CN111999496A - 一种SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及免疫分析医学领域,具体涉及一种SARS‑CoV‑2抗原抗体联合检测的试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包括包被有SARS‑CoV‑2病毒的N抗体和SARS‑COV‑2病毒的S抗原的反应板、样品稀释液、酶标记物、显色底物液、洗涤液等。本发明的试剂盒采用双抗原夹心法测总抗体,比捕获法、间接法具有更好的特异性,最大程度的避免假阳性。实现缩短窗口期、提高检出率的目的,且具有检测结果更加准确、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性优异、可测定线性范围宽、操作简单、结果容易判定等优点。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析医学领域,具体涉及一种SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒及其制备方法。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2,2019-nCOV)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)。
新型冠状病毒基因组依次编码刺突蛋白(Spike protein,简称S蛋白)、包膜蛋白(Envelope protein,简称E蛋白)、膜蛋白(Membrane protein,简称M蛋白)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,称N蛋白)。S蛋白是冠状病毒最重要的表面蛋白,与病毒的传染能力及发病机制等密切相关。N蛋白是SARS-CoV-2的重要结构蛋白,在病毒的包装、复制和蛋白质翻译等过程中起关键作用。
目前新冠病毒检测方法主要有核酸检测和抗体检测。抗体检测操作简单方便、快速、对设备和人员要求低,适用于大量疑似病例和无症状感染者检测,最快15分钟内出结果,但是由于平台所限,其灵敏度相对较低,变异大,检测窗口期较长,不能满足对发热早期患者筛查的需要。
夹心法,是将含有已知纯化的抗原、抗体吸附在固相载体上,并保持其免疫活性。使抗原或抗体与示踪物结合,形成示踪物标记的抗原、抗体。这种标记的抗原抗体既保留其免疫活性,又保留示踪物的活性。测定时,把待测样本和标记抗原、抗体按一定步骤与固相载体表面的抗原、抗体反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的示踪物的量与样本中待检物质的量程正相关。加入酶所作用的底物后,底物被示踪物催化,根据颜色反应的深浅或者光量值的大小,对待检样品定性或定量分析。示踪物特别是酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的灵敏度。
对SARS-CoV-2的抗原抗体夹心法检测主要致力于如何缩短窗口期、提高检出率的目的。提供结果更加准确、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性优异、可测定线性范围宽、操作简单的SARS-CoV-2抗体检测方法。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种具有缩短检测窗口期、灵敏度高、特异性好、重复性好、取样简便、操作简单、结果容易判定等优势的试剂盒及其制备方法。
本发明的目的在于提供一种SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒及其制备方法。
根据本发明的技术方案的原理为,采用双抗体夹心法和双抗原夹心法原理同时检测人血清、血浆、咽喉部分泌物中的SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗原(以下简称“N蛋白抗原”)和SARS-CoV-2刺突蛋白抗体(以下简称“S蛋白抗体”)。预先采用SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗体和SARS-CoV-2病毒的S蛋白抗原同时包被固相载体,加入样本后,若样本中含有SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗原和/或SARS-CoV-2病毒的S蛋白抗体,则与固相载体结合,再与加入的示踪物标记的SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗体和S蛋白抗原结合,形成固相抗体-抗原-示踪物标记抗体、固相抗原-抗体-示踪物标记抗原的夹心复合物,温育后洗涤除去未结合的样本和示踪物,加入配套底物,读数,根据临界值判断样本中是否含有SARS-CoV-2(2019-nCOV)病毒的N蛋白抗原和/或S蛋白抗体。
临界值的判定:取一定数量的阴性血清样本,使用免疫检测试剂盒进行测定,取阴性样本的测值的平均值。若阴性样本的平均值为X,则该次测定的临界值为2X或3X。例如,试剂盒结果判定以S(样本测值)/N(阴性对平均测值)≥2.1为阳性,其依据即是以阴性参考血清的2.1倍作为临界值。此外,为了避免阴性样本测值过低导致的临界值过低,还会规定阴性样本平均测值不到某一特定值,如0.05时,以0.05计算,即临界值不低于0.1。
根据本发明的试剂盒包括包被有SARS-CoV-2病毒N抗体和SARS-COV-2病毒S抗原的反应板、样品稀释液、酶标记物、显色底物液、洗涤液、阴性对照和SARS-CoV-2病毒N抗体阳性对照和SARS-COV-2病毒S抗原阳性对照以及其它辅助试剂。
根据本发明的SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒,所述固相载体为微孔板,优选为透明聚苯乙烯微孔板或白色不透光聚苯乙烯微孔板、黑色不透光聚苯乙烯微孔板。更优选为,透明聚苯乙烯微孔板或白色不透光聚苯乙烯微孔板。
根据本发明的具体实施方式,所述SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
获取SARS-CoV-2病毒N抗体、S抗原;
固相载体包被以及封闭,在包被缓冲液中分别投入SARS-CoV-2病毒的N抗体和SARS-CoV-2病毒的S抗原,使其包被浓度分别在1μg/mL,包被缓冲液为0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液。清洗后,封闭液封闭;
配制样品稀释液,包括以下步骤:
(1)将0.5%Tween20加入含有0.5%BSA的0.02M PBS中,并且搅拌均匀,
(2)向溶液中加入0.2%表面活性剂3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐CHAPS搅拌均匀,
(3)向溶液中加入0.1%的Proclin300搅拌均匀,
(4)定容分装,2-8℃保存备用;
酶标记SARS-CoV-2病毒的S抗原、N抗体;
配制显色底物液;
校准品配制;
分装校准品、酶标记的SARS-CoV-2N抗体和S抗原,显色底物液;
组装产品。
在上述方法中,进一步地,本发明的标记SARS-CoV-2病毒的N抗体和S抗原的酶为碱性磷酸酶、吖啶酯或辣根过氧化物酶,更优选为辣根过氧化物酶。
与现有技术相比,本发明的技术方案具有如下有益的技术效果:
1、本发明一种SARS-CoV-2抗原抗体联合检测试剂盒及其制备方法,为解决现有技术中出现的问题,提供了一种兼具窗口期短、灵敏度高、特异性好、取样简便、操作简单、结果容易判定等优势的SARS-CoV-2抗原抗体联合检测试剂盒及其制备方法。适用于急性期筛查、人群大规模筛查,能够批量快速处理大量样本,可以实现自动化处理。
2、本发明采用双抗体夹心法和双抗原夹心法,同时检测SARS-CoV-2病毒的N抗原和SARS-COV-2病毒的S抗体。本发明在研究过程中发现,在检测位点的设计上,选用配对N抗体夹心法检测N抗原、配对S抗原夹心法检测S抗体,这种设计显著提升检测的特异性、准确率,因为N蛋白作为冠状病毒结构蛋白中含量最丰富和保守的蛋白质,在感染早期病人血清中出现,诱导机体产生大量特异性IgG和IgM抗体,因此成为感染早期检测病毒抗体的首选抗原;S蛋白抗原处在病毒的最外侧,最早刺激机体,特异性抗体滴度在患病前三周低于N蛋白,但是后期则与N蛋白IgG抗体的检出率接近,所以S蛋白的抗体最早出现。两者之间存在互补性,因此本发明中以N蛋白和S蛋白组合作为抗原用于SARS-CoV-2的抗体检测,可以比单独使用任何一种抗原进一步提高检测的灵敏度,减少漏检。
3、根据本发明的SARS-CoV-2病毒双抗体夹心法和双抗原夹心检测法,S抗原的高效标记示踪与检测结果的准确率密切相关,现有技术大部分采用捕获法测抗人IgM抗体,间接法测抗人IgG抗体,这两种方法的特异性很容易受到血液样本中非特异型IgM和IgG抗体的干扰,造成假阳性。本发明采用配对S抗原夹心法原理,采用新冠病毒S1亚基的RBD区域作为包被和标记蛋白,因为RBD区域约占S1亚基的33%,不存在可被该区域外部的交叉反应识别的表位。通过包被端和标记端的双重选择,具有特异性好的明显优势。本发明的S抗体酶标技术采用高碘酸钠法。能使70%酶与90%以上球蛋白结合。采用本法首先是用无水乙醇封闭HRP表面的游离氨基,从而提高酶结合抗体球蛋白的能力,避免酶的自身交联。然后用高碘酸钠来氧化HRP表面结构的醣链部份(即低聚醣基团)使成醛基,使其直接与抗体球蛋白上的游离氨基形成共价键而结合。最后用硼氢化钠还原,使HRP表面醛基能充分与抗体球蛋白上氨基进行反应,使之形成稳定的结合物。
4、根据本发明的SARS-CoV-2病毒双抗体夹心法和双抗原夹心检测法。因为新型冠状病毒的一个重要特点是其独特的转录策略,N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳,N基因同时存在于全长基因组和其他亚基因组RNA,在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用。那么,在新冠病毒转录过程中,其N基因转录合成量更高,在感染早期机体就能产生N蛋白抗原,血液样本中的N抗原含量极低,但是含有高比例的残基,其中有80%的残基位置是保守的(在其N末端存在有一高度保守的基因序列FYYLGTGP)。本发明利用N蛋白这一特点建立快速检测SARS-CoV-2N抗原方法。
另外,充分解裂血液样本中的N抗原,为检测创造条件,解决了现有技术条件下样本中N抗原检出难的困境。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的试剂盒及其制备方法进行详细和具体的介绍,以便更好的理解本发明,但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1本发明试剂盒的制备
本实施例采用酶联免疫法检测,具体操作如下:
步骤1:制备高亲和力N抗体
获得高纯N抗原:
(1)克隆新型冠状病毒COVID-19NP蛋白基因序列,连入表达载体pET-30a,构建重组表达载体pET-30a-NP(N端带有6×His标签),将重组表达质粒转化入BL21感受态细胞,挑取单菌落于3ml含氨苄西林钠的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜,次日接种于250ml新鲜的LB液体培养基中,37℃、160r/min培养4h至对数生长期,加150μl 1M的IPTG诱导液,15℃诱导13h。
(2)4℃,6000r/min离心10min收集诱导后的菌体;用25mM Tris-HCl(PH8.5)重悬菌体,然后对菌体进行冰浴超声。
(3)冰浴超声后的菌体于4℃,12000r/min离心10min后收集上清,过滤得到备用样品。
(4)Ni柱纯化备用样品,平衡后,将处理好的样品缓慢上样,待吸光度值开始上升时,收集穿过液。再次平衡后,用含25mM咪唑、25mM Tris-HCl(25mM Tris-HCl中含250mM咪唑,溶液的pH为8.5)的溶液洗脱,分别收集蛋白峰,电泳分析纯化产物,验证纯化后的目的蛋白在250mM咪唑洗脱液中。获得高纯N抗原,根据所用骨髓瘤细胞选用小鼠作为免疫动物,共5次免疫,在最后一次加强免疫后第3天取出脾细胞。
饲养细胞。取6-10周龄的BALB/c小鼠,摘眼球取血,颈椎脱臼法处死小鼠后,立即放入75%酒精中消毒,消毒3min,用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜。用吸管注入培养液,反复冲洗,吸出冲洗液。离心5min;用20%小牛血清的培养液混悬,调整细胞数为1*105/ml,加入96孔板,100ul/孔。放入37℃恒温培养箱培养。第二天观察无污染,可使用。
细胞融合:取脾细胞与骨髓瘤细胞融合,并加入饲养细胞,形成杂交瘤细胞。
克隆化:在得到杂交瘤细胞以后,采用有限稀释法经3-4次亚克隆,直至单个细胞形成的克隆培养物上清液抗体阳性,测定上清效价,用间接ELISA法测定上清效价,获得稳定分泌抗体的单克隆细胞株。
动物体内生产单抗:成年BALB/c小鼠腹腔接种降植烷或液体石蜡,7-10天后腹腔接种用PBS稀释的杂交瘤细胞,间隔5天,每天观察小鼠腹水产生情况,适时采集腹水,将腹水离心(2000r/min 5分钟),除去细胞成分和其他的沉淀物,收集上清,测定抗体效价,分装。
单克隆抗体的纯化:采用辛酸-硫酸铵沉淀法,用紫外可见分光光度计检测蛋白含量,SDS-PAGE检测抗体纯度。
单克隆抗体亲和力测定。制备得到的N抗体亲和力较市面上常用的对照N抗体亲和力提高了约5000倍以上,相对于未进行细胞因子递送的免疫小鼠制备得到的普通抗体亲和力有更加明显的提高。
表1本发明制备的抗体与普通抗体亲和力对比
检测方法 | 本发明试剂盒 | 北京某厂家 |
ELISA检测 | 0.22pg | 1000pg |
步骤2:获取S抗原
克隆新型冠状病毒COVID-19S蛋白中RBD区域的基因序列;将合成的基因序列插入带有IL-33信号肽和小鼠Fc片段的pcDNA3.1表达载体中,以此表达载体转染HEK293S细胞,通过Protein G亲和纯化柱进行蛋白纯化,获得S抗原。
步骤3:微孔板包被以及封闭
在包被缓冲液中分别投入SARS-CoV-2病毒的N抗体和SARS-CoV-2病毒的S抗原,使其包被浓度分别在1μg/mL,包被缓冲液为0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液。每孔100uL包被,包被温度为4℃,包被时间为24±2小时;用PBST洗板两次后,封闭液150uL/孔封闭,封闭温度为4℃,封闭时间为20±2小时,封闭完成后将板孔内的封闭液甩干后干燥间干燥24±2小时,置于铝箔袋中加入干燥剂密封4℃保存。封闭液配方:0.02M PBS+1%BSA+0.2%酪蛋白钠盐,然后将所配封闭液加入上述洗涤后的微孔板内。
步骤4:配制样品稀释液
(1)将0.5%Tween20加入含有0.5%BSA的0.02M PBS中,并且搅拌均匀;
(2)向溶液中加入0.2%表面活性剂3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐CHAPS搅拌均匀;
(3)向溶液中加入0.1%的Proclin300搅拌均匀。
(4)定容分装,2-8℃保存备用。
步骤5:HRP标记SARS-CoV-2病毒的S抗原、N抗体
采用高碘酸钠法。
(1)取4mg HRP溶于0.4mL蒸馏水;
(2)向溶液中加入高碘酸钠溶液0.4mL,2~8℃反应30分钟,溶液颜色由棕红变为绿色;
(3)向溶液中加入无水乙醇溶液0.4mL,室温(20℃)下轻微搅拌作用30分钟,溶液颜色由绿色变为棕红色。
(4)取出活化后的HRP溶液共1.2mL,向2mg SARS-CoV-2病毒的S抗原中加入0.6mL活化后的HRP溶液,向2mgN抗体中加入0.6mL活化后的HRP溶液;
(5)将上述两份标记物分别装入透析袋,置于pH9.6的碳酸盐缓冲液中,2~8℃反应12小时±2小时;
(6)向两个透析袋中分别加入4mg/mL硼氢化钠溶液80μL,置于2~8℃反应2小时;
(7)向每个透析袋中加入等体积的饱和硫酸铵溶液,置2~8℃静置30分钟,10000r/min离心30min,去上清;
(8)将沉淀物溶于0.02MoL/LpH7.4的PBS中,装入透析袋,并以此缓冲液透析平衡6-12h,换液3次;
(9)在结合物内加入一倍体积的甘油,即为酶标记物,测定工作效价后,小量分装,-20℃保存备用。
步骤6:TMB显色底物液配制
使用方法:使用前将A液与B液按1:1比例混合后使用,现用现配。
步骤7:校准品配制
校准品A(阴性校准品)配制:
将正常人血清用稀释液稀释后,加入防腐剂、色素,得阴性校准品。
校准品B(SARS-CoV-2N蛋白阳性校准品)配制:
将重组SARS-CoV-2N蛋白,用稀释液稀释后得SARS-CoV-2N抗原阳性校准品。
校准品C(SARS-CoV-2S抗体阳性校准品)配制:
将SARS-CoV-2病毒S抗体,用稀释液稀释后得SARS-CoV-2S抗体阳性校准品。
步骤8:分装校准品、HRP标记的SARS-CoV-2N抗体和S抗原,TMB显色底物液。
步骤9:组装产品。
实施例2本发明试剂盒的使用方法
步骤1:加样:取SARS-CoV-2病毒的N抗体和SARS-CoV-2病毒的S抗原微孔板,平衡至室温后,每次实验设阴性对照3孔,SARS-CoV-2病毒的N抗体阳性对照2孔,SARS-CoV-2病毒的S抗原阳性对照2孔,每孔分别加入50ul,样品孔中每孔加入样品50uL,再加入样品稀释液50ul,混匀,贴上封板膜,置37℃温育60分钟;
步骤2:洗板,甩去反应液,用稀释后的洗涤液洗板5次,最后在干净的吸水纸上扣干;
步骤3:加酶,除空白孔外,每孔加入含有辣根过氧化物酶标记的SARS-CoV-2病毒的S抗原或SARS-CoV-2病毒的N抗体,贴上封板膜,静置37℃30分钟。
步骤4:方法同步骤2。
步骤5:使用前将TMB显色底物液A和B以1∶1混合,加入板孔中,置37℃反应15分钟。
步骤6:在酶标仪上测量各孔的OD值。
步骤7:根据待测样本的OD值与Cutoff值判断,若样本测≥Cutoff值,则为阳性反应,说明样本中含有S蛋白抗体和/或N蛋白抗原;若OD值<Cutoff值,则为阴性反应,说明样本中不含有S蛋白抗体或N蛋白抗原。
综上所述,通过抗原抗体联合检测试剂,验证了建立的方法在实际应用中的效果,为进一步快速准确的检验新冠患者的感染风险提供了新的检测方法。
实施例3本发明的试剂盒的临床实验比对
1、本发明试剂盒的临床实验比对,实验结果见下表:
表2本发明试剂盒检测血清样品与胶体金测定结果比较
表3本发明试剂盒与ELISA及胶体金灵敏度及特异性评价
本试剂盒 | ELISA | 胶体金 | |
灵敏度 | 100% | 80.0% | 66.7% |
特异性 | 100% | 100% | 98.3% |
结果表明,本发明的试剂盒的灵敏度和特异性均高于ELISA总抗体和胶体金法测IgM和IgG抗体检测试剂。
2、不同试剂盒对不同病程样本的灵敏度评估
为了评估各检测试剂原料在新冠肺炎不同病程样本中的灵敏度,将样本按疾病进行分组:早期阶段为发病14天内12份样本;中晚期阶段为发病后≥15天12份样本。
本发明检测试剂盒14天内样本的灵敏度为100%(12/12),在发病后≥15天样本的灵敏度为100%(12/12);对比厂家选用ELISA测定总抗体的检测试剂,其早期样本的灵敏度为41.7%(5/12),中晚期样本的灵敏度为100%(12/12)%。由此可见,本发明的抗原抗体联合检测可以有效的检出窗口期的样本。
实施例4与本发明相反的检测位点试剂盒与本发明试剂盒检测血清样品测定结果比较
采用与本发明相反的检测位点,双抗原夹心法和双抗体夹心法,即N抗原检测N抗体、S抗体检测S抗原,制备方法、使用方法同本发明。对该实验进行灵敏度、特异性的检验。
表4与本发明相反的检测位点试剂盒与本发明试剂盒检测血清样品测定结果比较
表5与本发明相反的检测位点试剂盒与本发明试剂盒灵敏度及特异性评价
本试剂盒 | 与本发明相反的检测位点试剂盒 | |
灵敏度 | 100% | 33% |
特异性 | 100% | 90% |
本发明的试剂盒采用双抗原夹心法测总抗体,比捕获法、间接法具有更好的特异性,最大程度的避免假阳性。实现缩短窗口期、提高检出率的目的,且具有检测结果更加准确、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性优异、可测定线性范围宽、操作简单、结果容易判定等优点。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:
包被有SARS-CoV-2病毒的N抗体和SARS-COV-2病毒的S抗原的反应板、样品稀释液、酶标记物、显色底物液、洗涤液、阴性对照和SARS-CoV-2病毒N抗体阳性对照和SARS-COV-2病毒S抗原阳性对照。
2.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒,其特征在于,所述样品稀释液的配方为:含有0.5%BSA的PBS,0.5%Tween20,0.2%表面活性剂3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐CHAPS,0.1%Proclin300。
3.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒,其特征在于,所述酶标记物为碱性磷酸酶、吖啶酯或辣根过氧化物酶标记物。
4.一种制备SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
获取SARS-CoV-2病毒的N抗体、S抗原;
反应板包被以及封闭,在包被缓冲液中分别投入SARS-CoV-2病毒的N抗体和SARS-CoV-2病毒的S抗原,进行包被,清洗后,以封闭液封闭;
配制样品稀释液;
酶标记SARS-CoV-2病毒的S抗原、N抗体;
配制显色底物液;
校准品配制;
分装校准品、酶标记的SARS-CoV-2N抗体和S抗原,显色底物液;
组装产品。
5.根据权利要求4所述的制备SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒的方法,其特征在于,通过以下步骤配制样品稀释液:
(1)将0.5%Tween20加入含有0.5%BSA的0.02M PBS中,并且搅拌均匀,
(2)向溶液中加入0.2%表面活性剂3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐CHAPS搅拌均匀,
(3)向溶液中加入0.1%的Proclin300搅拌均匀,
(4)定容分装。
6.根据权利要求4所述的制备SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒的方法,其特征在于,以碱性磷酸酶、吖啶酯或辣根过氧化物酶标记SARS-CoV-2病毒的S抗原、N抗体。
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CN202010845775.4A CN111999496A (zh) | 2020-08-20 | 2020-08-20 | 一种SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒及其制备方法 |
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