CN113777301A - 一种区分非洲猪瘟野毒与cd2v缺失毒的检测试纸条及其制备与检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫检测技术领域，具体为一种区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条及其制备与检测方法。所述检测试纸条包括吸水纸、硝酸纤维素膜、胶体金垫、滤血膜和样品垫；所述硝酸纤维素膜上依次间隔设置有C线、T1线和T2线，所述C线上固定有抗鸡IgY，T1线固定有PP62抗原，T2线固定有P30抗原。该试纸条结构简单，检测过程操作简便省时省力，可快速区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体为一种区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条及其制备与检测方法。
背景技术
非洲猪瘟是一种急性，发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪病，其特征是发病过程短，但死亡率高达100％,2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。截至2019年1月14日，中国曾有24个省份发生过家猪和野猪疫情，累计扑杀生猪91.6万头。近期，有媒体报道，在中国一些猪场鉴定出新形式的非洲猪瘟病毒，行业人士认为该病毒是由违法疫苗造成的。非洲猪瘟基因缺失毒株在猪体内的传播循环途径与野毒明显不同。在临床中发现，出现厌食症状的早期，通过唾液很难检测到非洲猪瘟基因缺失毒株的核酸，通过猪群唾液核酸检测更难筛查到感染早期的无症状感染猪。这导致相当一部分猪场因误诊错失了最佳处置时机，也让定点清除缺少了着力点。很多猪场在处理非洲猪瘟基因缺失毒株中发现，往往是清除了一批阳性猪后，很快就又出现一批异常猪，如此周而复始，定点清除到最后大部分猪都感染了。由于大多数猪在感染早期不表现发热症状，通过红外体温监测的尝试也宣告失败，在上万头规模的大群中难以发现感染的异常猪，这是导致难以定点清除的关键原因。
因此，急需开发一种能够区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失疫苗毒的检测方法，以便快速确定病毒类型。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明以抗鸡IgY为内参抗体，结合抗原PP62和P30，采用胶体金法制备出了一种操作简便，易于识别的区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失疫苗毒的试纸。
为了实现上述目的，本发明实施例提供了一种区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条，所述检测试纸条包括吸水纸、硝酸纤维素膜、胶体金垫、滤血膜和样品垫；
所述硝酸纤维素膜上依次间隔设置有C线、T1线和T2线，所述C线上固定有抗鸡IgY，T1线固定有PP62抗原，T2线固定有P30抗原。
进一步的，所述胶体金垫包被有PP62抗原、P30抗原和抗鸡IgY的标记物。
基于同一发明构思的，本发明实施例还提供了上述区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
将样品垫置于样品垫处理液中浸泡4-7min后进行干燥备用，所述样品垫处理液以PB缓冲液和氯化钠溶液为母液，加入络蛋白、十二烷基硫酸钠、吐温20和蔗糖配置而成；
将滤血膜置于滤血膜处理液中浸泡4-7min后干燥备用，所述滤血膜处理液是以十二水磷酸氢二钠和氯化钠为母液，加入蔗糖、抗血红细胞抗体配置而成；
配置抗鸡IgY溶液、PP62抗原溶液和P30抗原溶液，并将所述溶液抗鸡IgY溶液、PP62抗原溶液和P30抗原溶液分别在硝酸纤维素膜上划线并干燥获得含有C线、T1线和T2线的硝酸纤维素膜；
配置胶体金，分别取三份胶体金，分别加入碳酸钾缓冲液，再分别加入PP62、P30抗原和抗鸡IgY，充分混合后加入BSA溶液进行封闭并反应，离心后除去上清液，加入悬浮液悬浮混匀获得PP62抗原悬浮液、P30抗原悬浮液和内参抗体悬浮液，将所述PP62、P30抗原悬浮液混合后，再加入内参抗体悬浮液混匀并涂覆在玻璃纤维板上，干燥获得胶体金垫；
将吸水纸、含有C线、T1线和T2线的硝酸纤维素膜、处理后的滤血膜、胶体金垫和处理后的样品垫按顺序组装好并切条，加入干燥剂获得检测试纸条。
进一步的，所述样品处理液的配方为：
0.02M PB缓冲液和9g/L的氯化钠溶液为母液，加入0.5％酪蛋白，0.05％十二烷基硫酸钠，0.05％的吐温20，5％蔗糖，配制1L。
进一步的，所述滤血膜处理液的配方为：
十二水磷酸氢二钠5.8g/L和8g/L的氯化钠溶液，5％蔗糖，0.5mg/ml抗红细胞抗体配制25ml。
进一步的，所述胶体金的制备方法具体包括：
取金氯酸水溶液加热至沸腾，1-3min钟后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸6-10min，冷却后加入蒸馏水定容获得胶体金溶液。
进一步的，所述胶体金垫制备过程中，所述碳酸钾缓冲液的浓度为0.2mol/L，所述PP62和P30抗原用量与碳酸钾缓冲液的用量的比值为：(3-10)ug：(2-8)ul；所述抗鸡IgY的用量与与碳酸钾缓冲液的用量的比值为：(2-4)ug：(2-5)ul。
进一步的，所述悬浮液配方为：
十二水磷酸氢二钠0.6g、柠檬酸0.4g、酪蛋白钠0.4g、月桂醇聚氧乙烯醚0.3g、蔗糖10g、PEG200000.2g、吐温20千分之五，定容至200ml。
基于同一发明构思的，本发明实施例还提供了上述区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条的使用方法，具体包括：
获取待测血清，并将所述待测血清与样品稀释液按照1:5进行稀释，并反应8-12min获得待测样品，
将待测样品滴入样品垫；待样品流过硝酸纤维素膜后，判定待测样品类型；
当C线和T2线显色，T1线不显色，待测样品为非洲猪瘟野毒血清；当C线、T1线和T2线显色，待测样品为CD2V缺失毒血清，当C线显色，T1线和T2线不显色，为阴性，其余显色情况为无效。
进一步的，所述样品稀释液为：
十二水磷酸氢二钠5.8g/L和8g/L的氯化钠溶液、酪蛋白钠0.5％+千分之五的叠氮化钠，配制50ml。
有益效果：
本发明利用双抗原夹心胶体金法来实现的。将抗鸡IgY，PP62抗原、P30抗原分别固定在硝酸纤维素膜上，分别形成C线、T1、T2线；用胶体金混合标记鸡IgY、PP62、P30抗原，当样品从样品垫经层析作用向前移动，结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原的区域时，可通过肉眼观察到显色结果，通过不同线的显色情况判定样品类型，该试纸条结构简单，检测过程操作简便省时省力，非常适合现场和偏远地区检测，使用门槛低，可规模化生产和使用。
附图说明
图1为本发明实施例提供的区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条的结构示意图；
图2为本发明实施例提供的待测血清检测结果；
图3为本发明实施例提供的非洲猪瘟阳性血清检测结果；
图4为本发明实施例提供的非洲猪瘟CD2V缺失型阳性血清检测结果；
图5为本发明实施例提供的正常猪血清检测结果；
图6为本发明对比例1提供的非洲猪瘟阳性血清检测结果。
【附图标记说明】
1、吸水纸；2、硝酸纤维素膜；3、胶体金垫；4、滤血膜；5、样品垫；6、C线；7、T1线；8、T2线。
具体实施方式
为了更加清楚阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例和附图予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的技术内容显而易见地得出的其他技术方案仍属于本发明的保护范围。
本发明是利用双抗原夹心胶体金法来实现的，将抗鸡IgY(杭州隆基生物)，PP62抗原和P30抗原(湖南远泰生物技术有限公司)分别固定在硝酸纤维素膜上，分别形成C线、T1、T2线；用胶体金混合标记鸡IgY、PP62、P30抗原。待检样本1:5加到试纸条一端的样本垫上后，通过层析作用向前移动，结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原的区域时，可通过肉眼观察到显色结果。如果C线和T2线有反应，则说明此份标本为野毒标本；如果C线、T1和T2线都有反应，说明此标本为CD2V缺失毒标本；如果只要C线有反应，说明标本为阴性；如果C线无反应或者C线和T1有反应，说明此条无效。
如图1所示，本发明的区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条具体包括吸水纸1、硝酸纤维素(NC)膜2、胶体金垫3、滤血膜4和样品垫5，所述NC上依次间隔设置有C线6、T1线7和T2线8，所述C线6上固定有抗鸡IgY，T1线7固定有PP62抗原，T2线8固定有P30抗原；胶体金垫3包被有PP62抗原、P30抗原和抗鸡IgY的标记物。
实施例：区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条的制备
样品垫处理：配制样品处理液：0.02M PB缓冲液和9g/L的氯化钠溶液为母液，加入0.5％酪蛋白，0.05％SDS(十二烷基硫酸钠)，0.05％的吐温20，5％蔗糖，配制1L。取样品垫(上海金标SB08)，浸泡5分钟后用纱网晾干，60度鼓风干燥箱烘烤4小时后备用。
滤血膜处理：配制滤血膜处理液：十二水磷酸氢二钠5.8g/L和8g/L的氯化钠溶液，5％蔗糖，0.5mg/mlRBC抗体(抗红细胞抗体)配制25ml。取滤血膜(上海杰一，GF2)25cm*30cm一张，浸泡5分钟后用纱网晾干，60度鼓风干燥箱烘烤2小时后，切成0.5cm*30cm备用。
胶体金垫制备：
胶体金的制备工艺：取0.04％氯金酸(sigma)水溶液1L用电热套加热至沸，1分钟以后，搅动下准确加入1％柠檬酸三钠水溶液50ml，继续煮沸8分钟，冷却后以蒸馏水定容到1L。
悬浮液配制：十二水磷酸氢二钠0.6g+柠檬酸0.4g+酪蛋白钠(sigma产地新西兰)0.4g+brij350.3g+蔗糖10g+PEG20000 0.2g+吐温20千分之五定容至200ml。
取上述胶体金1ml，加入2-8ul 0.2M的碳酸钾缓冲液，加入3-10ug非洲猪瘟PP62和P30抗原，抗原的用量根据实际结果进行调试，本次实施例中PP62用2ul碳酸钾为标记的条件，抗原用量为5ug；P30用4ul碳酸钾为标记的条件，抗原用量为5ug；内参抗体鸡IgY3ul碳酸钾为标记的条件，抗原用量为2ug，充分混匀反应20min，加入40ul 10％BSA溶液进行封闭，反应10分钟，12000转4度离心10分钟弃上清，PP62和P30抗原加入300ul悬浮液悬浮，内参抗体鸡IgY用150ul悬浮液悬浮，分别用枪头吹打均匀。将PP62和P30充分混匀后，再加入50ul悬浮后的内参抗体鸡IgY，一共得到650ul母液。用枪头均匀铺至8975玻璃纤维(上海杰一)上0.5cmX30cm，放置鼓风干燥箱内60℃ 2小时。
划膜：
C线：取抗鸡IGY抗体(杭州隆基生物)8ug，加入8ul50％的海藻糖，用0.1MPB7.4定容至40ul。取35ul均匀的用划膜仪划在硝酸纤维素膜(赛多利斯140)上为C线。PP62抗原划膜：取本公司自产的PP62抗原10ug，加入8ul50％的海藻糖，用0.1MPB7.4定容至40ul。取35ul均匀的用划膜仪划在硝酸纤维素膜(赛多利斯140)上为T1线。P30抗原划膜：取本公司自产的P30抗原10ug，加入8ul50％的海藻糖，用0.1MPB7.4定容至40ul。取35ul均匀的用划膜仪划在硝酸纤维素膜(赛多利斯140)上为T2线。三者在同一张硝酸纤维素膜上，放置鼓风干燥箱内55℃ 2小时。
把试纸条按吸水纸，NC膜，滤血膜，胶体金垫和处理好的样品垫组装好切成3mm每条，加入干燥剂备用。
样品检测：
配制样品稀释液：十二水磷酸氢二钠5.8g/L和8g/L的氯化钠+酪蛋白钠(sigma产地新西兰)0.5％+千分之五的叠氮化钠，配制50ml。
取中国兽医药品监察所购买的非洲猪瘟阳性血清(202101批)，非洲猪瘟CD2V缺失型阳性血清(202101批)，以及正常猪血清，用样品稀释液1：5稀释，反应10分钟后，采用上述试纸条检测得到的结果如图2所示，前三个样本为非洲猪瘟阳性血清，中间三个样本为非洲猪瘟CD2V缺失型阳性血清，后面5个为5个不同的正常猪血清。因此本试纸条可以很好的区分非洲猪瘟阳性血清，非洲猪瘟CD2V缺失型阳性血清，以及正常猪血清。
另取取非洲猪瘟阳性血清10份，非洲猪瘟CD2V缺失型阳性血清10份，以及正常猪血清5份，用样品稀释液1：5稀释，反应10分钟后得到的结果如图3-5所示，检测的符合率为100％。
对比例1
将C线设置为抗鸡IgY，T1为P30，T2线为PP62，其余制备方法与实施例完全相同获得试纸条。
将所述试纸条对非洲猪瘟阳性血清进行检测，如图6所示，在T2线划有PP62位置有非特异性反应，因此考虑将T1为PP62，T2线为P30，利用P30先结合且消除非特异性影子，达到完全区分的目的。
对比例2
在划膜过程中，仅划C线，仅设置一条T线。C线：取抗鸡IGY抗体(杭州隆基生物)8ug，加入8ul50％的海藻糖，用0.1MPB7.4定容至40ul。取35ul均匀的用划膜仪划在硝酸纤维素膜(赛多利斯140)上为C线。T线比对1(P30，P72，P54远泰生物)：取对应非洲猪瘟抗原10ug，加入8ul50％的海藻糖，用0.1MPB7.4定容至40ul。取35ul均匀的用划膜仪划在硝酸纤维素膜(赛多利斯140)上为T线。T线比对2(P30，P72，P54杭州东抗)：取对应非洲猪瘟抗原10ug，加入8ul50％的海藻糖，用0.1MPB7.4定容至40ul。取35ul均匀的用划膜仪划在硝酸纤维素膜(赛多利斯140)上为T线。
T线比对3(P30，P72，P54北京百新意生物)：取对应非洲猪瘟抗原10ug，加入8ul50％的海藻糖，用0.1MPB7.4定容至40ul。取35ul均匀的用划膜仪划在硝酸纤维素膜(赛多利斯140)上为T线。
其他制备方法与实施例相同，获得试纸条。
采用上述试纸条，取非洲猪瘟阳性血清10份与阴性血清各5份，用样品稀释液1：5稀释，反应10分钟后得到的结果如下表所示：
表1 T线为P30的检测结果表
表2 T线为P72的检测结果表
表3 T线为P54的检测结果表
| 血清号 | 血清ELISA值 | P54远泰 | P54东抗 | P54百新意 |
| 1阳性 | 2.955 | — | — | + |
| 2阳性 | 2.685 | — | — | + |
| 3阳性 | 2.460 | + | + | — |
| 4阳性 | 1.653 | + | + | — |
| 5阳性 | 2.234 | — | + | + |
| 6阳性 | 2.514 | + | — | ± |
| 7阳性 | 2.549 | + | — | + |
| 8阳性 | 2.553 | + | + | + |
| 9阳性 | 2.751 | + | + | + |
| 10阳性 | 2.539 | — | + | ± |
| 11阴性 | 0,182 | — | ± | ± |
| 12阴性 | 0.190 | ± | — | — |
| 13阴性 | 0.131 | — | — | — |
| 14阴性 | 0.152 | ± | ± | — |
| 15阴性 | 0.128 | — | — | ± |
结果判读：+为阳性，±为弱阳，—为阴性结果。
由表1-3可知，远泰或者杭州东抗的P30，阳性符合率为100％，而东抗的原料出现假阳，可以通过工艺调试，进行改善，而P72和P54方面不管用哪家的原料都出现漏检的情况出现，不可作为非洲猪瘟病毒检测。
以上所述实施例，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条，其特征在于，所述检测试纸条包括吸水纸、硝酸纤维素膜、胶体金垫、滤血膜和样品垫；
所述硝酸纤维素膜上依次间隔设置有C线、T1线和T2线，所述C线上固定有抗鸡IgY，T1线固定有PP62抗原，T2线固定有P30抗原。
2.根据权利要求1所述的区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条，其特征在于，所述胶体金垫包被有PP62抗原、P30抗原和抗鸡IgY的标记物。
3.如权利要求1-2任意所述的区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
将样品垫置于样品垫处理液中浸泡4-7min后进行干燥备用，所述样品垫处理液以PB缓冲液和氯化钠溶液为母液，加入络蛋白、十二烷基硫酸钠、吐温20和蔗糖配置而成；
将滤血膜置于滤血膜处理液中浸泡4-7min后干燥备用，所述滤血膜处理液是以十二水磷酸氢二钠和氯化钠为母液，加入蔗糖、抗血红细胞抗体配置而成；
配置抗鸡IgY溶液、PP62抗原溶液和P30抗原溶液，并将所述溶液抗鸡IgY溶液、PP62抗原溶液和P30抗原溶液分别在硝酸纤维素膜上划线并干燥获得含有C线、T1线和T2线的硝酸纤维素膜；
配置胶体金，分别取三份胶体金，分别加入碳酸钾缓冲液，再分别加入PP62、P30抗原和抗鸡IgY，充分混合后加入BSA溶液进行封闭并反应，离心后除去上清液，加入悬浮液悬浮混匀获得PP62抗原悬浮液、P30抗原悬浮液和内参抗体悬浮液，将所述PP62、P30抗原悬浮液混合后，再加入内参抗体悬浮液混匀并涂覆在玻璃纤维板上，干燥获得胶体金垫；
将吸水纸、含有C线、T1线和T2线的硝酸纤维素膜、处理后的滤血膜、胶体金垫和处理后的样品垫按顺序组装好并切条，加入干燥剂获得检测试纸条。
4.根据权利要求3所述的区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述样品处理液的配方为：
0.02M PB缓冲液和9g/L的氯化钠溶液为母液，加入0.5％酪蛋白，0.05％SDS(十二烷基硫酸钠)，0.05％的吐温20，5％蔗糖，配制1L。
5.根据权利要求3所述的区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述滤血膜处理液的配方为：
十二水磷酸氢二钠5.8g/L和8g/L的氯化钠溶液，5％蔗糖，0.5mg/ml抗红细胞抗体配制25ml。
6.根据权利要求3所述的区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述胶体金的制备方法具体包括：
取金氯酸水溶液加热至沸腾，1-3min钟后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸6-10min，冷却后加入蒸馏水定容获得胶体金溶液。
7.根据权利要求3所述的区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述胶体金垫制备过程中，所述碳酸钾缓冲液的浓度为0.2mol/L，所述PP62和P30抗原用量与碳酸钾缓冲液的用量的比值为：(3-10)ug：(2-8)ul；所述抗鸡IgY的用量与与碳酸钾缓冲液的用量的比值为：(2-4)ug：(2-5)ul。
8.根据权利要求3所述的区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述悬浮液配方为：
十二水磷酸氢二钠0.6g、柠檬酸0.4g、酪蛋白钠0.4g、月桂醇聚氧乙烯醚0.3g、蔗糖10g、PEG200000.2g、吐温20千分之五，定容至200ml。
9.如权利要求1-2任意所述或权利要求3-8任意制备方法获得的区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条的使用方法，其特征在于，具体包括：
获取待测血清，并将所述待测血清与样品稀释液按照1:5进行稀释，并反应8-12min获得待测样品，
将待测样品滴入样品垫；待样品流过硝酸纤维素膜后，判定待测样品类型；
当C线和T2线显色，T1线不显色，待测样品为非洲猪瘟野毒血清；当C线、T1线和T2线显色，待测样品为CD2V缺失毒血清，当C线显色，T1线和T2线不显色，为阴性，其余显色情况为无效。
10.根据权利要求9所述的区分非洲猪瘟野毒与CD2V缺失毒的检测试纸条的使用方法，其特征在于，所述样品稀释液为：
十二水磷酸氢二钠5.8g/L和8g/L的氯化钠溶液、酪蛋白钠0.5％+千分之五的叠氮化钠，配制50ml。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20211210 |