检测样品时，取待检的组织，磨碎后重悬，将该试纸条的入水端即吸附纤维层2插入到重悬后的样品溶液中，约30秒后取出该试纸条，水平放置约1-5分钟。当试纸条的入水端（吸附纤维层）插入待检测样品溶液后，由于层析作用待检样品溶液带动待检小鹅瘟病毒（GPV）和结合层3中的胶体金标记的小鹅瘟病毒的第一抗体一起向纤维素膜层4扩散，并最终渗入握持端的吸水层5中。扩散过程中，若待检样品溶液中含有小鹅瘟病毒，则该病毒可与该病毒胶体金标记的第一抗体特异性结合，继续扩散，该小鹅瘟病毒与纤维素膜层4上检测线6中的第二抗体结合，从而检测线6处显示出棕红色的印迹；而对照线7中的羊抗或兔抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)与胶体金标记的第一抗体结合，也形成棕红色的印迹。如果待检样品液中没有GPV，该试纸条只在对照线7处显示出一条棕红色印迹；如果纤维素膜层4上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作失误。

本实用新型制备 及检查方法如下：

（1）羊（兔）抗小鼠IgG和羊（兔）抗兔羊IgG的制备

以饱和硫酸铵法提取小鼠血清中的IgG：取1份血清加2份PBS液（pH7.2）混匀，加等体积饱和硫酸铵液混匀，置4℃冰箱内2小时，在4℃、10000 r/min离心15 min，弃上清液；以适量PBS液（pH7.2）溶解沉淀，加饱和硫酸铵液至其最终浓度为33%，置4℃冰箱内2小时，在4℃、10000 r/min条件下离心15 min，弃上清液，以少量PBS液（pH7.2）溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS液（pH7.2）过夜透析，换液2-3次，在4℃、10000 r/min条件下离心15 min，收集上清液，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度。以50 μg～100 μg(IgG)/kg体重经皮下或肌肉注射抗体阴性健康羊或家兔3-4次，末次免疫20天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1:2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵法提取羊（兔）抗小鼠/鹅的IgG（其提取方法与上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述），同理制备羊/兔抗兔/羊IgG，用于标记本实用新型试纸条的对照印迹。

（2）抗GPV单克隆抗体的制备

差速离心、蔗糖密度梯度离心对GPV鹅胚毒进行浓缩、纯化，甲醛灭活后用福氏佐剂乳化制备免疫原。

以50-100 μg/只剂量的免疫原免疫Balb/c系小鼠三次，每次间隔15-30天；第三次加强免疫后3-4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75% 酒精浸泡5-10 min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，用GNK 洗液混悬脾细胞，1000 r/min离心10 min，收集脾细胞；将1×108个的脾细胞与2×107-5×107个的NS0骨髓瘤细胞混合，再用GNK洗液混悬后，1000 r/min离心10 min弃上清，细胞沉淀于37℃的水浴中在1 min内缓缓加入0.7-1.0 mL的PEG-1500（pH8.5-pH9.0）边加边摇，然后缓慢加入GNK洗液15 ml，以终止PEG的作用；37℃水浴5 min，1000 r/min离心10 min弃上清，将细胞沉淀重悬于1640/HAT选择培养基中，并加入96孔培养板（200 µL/孔），置于37℃、5%CO2培养箱中培养7-10天后，以5-10 μg/mL的纯化GPV VP3蛋白包被96孔酶标板，以酶联免疫吸附试验（ELISA）检测杂交瘤的培养上清，挑取强阳性细胞克隆（OD450≥0.5），连续三次的有限稀释法进行亚克隆，最后筛选得到特异性抗GPV的单克隆细胞。

该杂交瘤细胞染色体数为92-98，其分泌的抗GPV的单克隆抗体特异地与GPV反应，亲和力常数达109-10，轻链亚型为к或λ，重链亚型为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，用于制备金标单克隆抗体。

（3）抗GPV金标单克隆抗体和金标单克隆抗体纤维膜的制备

将筛选到的特异性抗GPV的单克隆细胞扩大培养，PBS洗后1000 r/min离心10 min，收集细胞，以1×106-2×106个/只对经产母鼠进行腹腔注射，10-20天后采集小鼠腹水，4000 r/min离心10 min后的上清即为所需的单克隆抗体腹水。

以柠檬酸钠还原法制备金溶胶：在50-100 mL沸腾的0.01-0.05%氯金酸水溶液中加入2-4 mL的0.5-2%柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径15 nm左右的胶体金。以0.1 mol/L的K2CO3调胶体金pH值至8.5-9.5，以1:1000-1300的印迹比将待印迹的抗GPV单克隆抗体腹水加入pH8.5-9.5的金溶胶中，印迹10 min后，加20wt%的PEG-10000至PEG-10000终浓度达到0.05%，4℃下、1500-3000 r/min离心20 min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃下、15000 r/min离心1小时，弃上清液，获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得胶体金印迹的抗GPV单克隆抗体。

将1:100-1:500稀释的胶体金印迹的上述单克隆抗体吸附于精制玻璃棉（尼龙纤维或聚酯纤维）中，4℃下低温真空干燥，即制得抗GPV金标单克隆抗体纤维膜，即结合层3。

(4）抗GPV多克隆抗体的制备

同上使用灭活的GPV鹅胚毒，单独多次免疫接种抗体阴性健康羊或兔。末次免疫20天后静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1:1024以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵法提取血清中的IgG抗体（方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述）。

（5）上述试纸条的检测操作方法

a 检测样品液的制备：取病雏鹅的组织如脾、胰或肝等，将其剪碎、研磨，以生理盐水制成1:2-1:5 倍的待检测样品悬液，置4℃室温澄清或离心；

b检测操作：将该试纸条入水端插入待检测样品中，插入深度不超过印迹线，约30秒后取出试纸条，水平放置约1-5分钟，同时观察结果。

c结果判断：如果在试纸条的纤维素膜层上只显示出一条棕红色对照线印迹C，表示测检结果呈阴性，说明在被检样品液中未检测出GPV；如果试纸条上的纤维素膜层出现棕红色的对照线印迹C和检测线印迹T，表示检测结果呈阳性，即在待检样品中检出GPV；如果纤维素膜层上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作有误。

（6）上述试纸条的检测原理：

当试纸条测入水端（吸附纤维层2）插入待检测样品溶液后，待检溶液通过层析作用带动待检病鹅小鹅瘟病毒及结合层中的金标抗体一起向纤维素膜层扩散，并最终渗入握持端的吸水层中，扩散过程中待检病毒可与该病毒相对应的金标单抗相结合，进而与纤维素膜层上检测线中的抗该病毒的多抗IgG结合，从而显示出棕红色的检测印迹T；而对照线印迹中的羊抗或兔抗小鼠IgG则可与金标单抗结合，形成棕红色对照印迹C。如果待检样品液中没有GPV，试纸条只显示出一条棕红色对照印迹C；如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作失误。

本实用新型的试纸条所依据的测试原理是：待检样品溶液中的小鹅瘟病毒（GPV）与结合垫上的胶体金标记的GPV第一抗体特异性结合，GPV与胶体金标记的抗体复合物在层析作用的推动下向试纸条握持端移动，当移动至包被GPV第二抗体的测试线时，形成双抗体夹心复合物并聚集显色，而游离的胶体金标记的第一抗体在移动到对照线时与被抗第一抗体的抗体捕获并显色以表明试纸条的有效性。

Claims (2)

1.一种检测小鹅瘟病毒的试纸条，包括支撑层（1），支撑层（1）一端粘贴吸附纤维层（2），另一端粘贴吸水层（5），在支撑层（1）的吸附纤维层（2）与吸水层（5）之间的部分粘贴纤维素膜层（4）与金标纤维层（3），吸附纤维层（2）、金标纤维层（3）、纤维素膜层（4）、吸水层（5）之间彼此拼接的交界处纤维互相交叉渗透，其特征在于：所述纤维素膜层（4）上标记以纯化的小鹅瘟病毒的第二抗体的检测印迹（6）与包含羊/兔抗小鼠免疫球蛋白G的对照印迹（7），检测印迹（6）与对照印迹（7）并列排列在纤维素膜层上，检测印迹（6）的位置靠近吸附纤维层；金标纤维层（3）为附着有胶体金标记的小鹅瘟病毒的第一抗体的玻璃棉制成；

本试纸条设有吸附纤维层（2）的一端为入水端，设有吸水层（5）的一端为握持端，入水端外侧覆盖有白色的第一保护膜（81），握持端覆盖有黄色的第二保护膜（82）；

在吸附纤维层（2）和金标纤维层（3）交界处对应的保护膜上偏向于吸附纤维层（2）一侧0.40cm处印有印迹线（9），印迹线的右端印有箭头及MAX字样；

握持端设有便于握持的凹槽（83），凹槽（83）标记有大拇指形状，凹槽（83）向内延伸到吸水层（5）；

所述纤维素膜层（4）采用硝酸纤维素膜、纤维素膜、羧化纤维素膜和聚偏二氟乙烯膜中的任意一种制成；

支撑层（1）在入水端设为网格状，其网孔（11）的形状为三角形。

2.如权利要求1所述的检测小鹅瘟病毒的试纸条，其特征在于：所述支撑层（1）由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成。