CN201413329Y - 爱泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白免疫球蛋白a抗体联合检测试纸 - Google Patents
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Abstract
本实用新型是涉及一种爱泼斯坦－巴尔EB病毒衣壳抗原VCA和胸苷激酶TK蛋白免疫球蛋白AIgA抗体联合快速检测试纸。在塑料支撑板一端上设置上样垫，在上样垫一端连接标记有鼠抗人IgA抗体的胶体金垫，在胶体金垫一端连接硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫，硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线和质控线，检测线为分开包被重组表达的EB病毒VCA和TK蛋白抗原或抗原片段，质控线为包被在NC膜上的抗鼠免疫球蛋白G(IgG)构成。检测时将被检样品加在试纸条卡上样垫上，然后直接观察免疫反应结果，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
Description
技术领域
本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法快速检测爱泼斯坦-巴尔EB病毒衣壳抗原VCA和胸苷激酶TK蛋白免疫球蛋白AIgA抗体联合快速检测试纸。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)是一种感染人类并引起重要疾病的DNA病毒。流行病学、血清学和分子生物学资料证实，与EBV感染有关的疾病很多，特别是与鼻咽癌nasopharyngeal carcinoma，NPC的发生有密切关系。1997年世界卫生组织的国际抗癌联盟年会上把EBV归类为第一类致癌物。血清EB病毒-衣壳抗原-免疫球蛋白AEBV-VCA-IgA，EB病毒-早期抗原-免疫球蛋白A(EBV-EA-IgA)检测目前已用于NPC的临床辅助诊断。衣壳抗原-免疫球蛋白AVCA-IgA检测通常用于筛查以排除NPC的诊断，灵敏度高于90％，但有报道表明其特异性有时会低于70％；相反，早期抗原-免疫球蛋白A EA-IgA检测目前被用于鼻咽癌的确定性检测，特异性高于90％而灵敏度低于80％，两者在鼻咽癌可疑病例诊断时有互补作用。对于鼻咽癌疑似病人，VCA-IgA其阴性预测率达98％，可作为排除鼻咽癌的指标，仅有低于10％的假阴性率；VCA-IgA阳性结果由于有时会产生高达30％的假阳性率，故检测阳性不作为的NPC阳性确认结果。
TK蛋白是EB病毒在DNA的合成调控中起重要作用的蛋白。Connolly等[Conolly Y，Littler E，Sun N，et al.Antibodies to Epstein Barr virus thymidinekinase：a characteristic marker for the serological detection of nasopharyngealcarcinoma[J].Int.JCancer，2001，15：692-697]用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测人体血清中针对EB病毒TK蛋白的IgA抗体，证实此抗体是一个良好的鼻咽癌标志物，与EBV-VCA-IgA相比，具有较高的检测灵敏度和更高的特异性。近年来陆续也有相关报道支持这一观点。因而将TK-IgA用于临床辅助诊断应该会进一步提高鼻咽癌诊断的可靠性。以上所有的报道基本采用ELISA方法对IgA进行检测，没有用免疫层析胶体金技术检测EBV-VCA-IgA和EB病毒-胸苷激酶-免疫球蛋白AEBV-TK-IgA的报道，特别是制备成同一种试剂进行快速联合检测。运用免疫层析胶体金技术，研制新型的EB病毒抗体诊断试剂，将为鼻咽癌的诊断提供更多更好的方法。
运用免疫层析胶体金技术诊断时，标记鼠抗人IgA抗体，包被VCA和TK抗原，检测时在上样垫上加入50-100ul被检样品，样品中的IgA将和标记的鼠抗人IgA结合形成复合物，样品中若含有抗VCA或抗TK-IgA抗体，亦同样形成复合物，在样品的带动下扩散到NC膜上进一步层析，当遇到包被在NC膜上T线处VCA或TK抗原时，抗VCA或TK-IgA-胶体金复合物将和T线上的抗体结合，被捕获在包被处，当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成肉眼可见的T线；若血清中不含特异性抗体IgA抗体，则不能形成免疫复合物，亦不能形成T线，C线作为试剂的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。根据C、T线的有无直接用肉眼判定结果，操作简单，整个反应在20分钟内完成。
发明内容
本发明的目的是提供一种爱泼斯坦-巴尔EB病毒衣壳抗原VCA和胸苷激酶TK蛋白免疫球蛋白AIgA抗体联合快速检测试纸，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
本发明提供一种爱泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白免疫球蛋白A抗体联合检测试纸，其特征是在塑料支撑板8一端上设置上样垫1，在上样垫1一端连接标记有鼠抗人IgA抗体的胶体金垫2，在胶体金垫2一端连接硝酸纤维素膜3，在硝酸纤维素膜3的另一端连接吸样垫4，硝酸纤维素膜3包被有相互分离的检测线5、6和质控线7，检测线5、6为分开包被重组表达的EB病毒VCA和TK蛋白抗原或抗原片段，质控线7为包被在NC膜上的抗鼠免疫球蛋白GIgG构成。
所述的爱泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白免疫球蛋白A抗体联合检测试纸，其特征在于所述的上样垫1为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫4由吸水滤纸，所述的抗鼠免疫球蛋白GIgG，是羊抗鼠或兔抗IgG构成。
检测线为分开包被在NC膜上的重组表达的EB病毒VCA和TK蛋白抗原或抗原片段，质控线为包被在NC膜上的抗鼠IgG，如羊抗鼠或兔抗IgG。标记的胶体金蛋白为鼠抗人IgA抗体。单克隆或多克隆抗体。
上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成，符合胶体金类检测试剂的一般要求。
抗原的包被方法为：以0.01M pH 7.2-7.4磷酸盐缓冲液(PBS)将包被抗原稀释成0.2-2mg/ml的溶液，优选为0.5-1.0mg/ml，用喷膜仪在NC膜下部分别划线，包被T1，T2线，同时在NC膜上部包被抗鼠IgG抗体作为C线，然后干燥NC膜以固定抗原。
标记胶体金颗粒的方法为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为20-50nm的胶体金溶液，优选为30-40nm胶体金溶液。制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH7.0-9.6，优选为pH 8.6。按100ml胶体金溶液加入0.5-2mg鼠抗人IgA，优选为1mg鼠抗人IgA。室温搅拌30-60min，再加入适量牛血清白蛋白BSA，聚乙二醇PEG20000封闭，离心，弃上清，复溶至100ml，铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间(温度20-25℃，湿度小于30％)干燥，切成适当宽度的小条，制成胶体金垫。
试纸的装配方法为：在干燥室内(温度20-25℃，湿度小于30％)，取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫；在NC膜C线一侧搭接吸样垫；最后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条，切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成检测卡。
试纸的检测方法为：将被检血清或血浆平衡至温室，将试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50-100ul被检样品，样品溶解胶体金并在NC膜上层析，然后用肉眼直接观察在5-20分钟内C、T线的出现情况，判定检测结果。T1线出现说明VCA-IgA阳性，T2线出现说明TK-IgA阳性。
本发明的有益效果是：提供一种利用免疫层析胶体金技术检测EB病毒VCA和TK蛋白IgA抗体的联合快速检测试纸。同时检测两种抗原的IgA，而现有的ELISA方法无法同时检测。VCA-IgA倾向于诊断的高灵敏度，相对于早期抗原-免疫球蛋白A，胸苷激酶-免疫球蛋白A同时倾向于诊断的高灵敏度和高特异性。两项检测同为阳性或同为阴性时，检测的准确性较单项检测更高，一项检测为阳性时作为怀疑对象作进一步的检测。同时本发明运用胶体金免疫层析技术检测方法，不同于ELISA方法，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
附图说明：
图1泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白免疫球蛋白A抗体联合检测试纸结构示意图。
附图符号说明：
1：上样垫 2：胶体金垫
3：硝酸纤维素(NC)膜 4：吸样垫
5：VCA检测线 6：TK检测线
7：质控(C)线 8：塑料支撑板
具体实施方式
实施例1：泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白免疫球蛋白A抗体的联合快速检测试纸制备：
1主要材料
1.1EBV的VCA、TK抗原：利用基因工程重组表达，由中国医学科学院提供，用于硝酸纤维素NC膜的检测线的包被；鼠抗人IgA单克隆抗体，军事医学科学院产品，用于胶体金的标记；羊抗鼠IgG：军事医学科学院产品，用于NC膜质控线的包被。氯金酸：Sigma公司产品；NC膜：Millipore公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白：Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。
1.2鼻咽癌(NPC)阳性或阴性内控血清 由公司收集并配制。
2方法
2.1IgA胶体金标记 氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2M K2CO3将溶液调到pH7.0、pH8.6和pH9.6。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.5mg、1mg、2.0mg将鼠抗人IgA缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌30-60分钟，再加入到终浓度为0.1％的PEG 20000和1％的BSA进行封闭，标记结束后以12000r/m离心，弃上清，沉淀按原体积复溶至不同配比的胶体金工作液硼酸盐缓冲液，pH8.0，含BSA、羊血清，蔗糖和表面活性剂中。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺22cm2的比例加样于无纺布上，在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥2-4小时，制成胶体金垫。
2.2VCA和TK蛋白的包被 用0.01M pH 7.2 PBS将VCA和TK分别稀释成0.2/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜下部按1ul/cm进行划线包被，同时在NC膜上部包被抗鼠IgG抗体，用于产品的质控，包被完成后将NC膜在在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥8-10小时。
2.3联合快速检测试纸的组装 在干燥室内取塑料支撑板8一端上设置上样垫1，在上样垫1一端连接标记有鼠抗人IgA抗体的胶体金垫2(搭胶体金垫的1/5)，在胶体金垫2一端连接硝酸纤维素膜3，在硝酸纤维素膜3的另一端连接吸样垫4(搭吸样垫的1/10)，硝酸纤维素膜3包被有相互分离的检测线5、6和质控线7，检测线5、6为分开包被重组表达的EB病毒VCA和TK蛋白抗原或抗原片段，质控线7为包被在NC膜上的抗鼠免疫球蛋白GIgG构成然后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成抗体检测试剂卡。上样垫1为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫4由吸水滤纸，所述的抗鼠免疫球蛋白GIgG，是羊抗鼠或兔抗IgG构成。
2.4检测方法 将被检血清或血浆平衡至温室，将试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50-100ul被检样品，样品溶解胶体金并在NC膜上层析，然后用肉眼直接观察在5-40分钟内C、T线的出现情况，判定检测结果。T1线出现说明VCA-IgA阳性，T2线出现说明TK-IgA阳性。
2.5试纸工艺参数调试 将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，用标准的NPC阳性和阴性血清检测，发现最佳组合。
2.6性能分析 以优化的工艺对数制备小样，按标准方法对试剂的分析灵敏度、分析特异性、不精密度和稳定性进行分析。
3 结果
3.1试纸工艺参数的确定根据小样的检测结果，确定了胶体金标记IgA的最佳pH值为8.6；最佳标记浓度为0.5-1mg每100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为10mM硼酸酸盐缓冲液，pH8.6，含0.5％BSA、10％羊血清，2％蔗糖，0.2％Tween 20；最佳包被VCA、TK蛋白的包被浓度各为0.5-1mg/ml。检测结果的最佳判定时间为5-30分钟。
3.2性能分析 分析性能表明试剂具有良好的灵敏度，对内控阳性血清最高的检测滴度到1∶128，和ELISA试剂接近。对一般性血清干扰物如高血脂、溶血、黄疸无非特异性反应，对艾滋病病毒(HIV)、乙肝表面抗原(HBSAG)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒(TP)等传染病血清样本无非特异性反应，对甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺素特异性抗原(PSA)等其它肿瘤标志物无非特异性反应。对肝素、乙二铵四乙酸二钠(EDTA)和枸橼酸纳等抗凝剂亦无非特异性反应。
实施例2：联合快速检测试纸临床样本试验
1材料
1.1EBV VCA和TK蛋白IgA抗体的联合快速检测试纸，由公司按优化的参数制备。
1.2NPC临床血清：NPC阳性血清，包括NPC 1、2、3和4期血清，共420份；NPC阴性血清：400份。由公司在相关医院获得。
2方法
按优化的方法进行。对临床样本的检测结果进行分析统计。
3结果
样本的检测结果如下：
表1联合快速检测试纸对临床样本的检测结果
从检测结果可以看出，联合检测试纸对鼻咽癌阳性样本检测时全为阳性的检出率为395/420＝94％，只较单独VCA阳性95.7％稍有下降，但不明显。而在阴性样本的检测方面，全为阳性的假阳性为1.25％，较VCA阳性8.5％有明显下降。全为阴性的特异性为89.5％，较单独的VCA特异性91.5％略有上升，但多数是一个阳性的可疑检测结果，TK检测的特异性达到97.3％。可以看出联合检测的试纸条提供了更多的检测信息，综合检测判定结果更为准确，可靠
Claims (2)
1、一种爱泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白免疫球蛋白A抗体联合检测试纸，其特征是在塑料支撑板(8)一端上设置上样垫(1)，在上样垫(1)一端连接标记有鼠抗人IgA抗体的胶体金垫(2)，在胶体金垫(2)一端连接硝酸纤维素膜(3)，在硝酸纤维素膜(3)的另一端连接吸样垫(4)，硝酸纤维素膜(3)包被有相互分离的检测线(5)、(6)和质控线(7)，检测线(5)、(6)为分开包被重组表达的EB病毒VCA和TK蛋白抗原或抗原片段，质控线7为包被在NC膜上的抗鼠免疫球蛋白G(IgG)构成。
2、根据权利要求1所述的爱泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白免疫球蛋白A抗体联合检测试纸，其特征在于所述的上样垫(1)为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫(4)为吸水滤纸，所述的抗鼠免疫球蛋白G(IgG)，是羊抗鼠或兔抗IgG构成。
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