CN109187986B - 一种便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条及其制备方法 - Google Patents

一种便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条及其制备方法，属于免疫分析检测领域，所述试纸条包括底板和依次搭接在底板上的样品垫、结合垫、分析膜和吸样垫，分析膜上设有检测线和质控线，检测线和质控线的两端分别与分析膜两侧边平齐，结合垫上结合有胶体金标记的抗甲状腺球蛋白抗体，检测线上包被有甲状腺球蛋白，质控线上包被有可与游离抗甲状腺球蛋白抗体特异性结合的质控抗体，抗甲状腺球蛋白抗体对应SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2任一所示氨基酸序列的抗原表位肽。本发明还提供了上述检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条的制备方法，本发明使用方便快捷，成本低，特异性及灵敏度高。

Description

一种便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条及其制备 方法
技术领域
本发明涉及免疫分析检测领域，更具体的，涉及一种便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条及其制备方法。
背景技术
抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)，英文名称anti-thyroglobulin antibodie，是自身免疫性甲状腺疾病病人血清中的一种常见自身抗体。TGAb的靶抗原甲状腺球蛋白(TG)是一种由甲状腺上皮细胞合成和分泌的可溶性的碘化糖蛋白，分子量660kDa，由2748个氨基酸组成。它是T3(triiodothyronine，三碘甲腺原氨酸)、T4(tet-raiodothyronine，四碘甲腺原氨酸)的生物合成前体，主要是以胶体形式贮存于甲状腺滤泡腔内，正常人血清中含量极微(10-40ng/ml)。TGAb是人的各种自身抗体中最典型的器官特异性抗体，它主要由IgG1、IgG2和IgG4组成，少部分为IgA和IgM。一般认为TGAb对甲状腺无损伤作用。TGAb与甲状腺球蛋白结合后，可通过Fc受体与结合的抗体相互作用激活NK细胞，而攻击靶细胞，导致甲状腺细胞破坏。TGAb还影响TG抗原的摄取、加工，催化TG水解，因而可以影响非显著性T细胞抗原决定簇的自身免疫反应，从而导致自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroidismdisease，AITD)发生恶化。
抗甲状腺球蛋白抗体在血液中的正常值为0-34IU/mL，异常结果常见于以下情况：(1)血清TGAb的改变较多见于甲状腺部位的恶性肿瘤，如TGAb在甲状腺滤泡状癌、甲状腺乳头状癌和间变癌都可出现不同程度的升高。甲状腺的破坏以及肿瘤组织分泌一定量的TGAb，而致血中TGAb升高；(2)甲状腺功能亢进症、甲状腺瘤、亚急性甲状腺炎以及慢性淋巴细胞性甲状腺炎等甲状腺疾病都可出现血中TGAb水平升高。
根据目前国内外有关甲状腺癌的诊疗指南，分化型甲状腺癌(DTC)患者在接受手术治疗以及放射性131I(RAI，清甲)治疗和甲状腺激素替代抑制(也称TSH抑制)治疗后，诊断与随访主要依靠血清TgAb检测和超声等其他影像学检查。DTC患者应定期和长期接受血清TgAb检测，方便及时发现病灶复发、转移或/和对相关后续治疗进行客观有效的评价及预后判断。临床医生可通过TgAb的持续动态监测，了解全甲状腺切除术后患者的疾病发展和肿瘤负荷情况。研究已证实，DTC患者经甲状腺手术并联合RAI治疗(清甲)后，在TSH刺激后(TSH>30mIU/L)，血清TgAb对判断DTC残留或复发的诊断敏感性与特异性最高。抗甲状腺球蛋白抗体在甲状腺癌中央淋巴结组织存在一定程度的表达，对于淋巴结组织中TGAb水平的检测，可以作为临床选择甲状腺癌手术方式以及术后手术效果的辅助判断指征，目前还没有便携快速的TGAb的检测试纸条。
免疫层析法(Immunochromatography)是近几年来兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗原抗体先固定于硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜的某一区带，当干燥的纤维素一端浸入样品(组织液或血液)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗原的区域时，样品中相应的抗体即与该抗原发生特异性结合，阻碍胶体金复合物与该抗原结合从而显色变浅。现有的免疫层析试纸条产品常用的示踪标记粒子有纳米金、纳米硒、彩色胶乳等等，其中纳米金应用最为广泛，纳米金也称为胶体金。
以胶体金作为示踪标记物的免疫层析技术特称为免疫胶体金技术(Immunecolloidal gold technique，GICT)。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗环血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态而得名。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团型成牢固结合，由于这种结合式静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其他生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、型状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提供了一种能够快速对穿刺组织洗脱液的人抗甲状腺球蛋白抗体进行定量分析的试纸条，其灵敏度高，使用方便。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条，包括底板和依次搭接在所述底板上的样品垫、结合垫、分析膜和吸样垫，所述分析膜上设有检测线和质控线，所述检测线和所述质控线的两端分别与所述分析膜两侧边平齐，所述检测线设于所述分析膜上靠近所述结合垫的一端，所述质控线设于所述分析膜上靠近所述吸样垫的一端，所述结合垫上结合有胶体金标记的抗甲状腺球蛋白抗体，所述检测线上包被有甲状腺球蛋白，所述质控线上包被有可与游离抗甲状腺球蛋白抗体特异性结合的质控抗体，所述抗甲状腺球蛋白抗体对应SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2任一所示氨基酸序列的抗原表位肽。
试纸条的检测原理：采用竞争法进行胶体金免疫层析，若样品中不存在人抗甲状腺球蛋白抗体，结合垫中的标记有胶体金的人抗甲状腺球蛋白抗体与在虹吸作用下向吸样垫一侧移动，到达检测线时与检测线上包被的甲状腺球蛋白结合，形成胶体金-人抗甲状腺球蛋白抗体-甲状腺球蛋白的复合物，而游离的胶体金标记的人抗甲状腺球蛋白抗体继续向前移动至质控线，并与质控线上的质控抗体发生免疫反应形成胶体金-人抗甲状腺球蛋白抗体-质控抗体复合物，当样品中含有人抗甲状腺球蛋白抗体时，在虹吸作用下向吸样垫移动，到达检测线时，样品中的人抗甲状腺球蛋白抗体与结合垫上的胶体金-人抗甲状腺球蛋白抗体竞争与检测线上的甲状腺球蛋白结合，分别形成人抗甲状腺球蛋白抗体-甲状腺球蛋白复合物和胶体金-人抗甲状腺球蛋白抗体-甲状腺球蛋白复合物，胶体金带有橘红色，会在检测线和质控线上分别形成橘红色的线条，当样品中含有人抗甲状腺球蛋白抗体时，由于竞争作用，形成的胶体金-人抗甲状腺球蛋白抗体-甲状腺球蛋白复合物会减少，颜色会减弱，根据橘红色线条颜色的深浅即可判断样品中人抗甲状腺球蛋白抗体含量的多少。
与现有技术相比，本发明的优点为：使用方便快捷，便于基层和现场使用，所有反应能在20min以内完成，应用范围广，标记物稳定，标记样品可在4℃储存两年以上，无信号衰减现象；胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，所述样品垫是将玻璃纤维膜经处理液浸泡后于室温相对湿度为15％～30％的条件下干燥得到的，其中所述处理液包括0.01M PBS、0.1wt％Tween-20、1wt％牛血清白蛋白和10wt％蔗糖。
采用上述进一步方案的有益效果是所述样品垫适用于体液/血清/血浆中人抗甲状腺球蛋白抗体检测。
进一步，所述样品垫包括滤血膜和经红细胞单抗处理后的纤维玻纤膜和，所述滤血膜一端与所述结合垫对应端抵接，所述纤维玻纤膜设置在所述滤血膜远离结合垫的一端，且所述纤维玻纤膜靠近所述滤血膜的一端压覆在所述滤血膜上端,或所述纤维玻纤膜一端与所述结合垫对应端抵接，所述滤血膜设置在所述纤维玻纤膜远离结合垫的一端，且所述滤血膜靠近所述纤维玻纤膜的一端压覆在所述纤维玻纤膜上端，将所述样品垫置于室温相对湿度为15％～30％的条件下干燥得到。
采用上述进一步方案的有益效果是所述样品垫适用于全血样品中人抗甲状腺球蛋白抗体的检测，其中红细胞单抗处理后的纤维玻纤膜能将全血中的红细胞、血小板等成分截留。
进一步，所述质控抗体为羊抗鼠IgG。
采用上述进一步方案的有益效果是获得容易，特异性强。
进一步，所述吸样垫为吸水滤纸。
采用上述进一步方案的有益效果是容易获得，吸水性强。
本发明还提供了上述便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条的制备方法，包括以下步骤：
S1:制备人抗甲状腺球蛋白抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体；
S2:将人抗甲状腺球蛋白抗体用胶体金进行标记，并喷涂在玻璃纤维膜或聚酯膜上，制得结合垫；
S3:将甲状腺球蛋白和羊抗鼠IgG抗体分别包被在检测线和质控线上制备得到分析膜；
S4:将样品垫、结合垫、分析膜和吸样垫裁成合适的尺寸，并依次搭接在底板上，制得便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条。
进一步，所述步骤S2的具体步骤为取胶体金溶液，调节pH至6.5～8.0，按照5～20μg/mL加入人抗甲状腺球蛋白抗体，室温搅拌1h，用酪蛋白或BSA封闭，12000r/min离心30min，弃上清，用胶体金工作液复溶，喷涂至玻璃纤维膜或聚酯膜上，于室温、相对湿度为15％～30％的条件下干燥得到所述结合垫。
进一步，所述胶体金溶液为采用氯金酸-柠檬酸三钠法制备的直径25～35nm的胶体金溶液；所述胶体金工作液包括1wt％牛血清白蛋白、0.1M Tris-HCL缓冲液和20wt％蔗糖，且pH为8.0。
进一步，所述步骤S3的具体步骤为：将人甲状腺球蛋白用包被缓冲液稀释至0.5～2mg/mL，将羊抗鼠IgG多克隆抗体用包被缓冲液稀释至1～2mg/mL，然后以1～2uL/cm分别喷涂于检测线和质控线上，于室温、相对湿度为15％～30％的条件下干燥。
进一步，所述包被缓冲液为硼酸盐、碳酸盐、磷酸盐、Tris-盐酸或Tris-磷酸盐缓冲液中的任一种，所述包被缓冲液的pH值为6.5～7.5，所述包被缓冲液的浓度为0.01M。
采用上述方案的有益效果是制备方法简单，组装方便。
附图说明
图1为本发明试纸条的结构简图；
图2为本发明试纸条的俯视图。
附图中，各标号所代表的含义如下：
1、样品垫，2、结合垫，3、分析膜，4、检测线，5、质控线，6、吸样垫，7、底板。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1人抗甲状腺球蛋白抗体的制备
(1)甲状腺球蛋白抗原表位肽的制备
根据NCBI等数据库查找人甲状腺球蛋白氨基酸序列，并将序列导入抗原表位设计软件，将位于蛋白质构象外部氨基酸序列统计出来，再将人甲状腺球蛋白氨基酸序列分别导入DNASTAR软件，通过抗原表位预测工具进行预测，并通过WesternBlot和Elisa试验进行筛选，最终分别得到两种具有良好抗原性的抗原表位肽，序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示：
SEQ ID NO:1
PSCAEGQSCASERQQALSRLYFGTSGYFSQHDLFSSPEKRWASPRVARFATSCPPTIKELFVDSGLLRPMVEGQSQQFSVSENLLAIFPSRG(SEQ ID NO:1)
SEQ ID NO:2
MQYFSHFIRSGNPNYPYEFSRKVPTFATPWPDFVPRAGGENYKEFSELLPNRQGLKKADCSFWSKYISSLKTSADGAKGGQSAESEEEELTAGSGLREDLLSLQEPGSKTYSK(SEQ ID NO:2)
上述肽段均具有亲水性、抗原性强并且易于合成的特点，抗原表位肽的制备利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成，并通过多肽序列鉴定所合成的抗原表位肽序列，肽段的纯度可用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原表位肽的浓度。
(2)抗体的制备
将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的肽段与载体蛋白BSA连接制备成免疫用抗原，取pH为6.0的0.01mol/L的PBS和二甲亚砜(DMSO)各0.25mL将5mg BSA溶解，取1.2mg 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MBS)溶于100mL DMSO中，并将MBS溶液加入BSA溶液中室温搅拌30min，然后4℃5000rpm离心留取上清液，将肽段溶于pH为7.2的0.01mol/L的PBS和DMSO总计500μL中，将肽段溶液与BSA-MBS溶液混合，室温搅拌60min后贮存于-20℃备用，PBS缓冲液用0.2mol/L的Na2HPO481ml加0.2mol/L的NaH2PO419ml配制而成。
免疫动物制备单克隆抗体：将上述制备的免疫用抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分混合后，免疫Balb/c小鼠，按照每只小鼠50μg抗原皮下多点注射，4周后测血清效价，选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫，取抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分混合后，按照每只小鼠25μg抗原皮下多点注射，加强免疫的次数为6次，融合前加强免疫两次，然后取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％的PEG(MW4000)介导进行融合并放入CO2培养箱中37℃培养10天后，培养孔内出现较大的细胞克隆，用间接ELISA进行筛选，对初筛阳性的培养孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖)，之后扩增细胞、冻存、制备腹水，将Balb/c小鼠用降植烷0.6ml/只进行处理，一周后腹腔接种杂交瘤细胞3×106个/只，10天后收集腹水，测定抗体效价，制备的单克隆抗体效价达到1:35000以上。
实施例2检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条的制备
如图1所示，检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条包括底板7和依次搭设在底板7上的样品垫1、结合垫2、分析膜3和吸样垫6，分析膜3上设有检测线4和质控线5，检测线4和质控线5的两端分别与分析膜3两侧边平齐，检测线4设于靠近结合垫2的一端，质控线5设于靠近吸样垫6的一端，结合垫2上结合有胶体金标记的抗甲状腺球蛋白抗体，检测线4上包被有甲状腺球蛋白，质控线5上包被有可与游离抗甲状腺球蛋白抗体特异性结合的质控抗体，抗甲状腺球蛋白抗体对应SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2任一所示氨基酸序列的抗原表位肽，其中吸样垫为吸水滤纸。
(1)结合垫的制备
用氯金酸-柠檬酸三钠法制备直径为25～35nm的胶体金溶液，取胶体金液放在烧杯内，用0.2M的K2CO3调至pH为6.5～8，再加入0.5～2μg实施例1制备的人抗甲状腺球蛋白抗体，加入的人抗甲状腺球蛋白抗体的浓度为5～20μg/mL，室温搅拌半小时，用酪蛋白或者BSA封闭，12000r/min离心30min，弃上清，配置胶体金工作液，包括包括1wt％牛血清白蛋白、0.lM Tris-HCl缓冲液、20wt％蔗糖，pH值为8.0，用胶体金工作液将沉淀复溶至70ml，结合垫的材质为玻璃纤维膜或聚酯膜，用配制好的结合垫处理液浸泡玻璃纤维膜或聚酯膜，在37℃放置17h烘干，按照包被量为1.2μL/cm的量将胶体金标记的人抗甲状腺球蛋白抗体喷涂在预处理的玻璃纤维膜或聚酯膜上于室温、相对湿度为15％～30％的条件下干燥，密封保存备用。
其中，A1的胶体金溶液pH为6.5，抗体用量与胶体金溶液的用量之比为5ug/mL，A2的胶体金溶液pH为7，抗体用量与胶体金溶液的用量之比为10ug/mL；A3的胶体金溶液pH为8，抗体用量与胶体金溶液用量之比为20ug/mL。
(2)分析膜的制备
分析膜选用硝酸纤维素膜(NC)，将甲状腺球蛋白加入pH为7.4的10mM PBS缓冲液中稀释，用划膜喷金仪喷在硝酸纤维膜上的检测线上，喷涂量为1.4μL/cm，羊抗鼠IgG多克隆抗体加入pH为7.4的10mM PBS缓冲液中稀释，用划膜喷金仪喷在质控线上，喷涂量为1.4μL/cm，，然后分析膜在20～25℃烘干，封装备用。
其中分析膜B1的甲状腺球蛋白浓度为0.5mg/mL，羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1mg/mL；B2的甲状腺球蛋白浓度为1.0mg/mL，羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1.5mg/mL；B3的甲状腺球蛋白浓度为2.0mg/mL，羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为2.0mg/mL。
(3)样品垫的制备
体液型样品垫：所述样品垫1是由处理液处理的玻璃纤维膜于室温相对湿度为15％～30％最优为18％～25％的条件下干燥，密封保存而得到的，其中所述处理液包括0.01M PBS、0.1wt％Tween-20、1wt％牛血清白蛋白、10wt％蔗糖。
体液型样品垫C1于室温在相对湿度为15％的条件下干燥，C2于室温在相对湿度为22％的条件下干燥，C3于室温在相对湿度为30％的条件下干燥。
全血型样品垫：所述样品垫1包括滤血膜和经红细胞单抗处理后的纤维玻纤膜，滤血膜压覆在纤维玻纤膜下端，用以对全血样品中的血细胞进行过滤；其中，纤维玻纤膜和滤血膜的边缘有2-4mm重叠，将所得到的样品垫于室温相对湿度为15％～30％最优为18％～25％的条件下干燥并密封保存而得到。
全血型样品垫C4于室温在相对湿度为15％的条件下干燥，C5于室温在相对湿度为22％的条件下干燥，C6于室温在相对湿度为30％的条件下干燥。
(4)试纸条的组装
将样品垫1、结合垫2、分析膜3和吸样垫6依次裁剪成合适的尺寸，将分析膜3贴合在底板的中间，分析膜3的左右两端分别贴有结合垫1和吸样垫6，且分别与分析膜3的两端重叠，结合垫2远离分析膜3的一端贴合有样品垫1。
本发明提供了两种试纸条，一种是用胶体金标记的用于检测血清/血浆/体液中的人抗甲状腺球蛋白抗体含量的试纸条,其由A1/A2/A3,B1/B2/B3,C1/C2/C3随机组成，一种是用胶体金标记的用于检测全血中PTH含量的试纸条，其由A3/A4/A5,B1/B2/B3,C4/C5/C6随机组成，其中每种试纸条均是由结合垫、样品垫和分析膜中择一进行组合。
其中，在此具体在每种试纸条中选取三种组合并与吸水垫结合拼装成试纸条作为试验组，胶体金标记的用于检测血清/血浆/体液中的人抗甲状腺球蛋白抗体含量的试纸条,A3B1C1,A2B2C2,A1B3C3；胶体金标记的用于检测全血中人抗甲状腺球蛋白抗体含量的试纸条，A3B1C4,A2B2C5,A1B3C6。
所述试纸条的宽度可以为3～4mm，相互压叠2～4mm，检测线与质控线之间的间距为6mm，将试纸条装配在卡壳中，卡壳是由上盖和下盖组装成的封闭盒体，上盖与样品垫相对应处设有样品孔，与检测线和质控线对应处设有视窗口。
试纸条的检测原理：采用竞争法进行胶体金免疫层析，若样品中不存在人抗甲状腺球蛋白抗体，结合垫2中的标记有胶体金的人抗甲状腺球蛋白抗体与在虹吸作用下向吸样垫6一侧移动，到达检测线4时与检测线4上包被的甲状腺球蛋白结合，形成胶体金-人抗甲状腺球蛋白抗体-甲状腺球蛋白的复合物，而游离的胶体金标记的人抗甲状腺球蛋白抗体继续向前移动至质控线5，并与质控线5上的质控抗体发生免疫反应形成胶体金-人抗甲状腺球蛋白抗体-质控抗体复合物，当样品中含有人抗甲状腺球蛋白抗体时，在虹吸作用下向吸样垫6移动，到达检测线4时，样品中的人抗甲状腺球蛋白抗体与结合垫上的胶体金-人抗甲状腺球蛋白抗体竞争与检测线上的甲状腺球蛋白结合，分别形成人抗甲状腺球蛋白抗体-甲状腺球蛋白复合物和胶体金-人抗甲状腺球蛋白抗体-甲状腺球蛋白复合物，胶体金带有橘红色，会在检测线4和质控线5上分别形成橘红色的线条，当样品中含有人抗甲状腺球蛋白抗体时，由于竞争作用，形成的胶体金-人抗甲状腺球蛋白抗体-甲状腺球蛋白复合物会减少，颜色会较减弱，根据橘红色线条颜色的深浅即可判断样品中人抗甲状腺球蛋白抗体含量的多少。
试验例
(1)标准曲线绘制：
分别用0.5、10、50、100、200、300mg/L的TGAb对试剂进行测定，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，用免疫层析判读记录仪将相应强度的色带数字化后，计算出标准曲线，并输入免疫层析结果判读记录仪中，完成TGAb标准曲线参数设置；设定TGAb的Cutoff值为34IU/mL，当高于Cutoff值时，结果判定为阳性，当检测结果低于Cutoff值时，结果判定为阴性。
(2)取样及样品预处理
用真空采血管采集静脉的抗凝全血或者血清；采集的静脉抗凝全血离心即获得血浆样本。用注射器术中穿刺淋巴结，检测血清、血浆、体液样品TGAb时分别精确吸取50-120ul的被检样本如血清、血浆，或者取直径为3-6mm活检穿刺组织，剪碎后加入到配有lmL样品稀释液(0.01M PBS PH 7.4或0.9％Nacl PH7.4)中，混匀。
(3)加样及检测
在血清/血浆/体液检测装置样本孔中加入100ul血清、血浆样品或者稀释好的样本，15-20分钟内用免疫层析结果判读记录定量判定结果；检测全血样品TGAb时分别精确吸取100-150ul的被检全血样本，在全血检测装置样本孔中加入100-150u样本，15-20分钟内用免疫层析结果判读记录定量判定结果；设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出TGAb样品浓度的定量测定结果。
对120例临床样本(其中60例的人抗甲状腺球蛋白抗体浓度高于34IU/mL，即为阳性，60例人抗甲状腺球蛋白抗体浓度低于34IU/mL，即为阴性)进行检测，检测结果显示阳性57例、阴性58例，准确率为98.5％。在定量检测方面，相关系数r均大于0.95，t检验P>0.05,不一致的检测离群值<2％，定量检测效果较好。通过以上结果可以判定检测装置的性能良好，具有操作简便、反应快速、结果准确、可信、适合现场检测等优点，适合临床对更为准确、简便检测的需要。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 施康培医疗科技（武汉）有限公司
<120> 一种便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条及其制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Pro Ser Cys Ala Glu Gly Gln Ser Cys Ala Ser Glu Arg Gln Gln Ala
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Thr Ser Gly Tyr Phe Ser Gln His Asp
20 25 30
Leu Phe Ser Ser Pro Glu Lys Arg Trp Ala Ser Pro Arg Val Ala Arg
35 40 45
Phe Ala Thr Ser Cys Pro Pro Thr Ile Lys Glu Leu Phe Val Asp Ser
50 55 60
Gly Leu Leu Arg Pro Met Val Glu Gly Gln Ser Gln Gln Phe Ser Val
65 70 75 80
Ser Glu Asn Leu Leu Ala Ile Phe Pro Ser Arg Gly
85 90
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Gln Tyr Phe Ser His Phe Ile Arg Ser Gly Asn Pro Asn Tyr Pro
1 5 10 15
Tyr Glu Phe Ser Arg Lys Val Pro Thr Phe Ala Thr Pro Trp Pro Asp
20 25 30
Phe Val Pro Arg Ala Gly Gly Glu Asn Tyr Lys Glu Phe Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Pro Asn Arg Gln Gly Leu Lys Lys Ala Asp Cys Ser Phe Trp Ser
50 55 60
Lys Tyr Ile Ser Ser Leu Lys Thr Ser Ala Asp Gly Ala Lys Gly Gly
65 70 75 80
Gln Ser Ala Glu Ser Glu Glu Glu Glu Leu Thr Ala Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Arg Glu Asp Leu Leu Ser Leu Gln Glu Pro Gly Ser Lys Thr Tyr Ser
100 105 110
Lys

Claims (10)

1.一种便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条，包括底板（7）和依次搭接在所述底板上的样品垫（1）、结合垫（2）、分析膜（3）和吸样垫（6），所述分析膜（3）上设有检测线（4）和质控线（5），所述检测线（4）和所述质控线（5）的两端分别与所述分析膜（3）两侧边平齐，所述检测线（4）设于所述分析膜（3）上靠近所述结合垫（2）的一端，所述质控线（5）设于所述分析膜（3）上靠近所述吸样垫（6）的一端，其特征在于，所述结合垫（2）上结合有胶体金标记的人抗甲状腺球蛋白抗体，所述检测线（4）上包被有人甲状腺球蛋白，所述质控线（5）上包被有可与游离人抗甲状腺球蛋白抗体特异性结合的质控抗体，所述胶体金标记的人抗甲状腺球蛋白抗体对应SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的抗原表位肽。
2.根据权利要求1所述的便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条，其特征在于，所述样品垫（1）是将玻璃纤维膜经处理液浸泡后于室温相对湿度为15%~30 %的条件下干燥得到，其中所述处理液包括0.01M PBS、0.1wt% Tween-20、1 wt% 牛血清白蛋白和10 wt% 蔗糖。
3.根据权利要求1所述的便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条，其特征在于，所述样品垫（1）包括滤血膜和经红细胞单抗处理后的纤维玻纤膜，所述滤血膜一端与所述结合垫（2）对应端抵接，所述纤维玻纤膜设置在所述滤血膜远离结合垫（2）的一端，且所述纤维玻纤膜靠近所述滤血膜的一端压覆在所述滤血膜上端,或所述纤维玻纤膜一端与所述结合垫（2）对应端抵接，所述滤血膜设置在所述纤维玻纤膜远离结合垫（2）的一端，且所述滤血膜靠近所述纤维玻纤膜的一端压覆在所述纤维玻纤膜上端，将所述样品垫（1）置于室温相对湿度为15%~30 %的条件下干燥得到。
4.根据权利要求1所述的便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条，其特征在于，所述质控抗体为羊抗鼠IgG。
5.根据权利要求1所述的便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条，其特征在于，所述吸样垫为吸水滤纸。
6.一种如权利要求1~5任一项所述的便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:制备人抗甲状腺球蛋白抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体；
S2:将人抗甲状腺球蛋白抗体用胶体金进行标记，并喷涂在玻璃纤维膜或聚酯膜上，制得结合垫（2）；
S3:将甲状腺球蛋白和羊抗鼠IgG抗体分别包被在检测线（4）和质控线（5）上制备得到分析膜（3）；
S4:将样品垫（1）、结合垫（2）、分析膜（3）和吸样垫（6）裁成合适的尺寸，并依次搭接在底板（7）上，制得便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条。
7.根据权利要求6所述的便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤S2的具体步骤为：取胶体金溶液，调节pH至6.5~8.0，按照5~20 μg/mL加入人抗甲状腺球蛋白抗体，室温搅拌1h，用酪蛋白或BSA封闭，12000r/min离心30min，弃上清，用胶体金工作液复溶，喷涂至玻璃纤维膜或聚酯膜上，于室温、相对湿度为15%~30%的条件下干燥得到所述结合垫（2）。
8.根据权利要求7所述的便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条的制备方法，其特征在于，所述胶体金溶液为采用氯金酸-柠檬酸三钠法制备的直径25~35nm的胶体金溶液；所述胶体金工作液包括1wt％牛血清白蛋白、0.1M Tris-HCL缓冲液和20wt％蔗糖，且pH为8.0。
9.根据权利要求6所述的便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤S3的具体步骤为：将甲状腺球蛋白用包被缓冲液稀释至0.5~2mg/mL，将羊抗鼠IgG多克隆抗体用包被缓冲液稀释至1~2mg/mL，然后以1~2uL/cm分别喷涂于检测线（4）和质控线（5）上，于室温、相对湿度为15%~30%的条件下干燥。
10.根据权利要求9所述的便携式检测人抗甲状腺球蛋白抗体的试纸条的制备方法，其特征在于，所述包被缓冲液为硼酸盐、碳酸盐、磷酸盐、Tris-盐酸或Tris-磷酸盐缓冲液中的任一种，所述包被缓冲液的pH值为6.5~7.5，所述包被缓冲液的浓度为0.01M。
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