CN105181964A - 水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条及制备方法，涉及胶体金检测试纸条技术领域，解决了现有的AD检测技术存在的检测步骤繁琐、耗时，需要专业人员进行操作且检测主要依赖实验室的问题。该试纸条包括PVC底板，依次粘帖在PVC底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫；金标结合垫包被有纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物以及小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，硝酸纤维素膜上的检测线包被有纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原，硝酸纤维素膜上的质控线包被有羊抗鼠IgG。本发明的试纸条操作简单快速、检测结果清楚易于判断、特异性强、敏感性高、无需仪器设备等优点。
Description
技术领域
本发明涉及胶体金检测试纸条技术领域，具体涉及一种水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法。
背景技术
水貂阿留申病(AleutianDisease，AD)是由水貂阿留申病毒(AleutianMinkDiseaseVirus，AMDV)引起的一种免疫系统紊乱、代谢异常的慢性传染病。水貂阿留申病可以严重影响水貂的毛皮质量，损害其生育能力，降低存活率，给养貂业带来巨大的经济损失，被称为毛皮动物三大疫病之一，目前国内外主要通过检测淘汰来防控该水貂阿留申病。
目前，常规的AD检测技术主要是采用对流免疫电泳(CIEP)，但该方法检测步骤繁琐、耗时，需要专业人员进行操作且主要依赖实验室，这些弊端严重阻碍了水貂阿留申病检测的普及和推广。因此，研究一种简单、快捷的AD检测方法具有十分重要的意义。
发明内容
为了解决现有的AD检测技术存在的检测步骤繁琐、耗时，需要专业人员进行操作且检测主要依赖实验室的问题，本发明提供一种水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条，包括PVC底板，依次粘帖在PVC底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫；所述金标结合垫包被有水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物以及小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，所述硝酸纤维素膜上的检测线包被有纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原，所述硝酸纤维素膜上的质控线包被有羊抗鼠IgG。
本发明还提供了上述水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条的制备方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、水貂阿留申病毒细胞抗原的制备：将水貂阿留申病毒接种长满单层的CRFK细胞，待CRFK细胞有85％～90％病变时，收获细胞培养液，反复冻融3次后，采用差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心纯化病毒，获得纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原；
步骤二、水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物的制备：逐级稀释法确定纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金溶液的用量比例为33ug～36ug:1ml，按照此用量比例逐滴加入纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原，再加入终浓度为1％的牛血清白蛋白，搅拌后获得水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化；
步骤三、小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的制备：逐级稀释法确定小鼠IgG与胶体金溶液的用量比例为3.85ug～4.2ug:1ml，按照此用量比例逐滴加入小鼠IgG，再加入终浓度为1％的牛血清白蛋白，搅拌后获得小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化；
步骤四、试纸条的组装：采用喷金仪将水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物、小鼠IgG与胶体金的偶联标记物分别喷在玻璃纤维素膜上，室温条件下自然干燥，密封，获得金标结合垫；采用划膜仪将纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原、羊抗鼠IgG分别划膜于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上；将处理好的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜依次粘帖在PVC底板上，切条、组装、密封，获得水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条，室温保存。
进一步的，步骤一中，将水貂阿留申病毒细胞接种长满单层的CRFK细胞后，于37℃孵育1小时，加入含5％血清的细胞培养液，37℃静置培养并逐天观察CRFK细胞病变情况。
进一步的，所述胶体金溶液采用柠檬酸三钠还原法制备：取1％氯金酸溶液1ml，加入99ml的超纯水配置成终浓度为0.01％的氯金酸溶液，加热至沸腾后，加入1％柠檬酸三钠1ml并继续加热，溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热5分钟，室温冷却，获得胶体金溶液，4℃保存备用，胶体金颗粒直径为40nm。
进一步的，步骤二中，所述逐级稀释法确定水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金溶液的用量比例的具体过程如下：用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的PH值为8.4，向11支离心管中分别加入1ml胶体金溶液；将纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原逐级稀释后即含量分别为5ug、10ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug，按照上述顺序加入到2号管至11号管中，并与离心管中的胶体金溶液混匀，5分钟后在2号管至11号管中分别加入10％的氯化钠溶液1ml混匀，室温静置2小时以上观察结果，1号管为空白对照；
2号管至6号管中，出现由红变蓝的聚沉现象，7号管至11号管中，保持胶体金的红色不变；因此，胶体金红色不变且水貂阿留申病毒细胞抗原加入量最低的离心管即7号管中的水貂阿留申病毒细胞抗原含量，即为稳定1ml胶体金溶液所需的最低稳定量，在该最低稳定量的基础上再加上10％～20％即为稳定1ml胶体金溶液所需的水貂阿留申病毒细胞抗原的实际使用量，即水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金溶液的用量比例为：33ug～36ug:1ml。
进一步的，步骤三中，逐级稀释法确定小鼠IgG与胶体金溶液的用量比例的具体过程如下：向11支离心管中分别加入1ml胶体金溶液；将小鼠IgG逐级稀释后即含量分别为0.5ug、1ug、1.5ug、2ug、2.5ug、3ug、3.5ug、4ug、4.5ug、5ug，按照上述顺序加入到2号管至11号管中，并与离心管中的胶体金溶液混匀，5分钟后在2号管至11号管中分别加入10％的氯化钠溶液1ml混匀，室温静置2小时以上观察结果，1号管为空白对照；
2号管至7号管中，出现由红变蓝的聚沉现象，8号管至11号管中，保持胶体金的红色不变；因此，胶体金红色不变且小鼠IgG加入量最低的离心管即8号管中的小鼠IgG含量，即为稳定1ml胶体金溶液所需的最低稳定量，在该最低稳定量的基础上再加上10％～20％即为稳定1ml胶体金溶液所需的小鼠IgG的实际使用量，即小鼠IgG与胶体金溶液的用量比例为：3.85ug～4.2ug:1ml。
进一步的，步骤二中，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化的具体过程如下：首先将体积为V的金标水貂阿留申病毒细胞抗原在4℃下以3000rpm/min离心40分钟，吸取上清液，弃沉淀；再将上清液在4℃下以10000rpm/min离心40分钟，弃去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即金标水貂阿留申病毒细胞抗原的体积V，稳定后过夜：4℃下，再以10000rpm/min离心40分钟，弃上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即金标水貂阿留申病毒细胞抗原的体积V的1/10，获得纯化的金标水貂阿留申病毒细胞抗原，4℃保存备用；所述PBS缓冲液中含有1％BSA和0.02％叠氮钠。
进一步的，步骤三中，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化的具体过程如下：首先将体积为V的小鼠IgG与胶体金的偶联标记物在4℃下以3000rpm/min离心40分钟，吸取上清液，弃沉淀；再将上清液在4℃下以10000rpm/min离心40分钟，弃上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的体积V，稳定后过夜：4℃下，再以10000rpm/min离心40分钟，弃上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的体积V的1/10，获得纯化的小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，4℃保存备用，所述PBS缓冲液中含有1％BSA和0.02％叠氮钠。
本发明的有益效果是：本发明的水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条具有特异性强、灵敏度高、简单快速、操作简单快捷等特点，易于推广，适用于基层养殖场检测，具有广阔的市场前景。
本发明将酶联免疫原理与胶体金层析技术结合，制备检测水貂阿留申病毒抗体的胶体金检测试纸条并拟应用于临床，提高水貂阿留申病的预防能力，具有操作简单快速、检测结果清楚易于判断、特异性强、敏感性高、无需仪器设备等优点，因此，非常适用于现场、门诊等实验条件有限的场所进行临床样品检测。本发明提供了上述试纸条的制备方法，适用于工业生产。
附图说明
图1为本发明的水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条的结构示意图。
图2为本发明的水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条结果判定示意图。
图中：1、PVC底板，2、样品垫，3、金标结合垫，4、硝酸纤维素膜，5、检测线，6、质控线，7、吸收垫。
具体实施方式
本发明的水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条，包括PVC底板1、样品垫2、金标结合垫3、带有检测线5和质控线6的硝酸纤维素膜4和吸收垫7，样品垫2、金标结合垫3、带有检测线5和质控线6的硝酸纤维素膜4、吸收垫7依次粘帖在PVC底板1上，金标结合垫3包被有纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物以及小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，硝酸纤维素膜4上的检测线5包被有纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原，硝酸纤维素膜4上的质控线6包被有羊抗鼠IgG。
本发明的水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条的使用方法如下：
1、用毛细玻璃管采血1～2滴，待血清自然析出后折断毛细玻璃管使血清(或血液)自然流出到干净的玻璃板上，用移液器取5ul样品用于检测。
2、将吸取的5ul样品加入试纸条的样品孔前端，随之滴加两滴稀释液于样品孔中，3～10分钟即可显示结果，10分钟时读取结果。
结果判断如图2所示：
1、阳性：在检测线5和质控线6处各出现一条红色条带，判定为阳性；检测线5条带色泽的深浅依检测样品中水貂阿留申病毒抗体效价的高低而变化，效价越高色带越深，反之越浅。
2、阴性：在质控线6出现一条红色条带，检测线5未出现红色条带，说明检测样品中无水貂阿留申病毒抗体存在。
3、无效：仅在检测线5有条带或在检测线5和质控线6均无明显条带出现，视为试纸条检测无效。
以下结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1水貂阿留申病毒(AMDV-G株)细胞抗原的制备
采用单层细胞吸附接毒法制备水貂阿留申病毒细胞抗原：细胞培养采用CRFK传代细胞，在CRFK细胞长满单层后，弃去原培养液，加入水貂阿留申病毒，于37℃孵育1小时，加入含5％血清的细胞培养液，37℃静置培养并逐天观察CRFK细胞病变情况，待CRFK细胞有85％～90％出现病变时即可收获细胞培养液，反复冻融3次后，将细胞培养病毒液放入无菌离心管中，裂解细胞并以10000rpm/min的速率离心2小时取上清，采用不连续蔗糖密度梯度离心的方法纯化病毒，获得纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原。
实施例2胶体金溶液的制备
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液：取1％氯金酸溶液1ml，加入99ml的超纯水配置成终浓度为0.01％的氯金酸溶液，加热至沸腾后，加入1％柠檬酸三钠1ml并继续加热，溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热5分钟，室温冷却后4℃保存备用，获得胶体金溶液。吸取少量胶体金颗粒用透射电镜观察，胶体金颗粒大小基本一致，分布均匀，直径约40nm方为合格。
实施例3水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物(金标水貂阿留申病毒细胞抗原)的制备
(1)逐级稀释法确定水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金溶液的用量比例：用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的PH值为8.4，取11支洁净的离心管，编号为1号管至11号管，每管加入胶体金溶液1ml；将纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原逐级稀释后(由5ug稀释至50ug，即纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原含量分别为5ug、10ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug)，按照逐级稀释顺序加入到2号管至11号管中，并与离心管中的胶体金溶液混匀，5分钟后在2号管至11号管中分别加入10％的氯化钠溶液1ml混匀，室温静置2小时以上观察结果，1号管为空白对照管。
水貂阿留申病毒细胞抗原加入量不足以稳定胶体金的离心管(2号管至6号管)，即出现由红变蓝的聚沉现象，而水貂阿留申病毒细胞抗原加入量达到或超过最低稳定量的离心管(7号管至11号管)，则保持胶体金的红色不变。因此，胶体金红色不变且水貂阿留申病毒细胞抗原加入量最低的离心管(7号管)中的水貂阿留申病毒细胞抗原含量(30ug)，即为稳定1ml胶体金溶液所需的最低稳定量，在该最低稳定量的基础上再加上10％～20％即为稳定1ml胶体金溶液所需的水貂阿留申病毒细胞抗原的实际使用量，即水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金溶液的用量比例为：33ug～36ug:1ml。
(2)用0.1mol/L碳酸钾溶液调节胶体金溶液的PH值为8.4，在磁力搅拌下，按照上述确定的纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金溶液的用量比例(33ug～36ug:1ml)向胶体金溶液中逐滴加入纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原，继续搅拌20分钟，加入终浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)，再搅拌15分钟，获得水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物即金标水貂阿留申病毒细胞抗原，4℃保存备用。
(3)金标水貂阿留申病毒细胞抗原的纯化
采用低温超速离心法纯化金标水貂阿留申病毒细胞抗原，以去除溶液中未标记的水貂阿留申病毒细胞抗原和未充分标记的胶体金以及在标记中可能形成的各种聚合物。首先将金标水貂阿留申病毒细胞抗原(体积为V)在4℃下，以3000rpm/min低速离心40分钟，小心吸取上清液，弃去沉淀；再将上清液在4℃下，以10000rpm/min离心40分钟，弃去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液(内含1％BSA和0.02％叠氮钠)溶解沉淀至原体积(指的是金标水貂阿留申病毒细胞抗原的体积V)，充分稳定后过夜：4℃下，再以10000rpm/min离心40分钟，弃去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液(内含1％BSA和0.02％叠氮钠)溶解沉淀至原体积(指的是金标水貂阿留申病毒细胞抗原的体积V)的1/10，获得纯化的金标水貂阿留申病毒细胞抗原，4℃保存备用。
实施例4小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的制备
(1)逐级稀释法确定小鼠IgG与胶体金溶液的用量比例：用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的PH值为8.4，取11支洁净的离心管，编号为1号管至11号管，每管加入胶体金溶液1ml；将小鼠IgG逐级稀释后(由0.5ug稀释至5ug，即0.5ug、1ug、1.5ug、2ug、2.5ug、3ug、3.5ug、4ug、4.5ug、5ug)，按照逐级稀释顺序加入到2号管至11号管中，并与离心管中的胶体金溶液混匀，5分钟后在2号管至11号管中分别加入10％的氯化钠溶液1ml混匀，室温静置2小时以上观察结果，1号管为空白对照。
小鼠IgG加入量不足以稳定胶体金的离心管(2号管至7号管)，即出现由红变蓝的聚沉现象，而小鼠IgG加入量达到或超过最低稳定量的离心管(8号管至11号管)，则保持胶体金的红色不变。因此，胶体金红色不变且小鼠IgG加入量最低的离心管(8号管)中的小鼠IgG含量(3.5ug)，即为稳定1ml胶体金溶液所需的最低稳定量，在该最低稳定量的基础上再加上10％～20％即为稳定1ml胶体金溶液所需的小鼠IgG的实际使用量，即小鼠IgG与胶体金溶液的用量比例为：3.85ug～4.2ug:1ml。
(2)用0.1mol/L碳酸钾溶液调节胶体金溶液的PH值为8.4，在磁力搅拌下，按照上述确定的小鼠IgG与胶体金溶液的用量比例(3.85ug～4.2ug:1ml)逐滴加入小鼠IgG，继续搅拌20分钟，加入终浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)，再搅拌15分钟，获得小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，4℃保存备用。
(3)小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的纯化
采用低温超速离心法纯化小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，以去除溶液中未标记的小鼠IgG和未充分标记的胶体金以及在标记中可能形成的各种聚合物。首先将小鼠IgG与胶体金的偶联标记物(体积为V)在4℃下，以3000rpm/min低速离心40分钟，小心吸取上清液，弃去沉淀；再将上清液在4℃下，以10000rpm/min离心40分钟，弃去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液(内含1％BSA和0.02％叠氮钠)溶解沉淀至原体积(指的是小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的体积V)，充分稳定后过夜：4℃下，再以10000rpm/min离心40分钟，弃去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液(内含1％BSA和0.02％叠氮钠)溶解沉淀至原体积(指的是小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的体积V)的1/10，获得纯化的小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，4℃保存备用。
实施例5试纸条的组装
(1)采用喷金仪(XYZ3000DispensingPlatform)将水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物、小鼠IgG与胶体金的偶联标记物分别喷在玻璃纤维素膜上，水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物、小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的标记量分别为33ug～36ug:1ml、3.85ug～4.2ug:1ml，室温条件下自然干燥，密封，获得金标结合垫3，4℃保存备用；
(2)采用划膜仪将水貂阿留申病毒细胞抗原、羊抗鼠IgG分别划膜于硝酸纤维素膜4上的检测线5和质控线6上，水貂阿留申病毒细胞抗原、羊抗鼠IgG的标记量分别2μg/cm、4μg/cm，室温条件下自然干燥，密封，获得带有检测线5(包被有纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原)和质控线6(包被有羊抗鼠IgG)的硝酸纤维素膜4，4℃保存备用；
(3)将上述处理好的样品垫2、金标结合垫3、带有检测线5和质控线6的硝酸纤维素膜4、吸收垫7等材料依次粘帖在PVC底板1上，切条、组装、密封，获得本发明的水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条，室温保存备用。组装后的试纸条如图1所示。
实施例6特异性试验
采用本发明的试纸条对水貂阿留申病毒(AMDV)阳性血清、水貂细小病毒性肠炎病毒(MEV)阳性血清、水貂犬瘟热病毒(CDV)阳性血清、兔抗MEV阳性血清、正常兔血清进行检测。
结果显示：仅水貂阿留申病毒阳性血清出现明显的检测线5和对照线，其余血清检测均为阴性，说明本发明的试纸条具有良好的特异性。
实施例7敏感性试验
将水貂阿留申病毒高免血清作2倍倍比稀释，然后分别采用对流免疫电泳法(CIEP)和本发明的试纸条进行检测。
结果显示：同一份水貂阿留申病毒阳性血清，对流免疫电泳法(CIEP)检测的最高稀释倍数为16倍，而采用本发明的试纸条进行检测的最高稀释倍数为28倍，说明本发明的试纸条敏感性比对流免疫电泳法(CIEP)高12倍。
实施例8符合率试验
将本研究室保存的1000份临床水貂阿留申病毒血清样品分别用本发明的试纸条和对流免疫电泳法(CIEP)进行平行检测，结果如表1所示，本发明的试纸条相对对流免疫电泳法(CIEP)的符合率为96.46％。
表1：试纸条和对流免疫电泳法(CIEP)的符合率检测结果
实施例9重复性试验
(1)组内重复性检测：
用同一批次的本发明的试纸条检测水貂阿留申病毒阴性血清、水貂阿留申病毒阳性血清各30份样本(三次重复试验)。结果显示，本发明的试纸条检测的阴性、阳性结果分别为30例，这表明本发明的试纸条具有良好的重复性。
(2)组间重复性检测：
用3个不同批次的本发明的试纸条检测水貂阿留申病毒阴性血清、水貂阿留申病毒阳性血清各30份样本(三次重复试验)。结果显示，每个批次试纸条检测的阴性、阳性结果分别为30例，再次表明本发明的试纸条具有良好的重复性。
Claims (10)
1.水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条，包括PVC底板，依次粘帖在PVC底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫；其特征在于：所述金标结合垫包被有水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物以及小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，所述硝酸纤维素膜上的检测线包被有水貂阿留申病毒细胞抗原，所述硝酸纤维素膜上的质控线包被有羊抗鼠IgG。
2.制备权利要求1所述的水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条的方法，包括以下步骤：
步骤一、水貂阿留申病毒细胞抗原的制备：将水貂阿留申病毒接种长满单层的CRFK细胞，待CRFK细胞有85％～90％病变时，收获细胞培养液，反复冻融3次后，采用差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心纯化病毒，获得纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原；
步骤二、水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物的制备：逐级稀释法确定水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金溶液的用量比例为33ug～36ug:1ml，按照此用量比例逐滴加入纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原，再加入终浓度为1％的牛血清白蛋白，搅拌后获得水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化；
步骤三、小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的制备：逐级稀释法确定小鼠IgG与胶体金溶液的用量比例为3.85ug～4.2ug:1ml，按照此用量比例逐滴加入小鼠IgG，再加入终浓度为1％的牛血清白蛋白，搅拌后获得小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化；
步骤四、试纸条的组装：采用喷金仪将水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物、小鼠IgG与胶体金的偶联标记物分别喷在玻璃纤维素膜上，室温条件下自然干燥，密封，获得金标结合垫；采用划膜仪将纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原、羊抗鼠IgG分别划膜于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上；将处理好的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜依次粘帖在PVC底板上，切条、组装、密封，获得水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条，室温保存。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，将水貂阿留申病毒细胞接种长满单层的CRFK细胞后，于37℃孵育1小时，加入含5％血清的细胞培养液，37℃静置培养并逐天观察CRFK细胞病变情况。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述胶体金溶液采用柠檬酸三钠还原法制备：取1％氯金酸溶液1ml，加入99ml的超纯水配置成终浓度为0.01％的氯金酸溶液，加热至沸腾后，加入1％柠檬酸三钠1ml并继续加热，溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热5分钟，室温冷却，获得胶体金溶液，4℃保存备用，胶体金颗粒直径为40nm。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述逐级稀释法确定水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金溶液的用量比例的具体过程如下：用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的PH值为8.4，向11支离心管中分别加入1ml胶体金溶液；将纯化的水貂阿留申病毒细胞抗原逐级稀释后即含量分别为5ug、10ug、15ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug，按照上述顺序加入到2号管至11号管中，并与离心管中的胶体金溶液混匀，5分钟后在2号管至11号管中分别加入10％的氯化钠溶液1ml混匀，室温静置2小时以上观察结果，1号管为空白对照；
2号管至6号管中，出现由红变蓝的聚沉现象，7号管至11号管中，保持胶体金的红色不变；因此，胶体金红色不变且水貂阿留申病毒细胞抗原加入量最低的离心管即7号管中的水貂阿留申病毒细胞抗原含量，即为稳定1ml胶体金溶液所需的最低稳定量，在该最低稳定量的基础上再加上10％～20％即为稳定1ml胶体金溶液所需的水貂阿留申病毒细胞抗原的实际使用量，即水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金溶液的用量比例为：33ug～36ug:1ml。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，逐级稀释法确定小鼠IgG与胶体金溶液的用量比例的具体过程如下：向11支离心管中分别加入1ml胶体金溶液；将小鼠IgG逐级稀释后即含量分别为0.5ug、1ug、1.5ug、2ug、2.5ug、3ug、3.5ug、4ug、4.5ug、5ug，按照上述顺序加入到2号管至11号管中，并与离心管中的胶体金溶液混匀，5分钟后在2号管至11号管中分别加入10％的氯化钠溶液1ml混匀，室温静置2小时以上观察结果；
2号管至7号管中，出现由红变蓝的聚沉现象，8号管至11号管中，保持胶体金的红色不变；因此，胶体金红色不变且小鼠IgG加入量最低的离心管即8号管中的小鼠IgG含量，即为稳定1ml胶体金溶液所需的最低稳定量，在该最低稳定量的基础上再加上10％～20％即为稳定1ml胶体金溶液所需的小鼠IgG的实际使用量，即小鼠IgG与胶体金溶液的用量比例为：3.85ug～4.2ug:1ml。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化的具体过程如下：首先将体积为V的金标水貂阿留申病毒细胞抗原在4℃下以3000rpm/min离心40分钟，吸取上清液，弃沉淀；再将上清液在4℃下以10000rpm/min离心40分钟，弃去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即金标水貂阿留申病毒细胞抗原的体积V，稳定后过夜：4℃下，再以10000rpm/min离心40分钟，弃上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即金标水貂阿留申病毒细胞抗原的体积V的1/10，获得纯化的金标水貂阿留申病毒细胞抗原，4℃保存备用；所述PBS缓冲液中含有1％BSA和0.02％叠氮钠。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化的具体过程如下：首先将体积为V的小鼠IgG与胶体金的偶联标记物在4℃下以3000rpm/min离心40分钟，吸取上清液，弃沉淀；再将上清液在4℃下以10000rpm/min离心40分钟，弃上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的体积V，稳定后过夜：4℃下，再以10000rpm/min离心40分钟，弃上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的体积V的1/10，获得纯化的小鼠IgG与胶体金的偶联标记物，4℃保存备用，所述PBS缓冲液中含有1％BSA和0.02％叠氮钠。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤四中，水貂阿留申病毒细胞抗原与胶体金的偶联标记物、小鼠IgG与胶体金的偶联标记物的标记量分别为33ug～36ug:1ml、3.85ug～4.2ug:1ml。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤四中，水貂阿留申病毒细胞抗原、羊抗鼠IgG的标记量分别2μg/cm、4μg/cm。
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