CN104198703B - 人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104198703B
CN104198703B CN201410405275.3A CN201410405275A CN104198703B CN 104198703 B CN104198703 B CN 104198703B CN 201410405275 A CN201410405275 A CN 201410405275A CN 104198703 B CN104198703 B CN 104198703B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pad
fusion
restructuring
preparation
polyclonal antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410405275.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104198703A (zh
Inventor
胡征
杨波
董俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hubei Hualong Biological Pharmaceutical Co., Ltd.
Hubei University of Technology
Original Assignee
HUBEI HUALONG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Hubei University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HUBEI HUALONG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd, Hubei University of Technology filed Critical HUBEI HUALONG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority to CN201410405275.3A priority Critical patent/CN104198703B/zh
Publication of CN104198703A publication Critical patent/CN104198703A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104198703B publication Critical patent/CN104198703B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56933—Mycoplasma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用，该检测试剂盒包括检测卡及银染增敏垫；检测卡由底板、样品垫、吸水垫、结合垫和检测层组成；结合垫包被有胶体金标记的兔抗人肺炎支原体P1蛋白及P30蛋白的多克隆抗体混合物；检测层是由带有一条检测线以及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；检测层粘贴在底板上；结合垫和吸水垫分别与检测层部分重叠后分别与检测层和底板粘贴；样品垫与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴；银染增敏垫则由AgNO3垫及还原垫组成。本发明能有效提高人肺炎支原体的检测灵敏度，特异性强，在人肺炎支原体的临床诊断、病原学鉴别、流行病学调查等方面具有很高的实用价值。

Description

人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，Mp)是人类支原体肺炎的病原体，主要经飞沫传染，潜伏期2-3周，发病率以青少年最高。Mp感染在小儿肺炎病原的发生率高达10-30％，近年来逐渐成为小儿感染呼吸道疾病的主要病原体之一。该病极易引发咽炎、扁桃体炎等呼吸道感染，甚至可能同时继发脑膜炎、肝炎、心肌炎等多脏器损伤，严重时也可导致患儿死亡。
由于Mp感染与其它病原体引起的呼吸道感染症状类似，不做病原学检查，很难将Mp与其它病原体引起的呼吸道感染相区别。Mp无细胞壁，常用的β-内酰胺类药物对其无效，故其引起的感染的治疗与其它细菌和病毒感染的治疗方案完全不同，因此建立简便、快速、可行、能早期诊断肺炎支原体感染的方法非常必要。
目前Mp的检测方法主要有3类：一是分离培养法，其是证实感染的“金标准”，但由于Mp的生长周期极为缓慢，培养周期长，导致该法在临床上不能进行快速诊断；二是血清学方法，即采用酶联免疫法、胶体金免疫法、微量免疫荧光法和间接血凝试验等，检测被检者血清中Mp抗体水平，可间接提示Mp感染的存在。然而，血清学试验只能提供一种回顾性的诊断，而且有时需要双份血清。另外，抗体出现的时机不易掌握，儿童、青少年与成人之间又存在Mp特异性抗体的差异，并且，Mp细胞膜上的糖脂抗原与其他微生物及机体组织存在非特异性交叉反应，故现有血清学方法的检测质量受到一定限制；三是利用分子生物学技术检测MpDNA的存在，其中最常用的是聚合酶链式反应(PCR)，该方法快速、灵敏、特异，是目前研究Mp感染的重要手段，但由于PCR对实验设备以及操作要求较高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。因此，建立Mp特异性抗原诊断方法十分必要。目前，已公开报道的检测Mp抗原的方法主要为双抗夹心ELISA法，间接免疫荧光法，量子点标记免疫层析法等，但这些方法均不能实行床旁检测，需要到特定的场合利用特定的仪器(如酶标仪、荧光仪等)来检测，不仅不够方便快捷而且时间较长，临床应用较为不便。
免疫胶体金层析是近年来继放射免疫分析和酶联免疫分析之后发展起来的一种微量检测技术，其具有检测范围宽、操作简便快速(5-10分钟内)、可进行床旁检测等优点，是当前较为理想的免疫分析方法，但由于其灵敏度较低，限制了其临床应用。目前还没有见到基于免疫胶体金层析法检测肺炎支原体抗原的，灵敏度高、稳定性好的试剂盒。
发明内容
本发明针对背景技术中现存的几种人肺炎支原体在检测方式中遇到的技术瓶颈，提出了一种具有操作简便、检测快速及高灵敏度等优点的人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用。
本发明的目的是通过以下技术手段来实现的：
一种人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒，其特征在于：所述人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒包括检测卡以及银染增敏垫；所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有胶体金标记的兔抗人肺炎支原体P1蛋白及P30蛋白的多克隆抗体混合物；所述检测层是由带有一条检测线以及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；所述检测线包被有鼠抗人肺炎支原体P1蛋白及P30蛋白的多克隆抗体混合物；所述质控线包被有抗兔IgG；所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起；所述银染增敏垫包括AgNO3垫以及还原垫；所述AgNO3垫由含有AgNO3的玻璃纤维膜构成；所述还原垫由含有苯二酚的玻璃纤维膜构成。
作为优选，本发明所采用的胶体金是直径范围是20-50nm的胶体金，优选40nm的胶体金。
作为优选，本发明所采用的抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。
作为优选，本发明所采用的检测层长2cm，所述检测层粘贴在长度是6.6-7.7cm的底板表面中间段；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2.5-3cm的吸水垫重叠0.2-0.4cm；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0.5-0.8cm的结合垫重叠0.2-0.4cm；所述结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2.5cm的样品垫重叠0.2—0.4cm；所述检测线与质控线的间距是0.5-0.8cm；所述底板的宽度是0.3-0.5cm。
作为优选，本发明所采用的吸水垫是吸水滤纸；所述底板是PVC板。
一种基于上述的人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
1)结合垫的制备：
1.1)重组P1-His、P30-His融合蛋白的制备、纯化：
1.1.1)对人肺炎支原体膜蛋白P1及P30进行生物信息学分析，分别获取其胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段；
1.1.2)找到步骤1.1.1)中所得到肽段对应的基因编码序列，根据大肠杆菌中密码子的偏好性，对步骤1.1.1)中所得到基因编码序列进行密码子优化；
1.1.3)在步骤1.1.2)中所得到的基因序列的5’端及3’端分别引入酶切位点并分别化学合成全基因序列，同时标记记为p1、p30；其基因和蛋白序列参见序列表；
1.1.4)将步骤1.1.3)中所得到的p1及p30按分子生物学方法分别克隆入表达载体pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组P1-His、P30-His融合蛋白；所述重组P1-His融合蛋白以可溶性方式存在于菌体中；所述重组P30-His融合蛋白则以包涵体形式存在于基因工程菌菌体内；
1.1.5)用镍柱分别纯化步骤1.1.4)所得到的重组P1-His、P30-His融合蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后，以Bradford法测定蛋白质浓度，将此二蛋白调整浓度均为0.2mg/mL后备用；
1.2)重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备：
1.2.1)以步骤1.1.5)中所得到的重组P1-His、P30-His融合蛋白为完全抗原，分别免疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白抗血清；所述兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于1×105；
1.2.2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG；
1.2.3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1.2.2)所得到的四种多克隆抗体IgG的浓度，将兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的浓度分别调整为1mg/mL，同时将鼠抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG及鼠抗重组P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的浓度均分别调整为3mg/mL后备用；所述调整的方式是采用磷酸盐缓冲液进行稀释；所述磷酸盐缓冲液中各组分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2PO4，1.44g/LNa2HPO4；所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.5；
1.2.4)将浓度均为3mg/mL的鼠抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG及鼠抗重组P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG溶液按1:1体积比混合后备用(用作检测线的包被)；
1.3)胶体金分别标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备与纯化：
1.3.1)制备40nm直径的胶体金：
取硅化处理过的250ml锥形瓶一个，取1ml1％金氯酸水溶液加入99ml去离子水配制成浓度为0.01％的氯金酸水溶液，于加热磁力搅拌器下加热至沸腾，搅拌下准确加入1％柠檬酸钠水溶液1ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫色，最后慢慢变成酒红色，变红后继续加热煮沸10min，待其冷却至室温后加入去离子水恢复到原体积100ml；4℃静置24hr后，观察无颗粒沉淀，经电镜下观察其分散度良好，颗粒大小均匀，表明所制备的40nm直径的胶体金质量良好，可用于金标抗体的制备；
1.3.2)胶体金标记兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG：
将胶体金和兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG溶液分别以0.1mol/LK2CO3调pH至8.2-9.0，取20ml胶体金溶液，快速电磁搅拌下，将一定量的浓度为1.0mg/ml的兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG溶液缓慢加入胶体金溶液中，至终浓度为10-50μg/ml，室温搅拌30分钟，加入5％牛血清白蛋白(BSA)至终浓度为0.7％，搅拌5分钟，2000r/min，4℃离心15分钟，弃掉沉淀，上清用0.45μm过滤器过滤除去聚合体后，在10000r/min，4℃离心45分钟，沉淀用磷酸盐洗涤液重悬沉淀至原体积，10000r/min，重复4℃离心2次，所得沉淀最后用2ml磷酸盐保存液重悬，4℃保存备用。
所述磷酸盐洗涤液中各组分含量分别为2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、5g/LPEG20000以及1g/L叠氮钠；所述磷酸盐洗涤液的pH＝7.5；
所述磷酸盐保存液中各组分含量分别为2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、10g/L牛血清白蛋白以及1g/L叠氮钠；所述磷酸盐保存液的pH＝7.5；
1.3.3)按照与步骤1.3.1)以及步骤1.3.2)相同的方法制得胶体金标记的兔抗重组P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG；
1.3.4)将胶体金标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG按体积比1：1混合后备用；
1.4)胶体金标记抗体的负载：
将聚酯纤维膜浸入步骤1.3)所得到的胶体金分别标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物中1h，取出，室温干燥后4℃密封保存备用，至此制得结合垫；
2)样品垫的制备：
取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h以上，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，室温密封干燥保存；至此制得样品垫；
所述样品垫处理液中各组分含量分别为2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、20g/L牛血清白蛋白、10mL/L吐温-20、20g/L蔗糖以及3g/L聚乙烯吡咯烷酮，所述样品垫处理液的pH＝7.5；
3)检测层的制备：
3.1)将步骤1.2.4)中制备的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物和抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度为0.5-2.5mg/mL，所述磷酸盐缓冲液中各组分含量分别为2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠，所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.5；
3.2)将稀释好的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5μl/cm的量按照与检测线0.5-0.8cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上作为质控线；
3.3)将喷有检测线以及质控线的硝酸纤维素膜在37℃干燥2h，4℃密封干燥保存；至此制得检测层；
4)底板的制备
将PVC材质的底板按实际要求裁剪后备用；
5)吸水垫的制备
将吸水滤纸按实际要求裁剪后备用；
6)人肺炎支原体金标银染免疫层析检测卡的组装：
6.1)将步骤4)所制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉；
6.2)将步骤3)所制备得到的检测层粘贴到底板的中部区域，并抹平膜面；
6.3)将步骤5)所制备得到的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层有部分重叠，同时将吸水垫的右边缘与底板的右边缘对齐粘好并抹平；
6.4)将步骤1)所制备得到的结合垫按部分重叠的方式重叠于硝酸纤维素膜的左边缘处，同时将结合垫粘于底板上；
6.5)将步骤2)所制备得到样品垫则按部分重叠的方式重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并抹平；
6.6)将组装好的人肺炎支原体金标银染免疫层析检测卡进行裁剪，4℃密封干燥避光保存；
所述步骤6.1)至步骤6.6)均是在生物安全柜内进行操作；
7)银染增敏垫的制备：
7.1)硝酸银垫的制备：将玻璃纤维素膜裁成大小为0.4×1.2cm/条，将裁好的玻璃纤维素膜于去离子水中充分漂洗，室温干燥后每条玻璃纤维素膜均匀涂布80μl含0.35％AgNO3的水溶液，于4℃-25℃避光干燥后密封避光保存；
7.2)还原垫的制备：将玻璃纤维素膜裁成大小为0.4×1.2cm/条，将裁好的玻璃纤维素膜于去离子水中充分漂洗，室温干燥后每条玻璃纤维素膜均匀涂布80μl还原缓冲液于室温避光干燥后密封避光保存；所述还原缓冲液中各组分含量分别为35g/L对苯二酚，63g/L柠檬酸以及62g/L柠檬酸三钠；所述还原缓冲液的pH＝4.0。
作为优选，本发明所采用的步骤1.3.2)中，将胶体金和兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体溶液分别以0.1mol/LK2CO3调pH至8.6；
作为优选，本发明所采用的步骤1.3.2)中，加入步骤1.2)所制备的浓度为1.0mg/ml兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG至胶体金溶液中，至终浓度为15-25μg/ml；
作为优选，本发明所采用的步骤3.1)中将步骤1.2.4)中制备的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物和抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别是1.5-2.0mg/mL以及0.5-1.5mg/mL；
作为优选，本发明所采用的步骤3.2)中，将稀释好的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0-2.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0-2.0μl/cm的量按照与检测线相距0.7cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上作为质控线。
一种基于上述的人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒作为非诊断性检测人肺炎支原体的应用。
一种基于上述的人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒的非诊断性检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
1)将待检样品用500μl的样品处理液充分溶解后，取出120μL滴于检测卡的样品垫上，待质控线处由于金颗粒的聚集出现红色的条带时，依次将AgNO3垫和还原垫覆盖于检测线和质控线上，再滴加250μL去离子水于还原垫上进行银染增敏，10分钟后观察检测结果；所述样品处理液中各组分含量分别为2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、10mL/LTritonx-100以及2g/L氯化钠；所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.5；
2)若待检样品中含有人肺炎支原体抗原，则与结合垫中的胶体金标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物结合后，在银染增敏垫的作用下会形成肉眼可见的一条黑色检测线，未结合完的胶体金标记抗体继续层析与抗兔IgG结合后亦在银染增敏垫的作用下形成肉眼可见的第二条黑色质控线；
若待检样品中无人肺炎支原体抗原，则仅出现一条黑色质控线；若黑色质控线未出现，则该检测试剂盒失效。
作为优选，本发明所采用的待检样品是包括但不限于咽拭子以及肺泡灌洗液标本。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明的检测肺炎支原体抗原的方法是将胶体金免疫层析与银染增敏技术综合起来，通过将银染垫覆盖在质控线和检测线上并滴加适当的去离子水于银染垫上，使其在硝酸纤维素膜上形成银染液，由于被还原的银在金粒子周围的大量聚集从而使检测线上的颜色信号放大，这样就大大提高了检测的灵敏度(检测灵敏度较银染增敏前提高了64倍)，同时本发明采用了双抗体捕捉人肺炎支原体的双特异性抗原(膜蛋白P1与P30)，较目前最广泛应用的单P1蛋白捕获法更有效，在此双重作用下本发明的检测试剂盒具备了很高的灵敏度，用其对临床样品的检测结果与目前对该病原体的检测“金标准”-培养法的相比无统计学差异。
2、本发明所用的抗体均是识别人肺炎支原体特异性P1、P30抗原胞外保守区的多克隆抗体，其特异性高，同时其较目前最广泛使用的单克隆抗体而言制备成本低廉，因此，本发明检测成本较低。
3、本发明检测方法简单，检测快速，易于判定，结果判定在15-20分钟内完成，不需要专门的仪器设备，检测成本低廉，克服了现有技术检测成本高、操作复杂繁琐、耗时长、需要特殊仪器、且必需专业人员才能操作的不足。
4、由于检测试剂盒检测的是支原体抗原而非抗体(抗体的出现需要感染几周以后)，故而可进行早期诊断和防治，临床诊断符合率高。该方法在MP的临床诊断、病原学鉴别、流行病学调查等方面具有很高的实用价值。
5、本发明检测方法所用的临床样本为呼吸道分泌物，而非血液，可免除婴幼儿患者抽血检查的痛苦与家长的心理负担，故较易于推广。
附图说明
图1是本发明所提供检测卡的纵向剖面结构示意图；
图2是本发明所提供检测卡的在完成组装后的结构示意图；
其中：
1-样品垫；2-结合垫；3-检测层；4-检测线；5-质控线；6-吸水垫；7-底板。
具体实施方式
本发明的工作原理是：本发明在免疫层析测定法(双抗体夹心)的前提下，以多克隆抗体为基础，采用胶体金标记探针技术，结合银染增敏技术，研制检测人肺炎支原体抗原的金标银染免疫层析检测试剂盒。首先是兔抗人肺炎支原体P1、P30蛋白多克隆抗体和鼠抗人肺炎支原体P1、P30蛋白多克隆抗体的制备、纯化以及胶体金标记，其次为喷膜，然后将检测卡各组成成分进行组装，并制备配套的银染增敏垫，最后制成检测人肺炎支原体的检测试剂盒。本发明所提供的试剂盒具有敏感、快速和特异性好等特点，能进行样品的高通量筛查，具有较好的市场应用前景。
如附图1所示，本发明所提供了一种人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒，其包括检测卡及配套的银染增敏垫。所述的检测卡包括样品垫1、结合垫2、检测层3、吸水垫6及底板7组成。结合垫2上包被有胶体金分别标记的兔抗人肺炎支原体P1、P30蛋白多克隆抗体的混合物；检测层3是喷有检测线4以及质控线5的固相硝酸纤维素膜简称NC膜；检测线4包被有鼠抗人肺炎支原体P1、P30蛋白多克隆抗体的混合物；质控线5包被有抗兔IgG；胶体金为直径40nm的胶体金颗粒；吸水垫6材质为吸水滤纸；底板7材质为PVC。
其具体结构是：检测层长2cm，检测层粘贴在长度是6.6-7.7cm的底板表面中间段；检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2.5-3cm的吸水垫重叠0.2-0.4cm；检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0.5-0.8cm的结合垫重叠0.2-0.4cm；结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2.5cm的样品垫重叠0.2—0.4cm；检测线与质控线间距是0.5-0.8cm；底板的宽度是0.3-0.5cm。
其中，上述参数优选方案是：检测层3长2cm，粘贴在底板7长7.3cm表面中间段，此检测层右端与粘贴在底板7右末端的吸水垫6长3cm重叠0.2cm，其另一端与结合垫2长0.6cm重叠0.3cm；结合垫2则与粘贴在底板7左端的样品垫(1)长2.5cm重叠0.3cm；检测层3上的检测线4及质控线5间距0.7cm。整条检测卡的宽度为0.4cm。
制备上述检测人肺炎支原体抗原的金标银染免疫层析试剂盒的方法，其主要步骤包括：
一、结合垫的制备
(1)重组P1-His、P30-His融合蛋白的制备、纯化：
对人肺炎支原体膜蛋白P1及P30进行生物信息学分析，分别获取其胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段；找到其对应的基因编码序列，根据大肠杆菌中密码子的偏好性，对其进行密码子优化后在其5’端及3’端分别引入酶切位点并分别化学合成全基因序列，同时标记记为p1、p30；其序列参见序列表；将该两段基因序列按分子生物学方法分别克隆入表达载体pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组P1-His、P30-His融合蛋白；所述重组P1-His融合蛋白以可溶性方式存在于菌体中；所述重组P30-His融合蛋白以包涵体形式存在于基因工程菌菌体内；用镍柱分别纯化此二蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后，以Bradford法测定蛋白质浓度，将此二蛋白均调整浓度为0.2mg/mL后备用。
(2)重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备：
以步骤(1)所制备的重组蛋白为完全抗原，按常规方法分别免疫新西兰大白兔及豚鼠，分别制备兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白抗血清。该四种抗血清的效价均大于1×105(间接ELISA法测得)，用ProteinG亲和层析柱分别纯化四种抗血清中的多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度。将兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的浓度用磷酸盐缓冲液((2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠，pH＝7.5)分别调整为1mg/mL，同时将鼠抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG及鼠抗重组P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的浓度用磷酸盐缓冲液((2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠，pH＝7.5)均分别调整为3mg/mL后按体积比1:1混合后备用；其中兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG用作胶体金标记试验；鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物用作检测线的包被。
(3)胶体金分别标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备与纯化：
a.制备40nm直径的胶体金。
取硅化处理过的250ml锥形瓶一个，取1ml1％金氯酸水溶液加入99ml去离子水配制成浓度为0.01％的氯金酸水溶液，于加热磁力搅拌器下加热至沸腾，搅拌下准确加入1％柠檬酸钠水溶液1ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫色，最后慢慢变成酒红色，变红后继续加热煮沸10min，待其冷却至室温后加入去离子水恢复到原体积100ml。4℃静置24hr后，观察无颗粒沉淀，经电镜下观察其分散度良好，颗粒大小均匀，表明所制备的40nm直径的胶体金质量良好，可用于金标抗体的制备；
b.胶体金标记兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG。
将胶体金和兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG溶液分别以0.1mol/LK2CO3调pH至8.2-9.0，优选为8.6，取20ml胶体金溶液，快速电磁搅拌下，将一定量的浓度为1.0mg/ml的兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG溶液缓慢加入胶体金溶液中，至终浓度为10-50μg/ml，优选为15-25μg/ml，室温搅拌30分钟，加入5％牛血清白蛋白(BSA)至终浓度为0.7％，搅拌5分钟，2000r/min，4℃离心15分钟，弃掉沉淀，上清用0.45μm过滤器过滤除去聚合体后，在10000r/min，4℃离心45分钟，沉淀用磷酸盐洗涤液(2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、5g/LPEG20000以及1g/L叠氮钠，pH＝7.5)重悬沉淀至原体积，10000r/min，重复4℃离心2次，所得沉淀最后用2ml磷酸盐保存液(2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、10g/L牛血清白蛋白以及1g/L叠氮钠，pH＝7.5)重悬，4℃保存备用。
c.按照与步骤a及b相同的方法制得胶体金标记的兔抗重组P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG；将上述制备的胶体金标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG按体积比1：1混合后备用；
(4)胶体金标记抗体的负载：
将聚酯纤维膜浸入步骤(3)所得到的胶体金分别标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物中1h，取出，室温干燥后裁成4cm*0.6cm的规格后4℃密封保存备用，至此制得结合垫。
二、样品垫的制备
取玻璃纤维素膜一张，将其在样品垫处理液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，20g/L牛血清白蛋白(BSA)，10mL/L吐温-20，20g/L蔗糖，3g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP-10)，pH7.5)中浸泡至少3h以上，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，剪裁成4cm*2.5cm的规格，室温密封干燥保存。至此制得样品垫。经试验证实玻璃纤维素膜经该种方法处理后，显著地提高了胶体金标记抗体的释放率。
三、检测层的制备
检测层的制备，是通过分别将由步骤一中所制备的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG和抗兔IgG用专用的喷膜机在硝酸纤维素膜上形成检测线和控制线；其具体制备方法包括如下步骤：
分别将上述步骤一中制备的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物和抗兔IgG用磷酸盐缓冲液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，pH7.5)调整至终浓度为0.5-2.5mg/mL，其中鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物优选的稀释终浓度为1.5-2.0mg/mL，抗兔IgG优选的稀释终浓度为0.5-1.5mg/mL。将稀释好的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5μl/cm，优选为1.0-2.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5μl/cm，优选为1.0-2.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，其与检测线间距为0.7cm。将喷好的硝酸纤维素膜37℃干燥2h，剪裁成4cm*2cm的规格，4℃密封干燥保存。至此制得检测层。
四、底板的加工
将PVC材质的底板裁剪成4cm*7.3cm的规格后备用。
五、吸水垫的制备
将吸水滤纸裁剪成4cm*3cm的规格，即制成吸水垫，备用。
六、检测卡的组装
组装工作于生物安全柜内操作，首先将步骤四所述的底板上的粘性保护膜揭掉，将上文步骤三所述的检测层(即带有1条质控线和1条检测线的硝酸纤维素膜)粘贴到底板的中部区域，并小心抹平膜面。其次，将上文步骤五所述的吸水垫组装到底板上，使其左边与检测层有0.2cm的重叠，同时将其右边缘与底板的右边缘对齐粘好并小心抹平。再将上文步骤一所述的结合垫按0.3cm重叠于硝酸纤维素膜的左边缘处，0.3cm粘于底板上。最后将上文步骤二所述的样品垫则按一边0.3cm重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并小心抹平。将组装好的检测板于切条机下裁成4.0mm宽的检测卡，4℃密封干燥避光保存。至此制得检测人肺炎支原体抗原的免疫层析检测卡。
七、银染增敏垫的制备
a.硝酸银垫的制备：将玻璃纤维素膜裁成大小为0.4×1.2cm/条，将裁好的玻璃纤维素膜于去离子水中充分漂洗，室温干燥后每条均匀涂布80μl含0.35％AgNO3的水溶液，于室温避光干燥后密封避光保存。
b.还原垫的制备：将玻璃纤维素膜裁成大小为0.4×1.2cm/条，将裁好的玻璃纤维素膜于去离子水中充分漂洗，室温干燥后每条均匀涂布80μl还原缓冲液(35g/L对苯二酚，63g/L柠檬酸，62g/L柠檬酸三钠，pH＝4.0)于室温避光干燥后密封避光保存。
至此制得人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒。
上述检测肺炎支原体抗原的金标银染免疫层析检测试剂盒的使用方法，步骤如下：
将待检样品(如咽拭子等)用500μl的样品处理液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，10mL/LTritonx-100，pH7.5)充分溶解后，取出120μL滴于检测卡的样品垫上，待质控线处由于金颗粒的聚集出现红色的条带时，依次将AgNO3垫和还原垫覆盖于检测线和质控线上，再滴加250μL去离子水于还原垫上进行银染增敏，10分钟后观察检测结果。
若待检样品中含有人肺炎支原体抗原，则与结合垫中的胶体金标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物结合后，在银染增敏垫的作用下会形成肉眼可见的一条黑色检测线，未结合完的胶体金标记抗体继续层析与抗兔IgG结合后亦在银染增敏垫的作用下形成肉眼可见的第二条黑色质控线；若待检样品中无人肺炎支原体抗原，则仅出现一条黑色质控线；若黑色质控线未出现，则该检测试剂盒失效。
本发明所需的PVC材质底板、吸水滤纸、硝酸纤维素膜、聚酯纤维膜、玻璃纤维素膜等可到Millipore及上海金标生物科技有限公司等专业性公司购买，所需的其他常规仪器、设备、生化药品均有市售。
本发明通过以下实施例作进一步具体描述。
本发明使用或采用的各种材料的来源及相关试剂的配制
1、样品垫处理液：称取0.29g磷酸氢二钠，0.0295g磷酸二氢钠，0.2g氯化钠，2g牛血清白蛋白(BSA)，1mL吐温-20，2g蔗糖，0.3g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-10)，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.5后用去离子水定容至100ml。
2、磷酸盐洗涤液：称取0.29g磷酸氢二钠，0.0295g磷酸二氢钠，0.2g氯化钠，0.5gPEG20000，0.1g叠氮化钠(NaN3)，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.5后用去离子水定容至100ml。
3、磷酸盐保存液：称取0.29g磷酸氢二钠，0.0295g磷酸二氢钠，0.2g氯化钠，1g牛血清白蛋白(BSA)，0.1gNaN3，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.5后用去离子水定容至100ml。
4、磷酸盐缓冲液(PBS)：称取0.29g磷酸氢二钠，0.0295g磷酸二氢钠，0.2g氯化钠，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.5后用去离子水定容至100ml。
5、兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG：为本发明自制，用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体浓度为1mg/ml。
6、兔抗重组P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG：为本发明自制，用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体浓度为1mg/ml。
7、鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物：为本发明自制，用PBS稀释，摇匀，使溶液中此二多克隆抗体浓度均为1.5mg/ml。
8、羊抗兔IgG：为博士德公司产品，用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体浓度为1mg/ml。
9、玻璃纤维素膜：厚度为0.4mm，吸水量为42mg/cm2，玻璃纤维直径为0.6-3μm，具有良好的亲水性，购买于上海金标生物科技有限公司(型号为BT40)。
10、聚酯纤维膜：厚度为0.48mm，吸水速度为18s/4cm，具有极好的亲水性，用于结合垫的制备，购买于上海金标生物科技有限公司(型号为DL42)。
11、硝酸纤维素膜：型号为MilliporeCorpSHF135，有衬板，购买于Millipore公司。
12、吸水滤纸：厚度为0.95mm，吸水速度为60s/4cm，吸水量为700mg/cm2，具有良好的吸水性，作为制作吸水垫的材料。购买于上海金标生物科技有限公司(型号为CH37K)。
13、底板：为高白度PVC材质，表面涂布单层高聚合物压敏胶SM31，购买于上海金标生物科技有限公司。
14、人肺炎支原体：购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCC15531。
15、本发明所用到的微生物样品均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
下面结合实施例对本发明所提供的技术方案进行详细说明：
实施例1(制备实施例)
结合垫的制备
(一)重组P1-His、P30-His融合蛋白的制备、纯化
(1)相关基因的克隆
对人肺炎支原体膜蛋白P1及P30(其NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber分别为AAK92040、ABR09215)进行生物信息学分析，分别获取其胞外保守结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到其对应的DNA编码序列，再根据大肠杆菌密码子偏好性，对其进行密码子优化，同时在其5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点XhoI后分别化学合成全基因序列(全序列合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交货时人工合成的基因片段均分别连于载体pUC57上)，记为p1，p30。其基因全序列如序列表所示。其中，p1基因编码的蛋白质序列为天然人肺炎支原体膜蛋白P1(accessionnumber:AAK92040)的1310-1523aa。P30基因编码的蛋白质序列为天然人肺炎支原体膜蛋白P30(accessionnumber:ABR09215)的41-274aa。将分别含有该二段人工合成的DNA片段的载体pUC57分别用NdeI及XhoI进行双酶切后按常规方法分别回收目的片段，备用。同时采用NdeI及XhoI对载体pET-28a(+)进行双酶切，并按常规方法分别将经双酶切后获得的p1，p30基因连入pET-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌TOP10，构建pET-P1、pET-P30表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体分别表达重组P1-His、P30-His融合蛋白。
(2)重组P1-His、P30-His融合蛋白的表达与纯化
将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coliBL21(DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株。分别挑取pET-P1、pET-P30转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并分别接种入100mLLB培养基中，于37℃培养过夜。分别取出菌液后，按1：100分别接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃培养至OD600＝0.6时，加入1mol/LIPTG至终浓度为1mmol/L，于37℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达。诱导4h后分别于8000r/min下离心10min收集菌体。将此二份菌体分别用20mL磷酸盐缓冲液洗涤3次并用10mL上样缓冲液(20mMNa3PO4，0.5MNaCl；30mM咪唑，pH7.4)重悬后进行超声破碎，操作条件为：50HZ，200W，超声3S，间歇5S，工作100次。超声完成后，12000g离心15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组蛋白P1-His以可溶性方式存在于菌体中，而P30-His则以包涵体形式存在。
重组P1-His融合蛋白的纯化步骤如下：
将上述获得的超声破碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用HisTrapaffinitycolumns(GEhealthcare公司产品)，按照说明书用同样的方法进行纯化。具体方法如下：
1)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上，以1mL/min流速洗柱。
2)用10mL上样缓冲液平衡，1mL/min流速。
3)将融合蛋白上样，1mL/min流速。
4)用10mL上样缓冲液，以1mL/min流速洗柱。
5)用10mL洗脱缓冲液(20mMNa3PO4，0.5MNaCl，300mM咪唑，pH7.4)，以1mL/min流速洗脱，分管收集，每管1ml，12％SDS-PAGE检测，合并洗脱组分中含有目的蛋白的样品。经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为0.2mg/mL。
重组P30-His融合蛋白的纯化步骤如下：
将上述获得的包涵体用Washingbuffer(20mMNa3PO4，0.5MNaCl；3M尿素，30mM咪唑，pH7.4)洗涤两次后，12000g离心15min收集沉淀。将沉淀分别用Bindingbuffer(20mMNa3PO4，0.5MNaCl；8M尿素，30mM咪唑，pH7.4)于室温下溶解后，12000g离心15min，上清用0.45μm的滤膜进行过滤后用HisTrapaffinitycolumns(GEhealthcare公司产品)，按照说明书用同样的方法进行纯化。具体方法如下：
1)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上，以1mL/min流速洗柱。
2)用10mLBindingbuffer平衡，1mL/min流速。
3)将融合蛋白上样，1mL/min流速。
4)用10mLBindingbuffer，以1mL/min流速洗柱。
5)用10mLElutionbuffer(20mMNa3PO4，0.5MNaCl；8M尿素，500mM咪唑，pH7.4)，以1mL/min流速洗脱，分管收集，每管1ml，12％SDS-PAGE检测，合并洗脱组分中含有目的蛋白的样品。经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为0.2mg/mL。
(二)重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备
(1)兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备
用上述纯化的重组P1-His融合蛋白按照200μg(1mL)与1mL弗氏完全佐剂混匀乳化后免疫雄性新西兰大白兔(由湖北省疾病预防控制中心提供)，于背部皮下多点注射，间隔7d后再免疫一次，再过14d后用上述纯化的重组P1-His融合蛋白按照200μg(1mL)与1mL弗氏不完全佐剂混匀乳化后进行加强免疫，加强免疫7d后再按上述同样方法再加强免疫一次。7d后取血分析抗体滴度。若不满意，可重复进行一到两次加强免疫，至抗体滴度满意(用间接ELISA法测定抗体效价大于1×105)。若满意则心脏采血，分离血清，以ProteinG亲和层析柱(GEhealthcare公司产品)，严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液调整为1mg/mL，-20℃保藏备用。
兔抗重组P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备方法与上述制备抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG方法完全一致。此二种抗体作为胶体金标记用。Westenblot试验表明，此二种多克隆抗体IgG均能对应性的特异性识别人肺炎支原体全长P1及P30蛋白。
(2)鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备
用上述纯化的重组P1-His融合蛋白作为完全抗原免疫豚鼠(由湖北省疾病预防控制中心提供)，肩胛下注射抗原200μg/只。基础免疫为等体积的抗原与弗氏完全佐剂进行乳化，每隔2周进行一次加强免疫，加强免疫用等体积抗原与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，总共免疫4次。末次免疫10d后取血分析抗体滴度。若不满意，可重复进行一到两次加强免疫，至抗体滴度满意(用ELISA法测定抗体效价大于1×105)。若满意则处死豚鼠取血清，以ProteinG亲和层析柱(GEhealthcare公司产品)，严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液调整为3mg/mL，备用。
鼠抗重组P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备方法与上述制备鼠抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG方法完全一致。将二种抗体溶液按1:1体积比混合后备用。此抗体混合物作为包被检测线用。Westenblot试验表明，此二种多克隆抗体IgG均能对应性的特异性识别人肺炎支原体全长P1及P30蛋白。
(三)胶体金分别标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备与纯化
a.胶体金标记抗人肺炎支原体多克隆抗体反应条件的优化：
1)金标抗体探针最佳标记pH的确定
利用胶体金梯度法和O值曲线法，确定金标多抗IgG的最佳pH为8.2-9.0。本实验选择pH8.6。
2)金标抗体探针最佳标记量的确定
利用胶体金梯度法和O值曲线法，确定金标多抗IgG的最佳标记量为10-30μg/ml，本实验选择20μg/ml。
b.标记过程：
1)制备胶体金溶液
制备40nm直径的胶体金。取硅化处理过的250ml锥形瓶一个，取1ml1％金氯酸水溶液加入99ml去离子水配制成浓度为0.01％的氯金酸水溶液，于加热磁力搅拌器下加热至沸腾，搅拌下准确加入1％柠檬酸钠水溶液1ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫色，最后慢慢变成酒红色，变红后继续加热煮沸10min，待其冷却至室温后加入去离子水恢复到原体积100ml。4℃静置24hr后，观察无颗粒沉淀，经电镜下观察其分散度良好，颗粒大小均匀，表明所制备的40nm直径的胶体金质量良好，可用于金标抗体的制备。
2)标记
将胶体金和兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG溶液分别以0.1mol/LK2CO3调pH至8.6，取20ml胶体金溶液，快速电磁搅拌下，将一定量的浓度为1mg/ml的抗人肺炎支原体抗体溶液缓慢加入胶体金溶液中，至终浓度为20μg/ml，室温搅拌30分钟，加入5％牛血清白蛋白(BSA)至终浓度为0.7％，搅拌5分钟，2000r/min，4℃离心15分钟，弃掉沉淀，上清用0.45μm过滤器过滤除去聚合体后，在10000r/min，4℃离心45分钟，沉淀用磷酸盐洗涤液重悬沉淀至原体积，10000r/min，重复4℃离心2次，所得沉淀最后用2ml磷酸盐保存液重悬，4℃保存备用。该磷酸盐保存液配方是综合考虑金标抗体的稳定性影响因素，如电解质、非电解质、稳定剂、pH等，通过多次试验筛选得到的，研究表明，金标抗体在此溶液中能保持充分的稳定性，不会发生聚集，脱金等不良状况。
按照上述与步骤1及步骤2相同的方法制得胶体金标记的兔抗重组P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG；将上述制备的胶体金标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG按体积比1：1混合后备用；
(四)胶体金标记抗体的负载：
将聚酯纤维膜浸入步骤(三)所得到的胶体金分别标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物中1h，取出，室温干燥后裁成4cm*0.6cm的规格后4℃密封保存备用，至此制得结合垫。
实施例2(制备实施例)
样品垫的制备
配制不同配方的样品垫处理液，观察胶体金标记抗体的释放效果，通过多次正交试验优化，得到最优的样品垫处理液配方(即本发明所述)。取玻璃纤维素膜一张，将其在样品垫处理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，剪裁成规格为4cm*2.5cm/条后，即制得样品垫，室温密封干燥保存。经试验证实该样品垫的使用，大大提高了结合垫上胶体金标记抗体的释放率，达到了较好的应用效果。
实施例3(制备实施例)
检测层的制备
将硝酸纤维素膜剪成4cm*2cm大小。将实施例1中所制备的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1μl/cm的喷速依次喷于硝酸纤维素膜上，作为检测线。同样，将羊抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1μl/cm的喷速喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，其与检测线间距为0.7cm。将喷好的硝酸纤维素膜37℃干燥2h，4℃密封干燥保存。
实施例4(制备实施例)
检测卡的组装
下面结合附图1及附图2对检测卡的组装作进一步说明。
将底板裁剪成4cm*7.3cm大小，备用。
将吸水滤纸裁剪成4cm*3cm大小，作为吸水垫，备用。
组装工作于生物安全柜内操作，首先将底板7上的粘性保护膜揭掉，将实施例3所述的检测层3即带有质控线5和检测线4的硝酸纤维素膜粘贴到底板7上附图1所指的具体区域，并小心抹平膜面。其次，将事先裁好的吸水垫6组装到底板7上，使其左边与检测层右末端有0.2cm的重叠，其右边缘则与底板7的右边缘对齐粘好并小心抹平。再将实施例1所描述的结合垫2按0.3cm重叠于检测层3的左边缘处，0.3cm粘于底板7上。最后将实施例2所描述的的样品垫1则按一边0.3cm重叠于结合垫2的左边缘处，另一边与底板7的左边缘对齐，粘于底板7上并小心抹平。将组装好的检测板于切条机下裁成4.0mm宽的检测卡，4℃密封干燥避光保存。
实施例5(制备实施例)
银染增敏垫的制备
a.硝酸银垫的制备：将玻璃纤维素膜裁成大小为0.4×1.2cm/条，将裁好的玻璃纤维素膜于去离子水中充分漂洗，室温干燥后每条均匀涂布80μl含0.35％AgNO3的水溶液，于室温避光干燥后密封避光保存。
b.还原垫的制备：将玻璃纤维素膜裁成大小为0.4×1.2cm/条，将裁好的玻璃纤维素膜于去离子水中充分漂洗，室温干燥后每条均匀涂布80μl还原缓冲液(35g/L对苯二酚，63g/L柠檬酸，62g/L柠檬酸三钠，pH＝4.0)于室温避光干燥后密封避光保存。
实施例6(制备实施例)
试剂盒的制备
由实施例5所描述的硝酸银垫及还原垫、由实施例4所描述的检测卡共同组成人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒。
实施例7(应用实施例)
试剂盒的使用方法
按常规方法获得待检者的咽拭子，将其插入装有500μl的添加了1％Tritonx-100(体积百分比)的磷酸盐缓冲液的软质塑料管中，挤压塑料管壁，使拭子上的样品充分溶解后，取出120μL滴于检测卡的样品垫上，待质控线处由于金颗粒的聚集出现红色的条带时，依次将AgNO3垫和还原垫覆盖于检测线和质控线上，再滴加250μL去离子水于还原垫上进行银染增敏，10分钟后观察检测结果。若待检样品中含有人肺炎支原体抗原，则与结合垫中的胶体金标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物结合后，在银染增敏垫的作用下会形成肉眼可见的一条黑色检测线，未结合完的胶体金标记抗体继续层析与抗兔IgG结合后亦在银染增敏垫的作用下形成肉眼可见的第二条黑色质控线；若待检样品中无人肺炎支原体抗原，则仅出现一条黑色质控线；若黑色质控线未出现，则该检测试剂盒失效。
实施例8(应用实施例)
本发明的应用效果举例
本实施例中所指的人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒的使用方法参照实施例7所述的操作步骤。
1)特异性试验
用呼吸道常见病原体如人呼吸道合胞病毒(Long株，ATCC编号VR26)、人肺炎衣原体(AR-39株，ATCC编号53592)、人腺病毒3型(GB株，ATCC编号VR-3)、人腺病毒7型(Gomen株，ATCC编号VR-7)、人甲型流感病毒(H1N1，ATCC编号VR-1743)、人乙型流感病毒(ATCC编号VR-790)、流感嗜血杆菌(ATCC编号53781)、卡他莫拉菌(ATCC编号25238)、人副流感病毒I型(ATCC编号VR-94)、人副流感病毒II型(ATCC编号VR-92)、人副流感病毒III型(ATCC编号VR-93)、肺炎链球菌(ATCC编号49619)等代替人肺炎支原体进行检测，试剂盒检测含这些微生物的PBS稀释液都为阴性。
2)重组人肺炎支原体P1蛋白增敏检测敏感性试验
将人工表达的重组人肺炎支原体P1蛋白(P1-His)用PBS稀释100倍后，进行连续倍比稀释，直至稀释至100×27倍，在使用检测卡检测时，增敏前底限为样品200倍稀释，对检测卡用实施例5所描述的银染增敏垫进行银染增敏处理后检测底限提高为样品12800倍稀释，该银染增敏方法可以使重组人肺炎支原体P1蛋白检测底限提高64倍。
3)重复性试验
3.1)试剂盒的批内重复性测试
选取在4℃保存的同一批组装好好的试剂盒，每天检测一次三个不同浓度含人肺炎支原体的样品。通过观察试剂盒内检测卡相应检测线上的显色变化来确定试剂盒的重复性。实验结果显示，批内重复的变异系数为2.7％。
3.2)检测卡的批间重复性测定
选取在4℃保存的3个不同批次组装好好的试剂盒，选定在相一时间，测定同一含人肺炎支原体的样品。通过观察试剂盒内检测卡相应检测线上的显色变化来确定试剂盒的重复性。实验结果显示，批间重复的变异系数为3.8％。
3.3)再现性试验
将同一批次的检测卡由不同的人员在同一实验室和同一人员在不同的实验室进行操作，通过观察试剂盒内检测卡相应检测线上的显色变化来确定试剂盒的再现性，结果显示，该试剂盒具有再现性。
4)临床测试例
以支原体检测“金标准”培养法作为参照，在流行季节，取220例临床咽拭子标本进行检测，培养法阳性率为13.1％(29/221)，本试剂盒为14.9％(33/221)，2种方法的符合率为97.3％(215/221)。具体结果如表1所示。
表1临床标本的检测结果
需要指出的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明精神和原则之内所做的任何修改、等同替换等均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种基于人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒的制备方法，所述人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒包括检测卡以及银染增敏垫；所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有胶体金标记的兔抗人肺炎支原体P1蛋白及P30蛋白的多克隆抗体混合物；所述检测层是由带有一条检测线以及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；所述检测线包被有鼠抗人肺炎支原体P1蛋白及P30蛋白的多克隆抗体混合物；所述质控线包被有抗兔IgG；所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起；所述银染增敏垫包括AgNO3垫以及还原垫；所述AgNO3垫由含有AgNO3的玻璃纤维膜构成；所述还原垫由含有苯二酚的玻璃纤维膜构成；
所述胶体金是直径40nm的胶体金；
所述抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG；
所述检测层长2cm，所述检测层粘贴在长度是6.6-7.7cm的底板表面中间段；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2.5-3cm的吸水垫重叠0.2-0.4cm；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0.5-0.8cm的结合垫重叠0.2-0.4cm；所述结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2.5cm的样品垫重叠0.2—0.4cm；所述检测线与质控线的间距是0.5-0.8cm；所述底板的宽度是0.3-0.5cm；
所述吸水垫是吸水滤纸；所述底板是PVC板；
其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
1）结合垫的制备：
1.1）重组P1-His、P30-His融合蛋白的制备、纯化：
1.1.1）对人肺炎支原体膜蛋白P1及P30进行生物信息学分析，分别获取其胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段；
1.1.2）找到步骤1.1.1）中所得到肽段对应的基因编码序列，根据大肠杆菌中密码子的偏好性，对步骤1.1.1）中所得到基因编码序列进行密码子优化；
1.1.3）在步骤1.1.2）中所得到的基因序列的5’端及3’端分别引入酶切位点并分别化学合成全基因序列，同时标记记为p1、p30；
1.1.4）将步骤1.1.3）中所得到的p1及p30按分子生物学方法分别克隆入表达载体pET-28a（+）后转入大肠杆菌中表达重组P1-His、P30-His融合蛋白；所述重组P1-His融合蛋白以可溶性方式存在于菌体中；所述重组P30-His融合蛋白则以包涵体形式存在于基因工程菌菌体内；
1.1.5）用镍柱分别纯化步骤1.1.4）所得到的重组P1-His、P30-His融合蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后，以Bradford法测定蛋白质浓度，将此二蛋白调整浓度均为0.2mg/mL后备用；
1.2）重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备：
1.2.1）以步骤1.1.5）中所得到的重组P1-His、P30-His融合蛋白为完全抗原，分别免疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白抗血清；所述兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于1×105；
1.2.2）采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG；
1.2.3）用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1.2.2）所得到的四种多克隆抗体IgG的浓度，将兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的浓度分别调整为1mg/mL，同时将鼠抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG及鼠抗重组P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的浓度均分别调整为3mg/mL后备用；所述调整的方式是采用磷酸盐缓冲液进行稀释；所述磷酸盐缓冲液中各组分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2PO4，1.44g/LNa2HPO4；所述磷酸盐缓冲液的pH=7.5；
1.2.4）将浓度均为3mg/mL的鼠抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG及鼠抗重组P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG溶液按1:1体积比混合后备用；
1.3）胶体金分别标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备与纯化：
1.3.1）制备40nm直径的胶体金：
取硅化处理过的250ml锥形瓶一个，取1ml1%氯金酸水溶液加入99ml去离子水配制成浓度为0.01%的氯金酸水溶液，于加热磁力搅拌器下加热至沸腾，搅拌下准确加入1%柠檬酸钠水溶液1ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫色，最后慢慢变成酒红色，变红后继续加热煮沸10min，待其冷却至室温后加入去离子水恢复到原体积100ml；4℃静置24hr后，观察无颗粒沉淀，经电镜下观察其分散度良好，颗粒大小均匀，表明所制备的40nm直径的胶体金质量良好，可用于金标抗体的制备；
1.3.2）胶体金标记兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG：
将胶体金和兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG溶液分别以0.1mol/LK2CO3调pH至8.2-9.0，取20ml胶体金溶液，快速电磁搅拌下，将一定量的浓度为1.0mg/ml的兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG溶液缓慢加入胶体金溶液中，至终浓度为10-50μg/ml，室温搅拌30分钟，加入5％牛血清白蛋白BSA至终浓度为0.7%，搅拌5分钟，2000r/min，4℃离心15分钟，弃掉沉淀，上清用0.45μm过滤器过滤除去聚合体后，在10000r/min，4℃离心45分钟，沉淀用磷酸盐洗涤液重悬沉淀至原体积，10000r/min，重复4℃离心2次，所得沉淀最后用2ml磷酸盐保存液重悬，4℃保存备用；
所述磷酸盐洗涤液中各组分含量分别为2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、5g/LPEG20000以及1g/L叠氮钠；所述磷酸盐洗涤液的pH=7.5；
所述磷酸盐保存液中各组分含量分别为2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、10g/L牛血清白蛋白以及1g/L叠氮钠；所述磷酸盐保存液的pH=7.5；
1.3.3）按照与步骤1.3.1）以及步骤1.3.2）相同的方法制得胶体金标记的兔抗重组P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG；
1.3.4）将胶体金标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG按体积比1：1混合后备用；
1.4）胶体金标记抗体的负载：
将聚酯纤维膜浸入步骤1.3）所得到的胶体金分别标记的兔抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物中1h，取出，室温干燥后4℃密封保存备用，至此制得结合垫；
2）样品垫的制备：
取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h以上，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，室温密封干燥保存；至此制得样品垫；
所述样品垫处理液中各组分含量分别为2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、20g/L牛血清白蛋白、10mL/L吐温-20、20g/L蔗糖以及3g/L聚乙烯吡咯烷酮，所述样品垫处理液的pH=7.5；
3）检测层的制备：
3.1）将步骤1.2.4）中制备的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物和抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度为0.5-2.5mg/mL，所述磷酸盐缓冲液中各组分含量分别为2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠，所述磷酸盐缓冲液的pH=7.5；
3.2）将稀释好的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5μl/cm的量按照与检测线0.5-0.8cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上作为质控线；
3.3）将喷有检测线以及质控线的硝酸纤维素膜在37℃干燥2h，4℃密封干燥保存；至此制得检测层；
4）底板的制备
将PVC材质的底板按实际要求裁剪后备用；
5）吸水垫的制备
将吸水滤纸按实际要求裁剪后备用；
6）人肺炎支原体金标银染免疫层析检测卡的组装：
6.1）将步骤4）所制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉；
6.2）将步骤3）所制备得到的检测层粘贴到底板的中部区域，并抹平膜面；
6.3）将步骤5）所制备得到的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层有部分重叠，同时将吸水垫的右边缘与底板的右边缘对齐粘好并抹平；
6.4）将步骤1）所制备得到的结合垫按部分重叠的方式重叠于硝酸纤维素膜的左边缘处，同时将结合垫粘于底板上；
6.5）将步骤2）所制备得到样品垫则按部分重叠的方式重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并抹平；
6.6）将组装好的人肺炎支原体金标银染免疫层析检测卡进行裁剪，4℃密封干燥避光保存；
所述步骤6.1）至步骤6.6）均是在生物安全柜内进行操作；
7）银染增敏垫的制备：
7.1）硝酸银垫的制备：将玻璃纤维素膜裁成大小为0.4×1.2cm/条，将裁好的玻璃纤维素膜于去离子水中充分漂洗，室温干燥后每条玻璃纤维素膜均匀涂布80μl含0.35%AgNO3的水溶液，于4℃-25℃避光干燥后密封避光保存；
7.2）还原垫的制备：将玻璃纤维素膜裁成大小为0.4×1.2cm/条，将裁好的玻璃纤维素膜于去离子水中充分漂洗，室温干燥后每条玻璃纤维素膜均匀涂布80μl还原缓冲液于室温避光干燥后密封避光保存；所述还原缓冲液中各组分含量分别为35g/L对苯二酚，63g/L柠檬酸以及62g/L柠檬酸三钠；所述还原缓冲液的pH=4.0。
2.根据权利要求1所述的人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤1.3.2）中，将胶体金和兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体溶液分别以0.1mol/LK2CO3调pH至8.6；
所述步骤1.3.2）中，加入步骤1.2）所制备的浓度为1.0mg/ml兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG至胶体金溶液中，至终浓度为15-25μg/ml；
所述步骤3.1）中将步骤1.2.4）中制备的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物和抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别是1.5-2.0mg/mL以及0.5-1.5mg/mL；
所述步骤3.2）中，将稀释好的鼠抗重组P1-His、P30-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合物装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0-2.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0-2.0μl/cm的量按照与检测线相距0.7cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上作为质控线。
CN201410405275.3A 2014-08-18 2014-08-18 人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用 Active CN104198703B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410405275.3A CN104198703B (zh) 2014-08-18 2014-08-18 人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410405275.3A CN104198703B (zh) 2014-08-18 2014-08-18 人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104198703A CN104198703A (zh) 2014-12-10
CN104198703B true CN104198703B (zh) 2015-12-30

Family

ID=52084026

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410405275.3A Active CN104198703B (zh) 2014-08-18 2014-08-18 人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104198703B (zh)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3633375A1 (en) * 2013-08-23 2020-04-08 Tauns Co., Ltd. Mycoplasma pneumoniae immunological detection method and kit
ES2775529T3 (es) * 2015-01-29 2020-07-27 Tauns Co Ltd Procedimiento de detección inmunológica y kit para Mycoplasma pneumoniae
EP3252471B1 (en) * 2015-01-29 2020-01-01 Tauns Co., Ltd. Immunological detection method and kit for mycoplasma pneumoniae
JP6655302B2 (ja) * 2015-05-29 2020-02-26 デンカ生研株式会社 被検対象の検出方法並びにそのための免疫測定器具及びモノクローナル抗体
JP6143818B2 (ja) 2015-06-01 2017-06-07 田中貴金属工業株式会社 マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置
WO2016194986A1 (ja) * 2015-06-01 2016-12-08 田中貴金属工業株式会社 マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置
CN105116150A (zh) * 2015-08-12 2015-12-02 杭州创新生物检控技术有限公司 肺炎支原体抗原检测试剂盒及其检测方法
CN105424933A (zh) * 2016-01-26 2016-03-23 姜竹泉 检测肺炎支原体的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
CN105585635B (zh) * 2016-03-08 2019-01-11 湖北工业大学 抗人肺炎支原体p1蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN105823875A (zh) * 2016-03-15 2016-08-03 威尚生物技术（合肥）有限公司 肺炎支原体抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法
CN105859884B (zh) * 2016-05-13 2020-01-10 湖北工业大学 抗人肺炎支原体p30蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN105859885B (zh) * 2016-05-13 2020-01-14 湖北工业大学 一种抗人肺炎支原体p30蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN105968197B (zh) * 2016-05-13 2019-08-16 湖北工业大学 一种抗3型解脲支原体mb蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN110133254A (zh) * 2018-02-02 2019-08-16 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种插拔式可实现信号二次放大的拉曼层析试纸
JP6426873B1 (ja) * 2018-08-06 2018-11-21 積水メディカル株式会社 マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法
US20200326337A1 (en) * 2018-08-31 2020-10-15 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Enhancing agent for detection of analyte in specimen, and method for detecting analyte in specimen
CN109342715A (zh) * 2018-10-09 2019-02-15 浙江度安生物科技有限公司 一种增强胶体金层析试纸信号强度的增敏试剂和使用增敏试剂的增敏方法
JP2022043360A (ja) * 2018-11-02 2022-03-16 積水メディカル株式会社 マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法
JP2022043359A (ja) * 2018-11-02 2022-03-16 積水メディカル株式会社 マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法
CN110540971A (zh) * 2018-12-20 2019-12-06 湖北诺美华抗体药物技术有限公司 人肺炎支原体表面蛋白单克隆抗体及应用
CN109557313A (zh) * 2019-01-04 2019-04-02 上海黄锦科技有限公司 一种家用hpv检测装置及其检测方法
CN110628942A (zh) * 2019-06-28 2019-12-31 广东朗源生物科技有限公司 一种检测非洲猪瘟病毒的胶体金试纸条及检测方法
JP2019207248A (ja) * 2019-07-29 2019-12-05 デンカ生研株式会社 被検対象の検出方法並びにそのための免疫測定器具及びモノクローナル抗体
CN113791214B (zh) * 2021-11-15 2022-02-22 南京黎明生物制品有限公司 一种沙眼衣原体抗原检测用增强液及其应用
CN117233388B (zh) * 2023-11-10 2024-02-02 济南玖方生物科技有限公司 一种用于尿液中梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101699290A (zh) * 2009-04-03 2010-04-28 李克生 肺炎支原体抗体检测方法及金标快速检测卡和制备方法
CN102135536A (zh) * 2011-01-29 2011-07-27 吉林大学 一种银染增强技术胶体金免疫层析试纸盒及其制备方法
CN102928589A (zh) * 2012-11-15 2013-02-13 南京凯基生物科技发展有限公司 呼吸道疾病IgG抗体的胶体金法检测试纸条、试剂盒及其制备方法
CN103529212A (zh) * 2013-10-16 2014-01-22 北京华卫天和生物科技有限公司 检测肺炎支原体的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5845033B2 (ja) * 2011-09-26 2016-01-20 アルフレッサファーマ株式会社 マイコプラズマ・ニューモニエ検出用イムノクロマトグラフィー試験デバイスおよびキット

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101699290A (zh) * 2009-04-03 2010-04-28 李克生 肺炎支原体抗体检测方法及金标快速检测卡和制备方法
CN102135536A (zh) * 2011-01-29 2011-07-27 吉林大学 一种银染增强技术胶体金免疫层析试纸盒及其制备方法
CN102928589A (zh) * 2012-11-15 2013-02-13 南京凯基生物科技发展有限公司 呼吸道疾病IgG抗体的胶体金法检测试纸条、试剂盒及其制备方法
CN103529212A (zh) * 2013-10-16 2014-01-22 北京华卫天和生物科技有限公司 检测肺炎支原体的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
肺炎支原体感染的实验室研究进展;张雪冬等;《临床肺科杂志》;20110228;第16卷(第2期);第241-243页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104198703A (zh) 2014-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104198703B (zh) 人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用
CN104407137B (zh) 一种猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸
CN110658339B (zh) 非洲猪瘟病毒的检测试纸、试剂盒及其制备方法
CN105319373B (zh) 基于磁性分离和量子点标记的人呼吸道合胞病毒快速检测方法和试剂盒
CN105277693A (zh) 人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡及其制备方法和应用
CN101762705A (zh) 检测猪瘟病毒野毒的胶体金免疫层析试纸条
CN104459144B (zh) 一种猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒株鉴别检测试纸
CN105319359B (zh) 人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用
CN109187967B (zh) 一种检测并区分o型、a型口蹄疫病毒的双联快速检测卡及其制备方法
CN101363858A (zh) 一种猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用
CN105753981B (zh) 抗人呼吸道合胞病毒n蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN101666800B (zh) 水泡性口炎病毒快速检测试纸条及其制作方法
CN204028084U (zh) 人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡
CN105585633B (zh) 抗人流感嗜血杆菌p6蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN105753982B (zh) 抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN105585635B (zh) 抗人肺炎支原体p1蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN105277694B (zh) 人a群链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用
CN101363865A (zh) 一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用
CN105319360B (zh) 人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用
CN105242040B (zh) 人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用
CN108957002A (zh) 具有双抗原夹心和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡
CN204028085U (zh) 卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡
CN105585634B (zh) 抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN204028083U (zh) 人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡
CN113671178A (zh) 基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸及制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Hu Zheng

Inventor after: Yang Bo

Inventor after: Dong Jun

Inventor before: Hu Zheng

Inventor before: Yang Bo

COR Change of bibliographic data
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20151028

Address after: 430068, Hubei, Wuhan, South Lake, a pier on the 1st Village

Applicant after: Hubei Industry University

Applicant after: Hubei Hualong Biological Pharmaceutical Co., Ltd.

Address before: 430068, Hubei, Wuhan, South Lake, a pier on the 1st Village

Applicant before: Hubei Industry University

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant