CN202735352U - 一种检测人心力衰竭新型标志物st2的快速诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型提供一种同时检测人全血、血清或血浆中人心力衰竭标志物ST2的免疫胶体金试剂盒，包括塑料盒体、衬垫、附着在衬垫上依次相连的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜检测层和吸收垫。衬垫的两端分别设有样品垫和吸收垫，衬垫中部设有硝酸纤维素膜检测层。检测层与样品垫交界处，设有包被金标记的抗人可溶性ST2抗体的金标垫，金标垫一端设置在样品垫之下，另一端设置在检测层之上。检测层上设有检测线和质控线，检测线包被有抗人可溶性ST2抗体，质控线包被有羊抗鼠IgG。本实用新型试剂盒灵敏度高、操作简捷、结果判断方便，可结合仪器使用；和其他心力衰竭标志物无交叉反应；检测样品范围广，具有良好的经济效益和社会效益。

Description

一种检测人心力衰竭新型标志物ST2的快速诊断试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种同时检测人全血、血清或血浆中人心力衰竭标志物ST2的试剂盒，具体涉及一种检测人心力衰竭标志物ST2的免疫胶体金快速检测试剂盒。

背景技术

心力衰竭(heartfailure)HF简称心衰)是一种以心室功能不全、神经内分泌激活和外周血流分布异常为特征的复杂的临床综合征，是各种心血管疾病的终末阶段。心力衰竭的患病率随着年龄的增加而迅速增加，其发病率和死亡率均较高，五年存活率与恶性肿瘤相仿。在我国50家医院住院病例调查中发现，心衰住院率占同期心血管病的20％，死亡率却占40％。而在欧洲普通人群中，症状性心衰的发病率达0.1％～2.0％。在美国，患有心力衰竭的病人大约有500万人，每年新增20万人，心力衰竭已成为美国主要的公共卫生问题。

ST2蛋白是白介素-1(IL-1)受体家族成员之一，有血清可溶性ST2蛋白(sST2)和跨膜性ST2蛋白(ST2L)两种。ST2L通过与其特异性配体白介素-33IL-33结合，抑制血管紧张素II和苯肾上腺素诱导的抑制酶的磷酸化，在心脏压力失代偿的情况下，起到对心肌细胞的保护作用。研究表明，当心肌细胞和纤维原细胞受到机械牵张后，ST2和IL-33的表达率明显增加。心力衰竭患者可溶性ST2水平有显著升高。由此可见，ST2作为生物标志物，在心力衰竭诊断中具有重要的临床应用价值。

临床上心衰时的症状和体征特异性较差，常可因症状轻微、老龄、肺部疾病及肥胖等而难以鉴别。超声心动图、X线及有创血流动力学等辅助检查也有局限性，且受客观条件限制。其他生物标志物如脑利钠肤(BNP和NT-proBNP)，具有半衰期长、血浆浓度高、体外稳定性好等优点，是早期发现并治疗心衰患者的良好指标。但其预测价值会受到年龄、肾功能损害和体重指数的影响。CRP最早也被认可在高危人群中早期发现症状不典型的心力衰竭患者，但是，CRP缺乏特异性，在各种急慢性感染、急性冠脉综合征、吸烟、以及风湿免疫性等疾病中均有升高。

相比前述几种方法，可溶性ST2作为诊断指标，具有特异性强、个体变异低、不受生理节律影响、不受标本采集条件限制、不受标本类型(血浆或血清)影响等优势。另外，胶体金免疫层析技术将反应时间大大缩短，结果客观可靠，操作简便、不需要配备复杂仪器设备，结果直观肉眼可判断。

发明内容

本实用新型的目的在于提供一种特异性强，操作简便、快速、高效、准确，检测时间短的检测人心力衰竭标志物ST2的试剂盒。

本实用新型提供的检测人心力衰竭标志物ST2的免疫胶体金快速检测试剂盒，包括塑料盒体、衬垫、附着在衬垫上依次相连的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜检测层和吸收垫。衬垫的两端，分别设有样品垫和吸收垫；衬垫中部设有硝酸纤维素膜检测层。硝酸纤维素膜检测层与样品垫交界处，设有包被金标记的抗人可溶性ST2抗体的金标垫。金标垫一端部分设置在样品垫之下，另一端部分设置在硝酸纤维素膜检测层之上。在与样品垫延续的检测层上设有检测线T和质控线C，检测线上包被有抗人可溶性ST2抗体，质控线上包被有羊抗鼠IgG。

所述金标垫设置在样品垫之下，与样品垫设有5mm的重叠区；所述金标垫设置在硝酸纤维素膜检测层之上，与硝酸纤维素膜检测层设有2mm的重叠区，重叠区保证样品在样品垫、金标垫和检测层上无阻碍地流动。

所述塑料盒体用于固定盒体内衬垫，盒体上设置加样区和检测观察区，用于滴加样品、观测检测结果。

所述衬垫为PVC板，也可以代之以不吸水的硬质材料，用于固定盒内各组建。

所述金标垫上抗人可溶性ST2抗体的金标记为胶体金颗粒，也可以代之以荧光颗粒、乳胶颗粒、磁性颗粒或其他有色颗粒。

本实用新型试剂盒具有如下有益效果：

(1)检测速度快。全过程只需10分钟，可以实现单个样品或大量样品的检测；

(2)灵敏度高。最低检测单位为ng/ml；

(3)特异性强。和其他心力衰竭标志物无交叉反应；

(4)操作简捷。检测过程无需其他试剂，样品无需特殊处理，可肉眼观测也可结合仪器使用。

(5)结果判断方便。快速检测试剂盒以肉眼可见的红色印记作为结果判断标准，即检测层上只有质控线(C线)显示红色，表示样品不含人可溶性ST2，检测线(T线)和控制线(C线)上均显示红色，表示样品含有人可溶性ST2。结果判断明确、直观。

(6)检测样品范围广。全血、血清或血浆均可用作试验样本，尤其是外周血，所需试剂和样品量少，样品量最低可至50-100μL。

附图说明

图1为本实用新型的结构示意图，其中1为样品垫、和吸收垫，2为金标垫、，3为硝酸纤维素膜检测层，4为检测线T，5为质控线C，6为吸收垫，7为衬垫。

图2为本实用新型的检测结果判读示意图，图2.a为阳性结果，图2.b为阴性结果，图2.c结果无效，图2.d结果无效。其中8为观察区，9为加样区，10为塑料盒体，T为检测线，C为质控线。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本实用新型试剂盒的结构和使用方法。

如图1显示的本实用新型试剂盒的结构示意图：衬垫7由PVC板制成，衬垫7的两端，分别设有样品垫1和吸收垫6，衬垫7中部设有硝酸纤维素膜检测层3。硝酸纤维素膜检测层3与样品垫1交界处，设有包被金标记的抗人可溶性ST2抗体的金标垫2，金标垫2一端部分设置在样品垫1之下，另一端部分设置在硝酸纤维素膜检测层3之上。在与样品垫1延续的检测层3上设有检测线T4和质控线C5，检测线4上包被有抗人可溶性ST2抗体，质控线5上包被有羊抗鼠IgG。金标垫2设置在样品垫1之下，与样品垫设有5mm的重叠区；金标垫2设置在硝酸纤维素膜检测层3之上，与硝酸纤维素膜检测层设有2mm的重叠区。

使用本实用新型试剂盒检测人心力衰竭标志物ST2实施例

样本采集：于晨起7～10时对20例心力衰竭患者进行空腹抽前臂血，立即加入EDTA和/或肝素等抗凝剂，离心后取血清置于-20℃备检。

检测方法：

将试剂盒平放，取待测样品缓慢滴加4-5滴于试剂盒的加样区中(尽量滴加于加样区中部，以保证测试结果准确)，静置等待10分钟。在吸水材料的作用下，待检样品缓慢移动到检测区和质控区，膜反应体系启动。无论待检样本中有无人可溶性ST2，质控区处都应显现一条颜色条带，这是重要的判断标准，可以确定是否加入足够量的外周血，层析过程是否正常，同时也可以作为判断检测盒是否合格的一个内在标准。

结果判定：

(1)若待检样品中人可溶性ST2的浓度高于检测阈值时，即样品中的人特异性ST2与固定在膜上的检测区内的单抗结合，因而检测区内会出现一条红色检测带，表示阳性(+)结果，即在质控区内和检测区内内均出现一条颜色条带，如图2.a所示。(注意：由于待检样品中人可溶性ST2的浓度有所不同，因而测试区内的颜色条带可能出现颜色深浅的现象。但是，在一定时间内，不论测试区内的颜色条带颜色深浅，都可判定为阳性。)

(2)在层析过程中，若待测的外周血样品中不含有人可溶性ST2或其浓度低于检测灵敏度时，即样本中没有特异性抗原与膜上的检测带内的单抗发生免疫反应，因而检测区内不会出现一条颜色检测带，表示阴性(-)结果，即仅在质控区内出现一条颜色带，如图2.b所示。

(3)若质控区未出现颜色条带，则检测过程失败。可能的原因为操作过程不正确、试剂盒已变质损坏或出现质量问题，如图2.c和2.d所示。

14例心力衰竭确诊患者和6例健康实验人员随机采集外周血标本，盲检结果如下：

实验结果显示，本发明的试纸条具有较高的特异性和灵敏度，试纸条和ELISA盲检结果符合率达100％。

本实用新型试剂盒的制备还包括抗人可溶性ST2单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体金结合物的制备、检测线和质控线的包被和金标垫的制备。

1.制备抗-人可溶性ST2单克隆抗体

分别用纯化的人可溶性ST2抗体和/或抗原结合片段免疫纯系小鼠，小鼠血清产生相应的抗体时，即可将小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合。利用HAT选择杂交瘤细胞，并用酶联免疫吸附试验(ELISA)或者WB对McAb进行检测。对于检测抗体阳性的杂交瘤细胞应用有限稀释液进行克隆，同时保存阳性细胞株，利用BALB/c纯系小鼠制备大量的单克隆抗体，同时对抗体特异性的鉴定、识别抗原表位的鉴定、亲和力的鉴定及配对试验，筛选出效果最好的一对细胞株。将筛选到的细胞株重新植入小鼠腹腔中，过5-6天取出腹水，利用硫酸铵盐析及亲和层析纯化得到的单克隆抗体。

2.胶体金的制备

(1)用5毫升微量移液器取3毫升1％四氯金酸于500毫升的圆底烧瓶中，量取297毫升的超纯水亦加入烧瓶中，配制成0.01％的四氯金酸反应液，充分搅拌混匀；

(2)连接上蛇形冷凝管，开启冷凝水，并置于磁力加热搅拌器上，加热煮沸；

(3)放入搅拌子，剧烈搅拌，然后一次性快速准确地加入3毫升柠檬酸铵溶液；

(4)金黄色的氯金酸水溶液首先变成灰色，约2分钟后变成紫红色，继续煮沸5分钟；

(5)关闭磁力加热搅拌器，待胶体金冷却后，分装于500毫升的玻璃试剂瓶中，外面覆上铝箔，按规定贴上标签。

制备的胶体金应呈现透亮的紫红色，没有聚合物及肉眼可见的沉淀；取适量于530纳米波长处测定，紫外吸收值在1.1-1.3之间。

3.制备胶体金结合物

(1)根据用拟标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质的总量，工本艺每毫升胶体金标记12微克/抗体，标记的抗体量为3.6毫克；

(2)用0.1M的碳酸钾或0.1M盐酸调节胶体金的pH值为7.8；

(3)在电磁搅拌器下，将抗体蛋白质溶液加入胶体金溶液中，加入蛋白质时应逐滴加入，1毫克蛋白质大约5分钟加完；

(4)抗体和胶体金反应5分钟后，在磁力搅拌器下加入5％的牛血清蛋白(BSA)，使其终浓度为1％；

(5)10分钟后，加入3％的PEG2000，至终浓度为0.3％；

(6)继续反应1小时或者过夜；

(7)将标记好的胶体金溶液于2000r/min，4℃离心10分钟，吸出上清，弃去沉淀，以去除大的聚合物；

(8)调整好离心机的转速为10000r/min，4℃离心30分钟，弃上清，将沉淀以原体积的0.01M PBS pH8.2(内含1％BSA)溶解，重复离心三次；

(9)最后一次小心弃去上清，沉淀溶于原体积的1/50PBS(内含1％BSA)中，即得免疫金。

4.检测线和质控线包被(将检测抗体包被在硝酸纤维素膜上)

(1)检测线划线：分别将抗-人可溶性ST2单克隆抗体装入喷膜机中(蛋白微量喷膜系统)，在硝酸纤维素膜上按1ul/cm的量划上；

(2)质控划线：羊抗鼠IgG抗体包被液装入喷膜机中(蛋白微量喷膜系统)，在硝酸纤维素膜上按1ul/cm的量划上；

(3)包被：37℃包被2小时；

(4)封闭：37℃封闭30分钟；

(5)干燥：将包被后的硝酸纤维素膜放入真空干燥器内干燥20小时，密闭保存待用。

5.金标垫制备

(1)开启点膜仪，预热30分钟，用蒸馏水做10个循环；

(2)调整免疫金的OD值为30，将免疫金加入机器左边的塑料容器内，设置程序，调整2#喷头喷量为2ul/cm，将免疫金喷涂在玻璃纤维结合垫上，喷线的位置在金标垫的中央；

(3)喷完金标垫后，置于37℃烘箱中干燥30分钟；

(4)干燥：将标记后玻璃纤维放入真空干燥器内干燥20小时，取出密闭保存待用。

6.试剂盒制备

(1)在塑料底板的中央撕去覆于上面的胶带，贴上包被好抗体的硝酸纤维素膜；

(2)撕去塑料板中央下面的宽为5毫米的胶带，贴上喷上胶体金的结合垫，结合垫前端的硝酸纤维素膜重叠2毫米；

(3)撕去塑料板最下面宽为20毫米的胶带，贴上经过预处理的样品垫，样品垫的前端与结合垫重叠约5毫米；

(4)撕去塑料底板的最上端约为25毫米的胶带，贴上吸水纸，吸水纸与硝酸纤维素膜重叠约2毫米；

(5)组装完成后，将每一个配件都压实，检查粘贴结果，将组装好的大卡用切条机切成3毫米宽的试纸条；

(6)把切好的试纸条装在测试盒中，即得。

Claims (5)

1.一种同时检测人全血、血清或血浆中人心力衰竭标志物ST2的免疫胶体金试剂盒，包括塑料盒体、衬垫、附着在衬垫上依次相连的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜检测层和吸收垫，其特征在于：衬垫的两端，分别设有样品垫和吸收垫，衬垫中部设有硝酸纤维素膜检测层3，硝酸纤维素膜检测层与样品垫交界处，设有包被金标记的抗人可溶性ST2抗体的金标垫，金标垫一端部分设置在样品垫之下，另一端部分设置在硝酸纤维素膜检测层之上，在与样品垫延续的检测层上设有检测线T和质控线C，检测线4上包被有抗人可溶性ST2抗体，质控线上包被有羊抗鼠IgG。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述金标垫设置在样品垫之下，与样品垫设有5mm的重叠区；所述金标垫设置在硝酸纤维素膜检测层之上，与硝酸纤维素膜检测层设有2mm的重叠区。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述塑料盒体上设置加样区和检测观察区。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述衬垫为PVC板，也可以代之以不吸水的硬质材料。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述金标垫上抗人可溶性ST2抗体的金标记为胶体金颗粒，也可以代之以荧光颗粒、乳胶颗粒、磁性颗粒或其他有色颗粒。

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