CN204719052U - 联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型是一种联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒，其上样垫的一端紧密压接含有“特异性重组抗原east-6+LAM+38KDa+16kDa的生物素-链霉亲和素-胶体金”的复合物偶联垫，复合物偶联垫的另一端紧密压接硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线T1、检测线T2和质控线，检测线T1为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，检测线T2为包被在NC膜上的抗人IgG抗体，质控线为包被在NC膜上的羊抗鼠IgG抗体，硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫（4），本试剂盒具有敏感性高、特异性强、操作简便、反应快速和经济实用等优点。
Description
技术领域
本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒。
背景技术
结核分枝杆菌是引起结核病的病源菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。因此及时诊断和治疗结核病，对于控制其发展和阻断其传播均有重要意义。
目前诊断结核病的实验室方法很多，对结核分枝杆菌的检测的主要方法是痰结核菌常规培养法，是结核病检测的金标准。而结核分枝杆菌特异性抗体免疫学检测方法主要包括ELISA和胶体金法。同时检测结核分枝杆菌IgM和IgG两种抗体有利于对被检对象进行全面的判定，有利于结核病的辅助诊断，有利于结核病的防控。在胶体金的检测方法中，大多数是检测结核分枝杆菌（TB）IgG的报道，也有同时检测结核分枝杆菌（TB）IgM和IgG抗体的检测试纸相关报道，但均未能实现结核分枝杆菌的east-6+LAM+38KDa+16kDa特异性重组抗原的标记，会出现漏检的问题。
本实用新型联合检测结核分枝杆菌抗体试剂盒，突破了传统技术难点，引入了生物素和链霉亲和素反应系统，将鼠源的特异性重组抗原east-6+LAM+38KDa+16kDa与活化的生物素BHZ偶联，将链霉亲和素与胶体金制备成链霉亲和素-胶体金复合物，然后将二者根据一定比例混合偶联后固相到玻璃纤维素膜上，实现结核分枝杆菌特异性抗原的标记和信号的放大，在NC膜第一检测线和第二检测线上分别包被鼠抗人IgM、鼠抗人IgG抗体，质控线上包被羊抗鼠IgG抗体，当样本中有结核分枝杆菌抗体IgM或者IgG时，首先被与生物素BHZ结合的结核分枝杆菌的重组抗原结合，形成复合物，通过侧向层析作用与第一检测线或者第二检测线上的鼠抗人IgG或者鼠抗人IgM抗体结合而显色，呈现阳性反应，否则呈现阴性反应。 同时由于一个链霉亲和素可以跟多个生物素结合，即一个“生物素-特异性重组抗原-结核分枝杆菌抗体”可以和多个亲和素标记的胶体金结合，起到了信号放大作用，提高了产品的灵敏度，大大降低了漏检率。
生物素-链霉亲和素系统是一种新型的生物反应放大系统，此技术利用生物素和链霉亲和素均可偶联抗原、抗体等生物大分子，同时也可偶联酶、荧光素、胶体金、乳胶等示踪物质，同时生物素、亲和素之间具有高度亲和力和放大作用的特点，能够在免疫反应中起到信号放大作用，能够提高反应的灵敏度和特异性而被广泛应用于检测产品的试剂盒开发。
发明内容
本实用新型的目的是提供一种联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒，具有敏感性高、特异性强、操作简便、反应快速和经济实用等优点。
本实用新型提供一种联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒，其特征在于这种方法的试剂盒的组成，上样垫(1) 的一端紧密压接含有“特异性重组抗原east-6+LAM+38KDa+16kDa的生物素-链霉亲和素-胶体金”的复合物偶联垫(2)，复合物偶联垫(2)另一端紧密压接硝酸纤维素(NC)膜(3)，硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线T1 (5)、检测线T2(6)和质控(C)线，检测线T1 (5) 为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，检测线T2(6) 为包被在NC膜上的抗人IgG抗体，质控(C)线(7)为包被在NC膜上的羊抗鼠IgG抗体，硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫(4) 形成试纸。
所述的一种联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒，其特征在于生物素-链霉亲和素对检测信号的放大作用，将鼠源的特异性重组抗原east-6+LAM+38KDa+16kDa与活化的生物素BHZ偶联，将链霉亲和素与胶体金制备成链霉亲和素-胶体金复合物，然后将二者根据一定比例混合偶联后固相到玻璃纤维素膜上，实现结核分枝杆菌特异性抗原的标记信号的放大。
所述的一种联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒，其特征在于所述的重组抗原，结核分枝杆菌特异性的抗原主要包括east-6、LAM、38KDa、16kDa 4种，其特征在于这些抗原的特异性基因片段重组联合形成结合分枝杆菌的east-6+LAM+38KDa+16kDa重组抗原，能够提高结核病检测检测结果的准确性。重组抗原可以利用基因工程重组表达或在培养病毒中纯化。
所述的一种联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒，其特征在于链霉亲和素与胶体金颗粒的偶联作用，生物素BHZ与特异性结核分枝杆菌重组抗原的偶联，生物素与链霉亲和素的偶联，通过四者的偶联作用形成复合物，利用胶体金的显色作用，实现检测信号的可视和放大。
所述的一种联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒的上样垫（1）为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫（4）由吸水滤纸构成。
所述的一种联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒，样本要求如下：
人体血液中的某些成分具有潜在的传染性，操作时应按照微生物和生物医学实验室生物安全通则进行。血清样本按照常规方法采集获得。
如果不能立即检测，3天以内的样本可以4度保存，如果放置-20度至少保存3个月。
测试前将冷冻保存的样本慢慢恢复至室温后混匀使用，避免样本反复冻融。
检测样本中如果有明显颗粒物或者沉淀时，离心取上清进行检测。
所述的一种联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒其检测方法为：将被检血清或血浆平衡至温室，将试剂平放，在上样垫上用滴管或者移液器取2-3滴或者60—90ul血清，使金标链霉亲和素-生物素复合物溶解后在NC膜上层析，然后用肉眼直接观察在15分钟内C、T1、T2线的出现情况，并判定检测结果。
本实用新型的有益效果是：提供一种联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒，通过引入生物素-链霉亲和素的反应系统，能够起到检测信号放大作用，提高产品灵敏度和反应特异性，降低产品的漏检率。具有敏感性高、特异性强、操作简便、反应快速和经济实用等优点。同时试剂盒通过在NC膜上包被鼠抗人IgM和IgG抗体，实现对血液中结核分枝杆菌抗体的联合检测，一次检测获得两种检测指标，节约时间和成本，减轻患者的痛苦。
附图说明
图1 结构示意图
附图符号说明：
1：上样垫；2：复合物偶联垫；3：NC膜；4：吸样垫
5：检测线T1；6：检测线T2；7：质控（C）线；8：塑料支撑板
具体实施方式
1 主要材料
1.1结核分枝杆菌（TB）特异性重组抗原：杭州启泰生物技术有限公司，east-6、LAM、38KDa、16kDa优势表位区段，经过特殊修饰、重组融合，用于标记；生物素BHZ、链霉亲和素：美国Alfa公司，用于抗原偶联和标记；羊抗鼠IgG抗体：菲鹏生物股份有限公司产品，用于NC膜质控线包被；鼠抗人IgM和IgG抗体：Arista公司产品，用于NC膜包被；氯金酸：Sigma公司产品；硝酸纤维素（NC）膜：Millipore公司产品；酪蛋白钠：Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。
1.2 血清样本 由公司在相关医院获得。
2 方法
2.1 结核分枝杆菌特异性抗原的标记 将胶体金溶液用缓冲溶液调整PH值后与一定浓度的链霉亲和素进行偶联；同时将结核分枝杆菌特异性重组抗原与生物素BHZ进行偶联，将两种偶联物以一定比例混合，然后以不同浓度的酪蛋白、BSA及其他有封闭效果的蛋白或者化合物分别对标记物进行封闭；标记结束后以12000 r/m离心，弃上清，用washbuffer对沉淀进行吹洗，以12000 r/m离心，弃上清，用磷酸盐缓冲液将沉淀复溶至原体积，然后将复溶液按1ml溶液铺20cm2的比例加样于无纺布、玻璃纤维素膜或者聚酯膜上，在温度20-25℃，相对湿度在＜30%的干燥环境中将标记物固相化。
2.2 鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体的包被 用0.01M pH7.2 PBS将鼠抗人IgM抗体和鼠抗人IgG抗体分别稀释到一定浓度，然后用喷膜仪在NC膜下部按1ul/cm进行分别划线包被，同时在NC膜上部包被羊抗鼠IgG抗体，用于产品的质控，包被完成后将NC膜在在温度20-25℃，相对湿度在＜30%的干燥间干燥2-5小时。
2.3 试剂盒的组装 在干燥室内（温度20-25℃，相对湿度＜30%）取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接复合物偶联垫（搭复合物偶联垫的1/3）粘贴，在复合物偶联垫另一侧搭接粘贴上样垫（搭胶体金垫的1/5）；在NC膜C线一侧搭接吸样垫（搭吸样垫的1/10）；然后用裁剪机将贴好塑料板切成3.5mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒。
2.4 检测 将被检血清或血浆平衡至温室，将试剂盒平放，在上样垫上用滴管或者移液器取2-3滴或者60—90ul血清，使金标链霉亲和素-生物素复合物溶解后在NC膜上层析，然后用肉眼直接观察在15分钟内C、T1、T2线的出现情况，并判定检测结果。
3、结果
在侧向层析的作用下，若样品中含结核分枝杆菌IgG抗体或者IgM抗体，则和复合物偶联垫上的“特异性重组抗原east-6+LAM+38KDa+16kDa的生物素-链霉亲和素-胶体金”复合物结合，并扩散到NC膜上进一步层析，当遇到包被在NC膜上T1线处的鼠抗人IgM抗体时，已与复合物结合的IgM抗体则和包被的鼠抗人IgM抗体结合，被捕获在T1线处；当遇到包被在NC膜上T2线处鼠抗人IgG抗体时，已与复合物结合的IgG抗体则又和包被的鼠抗人IgG抗体结合，被捕获在T2线处；当被捕获的偶联复合物达到一定数量时，则形成肉眼可见的T1或T2线；若血清中不含特异性抗体，则不能被鼠抗人IgM抗体和鼠抗人IgG抗体捕获，亦不能形成T线，C线作为试剂的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出线；若C线不出线，则表明试剂盒无效。
Claims (2)
1.一种联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒，其特征在于这种试剂盒的组成，上样垫的一端紧密压接含有“特异性重组抗原east-6+LAM+38KDa+16kDa的生物素-链霉亲和素-胶体金”的复合物偶联垫，复合物偶联垫的另一端紧密压接硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线T1、检测线T2和质控线，检测线T1为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，检测线T2为包被在NC膜上的抗人IgG抗体，质控线为包被在NC膜上的羊抗鼠IgG抗体，硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫（4）形成试剂盒。
2.根据权利要求1所述的一种联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒，其特征在于上样垫为玻璃纤维素膜或无纺布，复合物偶联垫为玻璃纤维素膜、无纺布或者聚酯膜，吸样垫为吸水滤纸。
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| CN201520311622.6U CN204719052U (zh) | 2015-05-15 | 2015-05-15 | 联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒 |
Publications (1)
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|---|---|
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| CN201520311622.6U Active CN204719052U (zh) | 2015-05-15 | 2015-05-15 | 联合检测结核分枝杆菌抗体的试剂盒 |
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106290860A (zh) * | 2016-07-27 | 2017-01-04 | 郑州点石生物技术有限公司 | 结核杆菌检测试纸 |
| CN106885901A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-06-23 | 上海埃文生物科技有限公司 | 特发性膜性肾病双联检测试剂盒 |
| CN111868528A (zh) * | 2018-04-03 | 2020-10-30 | 赛诺菲 | 侧向流动免疫测定条状装置 |
| CN113341138A (zh) * | 2021-05-21 | 2021-09-03 | 长沙兴嘉生物工程股份有限公司 | 一种同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡及其制备方法与应用 |
| CN111868528B (zh) * | 2018-04-03 | 2024-10-01 | 赛诺菲 | 侧向流动免疫测定条状装置 |
-
2015
- 2015-05-15 CN CN201520311622.6U patent/CN204719052U/zh active Active
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