CN101363865A - 一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条。它是在硝酸纤维膜(NC膜)上同时包被猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体或抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体和二抗IgG，结合胶体金标记的猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法，检测标本中猪蓝耳病毒。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合流行病学调查，对猪蓝耳病毒的感染诊断起到辅助作用。

Description

一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用，属于生物检测领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome，PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起，以高热，发病率和死亡率高，成年猪生殖障碍、早产、流产和死胎，仔猪呼吸异常为特征，是一种接触传染性疾病。仔猪发病率可达100％，死亡率在50％左右；母猪流产、死胎等可达30％以上，对养猪业危害较大。本病几乎发生于世界各养猪国家，并于九十年代中期传入我国。由于其对养猪业的严重威胁性，国际兽疫局(1996)已将本病例为B类传染病。

近几年，由于PRRSV不断变异，毒力更强的新型PRRSV毒株严重危害着养猪业。2006年入夏以来，我国南方一些猪场暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染病，运用分子生物学方法诊断与鉴定，最后证实猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株为主要病原之一。

PRRS的诊断方法有多种。依据临床症状和病理变化可作出初步诊断，确诊必须依靠实验室检查。目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和血清中和试验(SN)等。

病毒检测方法：

1.血清学试验

血清学方法是目前广泛应用于实验室的诊断方法。目前国内外已经建立了4种检测PRRS抗体的方法：

免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)

IPMA是广泛用于该病诊断的一种方法，敏感性和特异性都比较好，可用于PRRSV的抗原检测、病毒鉴定及血清抗体检测。目前该方法在欧美等国家已经广泛用于PRRSV感染的研究中。试验主要在PAM、CL2621及MARC-145培养物上进行。IPMA能在感染后6天血清中检测到PRRSV抗体，具有较高的特异性。

间接荧光抗体试验(IFA)

免疫荧光抗体染色技术是应用异硫氰酸荧光素标记，建立了免疫荧光抗体染色技术用于直接检测仔猪肺组织中的抗原。有的直接采集小猪的肺泡巨噬细胞进行直接培养，用病毒特异性荧光抗体进行诊断。

血清中和试验(SN)

SN检测PRRS抗体虽然特异性好，但PRRS的SN抗体比IFA抗体在血清中出现的晚，对急性感染的敏感性较差，因此SN不适宜于早期诊断，而且细胞培养工作量大、技术性强，目前仅限于实验室研究应用。作为经典方法在病毒鉴定中起着重要作用，许多新的检测方法都要以此作为标准进行比较。

间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)

ELISA灵敏度高，特异性好，制好的诊断膜片常温下保存时间长，携带寄送方便，操作简便，快速(3h内即可完成)，不需特殊实验条件，反应板可重复使用多次，结果客观，肉眼易于判断。目前英国已把间接ELISA作为监测诊断的常规手段。童光志等利用杆状病毒表达的猪繁殖与呼吸综合症病毒N蛋白建立了ELISA诊断方法。目前已有商品化ELISA试剂盒问世，经济方便，适合于大批样品的检测。

2分子生物学诊断技术

利用RT-PCR，核酸探针，序列测定和原位杂交等方法对PRRS进行分子诊断和分型，从分子水平揭示抗原变异的基础和毒株演化过程。RT-PCR扩增病毒基因组的通用引物分别针对欧美毒株的特异性引物进行分型鉴定。嵌套性RT-PCR中同时使用通用引物和特异性引物在一次PCR反应中即可进行分型诊断。利用反转录扩增所得的cDNA片段进行放射性同位索或光敏生物紊或地高辛标记后制备DNA探针，通过Nerthern杂交捡测PRRSV培养物或病料中提取的RNA，也是一种简便、稳定的诊断方法。

病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。IPMA、IFA和间接ELISA三者特异性相似，但以间接ELISA的敏感性最高。中和抗体出现最晚，不适合于早期诊断。以上方法存在着各种不同的缺陷，如：技术条件要求高、设备比较昂贵等。

PRRSV基因组结构及其编码的蛋白已被人们进一步的认识和了解，而在病毒基因组所编码的蛋白中，由ORF7编码的核衣壳蛋白(N)高度保守，即使是在体内传代也很少引起ORF7的核苷酸序列变异。另外，N蛋白激发的免疫反应最强，机体产生的PRRSV抗体主要是针对N蛋白的，猪感染PRRSV后，一周后即可检出N蛋白抗体，且N蛋白抗体维持时间较长。因此，N蛋白是PRRS新型诊断抗原的首选蛋白。核衣壳蛋白(N)所具有的特性引起人们的普遍重视，并且各国学者围绕这一蛋白开展了许多研究，证明该蛋白在本病诊断中发挥着重要作用，也为本课题的研究提供了重要依据。

胶体金免疫层析法(Immunochromatography Assay)始于上世纪90年代中期，是在免疫渗滤法的基础上发展起来的。它是免疫亲和技术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的组合。将包被抗原、胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层析诊断试条/板，使用时只需要把试纸条下插入样本溶液，数分钟就可以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、快速，且由于为试条/试板形式，无需低温保存，储运方便。

针对猪蓝耳病的流行现状和防治要求，对于猪蓝耳病的诊断，不但要求高的特异性和敏感性，还需要快速、简便、易于基层医疗和卫生单位使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用方便、快捷，用于检测猪蓝耳病毒的试纸条，检测猪标本中猪蓝耳病毒抗原，用于猪蓝耳病的辅助诊断。

本发明的另一目的是提供一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条，其包含：同时包被猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体或抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体和二抗IgG两个条带的硝酸纤维膜；及含有胶体金标记猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体的玻璃纤维膜。

其中，所述猪蓝耳病毒N蛋白通过原核表达制备获得。

所述的二抗IgG为抗鼠IgG抗体。

所述硝酸纤维膜中猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体或抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体的浓度为1.5±0.1mg/ml，所述抗鼠IgG抗体的浓度为2.0±0.1mg/ml。

所述玻璃纤维膜中胶体金标记的猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体的标记pH值为7.4～8.0，胶体金和抗体的配比为24μg/ml胶体金。

本发明所述猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条，还包括反应支持物、金标抗体保护膜和吸水垫，所述反应支持物上依次相互搭接粘贴的金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。

反应支持物优选PVC板；吸水垫优选滤油纸；金标抗体保护膜同时具有吸水功能，优选用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。

本发明所述猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

1)制备猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体或抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体；

2)硝酸纤维膜的制备：将猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体或抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体稀释成1.5±0.1mg/ml，将抗鼠IgG抗体稀释成2.0±0.1mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线，且于37℃中干燥2小时，备用；

3)玻璃纤维膜的制备：将胶体金调整抗体pH值为7.4～8.0，胶体金和抗体的配比为24μg/ml胶体金，经稳定剂(含0.05％BSA，pH8.0，0.01MTris缓冲液)处理后，按每平方厘米65μl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用；

4)最后在反应支持物上依次相互搭接粘贴金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。

本发明所述猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条在检测猪蓝耳病毒中的应用。

本发明采用纯化的猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体或抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体和抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上(NC膜)，结合胶体金标记的猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法的原理检测标本中的猪蓝耳病毒抗原。

本发明的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定性半定量检测样本中可能存在的猪蓝耳病毒抗原，达到快速筛检病猪，及时控制疫情的目的。节省了大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合流行病学调查，对猪蓝耳病毒的感染诊断起到辅助作用。

附图说明

图1A为本发明所述猪蓝耳病毒特异性抗体检测试纸条的正面示意图；

图1B为本发明所述猪蓝耳病毒特异性抗体检测试纸条的侧面示意图；

其中：1吸水垫；2硝酸纤维膜(T：猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体或抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体的条带；C：包被抗鼠IgG的质控条带)；3含有胶体金标记猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体的玻璃纤维膜；4金标抗体保护膜；5反应支持物。

图2为检测试纸条检测结果示意图。

从左至右依次为：从左至右依次为：T、C两条线阳性；C一条线阴性；T、C两条线阴性，无效。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1猪蓝耳病毒N蛋白的克隆及表达

(1)目的基因的获得

猪蓝耳病病毒基因组由北京畜牧兽医研究所提供。pET-32a(+)表达载体及PMD-18T向Novagen公司购买。根据pET-32a(+)表达载体的特点设计两端含有限制性内协酶BamH I、Xho I酶切位点的引物：

上游为5′C GGATCC ATG CCAAATAAC AAC G3′

下游为5’G CTC GAG TCA TGC TGA GGG TGA T3′

扩增出目的片断N，扩增条件：94℃变性3min，94℃45s，56℃复性90s，72℃延伸90s，进行30个循环，最后72℃延伸10min。

(2)目的基因的克隆和阳性重组子的筛选

PCR扩增产物电泳后切胶回收，与PMD-18T克隆载体16℃过夜连接后，转化到DH5a感受态细胞中，挑取单克隆37℃过夜培养，提取质粒后，以质粒为模板进行PCR鉴定阳性克隆，送测序。

(3)N基因融合表达载体的构建

用限制性内切酶BamH I、Xho I分别酶切T/N和pET-32a(+)，1％琼脂糖电泳切胶回收N基因目的片段和pET-32a(+)双酶切后的大片段，用T4连接酶将两者16℃过夜连接，连接产物转入BL21感受态细胞，LB固体培养基培养8～10小时，挑取单菌落培养过夜后提取质粒，用PCR及限制性内切酶BamH I、Xho I双酶切分别鉴定，PCR产物和酶切产物用1％琼脂糖电泳进行分析，筛选阳性克隆，将重组的质粒送出测序。

(4)pET32a-N基因融合蛋白的诱导表达

筛选出的阳性克隆菌在LB培养基中摇菌培养过夜后，将过夜菌按照1：100的比例接种至1000mlLB液体培养基中，37℃摇床培养。N基因转化菌在接种后2小时为最佳诱导时机(OD600nm0.5)，IPTG浓度0.4mmol/L，37℃诱导8小时，目的蛋白存在于细胞裂解液上清中。

(5)pET32a-N融合蛋白的纯化、鉴定

将(4)中1000ml菌液12000r/m、4℃离心，弃上清，将菌体用细胞裂解液裂解，使用含有HIS标签的亲和层析柱子纯化融合蛋白，Western-blot鉴定融合蛋白的免疫活性。

实施例2：猪蓝耳病病毒N蛋白的单克隆抗体细胞株的研制

(1)骨髓瘤细胞

SP2/0骨髓瘤细胞：用时将存储在液氮罐中的SP2/0细胞复苏，在含有10％小牛血清DMEM培养基中培养48-72小时，待细胞生长良好，细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐、呈对数分裂，准备融合。

(2)免疫小鼠

制备的基因工程抗原从-20℃低温冰箱取出溶解后，给BALB/C小鼠多点皮下注射(0.2ml/只)，间隔10天。共免疫3次。融合前3日，在小鼠腹腔以抗原0.15ml进行攻击。

(3)细胞融合

融合剂PEG(分子量1500，日本产)；培养液：10％小牛血清DMEM。SP2/0细胞和免疫的BALB/C鼠的淋巴细胞分别按2×10⁷和2×10⁸比例融合。

(4)阳性孔的监测

将融合孔上清液分别加在猪蓝耳病毒N蛋白抗原包被的聚乙烯96孔扳上，ELISA法检测，红色为细胞阳性孔。

(5)将检测所得11个阳性株以有限稀释法进行亚克隆，最后获得7株。

(6)抗体分泌稳定性实验

将亚克隆所得的单抗细胞株于体外进行传代培养，并进行反复液氮冻存和复苏，其产生猪蓝耳病病毒N蛋白单克隆抗体阳性率100％，且保持稳定分泌抗体的能力，其ELISA效价达到1：2000以上。

实施例3：猪蓝耳病病毒N蛋白的单克隆抗体的制备和检定

(1)单抗腹水制备：

小鼠：SPF级小鼠，经检查无鼠源病毒污染，在腹水生产过程中如发现动物不健康、咬伤、感染者应弃掉。

细胞株扩大培养：取生产批细胞管1支复苏，加营养液扩大培养，1只生产细胞只用一次，不再冻存。

杂交瘤细胞株接种：制备腹水均需在无菌条件下进行，注射杂交瘤细胞之前，每只小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml。一周后每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞1～3×10⁶/0.2ml。

腹水采集：注射细胞株7～10天，或小鼠濒死前一次采集腹水，置-20℃保存。

(2)单克隆抗体的提纯：

采用硫酸铵沉淀法粗提，进而用HiTrap rProtein A柱纯化，经SDS-PAGE电泳检定，仅显示单一蛋白带。

(3)抗体亲合力测定：

采用NaSCN竞争ELISA实验，测定其ED50的下降值，来间接反映其抗体亲合力的大小。选择其中亲和力较好的7株，进行亚型检定。

(4)亚型检定：

采用免疫扩散法对细胞培养上清的单抗进行Ig亚类的检测。上述6株单克隆抗体的Ig亚类分别是：IgG1有二株；IgG2a有一株；IgG2b有两株；IgM有二株。

(5)抗原位点检定：

用相加ELISA法对非IgM的5株单抗的抗原结合位点进行检测。结果表明，这7株中，有三种不同的抗原结合位点。

实施例4：猪蓝耳病毒检测试剂盒的研制

(1)胶体金-抗体结合物的制备：

经实验确定，以猪蓝耳病病毒N蛋白单克隆抗体作为金标抗体，其最佳结合pH值为8.0，胶体金和抗体的配比为24μg/ml胶体金。标记胶体金经稳定剂(含0.5％BSA，pH8.0，0.0MTris缓冲液)处理后，标记胶体金稀释至OD2.0，按每平方厘米65μl的量，取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，并在干燥环境中保存。

(2)包被抗体于硝酸纤维膜：

将猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体(与胶体金标记的单克隆抗体的抗原结合位点不同)用0.01MPBS稀释成1.5±0.1mg/ml。将抗鼠IgG多克隆抗体用0.01MPBS稀释成2±0.1mg/ml。用喷膜机将二者以1μ1/cm的速度喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线。两条线之间的间隔为0.5cm。

把固定有抗体的硝酸纤维置37℃烤箱中干燥2小时。干燥环境中保存备用。

(3)猪蓝耳病毒检测试剂盒组成

反应支持物5为6.5cm×0.4cm PCV板；吸水垫1为2cm×0.4cm的滤油纸；1.8cm×0.4cm的硝酸纤维膜2依次包被抗鼠IgG，猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体或猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体，0.4cm×0.4cm的含有胶体金标记的猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体的玻璃纤维膜3；金标抗体保护膜4(样品垫)为2.7cm×0.4cm的滤纸纤维；即形成了猪蓝耳病毒快速检测试纸条(胶体金法)。

(4)猪蓝耳病毒检测试剂盒特异性及敏感度

使用步骤3的检测试剂盒(检测带为单克隆抗体)进行实验

产品特异性：

用本产品与猪瘟病毒、猪链球菌、猪种布氏菌、空肠弯曲菌进行交叉反应性实验，结果表明与本品针对上述病原而言是特异的。

产品敏感度：

Marc145细胞培养猪蓝耳病毒，其细胞病变达到一定程度(+++)后，收获病毒。用ELISA试剂盒对其进行标定。检测结果表明，本品对猪蓝耳病毒的最低检出量为1:256(滴度)。

实施例5检测方法(参见图2)

将标本放入装有稀释液的小瓶内，将实施例4试纸条“4”处插入瓶内(直至观察完结果后方可取出试纸条)，样品中的液体吸起上行，10-15分钟判读。

结果：

如标本中含有猪蓝耳病毒N蛋白抗原，则与试纸条上胶体金标记的猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体或抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体，形成红色线条，即在T处形成红色条带。

无论是否含有相对应的抗原，胶体金标记猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体继续向上爬行与包被在膜上的抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸条失效。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司

<120>一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

Claims (8)

1、一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条，其特征在于，其包含：同时包被猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体或抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体和二抗IgG两个条带的硝酸纤维膜(2)；及含有胶体金标记猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体的玻璃纤维膜(3)。

2、根据权利要求1所述猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条，其特征在于，所述猪蓝耳病毒N蛋白是通过原核表达制备获得。

3、根据权利要求1或2所述猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条，其特征在于，所述的二抗IgG为抗鼠IgG抗体。

4、根据权利要求3所述猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维膜中猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体或抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体的浓度为1.5±0.1mg/ml，所述抗鼠IgG抗体的浓度为2.0±0.1mg/ml。

5、根据权利要求1-4任意一项所述猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条，其特征在于，所述玻璃纤维膜中胶体金标记的猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体的标记pH值为7.4～8.0，胶体金和抗体的配比为24μg/ml胶体金。

6、根据权利要求1-5任意一项所述猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条，其特征在于，还包括反应支持物(5)、金标抗体保护膜(4)和吸水垫(1)，所述反应支持物(5)上依次相互搭接粘贴的金标抗体保护膜(4)、玻璃纤维膜(3)、硝酸纤维膜(2)和吸水垫(1)。

7、一种制备权利要求6所述猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条的方法，包括如下步骤：

1)制备猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体或抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体；

2)硝酸纤维膜的制备：将猪蓝耳病毒N蛋白的单克隆抗体或抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体稀释成1.5±0.1mg/ml，将抗鼠IgG抗体稀释成2.0±0.1mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线，且于37℃中干燥2小时，备用；

3)玻璃纤维膜的制备：将胶体金调整抗体pH值为7.4～8.0，胶体金和抗体的配比为24μg/ml胶体金，经稳定剂处理后，按每平方厘米65μl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用；

4)最后在反应支持物上依次相互搭接粘贴金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。

8、权利要求1-6任意一项所述猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条在检测猪蓝耳病毒中的应用。

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