CN207336547U - 用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，所述诊断试纸条包括设在硬质塑料底板上依次相连的吸水滤纸、固定有抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体（检测区）与兔抗小鼠IgG（质控区）的醋酸纤维膜的检测垫、标记有抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金垫和放置样品的样品垫。本实用新型胶体金试纸条用于肉眼检测溶液中的乙酰胆碱酯酶，具有以下优点：①试剂和样本用量极小，样本量可低至10～20μl，因而可以增加标本洗脱液中乙酰胆碱酯酶的浓度，不易出现假阴性结果；②不需贵重仪器，更适于现场应用；③时间大大缩短，提高了检测速度；④试纸条可在室温保存，只需保持试纸条干燥即可。

Description

用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条

技术领域

本实用新型涉及免疫诊断学检测领域，具体涉及用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条。

背景技术

随着社会工业的发展，周围神经损伤的发病率逐年上升。目前主要的治疗方式为周围神经缝合重建技术。而神经缝合最大的难题在于如何在手术中快速准确鉴别神经干内运动束和感觉束。目前临床上尚缺乏能在短时间内准确鉴别周围神经束性质的方法，一旦发生不同性质神经束的错误吻合必将严重影响术后神经功能的恢复率。因此如何快速准确鉴别周围神经束的性质已成为当今显微外科极其关注的世界难题。

免疫层析法(immunochromatography)是一种快速可靠的诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液、血清和溶液)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

目前，采用在免疫传感器反应芯片表面固化胆碱酯酶抗体的方法，利用免疫传感器灵敏度高、快速、准确、特异性强的特点，快速检测溶液中胆碱酯酶的含量。根据运动神经的乙酰胆碱酯酶含量远高于感觉神经的事实，此方法已经成功用于鉴别脊髓的前根和后根(1、Sui T,Ge Y,Liu W,Zhao ZK,Zhang N,Cao X.An acetylcholinesterase antibody-based quartz crystal microbalance for the rapid identification of spinalventral and dorsal roots.PLoS One.2013Jul 23；8(7):e69049.2、Sui T,Que J,KongD,Xie H,Wang D, Shi K,Cao X,Li X.Rapid identification of spinal ventral anddorsal roots using a quartz crystal microbalance.Neural Regen Res.2013Mar 15；8(8):686-92.)本方法的建立为临床快速鉴别诊断周围神经感觉与运动支提供了可能。

但是此方案尚存在下列不足，影响其在临床的推广使用：

1、芯片稳定性较差：已有方案是首先在晶体金属表面建立一层惰性疏水物质，主要是聚乙烯亚胺和3-氨丙基-三乙氧基硅烷，然后再用戊二醛作为交联试剂乙酰胆碱酯酶抗体结合。戊二醛化学性质较为活泼，一旦被空气氧化，其结合抗体的能力会降低，影响抗原抗体在芯片表面的结合，不但会影响传感器的敏感性，也会使结果随抗体与芯片结合的能力不同而发生改变。芯片的稳定性较差，直接限制其在临床的应用。

2、芯片使用的便利性较差：现有方案中，开始检测前首先是将芯片激活，再将戊二醛与芯片结合，再将抗体注射至传感器的反应池中。操作较为繁琐，且抗体需要冷藏或冷冻保存，抗体保存不当也会使其效价降低，传感器的敏感度降低。

3、方案中所使用的设备昂贵，每台设备约需人民币50万元，即使简化配置，也需人民币25万元以上。此外此方案操作繁琐，操作人员需要较为熟练的技术。

4、干扰因素较多，影响结果的判读。免疫传感器所依据的原理是抗原抗体反应，其特异性取决于抗体的特异性。上述方案所使用的单克隆抗体，其抗原来源于合成多肽，所制备的抗体可以识别乙酰胆碱酯酶的全蛋白，包括人红细胞表面也含有乙酰胆碱酯酶。用于检测的神经断面溶液中乙酰胆碱酯酶的含量极微(1μg/ml左右)，所以手术中的血液污染会影响免疫传感器对胆碱酯酶的读取，不可避免地会影响结果的判断。

5、免疫传感器是基于石英震荡天平技术(QCM)，QCM在液态环境中检测得到的芯片的频率变化值(即QCM信号)是由芯片表面质量改变与溶液粘弹性改变共同引起的，数据分析的复杂性显然易见。排除溶液粘弹性因素的影响很困难。

实用新型内容

实用新型目的：为了克服现有免疫传感器对神经束性质进行判断方法的不足，本实用新型所要解决的技术问题是提供了一种直接用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，用于实时检测神经束的性质。该试纸条可以通过肉眼判断神经束洗脱液中的乙酰胆碱酯酶的含量，从而快速鉴别出周围神经运动束与感觉束，实现运动束对运动束、感觉束对感觉束正确吻合。

技术方案：为了解决上述问题，本实用新型的技术方案是提供了一种用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，所述诊断试纸条包括设在硬质塑料底板上依次相连的吸水滤纸、硝酸纤维素膜的检测垫、质控区、检测区、胶体金垫以及样品垫，所述检测垫上的质控区上固定有市售兔抗鼠IgG，检测垫上的检测区固定有抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。

其中，上述抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体为小鼠抗乙酰胆碱酯酶抗体。

其中，上述质控区喷涂有能与乙酰胆碱酯酶胶体金标记抗体相结合的抗体。

其中，上述胶体金垫喷涂有胶体金标记的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。

其中，上述胶体金标记的抗胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金直径为20nm～100nm、抗胆碱酯酶单克隆抗体浓度为45μg～100μg/ml。

进一步地，作为优选，上述胶体金标记的抗胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金直径为40nm～100nm、抗胆碱酯酶单克隆抗体浓度为64μg～100μg/ml。

其中，上述胶体金标记的抗胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金直径为40nm、抗胆碱酯酶单克隆抗体浓度为64μg/ml或100μg/ml。

本实用新型的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体可以为常规市售的小鼠抗乙酰胆碱酯酶抗体。

本实用新型的胶体金标记的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体可以为常规市售的胶体金标记的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。

本实用新型中的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体也可以通过实验室自制的方法获得，具体制备方法，包括以下步骤：

1)免疫原的获得：利用乙酰胆碱酯酶单克隆抗体与大鼠神经组织通过免疫共沉淀法，得到神经组织的乙酰胆碱酯酶蛋白与抗体复合物；

2)将乙酰胆碱酯酶蛋白与抗体复合物用甘氨酸溶液解离下来，透析除去甘氨酸得到乙酰胆碱酯酶蛋白，作为免疫原；

3)小鼠免疫：挑选六只雌性6周龄的BALB/C小鼠，用免疫原按时间周期进行基础免疫和加强免疫，整个周期为7到10周，第3次加强免疫后根据具体实验要求进行处理或者继续加强免疫；

4)融合：在第二次加强免疫7天后和第三次加强免疫7天后分别进行阳性血的采集，进行ELISA检测效价，根据ELISA测定的小鼠血清稀释到1：10000时OD值需达到0.5以上，加强免疫三天后的小鼠，拉颈猝死后，取出脾脏研磨后，按常规方法进行融合，筛选的阳性孔进行多次亚克隆，直至100％阳性，即得到单克隆抗体。

其中，本实用新型的胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体也可以通过以下方法获得：通过将纯化后的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体与大鼠脑组织进行杂交，进而获取特异性的单克隆抗体作为胶体金试纸条的备选；然后将选取的特异性的单克隆抗体分别进行HRP标记，进行两两组合配对检测，确定可夹心检测标准乙酰胆碱酯酶的抗体对作为配对抗体即得胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。

本实用新型用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条的制备方法，包括以下步骤：

1)在硬质塑料底板自上而下依次黏贴吸水滤纸、硝酸纤维素膜的检测垫，胶体金垫(吸水玻璃纤维)和样品垫(吸水玻璃纤维)，真空干燥状态下保存，备用。

2)按照试纸条组装步骤，分别将抗乙酰胆碱单克隆抗体标记不同直径的胶体金制成胶体金垫，能配对的抗乙酰胆碱单克隆抗体喷点到检测垫的检测区，将兔抗鼠IgG喷点到检测垫的质控区；

3)将胶体金垫插入样品垫和检测垫之间，将标准乙酰胆碱酯酶的PBST溶液滴涂到样品垫上，跑样10分钟，根据检测区域现象筛选出可用于检测标准乙酰胆碱酯酶的夹心式单克隆抗体组合，当检测区出现清晰可见的酒红色条带，即为阳性结果。

本实用新型也可以用我们先前制备的乙酰胆碱酯酶单抗(发明专利授权号：ZL2012 1 0516 218.3；单抗克隆号：AP0691)，用免疫共沉淀的方法，从脑组织中分离提纯出神经型乙酰胆碱酯酶蛋白，免疫小鼠获得神经型乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。以红细胞悬液负向筛选出与红细胞膜上的乙酰胆碱酯酶不发生交叉反应的、特异性识别表达于神经组织的、高亲和性的乙酰胆碱酯酶的配对单克隆抗体，用此抗体制备出胶体金试纸条，用以检测神经组织断端的乙酰胆碱酯酶含量，显示出较好的灵敏度与特异性。

本实用新型针对鉴别神经束中感觉支、运动支和混合支的需要，我们通过调整胶体金直径、与胶体金结合的抗体浓度、调整硝酸纤维素膜孔径的方法，合理设定了胶体金试纸条的敏感性，从而可以快速有效地分辨出感觉支(阴性)、运动支(强阳性)和混合支(弱阳性)，从而满足临床鉴别的需要。

有益效果：本实用新型胶体金试纸条用于肉眼检测洗脱液中的乙酰胆碱酯酶，具有以下优点：①试剂和样本用量极小，样本量可低至10～20μl，因而可以增加洗脱液中乙酰胆碱酯酶的浓度，不易出现假阴性结果；②不需贵重仪器，更适于现场应用；③检测速度快，一般5-10分钟可出结果；④试纸条可在室温保存，只需保持试纸条干燥即可。本实用新型检测速度快，一般一两分钟可出结果；灵敏度高，可达到ELISA的水平 (pg/ml)，而结合银染色时，检测的敏感性更大大提高，完全能满足检测神经束洗脱液中乙酰胆碱酯酶含量的需要。试纸条的快速特性来源于胶体金免疫层析法的固有特性，也与原材料选择特别是NC膜的孔径大小密切相关，准确性取决于抗胆碱酯酶单克隆抗体的特异性。

附图说明

图1为本实用新型的结构示意图。其中：1、吸水滤纸，2、硝酸纤维素膜检测垫， 3、胶体金标记的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金垫，4、样品垫，5、固定于硝酸纤维素膜上用于质量控制的市售兔抗鼠IgG，6、固定于硝酸纤维素膜上用于检测样品的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。

图2为本实用新型的结构示意图。其中：1、吸水滤纸，2、硝酸纤维素膜检测垫， 3、胶体金标记的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金垫，4、样品垫，5、固定于硝酸纤维素膜上用于质量控制的市售兔抗鼠IgG，6、固定于硝酸纤维素膜上用于检测样品的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体，7、硬质塑料底板

图3为大鼠脑组织的免疫共沉淀图。泳道1：转染乙酰胆碱酯酶的293T细胞裂解液；泳道2：大鼠脑组织匀浆液。上述两个泳道作为Input对照Western blot检测阳性，说明转染乙酰胆碱酯酶的293T细胞裂解液和大鼠脑组织匀浆液中含有乙酰胆碱酯酶蛋白。泳道3：是克隆号AP0961的单克隆抗体与脑组织匀浆免疫共沉淀的蛋白样品， Western blot检测阳性，说明克隆号AP0961的单克隆抗体能够识别脑组织中的乙酰胆碱酯酶。泳道4：是大鼠IgG与脑组织匀浆免疫共沉淀的蛋白样品，Western blot检测阴性，说明大鼠IgG不能识别脑组织中的乙酰胆碱酯酶。泳道5：是克隆号53E11c9的单克隆抗体与脑组织匀浆免疫共沉淀的蛋白样品，Western blot检测阳性，说明克隆号53E11c9 的单克隆抗体能够识别脑组织中的乙酰胆碱酯酶。泳道6：是克隆号62D12H4的单克隆抗体与脑组织匀浆免疫共沉淀的蛋白样品，Western blot检测阳性，说明克隆号62D12H4 的单克隆抗体能够识别脑组织中的乙酰胆碱酯酶。泳道7：是大鼠IgG与脑组织匀浆免疫共沉淀的蛋白样品，Western blot检测阴性，说明大鼠IgG不能识别脑组织中的乙酰胆碱酯酶。泳道8：是克隆号1H1H4的单克隆抗体与脑组织匀浆免疫共沉淀的蛋白样品， Western blot检测阳性，说明克隆号1H1H4的单克隆抗体能够识别脑组织中的乙酰胆碱酯酶。泳道9：是大鼠IgG与脑组织匀浆免疫共沉淀的蛋白样品，Western blot检测阴性，说明大鼠IgG不能识别脑组织中的乙酰胆碱酯酶。泳道10：是克隆号AP0962的单克隆抗体与脑组织匀浆免疫共沉淀的蛋白样品，Western blot检测阴性，说明克隆号AP0962 的单克隆抗体不能识别脑组织中的乙酰胆碱酯酶。泳道11：是克隆号AP0962的单克隆抗体与脑组织匀浆免疫共沉淀的蛋白样品，Western blot检测阴性，说明克隆号AP0962 的单克隆抗体不能识别脑组织中的乙酰胆碱酯酶。泳道12：是多克隆抗体与脑组织匀浆免疫共沉淀的蛋白样品，Western blot检测阳性，说明多克隆抗体能够识别脑组织中的乙酰胆碱酯酶。

图4按照实施例1步骤制备的单克隆抗体与大鼠脑组织匀浆的Western blot；其中3，为蛋白Marker。泳道28可见阳性条带，其余泳道未见明显阳性反应，故选取抗体编号 28号(克隆号：2H12-F-7)应用于胶体金试纸条的备选；

图5按照实施例1步骤制备的单克隆抗体与大鼠脑组织匀浆的Western blot，其中4 为蛋白Marker。泳道41和42可见阳性条带，其余泳道未见明显阳性反应，故选取抗体编号41号(克隆号：1F4-C4-F2-D5)和42号(克隆号：3A11-C5)应用于胶体金试纸条的备选。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型作更进一步的说明。

实施例1检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条的制备

一种用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，该诊断试纸条包括设在硬质塑料底板7上依次相连的吸水滤纸1、检测垫2、质控区5、检测区6、胶体金垫3 以及样品垫4，所述检测垫2上的质控区5上固定有兔抗鼠IgG，检测垫2上的检测区 6固定有抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。该抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体为市售的小鼠抗乙酰胆碱酯酶抗体。该胶体金垫3喷涂有市售的胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。该胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金直径为20nm、抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体浓度为45μg/ml。

试纸条的装配方法：在塑料底板上分别将吸水滤纸1、检测垫2以及样品垫4按图装配，配件与塑料底板的结合可用粘性材料粘接。装配好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为4mm的条状，将胶体金垫3插入样品垫4与检测垫2之间即为胆碱酯酶检测用试纸条。按照试纸条组装步骤，分别将抗乙酰胆碱单克隆抗体标记不同直径的胶体金制成胶体金垫，能配对的抗乙酰胆碱单克隆抗体喷点到检测垫的检测区6。将胶体金垫3插入样品垫4和检测垫2之间，将标准乙酰胆碱酯酶的PBST溶液滴涂到样品垫上，跑样10 分钟，根据检测区域现象筛选出可用于检测标准乙酰胆碱酯酶的夹心式单克隆抗体组合。

将不同浓度的乙酰胆碱酯酶PBST溶液(浓度分别为1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、 1μg/ml、10μg/ml)，滴涂到样品垫上，跑样10分钟，肉眼观察，在检测区6和质控区5 出现两条明显红线的为阳性结果，只在质控区5出现一条红线着为阴性。

本实施例中，当乙酰胆碱酯酶浓度为1μg/ml时，未出现典型阳性结果。

实施例2检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条的制备

与实施例1基本一样，所不同的在于，该胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金直径为100nm、抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体浓度为70μg/ml。

将不同浓度的乙酰胆碱酯酶PBST溶液(浓度分别为1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、 1μg/ml、10μg/ml)，滴涂到样品垫上，跑样10分钟，肉眼观察，在检测区6和质控区5 出现两条明显红线的为阳性结果，只在质控区5出现一条红线着为阴性。

本实施例中，当乙酰胆碱酯酶浓度为1μg/ml时，未出现典型阳性结果。

实施例3检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条的制备

一种用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，所述诊断试纸条包括设在硬质塑料底板7上从上到下依次相连的吸水滤纸1、硝酸纤维素膜(Millipore公司，135S，孔径8μm)的检测垫2和滴有40nm胶体金标记的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体(克隆号：2H12-F-7)的胶体金垫(吸水玻璃纤维)3以及样品垫(吸水玻璃纤维)4，检测垫上的质控区5固定有市售兔抗鼠IgG(Abcam公司ab46540)，检测垫上的检测区6固定有乙酰胆碱酯酶单克隆抗体(克隆号：1F4-C4-F2-D5)。

本实施中的胶体金垫的胶体金直径为40nm，与胶体金结合的单克隆抗体(克隆号：2H12-F-7)浓度为64μg/ml；硝酸纤维素膜上检测区6为配对的单克隆抗体(克隆号： 1F4-C4-F2-D5)浓度为100μg/ml。将不同浓度的乙酰胆碱酯酶PBST溶液(浓度分别为 1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml)，滴涂到样品垫上，跑样10分钟，肉眼观察，在检测区6和质控区5出现两条明显红线的为阳性结果，只在质控区5出现一条红线则为阴性结果。

本实施例中，当乙酰胆碱酯酶浓度为1μg/ml时，出现典型阳性结果。

本实施例的乙酰胆碱酯酶单克隆抗体和胆碱酯酶溶液都有良好的适应性，保藏于能有效保持抗体活性和消除假阳性的缓冲液中。

该缓冲液配方：0.01M PBS PH7.2+0.5％cold fish skin gelatin(冷水鱼皮肤胶原，购于Sigma公司)+0.05％sodium azide(叠氮钠)。

制备方法：取0.01M PBS 100ml，再加入冷水鱼皮肤胶原50mg，搅拌溶解后，1. 2个大气压下加热沸腾20分钟，冷却至室温，加入叠氮钠200mg，过滤，分装保存。

实施例4抗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的制备

1、免疫原的获得

1)利用本课题组先期获取的单克隆抗体(发明授权号：ZL2012 1 0516 218.3；按照该专利中的方法制备得到单抗克隆号为AP0691、AP0962、53E11c9，62D12H4，1H1H4 的单克隆抗体)，分别将500μl大鼠神经组织(脑组织)匀浆液(3μg/μl)中加入20μl 浓度为1mg/ml的单克隆抗体(克隆号：AP0961，53E11c9，62D12H4，1H1H4，AP0962) 与50μlAnti-mouseIgG(H+L)，F(ab')2Fragment(Bead Conjugate)(Cell Signaling Technology公司，货号：5946)、20μl浓度为1mg/ml的自制兔抗乙酰胆碱酯酶多克隆抗体与50μlProteinG Agarose Beads(Cell Signaling Technology公司，货号 37478)、50μlMouse IgG(Bead Conjugate)(Cell Signaling Technology公司，货号3420)，4℃摇床过夜。4℃12000g离心15分钟，弃去上清，得到乙酰胆碱酯酶单克隆抗体与大鼠脑组织的免疫共沉淀样品。样品PBST清洗3次后，加入5X上样缓冲液(碧云天生物技术，货号P0015)煮沸后离心，取15μl上清与15μl转染乙酰胆碱酯酶的293T细胞裂解液和15μl鼠脑组织匀浆液一起SDS-PAGE电泳后转膜，进行常规 Western blot，市售商品化乙酰胆碱酯酶抗体(Abcam，货号：ab70219)作为检测抗体；结果参见图3；根据以上结果，我们选取克隆号AP0961的单克隆抗体与鼠脑组织进行免疫共沉淀以获取用于制备胶体金试纸条的单克隆抗体的抗原。

2)将乙酰胆碱酯酶单克隆抗体AP0961与脑组织的免疫共沉淀样品用0.1M的甘氨酸溶液解离下来，透析除去甘氨酸得到乙酰胆碱酯酶蛋白，作为免疫原；

2、小鼠免疫

挑选六只雌性6周龄的BALB/C小鼠，用免疫原按时间周期进行基础免疫和加强免疫(整个周期为7到10周)，如表1。第3次加强免疫后根据具体实验要求进行处理或者继续加强免疫。

表1

3、融合

在第二次加强免疫7天后和第三次加强免疫7天后分别进行阳性血的采集，进行ELISA检测效价。根据ELISA测定的小鼠血清稀释到1：10000时OD值需达到0.5以上，加强免疫三天后的小鼠，拉颈猝死后，取出脾脏研磨后，按常规方法进行融合，多次亚克隆，直至100％阳性，我们认为即得到单克隆株。

4、腹水制备及抗体纯化

腹水制备：计划注射细胞前2-3周，选Balb/c小鼠(小鼠一定要健康)用500μl液体石蜡进行预刺激，取约1×10⁶个细胞进行注射，每只老鼠注射500μl左右。每株杂交瘤打3-4只，可保证腹水量在20ml以上。

抗体纯化：用免疫原(乙酰胆碱酯酶蛋白)亲和柱对细胞上清或腹水进行分离纯化，纯化过程所得的接收液进行透析，浓缩并保存。

5、抗体的筛选：

采用western blot的方法将获得的单克隆抗体与大鼠脑组织进行杂交，选取特异性的单克隆抗体作为胶体金试纸条的备选。

根据结果，参见图4的28号(克隆号：2H12-F-7)，图5的41号(克隆号： 1F4-C4-F2-D5)，42号(克隆号：3A11-C5)被应用于胶体金试纸条的备选。

6、抗体标记及夹心抗体配对

将3个单克隆抗体分别进行HRP标记，进行两两组合配对检测，确定可夹心检测标准乙酰胆碱酯酶的抗体对。最终选取了2H12-F-7与1F4-C4-F2-D5，作为配对抗体即为胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。

实施例5

切取一段1mm左右的人脊髓前根，放入250μl的PBS溶液中震荡混匀并离心，获得上清液，然后分别取100μl上清液滴涂到实施例2所获得的胶体金试纸条的样品垫上，跑样10分钟，试纸条上出现典型阳性结果；同样取人脊髓后根标本，将其上清液滴涂到实施例2所获得的胶体金试纸条的样品垫上，跑样10分钟，试纸条呈阴性。根据以上结果，实施例2所获得的胶体金试纸条可以鉴别出脊髓的前根与后根。根据我们以往免疫传感器与ELISA的实验结果，脊髓前根溶出液的乙酰胆碱酯酶浓度为2.98μg/ml，脊髓后根溶出液的乙酰胆碱酯酶浓度为0.90μg/ml(Sui T1,Ge Y,Liu W,Zhao ZK,Zhang N,Cao X.Anacetylcholinesterase antibody-based quartz crystal microbalance for the rapididentification of spinal ventral and dorsal roots.PLoS One.2013Jul 23；8(7):e69049.)。因此，本实用新型的胶体金试纸条对乙酰胆碱酯酶的检测灵敏度为＞0.90μg/ml。

以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本实用新型的保护范围。

Claims (5)

1.一种用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，其特征在于，所述诊断试纸条包括设在硬质塑料底板(7)上依次相连的吸水滤纸(1)、检测垫(2)、质控区(5)、检测区(6)、胶体金垫(3)以及样品垫(4)，所述检测垫(2)上的质控区(5)上固定有兔抗鼠IgG，检测垫(2)上的检测区(6)固定有抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，其特征在于，所述抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体为小鼠抗乙酰胆碱酯酶抗体。

3.根据权利要求1所述的用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，其特征在于，所述胶体金垫(3)喷涂有胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，其特征在于，所述胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金直径为20nm～100nm、抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体浓度为45μg～100μg/ml。

5.根据权利要求3所述的用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条，其特征在于，所述胶体金标记的抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的胶体金直径为40nm、抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体浓度为64μg/ml或100μg/ml。