CN202141725U - 一种定性/定量检测乙型肝炎病毒表面抗原的磁珠免疫层析试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种定性/定量检测乙型肝炎病毒表面抗原的磁珠免疫层析试剂盒,包括底板,底板上设有免疫层析分离垫,在免疫层析分离垫的一端顺次搭接有免疫磁珠结合垫和样品垫,在免疫层析分离垫的另一端设有吸水垫;所述的免疫磁珠结合垫是在玻璃纤维素膜或无纺布上附着通过链亲和素-生物素与HbsAg单克隆抗体相偶联的纳米磁珠;所述的免疫层析分离垫是在硝酸纤维素膜上间隔2~5mm设置检测线T线和质控线C线;T线上吸附有鼠源性的HbsAg多克隆抗体,C线上吸附有羊抗鼠的抗体。本实用新型实现了乙型肝炎病毒表面抗原的定性/定量检测,大大提高了检测效率,并降低了检测成本。
Description
技术领域
本实用新型属于免疫层析检测技术领域,特别涉及一种定性/定量检测乙型肝炎病毒表面抗原的磁珠免疫层析试剂盒。
背景技术
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高,据统计,全世界无症状乙肝病毒携带者(HBsAg携带者)超过2.8亿,我国约占1.3亿。多数无症状,其中1/3出现肝损害的临床表现。目前我国有乙肝患者3000万。近年来病毒性肝炎、肝纤维化、脂肪肝、酒精肝、药物性肝损害及肝硬化、肝癌等肝病是当今社会威胁人类健康的主要疾病之一。
乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA病毒,属嗜肝DNA病毒科(hepadnavividae),是直径42nm的球形颗粒。又名Dane颗粒,有外壳和核心两部分。外壳厚7-8nm,有表面抗原(HBsAg),核心直径27nm,含有部分双链,部分单链的环状DNA,DNA聚合酶,核心抗原及e抗原。HBVDNA的基因组约含3200个硷基对。长链的长度固定,有一缺口(nick)此处为DAN聚合酶;短链的长度不定。当HVB复制时,内源性DNA聚合酶修补短链,使之成为完整的双链结构,然后进行转录。HBV DNA的长链有4个开放性读框(ORF),即S区、C区、P区和X区。S区包括前S1前S2和S区基因,编码前S1、前S2和S三种外壳蛋白;C区以包括前C区,C区基因编码HBcAg蛋白,前C区编码一个信号肽,在组装和分泌病毒颗粒以及在HBeAg的分泌中起重要作用;P基因编码DNA聚合酶;X基因的产物是X蛋白,其功能尚不清楚。HBVDNA的短链不含开放读框,因此不能编码蛋白。
HBsAg是乙肝病毒外壳部分的蛋白质,乙肝病毒感染人体后,便在肝细胞内复制装配,其中外壳部分常有剩余,此剩余物进入血液就形成HBsAg血症。由于HBsAg本身不是完整的乙肝病毒,不含核酸,也无DNA聚合酶活力,故无传染性,但有抗原性。由于它常伴随乙肝病毒的存在,故已被定为现症HBV感染的指标之一,检测HBsAg有助于乙型肝炎的诊断。
在急性乙型肝炎,HBsAg常在感染乙肝病毒后6-12周出现,当氨基转移酶(ALT、AST)或胆红素开始上升时,HBsAg滴度达到高峰;当症状出现后HBsAg滴度开始下降,多在发病4~5个月内消失。由于HBsAg是感染乙肝病毒后出现的第一个乙肝病毒标志物,故常用于急性乙型肝炎的早期诊断。在乙型肝炎急性症状消失、肝功能恢复后,而HBsAg仍持续阳性者,常提示肝炎慢性化。另外需要指出的是:有相当一部分HBSAg阳性的肝炎病人,其原先可能就有乙肝病毒感染,常表现为无症状带毒者,病情在不知不觉中进展,一旦出现症状,已是慢性乙型肝炎,甚至已是肝硬化了。
自从二十世纪八十年代,侧向免疫层析技术发展之初,这项技术就被广泛的接受。主要是因为其实验设计的简便性:侧向免疫层析产品具有小而便于携带的优势,而且大多数产品不需要额外的试剂去实现结果,还有液态样品直接可以用于测试,测试结果也能快速简便的读取,而且经常不需要任何仪器的辅助。其强大的功能在于可以将多个样品同时在同一个产品上测量。其容易和其他技术结合起来综合分析,如警察可以再路边上用一个小型仪器同时测量药物和酒精超标情况。免疫层析试纸条的制作相对容易且成本低、材料成分的改进,加工仪器的改进,更加注意生产质量等都可以增加可信度,精确性。
然而,不断涌现的对定量的结果和敏感性的要求对这项技术的提出了更大的挑战。磁性纳米颗粒的出现使得这一技术得到了快速的发展,借助小型仪器对试纸条上免疫磁珠微量磁信号的检测从而对样品实行定量检测,大大提高了检测的灵敏度,使得这一技术得到认可。
纳米磁珠免疫层析检测试剂盒检测的基本原理如下:利用纳米磁珠标记一种抗原或抗体,成为免疫磁珠,在NC膜上包被相应的配对的抗原或抗体,检测时当样品中含有相应的抗体或抗原时,免疫磁珠会和样品中的抗原或抗体结合形成复合物,然后在NC膜上层析,再被捕获线上的抗体或抗原捕获,聚集在检测线上,数分钟后,再通过MICT磁信号检测仪测定检测线上捕获磁珠的含量实现结果的判定。磁珠免疫层析试纸条的最大特点是可以通过MICT磁信号检测仪读取磁珠含量,定量检测样本中分析物的含量,而不只是像传统的胶体金一样只能通过肉眼观察或评价其颜色深浅,因此使得结果更精确灵敏,数据客观,易于读取、保存记录。
实用新型内容
本实用新型解决的技术问题在于提供一种定性/定量检测乙型肝炎病毒表面抗原的磁珠免疫层析试剂盒,将超顺磁性纳米颗粒作为标记物,具有简便快速、定量、实时检测的优势。
本实用新型是通过以下技术方案来实现:
一种定性/定量检测乙型肝炎病毒表面抗原的磁珠免疫层析试剂盒,包括底板,底板上设有免疫层析分离垫,在免疫层析分离垫的一端顺次搭接有免疫磁珠结合垫和样品垫,在免疫层析分离垫的另一端设有吸水垫;
所述的免疫磁珠结合垫是在玻璃纤维素膜或无纺布上附着通过链亲和素-生物素与HbsAg单克隆抗体相偶联的纳米磁珠;
所述的免疫层析分离垫是在硝酸纤维素膜上间隔2~5mm设置检测线T线和质控线C线;T线上吸附有鼠源性的HbsAg多克隆抗体,C线上吸附有羊抗鼠的抗体。
所述的免疫层析分离垫上还覆盖有一层保护膜或标志膜。
所述的免疫磁珠结合垫和样品垫搭接在靠近检测线的一端,吸水垫搭接在靠近质控线的一端。
所述的底板为PVC板,样品垫为玻璃纤维素膜或无纺布,纳米磁珠为超顺磁性纳米磁珠。
与现有技术相比,本实用新型具有以下有益的技术效果:
1)本实用新型通过对免疫层析试剂盒的改进,尤其是对免疫磁珠结合垫和免疫层析分离垫的改进,HbsAg单克隆抗体、HbsAg多克隆抗体、羊抗鼠的抗体(作为二抗)引入到同一个试纸条,实现了乙型肝炎病毒表面抗原的定性/定量检测,大大提高了检测效率,并降低了检测成本。
2)本实用新型通过对免疫层析试剂盒的纳米磁珠及其与抗原或抗体的结合方式进行改进,所使用的超顺磁性纳米磁珠不受其他有色杂质干扰,通过高灵敏度磁性检测仪测量结合在免疫磁性复合物上的微粒所产生的局部磁场效应,进而得出所测分析物的定量结果,并使检测下限高于同类目测法10~1000倍;而链亲和素-生物素系统是一种具有亲和力高、灵敏度高、特异性强、稳定性好的成熟的生物信号放大标记技术。
3)本实用新型提供的免疫层析试剂盒的检测结果,克服了主观观察颜色的缺点,使得判断结果具有客观,准确,更值得信赖;而且其检测结果稳定,实验结果可以保存数月至数年,有利于提供复检的机会并易于保存原始数据。
4)本实用新型提供的免疫层析试剂盒其成本低,操作简单,检测仪器也容易携带,检测灵敏度高,因此可以推广于医院,血站及边远地区卫生条件较差的单位。既可以单人份检测,也可批量检测。
附图说明
图1为磁珠免疫层析试剂盒的侧视图;
图2为磁珠免疫层析试剂盒的俯视图。
其中:1为样品垫;2为免疫磁珠结合垫;3为免疫层析分离垫;4为检测线T线;5为质控线C;6为吸水垫;7为底板。
具体实施方式
下面结合附图对本实用新型做进一步详细描述,所述是对本实用新型的解释而不是限定。
参见图1、图2,一种用于输血筛查联合检测的磁珠免疫层析试剂盒,包括底板7,底板7上设有免疫层析分离垫3,在免疫层析分离垫3的一端顺次搭接有免疫磁珠结合垫2和样品垫1,在免疫层析分离垫3的另一端设有吸水垫6;并且免疫磁珠结合垫2和样品垫1搭接在靠近检测线的一端,吸水垫6搭接在靠近质控线的一端。
免疫层析分离垫3上还覆盖有一层保护膜或标志膜,以起到保护作用;
所述的免疫磁珠结合垫2是在玻璃纤维素膜或无纺布上附着附着通过链亲和素-生物素与HbsAg单克隆抗体相偶联的纳米磁珠;
所述的免疫层析分离垫3是在硝酸纤维素膜上设置检测线T线4,以及质控线C线5;T线上吸附有鼠源性的HbsAg多克隆抗体,C线上吸附有羊抗鼠的抗体(作为二抗)。
下面说明各个组件部分的制备及磁珠免疫层析试剂盒的组装:
1、样品垫的处理:将玻璃纤维膜用作样品垫,在样品垫处理液中浸泡30min后取出在室温下干燥后放入自封袋里保存备用。样品垫处理液:1%-5%的triton X100,0.1-1%的PVP,0.02M、PH7-9的磷酸盐缓冲液。
2、以超顺磁性纳米磁珠作为纳米磁珠,其表面偶联有链亲和素的修饰,通过与生物素化的抗体或抗原混合反应后,使得HbsAg单克隆抗体牢固地偶连到磁珠的表面。
生物素化抗原或抗体的制备:将HbsAg单克隆抗体与预活化的生物素以1∶10的比例混合,室温下反应1小时,并用0.02M,PH7.0~7.4的PBS于4℃透析过夜,加入等体积甘油后-20℃保存备用。
生物素化抗原与链亲和素化磁纳米颗粒的偶联方法为:2mg链亲和素化纳米颗粒溶液中加入生物素化抗原150ug,在垂直旋转混合仪上反应30min,然后用500ul保存缓冲液保存。
3、免疫结合垫的制备:将制备好的免疫磁珠用喷点仪均匀喷于玻璃纤维膜或无纺布上,在20~25℃干燥条件下干燥2~5小时,制成免疫结合垫。
4、免疫层析分离垫的制备:以0.01M、PH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)分别将HbsAg多克隆抗体、羊抗鼠的抗体和生物素化牛血清白蛋白(BSA)配置成2mg/ml的溶液,并用喷膜仪在NC膜上以2μl/cm的量分别划线作为T线和C线,两条线间距为2-3mm,划线后在37℃干燥30min。
5、磁珠免疫层析试剂盒的组装:
在干燥的室内,温度20-25℃,湿度小于30%,将已包被好的NC膜放在PVC板的中部粘贴,在NC膜T线一侧搭接免疫磁珠垫(2mm)粘贴,在免疫磁珠垫另一侧搭接样品垫(3mm),在NC膜的另一侧搭接吸水垫(2mm);最上面可贴一层标志膜,用来保护试纸条。
样品的检测及结果的显示:
将被检血清或尿液平衡至室温,再将试剂盒平放,在样品垫上加入80-100μl被检样品,溶液将溶解结合垫上的标记好的磁珠,并在NC膜上发生层析,然后在5-10min内用磁力检测仪(MICT)检测试纸条特定位置上的磁信号,根据磁信号得出待测样品中HCG的含量进行定量检测,或直接用肉眼观测条带颜色的深浅,从而判断血清中是否含有乙肝表面抗原,进行定量检测。
Claims (4)
1.一种定性/定量检测乙型肝炎病毒表面抗原的磁珠免疫层析试剂盒,其特征在于,包括底板,底板上设有免疫层析分离垫,在免疫层析分离垫的一端顺次搭接有免疫磁珠结合垫和样品垫,在免疫层析分离垫的另一端设有吸水垫;
所述的免疫磁珠结合垫是在玻璃纤维素膜或无纺布上附着通过链亲和素-生物素与HbsAg单克隆抗体相偶联的纳米磁珠;
所述的免疫层析分离垫是在硝酸纤维素膜上间隔2~5mm设置检测线T线和质控线C线;T线上吸附有鼠源性的HbsAg多克隆抗体,C线上吸附有羊抗鼠的抗体。
2.如权利要求1所述的定性/定量检测乙型肝炎病毒表面抗原的磁珠免疫层析试剂盒,其特征在于,所述的免疫层析分离垫上还覆盖有一层保护膜或标志膜。
3.如权利要求1所述的定性/定量检测乙型肝炎病毒表面抗原的磁珠免疫层析试剂盒,其特征在于,所述的免疫磁珠结合垫和样品垫搭接在靠近检测线的一端,吸水垫搭接在靠近质控线的一端。
4.如权利要求1所述的定性/定量检测乙型肝炎病毒表面抗原的磁珠免疫层析试剂盒,其特征在于,所述的底板为PVC板,样品垫为玻璃纤维素膜或无纺布,纳米磁珠为超顺磁性纳米磁珠。
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