CN116430036B - 一种滤血膜检测装置及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种滤血膜检测装置及制备方法和应用，所述制备方法包括在滤血垫上涂覆第一处理液以形成滤血膜；所述第一处理液采用的原料组分包括RBC抗体、聚凝胺、葡萄糖溶液、氯化钠溶液和水；在样品垫上涂覆第二处理液以形成反应膜；所述第二处理液采用的原料组分包括Tris缓冲液、氯化钠溶液、酪蛋白酸钠、Proclin300、PVP40000、吐温‑20、异嗜性抗体阻断剂和水。所述滤血膜检测装置采用所述制备方法制备得到，其应用于血液检测。本发明无需离心或额外添加样本稀释液等操作，便可分离血液样本中的红细胞和血浆，同时，能够减少假阳，提高检测准确度，也能够便于操作和降低成本。

Description

一种滤血膜检测装置及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及血液检测技术领域，具体涉及一种滤血膜检测装置及制备方法和应用。

背景技术

目前，临床体外试剂盒诊断方法通常是针对血液样品进行的。在血液样品临床诊断中，最常使用的检测方法是通过低温高速离心进行分离，取血清或血浆进行检测，具体过程如下：通常是需要将采集的血液样品置于真空采血管内，且在真空采血管内装有抗凝剂肝素，能够防止血液样品发生凝血反应；将真空采血管先静置30分钟以上，再置于离心机中离心，取上层血清进行检测。该检测方法需要专门人员进行采血操作，且检测过程繁琐，耗时长，需要昂贵的仪器设备辅助；同时通过离心等方法检测时，也有可能因为检测人员操作不当，造成血液样本溶血。溶血后的血液样本会引起非特异性的结合或很高的背景干扰，导致检测灵敏度丧失；同时，溶血后的血液样本由于红细胞自身的颜色，也会影响临床诊断中的C线、T线的显色判断，进而影响临床诊断的准确度。

上述检测方法也不适用于个人自测。在市面上已有的适用于个人自测的快速检测产品（如检测试剂盒）中，在检测血液样本时，操作步骤大多如下：在血液样本中添加一定量的样本稀释液混合后再滴入样品孔，或先将血液样本滴入样品孔再添加样本稀释液；随后，由检测试剂盒进行检测。

在快速检测产品检测血液样本时，可能会存在如下问题：

1）若先将血液样本滴入样品孔再添加样本稀释液，则可能使血液样本暴露在空气中，时间过长会凝固；将血液样本滴入试纸采集区时，由于毛细效应，血液样本会向试纸的检测区扩散，但扩散需要一点时间，如果血液样本凝固过快，可能造成血液样本未扩散到检测区，就已经凝固，导致检测失败。因血液样本中微凝血块过多，会减慢扩散的速度，检测结果产生的时间就会延长。

2）若在血液样本中添加一定量的样本稀释液混合后再滴入样品孔，则操作繁琐，且对于使用者来说，没有移液枪等精密仪器，无法精确配比血液样本与样本稀释液的量；同时，此种混合方法需控制操作时间，血液样本暴露在空气中，较容易发生溶血，溶血会导致测试结果有误差。

3）在免疫层析检测试剂盒中使用的样本稀释液中含有较多的成分，可能会引起保质期短，容易变质等问题。若样本稀释液变质与血液样本混合再检测，对后续测试结果将影响较大。

4）还容易出现假阳问题，具体的，在胶体金、荧光免疫层析等免疫层析检测方法中，最常见的问题为假阳，假阳是指检测试剂盒的检测结果为阳性，但实际为阴性，降低了检测准确度。常存在三种原因引起的免疫反应产生假阳现象：第一种是非特异性结合，不管血液样本中是否含有检测物，都能引起检测试剂盒显示阳性；第二种是交叉物质，血液样本中含有的某些物质可能会引起交叉物质反应，对不是目标检测物质的抗原也会发生免疫反应；第三种是异嗜性抗体，该异嗜性抗体广泛存在血液样本中，可引起检测试剂盒假阳，且随着对血液样本的稀释，假阳不会减弱。

因此，从便于操作、降低成本和提高检测准确度上来考虑，急需提供一种滤血膜检测装置及制备方法和应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种滤血膜检测装置及制备方法和应用，能用于分离血液样本中的红细胞和血浆，而无需离心或额外添加样本稀释液等操作，同时，能够减少假阳，提高检测准确度，也能够便于操作和降低成本。具体技术方案如下：

在第一方面，本申请提供了一种滤血膜检测装置的制备方法，其包括以下步骤：

在滤血垫上制备滤血膜

在所述滤血垫上涂覆第一处理液以形成滤血膜；所述第一处理液采用的原料组分包括RBC抗体、聚凝胺、葡萄糖溶液、氯化钠溶液和水；

在样品垫上制备反应膜

在所述样品垫上涂覆第二处理液以形成反应膜；所述第二处理液采用的原料组分包括Tris缓冲液、氯化钠溶液、酪蛋白酸钠、Proclin300、PVP40000、吐温-20、异嗜性抗体阻断剂和水；

制备滤血膜检测装置

将具有滤血膜的滤血垫设置在样品垫的反应膜上，从而制备得到滤血膜检测装置。

可选的，所述第一处理液采用的原料组成为0.05-6.0mg/mL的RBC抗体、2-30g/L的聚凝胺、30-80g/L葡萄糖溶液、2-9g/L氯化钠溶液和水；

所述第一处理液的pH值为7.4±0.05。

可选的，所述第二处理液采用的原料组成为0.1mol/L的Tris缓冲液、2-9g/L氯化钠溶液、0.1g/L酪蛋白酸钠、0.2g/LProclin300、5g/LPVP40000、1g/L吐温-20、10 µg/mL异嗜性抗体阻断剂和水；

所述第二处理液的pH值为8.0±0.05。

可选的，在所述滤血垫上涂覆第一处理液后置于烘箱内烘干以形成滤血膜，烘干温度为37-45℃；

在所述样品垫上涂覆第二处理液后置于烘箱内烘干以形成反应膜，烘干温度为37-45℃。

可选的，所述滤血垫包括醋酸纤维膜、聚酰胺复合膜、聚砜膜、聚醚砜膜、聚酰胺复合膜、聚丙烯腈膜、醋酸－硝酸纤维素复合膜、玻璃纤维膜、滤纸和聚酯纤维中的至少一种；

所述滤血垫的孔径为0.5-6μm。

可选的，所述样品垫包括醋酸纤维膜、聚酰胺复合膜、聚砜膜、聚醚砜膜、聚丙烯腈膜、硝酸纤维素膜、醋酸－硝酸纤维素复合膜、玻璃纤维膜、滤纸、聚酯纤维中的至少一种；

所述样品垫的孔径为0.25-3μm。

可选的，在制备所述滤血膜检测装置时，还包括标记垫、检测膜、吸水纸和阻水板；

所述检测膜和样品垫均设置在阻水板上；在所述检测膜的一端上设置吸水纸，而在其另一端上设置标记垫；所述标记垫远离检测膜的一端与样品垫连接；

在所述检测膜上设置控制线C和检测线T。

可选的，所述阻水板包括聚氯乙烯板；所述检测膜包括硝酸纤维素膜。

在第二方面，本申请提供了一种滤血膜检测装置，其包括采用所述滤血膜检测装置的制备方法所制备得到的滤血膜检测装置。

在第三方面，本申请提供了一种采用所述滤血膜检测装置的应用，用于血液检测。

应用本发明的技术方案，至少具有以下有益效果：

（1）本发明中所述滤血膜检测装置的制备方法，一方面，通过在滤血膜中组合使用RBC抗体和聚凝胺，能够使得血液样本中的红细胞凝集在滤血膜上，且不溶血；同时，经滤血膜将血液样本中的血浆与血细胞（血细胞包括白细胞、血小板和红细胞，三者均会被隔离在滤血膜和/或滤血垫上）分离，即无需采用离心操作便可分离出血浆，提高待测血液样本的纯度和活性，从而提高了免疫层析反应的灵敏度；此外，经滤血垫过滤后的血浆不会有红细胞残留、无线条泛白等影响人眼观测结果的情况，从而减少了因红细胞破裂带来的检测误差；另一方面，被分离出的血浆能够与样品垫上的反应膜结合，促进免疫反应的发生，减少假阳，提高检测准确度；具体的，在反应膜组合使用PVP40000和吐温-20能够增强酪蛋白酸钠和异嗜性抗体阻断剂的水溶性，改善对血浆的润湿性和渗透性，消除非特异性的结合；同时，组合使用PVP40000和吐温-20能够充当载体的作用，使第二处理液更好地与血浆接触并提高检测线的可读性；酪蛋白酸钠能够消除检测过程中的假阳或假阴性物质进一步稳定血浆中被检测的抗原或抗体，异嗜性抗体阻断剂也能够减少假阳的发生。再一方面，本发明的制备方法过程简单，且便于操作。

（2）本发明中所述滤血膜检测装置成本低，操作简单，检测速度快，能用于分离血液样本中的红细胞和血浆，而无需离心或额外添加样本稀释液等操作，同时，能够减少假阳，提高检测准确度。

（3）本发明中所述滤血膜检测装置在用于血液检测时，测试准确度和灵敏度能够达到与血清测试等临床诊断方法相同的检测效果，具有较好的重复性，能够在不同批次的操作中保持一致的效果，从而提高产品的一致性和稳定性。同时，所述滤血膜检测装置在用于血液检测时，比同类产品准确度和灵敏度更高。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明实施例1中的一种滤血膜检测装置的结构示意图；

其中，1、滤血垫，2、样品垫，3、标记垫，4、检测膜，5、吸水纸，6、阻水板。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

参见图1，一种滤血膜检测装置的制备方法，包括以下步骤：

在滤血垫1上制备滤血膜

在所述滤血垫1上涂覆第一处理液以形成滤血膜；所述第一处理液采用的原料组分包括RBC抗体、聚凝胺、葡萄糖溶液、氯化钠溶液和水；

在样品垫2上制备反应膜

在所述样品垫2上涂覆第二处理液以形成反应膜；所述第二处理液采用的原料组分包括Tris缓冲液、氯化钠溶液、酪蛋白酸钠、Proclin300、PVP40000、吐温-20、异嗜性抗体阻断剂和水；

制备滤血膜检测装置

将具有滤血膜的滤血垫1设置在样品垫2的反应膜上，从而制备得到滤血膜检测装置。

所述第一处理液采用的原料组成为0.3mg/mL的RBC抗体、2g/L的聚凝胺、50g/L葡萄糖溶液、9g/L氯化钠溶液和水；在配制第一处理液时，需要将各原料组分充分溶解混匀。

RBC抗体能够对全血（或指尖血）血液样本中的红细胞具有高度亲和性，能够有效固定/捕捉人血液样本中的红细胞，稳定红细胞，使其不发生溶血，同时不干扰血液样本中的其他物质；还能够良好地缩短对血液样本采集、离心和运输等的处理时间。

聚凝胺能够减少红细胞周围的阳离子云，促进血清中的抗体与红细胞相应的抗原结合。加入带有亚电荷的聚阳离子聚合物－聚凝胺，中和红细胞表面的负电荷，缩短红细胞间距，形成可逆的非特异性聚集，使IgG抗体直接凝集红细胞。

葡萄糖溶液一方面为红细胞提供新陈代谢的能量，有助于维持红细胞形态和功能；另一方面，还能够防止红细胞因为吸水而破裂，即避免红细胞溶血；

氯化钠溶液能够调节细胞内外的渗透压，维持红细胞的正常形态和稳定性；减少红细胞因为渗透压改变，吸水膨胀而破裂，进一步地提高了红细胞的稳定性。

所述第一处理液的pH值为7.4±0.05，模拟血液环境，便于保证血液样本的活性。

所述第二处理液采用的原料组成为0.1mol/L的Tris缓冲液、9g/L氯化钠溶液、0.1g/L酪蛋白酸钠、0.2g/LProclin300、5g/LPVP40000、1g/L吐温-20、10 µg/mL的异嗜性抗体阻断剂和水；

组合使用PVP40000和吐温-20能够增强酪蛋白酸钠和异嗜性抗体阻断剂的水溶性，改善对血浆的润湿性和渗透性，消除非特异性的结合；同时，组合使用PVP40000和吐温-20能够充当载体的作用，使第二处理液更好地与血浆接触并提高检测线的可读性；

酪蛋白酸钠是免疫层析类产品里最常见的特异性吸附蛋白，消除检测过程中的假阳或假阴性物质；

氯化钠溶液能够增强反应体系中的离子强度，增强C/T线显色；

异嗜性抗体阻断剂是为了阻断异嗜性抗体引起的假阳，能够减少假阳的发生；

所述第二处理液的pH值为8.0±0.05，可以增强消除假阳性的能力。控制合适的pH值，可以控制反应环境的酸碱度，保持反应的稳定性和一致性，也可以改变蛋白构象，以便更多的结合位点暴露，从而更易于和标记物结合，提高滤血膜检测装置的灵敏度；

此外，第二处理液中还包含防腐剂Proclin300，以延长样品垫2的保存期限和保存质量。

在所述滤血垫1上涂覆第一处理液后置于烘箱内烘干以形成滤血膜，采用37℃的烘烤温度，便于保持蛋白质的活性；

在所述样品垫2上涂覆第二处理液后置于烘箱内烘干以形成反应膜，采用37℃的烘烤温度，便于蒸发溶剂，且低温蒸发有利于保留化学物质的活性，避免高温碳化。

所述滤血垫1为玻璃纤维膜，在涂覆第一处理液前，需要将玻璃纤维膜放置在37℃烘箱内处理12-24小时；所述滤血垫1的孔径为0.5-6μm，而红细胞的平均直径在6-9μm，便于成功过滤红细胞。

所述样品垫2为玻璃纤维膜；

所述样品垫2的孔径为0.25-3μm，便于阻隔其它大分子杂质，只让血浆参与层析。

参见图1，在制备所述滤血膜检测装置时，还包括标记垫3、检测膜4、吸水纸5和阻水板6；

所述检测膜4和样品垫2均设置在阻水板6上；在所述检测膜4的一端上设置吸水纸5，而在其另一端上设置标记垫3；所述标记垫3远离检测膜4的一端与样品垫2连接；

在所述检测膜4上设置控制线C和检测线T。

所述标记垫3采用常规的胶体金溶液，平均粒径40 nm左右，标记人类免疫缺陷病毒（HIV）鼠抗单克隆抗体，并用喷金划膜仪均匀喷洒在玻璃纤维膜上，置于烘箱中烘干处理，烘干温度为37℃，烘干时间为8-24小时。

所述阻水板6为不透水的聚氯乙烯板。

所述检测膜4为硝酸纤维素膜，具体的，还需要对硝酸纤维素膜进行处理，即配置好羊抗鼠IgG多抗（浓度为1 mg/mL）作为结果控制线C，再将人类免疫缺陷病毒鼠抗单克隆抗体（浓度为1 mg/mL）作为结果检测线T，使用喷金划膜仪进行划膜操作，喷量都为8 μL/cm，完成后将硝酸纤维素膜放置在37℃烘箱内过夜，固定抗体试剂，烘干后使用。

一种滤血膜检测装置，包括采用所述滤血膜检测装置的制备方法所制备得到的滤血膜检测装置。

根据对血液样本的检测目的，本发明设置了实施例1和实施例2。

其中，在实施例1中，检测目的为检测血液样本中的人类免疫缺陷病毒（即HIV病毒）。因此，需要在滤血膜检测装置中组装检测的HIV试剂条，再将滤血膜检测装置装入塑料卡壳内形成滤血膜检测试剂盒。在塑料卡壳上设有与滤血膜对应的加样孔，便于加入血液样本。

实施例2：

与实施例1不同的是，检测目的为检测血液样本中的梅毒（即TP病毒）。因此，需要在滤血膜检测装置中组装检测的TP试剂条；

所述标记垫3上标记梅毒鼠（TP）抗单克隆抗体；

在所述检测膜4上将梅毒鼠抗单克隆抗体（浓度为1 mg/mL）作为结果检测线T。

对比例1：

市售胶体金法检测的检测试剂盒商品，进行血液样本测试。

实验前准备：将实施例1-2中的滤血膜检测试剂盒、对比例1中的检测试剂盒以及待测的血液样本平衡至室温，取出检测卡，平放。

一种采用实施例1和实施例2中所述滤血膜检测试剂盒分别用于血液检测，其检测步骤和检测原理如下：

将血液样本（取80μL）通过加样孔直接滴加在滤血膜上，减少了现有技术中需要离心或额外添加样本稀释液等操作，操作简单；同时，借助“毛细管作用”将血液样本中的液体吸附并依次从滤血膜、滤血垫1、反应膜、样品垫2、标记垫3和检测膜4流向吸水纸5；

在此流动过程中，本发明在滤血膜中组合使用RBC抗体和聚凝胺，能够使得血液样本中的红细胞凝集在滤血膜上，且不溶血；同时，经滤血膜将血液样本中的血浆与血细胞（白细胞、血小板也会被隔离在滤血膜上方）分离，即无需采用离心操作便可分离出血浆，提高待测血液样本的纯度和活性，从而提高了免疫层析反应的灵敏度；

被分离出的血浆能够与样品垫2上的反应膜结合，进一步稳定血浆中被检测的抗原，促进免疫反应的发生；最后，在层析过程中，待测血液样本中的血浆经过检测膜时，形成的胶体金*抗体-抗原会被固定在检测膜上检测线T的另一个抗体所捕获，形成红色胶体金*抗体-抗原-抗体的夹心复合物，在检测线T内会出现一条红色条带。如果是阴性样本，不含目标抗原，则在检测线T内没有红色条带出现。由于在检测膜上会形成胶体金*抗体-抗体的复合物。因此不管血液样本中是否含有检测目标抗原，控制线C都会显示一条红色的条带。

经滤血垫1过滤后的血浆不会有红细胞残留、无线条泛白等影响人眼观测结果的情况，从而减少了因红细胞破裂带来的检测误差。

对比例1在测试血液样本时，测试步骤按照其说明书操作，如滴加血液样本40 μL于洁净的离心管中，再添加80 μL样本稀释液混匀后，加入检测试剂盒加样孔中。

由实施例1-2和对比例1对同一来源且同一批次的血液样本测试后，观测血液层析过程中试剂盒背景是否干净，有无血液残留，是否有溶血现象，控制线C与检测线T是否存在线条泛白的情况，观测是否有检测线T的出现（若检测线T显色，则表示为阳性样本）。具体结果详见表1和表2。

表1 由实施例1-2和对比例1测试的加样后快速诊断试剂条背景显示情况（单位：例）

由表1数据知，相比于对比例1，本发明采用实施例1-2能够有效避免假阳，提高检测准确度。

表2 由实施例1-2和对比例1测试的灵敏度和特异性结果（单位：例）

在表2中，测试实施例1-2和对比例1中检测试剂盒的灵敏度和特异性，其中，灵敏度为体外诊断检验程序可以识别与特定疾病或状态相关的目标标志物存在的能力，灵敏度=（真阳性÷总患病人数）×100%；特异性为体外诊断检验程序可以识别与特定疾病或状态相关的目标标志物不存在的能力，特异性=（真阴性÷总非患病人数）×100%。

由表2数据知，相比于对比例1，本发明采用实施例1-2能够有效提高检测灵敏度。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种滤血膜检测装置的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

在滤血垫(1)上制备滤血膜

在所述滤血垫(1)上涂覆第一处理液经烘干以形成滤血膜；所述第一处理液采用的原料组分包括RBC抗体、聚凝胺、葡萄糖溶液、氯化钠溶液和水；

在样品垫(2)上制备反应膜

在所述样品垫(2)上涂覆第二处理液经烘干以形成反应膜；所述第二处理液采用的原料组分包括Tris缓冲液、氯化钠溶液、酪蛋白酸钠、Proclin300、PVP40000、吐温-20、异嗜性抗体阻断剂和水；

制备滤血膜检测装置

将具有滤血膜的滤血垫(1)设置在样品垫(2)的反应膜上，从而制备得到滤血膜检测装置；

在制备所述滤血膜检测装置时，还包括标记垫(3)、检测膜(4)、吸水纸(5)和阻水板(6)；

所述检测膜(4)和样品垫(2)均设置在阻水板(6)上；在所述检测膜(4)的一端上设置吸水纸(5)，而在其另一端上设置标记垫(3)；所述标记垫(3)远离检测膜(4)的一端与样品垫(2)连接；

在所述检测膜(4)上设置控制线C和检测线T。

2.根据权利要求1所述的滤血膜检测装置的制备方法，其特征在于，所述第一处理液采用的原料组成为0.05-6.0mg/mL的RBC抗体、2-30g/L的聚凝胺、30-80g/L葡萄糖溶液、2-9g/L氯化钠溶液和水；

所述第一处理液的pH值为7.4±0.05。

3.根据权利要求1所述的滤血膜检测装置的制备方法，其特征在于，所述第二处理液采用的原料组成为0.1mol/L的Tris缓冲液、2-9g/L氯化钠溶液、0.1g/L酪蛋白酸钠、0.2g/LProclin300、5g/LPVP40000、1g/L吐温-20、10μg/mL异嗜性抗体阻断剂和水；

所述第二处理液的pH值为8.0±0.05。

4.根据权利要求1-3任一项所述的滤血膜检测装置的制备方法，其特征在于，在所述滤血垫(1)上涂覆第一处理液后置于烘箱内烘干以形成滤血膜，烘干温度为37-45℃；

在所述样品垫(2)上涂覆第二处理液后置于烘箱内烘干以形成反应膜，烘干温度为37-45℃。

5.根据权利要求4所述的滤血膜检测装置的制备方法，其特征在于，所述滤血垫(1)包括醋酸纤维膜、聚酰胺复合膜、聚砜膜、聚醚砜膜、聚酰胺复合膜、聚丙烯腈膜、醋酸－硝酸纤维素复合膜、玻璃纤维膜、滤纸和聚酯纤维中的至少一种；

所述滤血垫(1)的孔径为0.5-6μm。

6.根据权利要求4所述的滤血膜检测装置的制备方法，其特征在于，所述样品垫(2)包括醋酸纤维膜、聚酰胺复合膜、聚砜膜、聚醚砜膜、聚丙烯腈膜、硝酸纤维素膜、醋酸－硝酸纤维素复合膜、玻璃纤维膜、滤纸、聚酯纤维中的至少一种；

所述样品垫(2)的孔径为0.25-3μm。

7.根据权利要求4所述的滤血膜检测装置的制备方法，其特征在于，所述阻水板(6)包括聚氯乙烯板；所述检测膜(4)包括硝酸纤维素膜。

8.一种滤血膜检测装置，其特征在于，包括采用如权利要求7所述的滤血膜检测装置的制备方法所制备得到的滤血膜检测装置。

9.一种采用如权利要求8所述的滤血膜检测装置的应用，其特征在于，用于血液检测。