CN1580772A - Sars病毒抗体双抗原夹心elisa检测法 - Google Patents

Sars病毒抗体双抗原夹心elisa检测法 Download PDF

Info

Publication number
CN1580772A
CN1580772A CN 03126278 CN03126278A CN1580772A CN 1580772 A CN1580772 A CN 1580772A CN 03126278 CN03126278 CN 03126278 CN 03126278 A CN03126278 A CN 03126278A CN 1580772 A CN1580772 A CN 1580772A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
sars virus
enzyme
albumen
virus antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 03126278
Other languages
English (en)
Inventor
王云龙
曹诚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HENAN BIOENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Original Assignee
HENAN BIOENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HENAN BIOENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER filed Critical HENAN BIOENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Priority to CN 03126278 priority Critical patent/CN1580772A/zh
Publication of CN1580772A publication Critical patent/CN1580772A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种SARS病毒抗体检测方法。属疾病诊断领域中血清(浆)中抗体的ELISA检测方法。通过基因工程方法制备出SARS病毒的基因工程抗原，抗原与酶偶连形成酶标抗原，抗原可吸附于酶联反应板上，与酶标抗原一起可以对血清(浆)中的SARS病毒抗体进行双抗原夹心法ELISA检测。

Description

SARS病毒抗体双抗原夹心ELISA检测法
所属技术领域
本发明涉及血清(浆)中SARS病毒抗体检测方法，属疾病诊断领域中血清(浆)中抗体的ELISA检测方法。
技术背景
非典型肺炎(SARS)的流行给人民的身体健康和社会、经济发展带来了巨大的威胁，建立快速、准确的早期诊断方法可以使疑似病人尽早确诊，从而减少交叉感染和社会负担。SARS病毒得到确认以后，国内外相继推出了一系列该病的诊断试剂，其中包括基因诊断试剂(RT-PCR法)和免疫诊断试剂(SARS病毒抗体诊断试剂)。但到目前为止，免疫诊断试剂主要为间接ELISA法和间接免疫荧光法。使用的抗原的为全病毒裂解抗原，可以对血清(浆)中的IgG或IgM分别进行检测，SARS病毒抗体的检测还未使用双抗原夹心法，其主要原因是全病毒裂解抗原需要在P3实验室进行病毒的培养、增殖、纯化和裂解，成本极其高昂，并且非常危险，同时全病毒裂解抗原为病毒的全组份，成份复杂，裂解时需要使用变性剂如SDS等，使得抗原难于进行标记。使用全病毒裂解抗原的间接SARS病毒抗体检测法本身又有不可克服的缺点：首先，灵敏度低，因为酶标记物为酶标抗人IgG或酶标抗人IgM，为了避免非特异性吸附，血清(浆)标本必须1∶10或1∶20以上进行稀释，反应灵敏度与不需稀释血清(浆)标本的双抗原夹心法比自然低10～20倍，容易造成漏检；第二，特异性差，即使血清(浆)经过1∶10～1∶20稀释，个别标本中的IgG或IgM仍对包被反应板有非特异性吸附或对包被反应板中的杂蛋白有特异性吸附。而抗人IgG或抗人IgM酶标对特异性吸附的SARS病毒抗体和其它方式吸附的人IgG或IgM无分辩能力，必然造成一部分假阳性；第三，一般情况下不能或不方便使用一套试剂同时检测IgG和IgM，目前商品化间接ELISA法检测试剂盒绝大多数只检测IgG，这样有可能造成一部分单独IgM阳性标本的漏检。
发明内容
本发明的目的是：研制出SARS病毒抗体双抗原夹心法ELISA试剂替代间接ELISA试剂，克服间接ELISA法灵敏度低、特异性差及IgG、IgM不能同时检出的弊端。
本发明是这样实现的：通过基因工程方法制备出SARS病毒基因工程抗原，基因工程抗原用于包被酶联反应板时称为包被抗原，基因工程抗原经酶标记，形成酶标抗原，包被抗原和酶标抗原一起可组成SARS病毒抗体双抗原夹心法ELISA检测试剂。
本发明的积极效果：一、灵敏度高：血清(浆)标本不稀释或仅需1∶1、1∶2稀释，比间接ELISA灵敏度提高十倍左右。二、缩短窗口期：IgM、IgG可同时检测，IgM一般出现在感染的早期，一般比IgG早出现7至10天，双抗原夹心法可提高7至10天检出感染者。三、特异性强：由于包被抗原和标记抗原均是特异性的，间接ELISA一些不可避免的非特异性标本绝大多数可被排除，提高临床诊断的准确度。四、成本低、安全性好：由于使用基因工程方法，整个抗原生产及试剂生产操作不需在P3实验室进行，成本低。表达的抗原不含SARS病毒核酸，对人和环境不会造成污染，安全性好。五、社会效益好：SARS病毒由于是通过近距离飞沫传播，极容易传染，目前尚无疫苗防治，发烧是SARS症状之一，将疑似SARS的发烧病人进行隔离是阻止该病传播的有效方法，但成本极高，SARS病毒抗体双抗原夹心ELISA检测试剂，可对疑似病人进行早期诊断，减少SARS的传播几率，降低社会防治成本。
附图说明
附图是本发明的原理示意图。图中1.酶联反应板  2.基因工程包被抗原  3.SARS病毒抗体  4.基因工程标记抗原  5.酶
具体实施方式
以下实例详述本发明：
包被抗原的获得：含有SARS病毒的基因克隆到pET-22b(+)(美国Novagen公司产品)表达质粒中，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃生长，待菌斑长出后，挑取单个克隆接种于含氨苄青霉素的LB培养基试管中，37℃，200rpm生长过夜。第二天，1∶100接种于新鲜含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃生长到OD600＝0.6～0.9之间。按终浓度0.5mmol/L加入1mol/L IPTG，37℃ 200rpm，诱导4小时，5000rpm，4℃离心10分钟，菌体反复冻融三次，超声波破碎。10000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，沉淀为包涵体，包涵体用含1％的Triton-X100洗涤一次，离心同上，用适量pH8.0 0.02mol/L PB 8mol/L尿素缓冲液溶解包涵体，离心同上，用pH8.00.02mol/L PB 8mol/L尿素缓冲液平衡CM纤维素离子交换柱，已溶解的包涵体过柱，SARS病毒抗原被吸附，用含0.1mol/L NaCl pH8.0 0.02mol/L PB8mol/L尿素的缓冲液洗涤除去杂蛋白，用含0.5mol/L NaCl pH8.0 0.02mol/LPB 8mol/L尿素的缓冲液洗脱，Ni-金属亲和柱用0.5mol/L NaCl pH8.00.02mol/L PB 8mol/L尿素的缓冲液平衡，合并CM柱洗脱的SARS病毒抗原，上Ni-亲和柱，用含25mmol/L咪唑的0.5mol/L NaCl pH8.0 0.02mol/L PB8mol/L尿素缓冲液洗涤去除杂蛋白；用含100mmol/L眯唑的0.5mol/L NaClpH8.0 0.02mol/L PB 8mol/L尿素缓冲液洗脱获得纯SARS病毒抗原，用适量pH8.0 0.02mol/L PB 8mol/L尿素缓冲液稀释至0.5mg/ml，-20℃冻存。
SARS病毒可溶性抗原的获：含有SARS病毒的基因克隆到pET-32a(美国Novagen公司产品)中，将重组质粒转化BL21(DE3)，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃生长，待菌斑长出后，挑取单个克隆于含氨苄青霉素的LB培养基试管中，37℃，200rpm生长过夜。第二天，1∶100接种于新鲜含氨苄青霉素LB培养基中，37℃生长到OD600＝0.6～0.9之间。按终浓度0.5mmol/L加入1mol/LIPTG，30℃ 200rpm，诱导8小时，5000rpm，4℃离心10分钟，用pH8.00.02mol/L pB 0.5mol/L NaCl缓冲液将菌体洗涤一次，离心同上，菌体反复冻融三次，超声波破碎，离心后上清过Ni-金属亲和柱，用含50mmol/L咪唑的pH8.00.02mol/L PB 0.5mol/L NaCl缓冲液洗涤去除杂蛋白，用含100mmol/L咪唑的pH8.0 0.02mol/L PB 0.5mol/L NaCl缓冲液洗脱获得纯SARS病毒可溶性抗原，分装后-20℃冻存。
SARS病毒可溶性抗原的辣根过氧化物酶(HRP)的标记：纯SARS病毒可溶性抗原对pH9.5 0.01mol/L碳酸缓冲液(CB)透析过夜，按Ag∶HRP＝1∶1质量比，取适量HRP，用高碘酸钠法将HRP活化后，对1mmol/L pH4.0醋酸缓冲液透析过夜。第二天，按IgG∶HRP＝1∶1质量比将SARS病毒可溶性抗原和活化后的HRP混和，用适量pH9.5 0.2mol/L CB调整混合物pH＝9.2，用pH＝9.50.01mol/L CB调整体积至SARS病毒可溶性抗原反应浓度等于1.0mg/ml，25℃暗处反应2小时，然后将反应混匀物降至4℃，按1mg HRP加入51ul的量加入0.1mol/L NaBH4，4℃反应2小时终止连接反应。装透析袋对pH7.00.02mol/L PB 0.2mol/L NaCl透析48小时，中间每6小时换液一次。透析完成后加入等体积甘油混匀，-20℃存放，即获得SARS病毒酶标抗原。
双抗原夹心法检测SARS病毒抗体：0.5mg/ml的SARS病毒包被抗原1∶1000用pH9.5 0.05mol/L CB稀释，100ul/孔加入酶标反应板，4℃包被过夜，第二天，洗涤液(pH7.0 0.01mol/L PB 0.1mol/L NaCl 0.1％tween-20)洗板一次，按115ul/孔加入含5％小牛血清的pH7.0 0.01mol/L PB封板，4℃封闭过夜，然后吸净封板液，37℃干燥2小时，加干燥剂封装于铝箔袋中，包被完毕。检测时在包被反应孔中先加入50ul pH7.0 0.01mol/L PB 0.1mol/L NaCl的PBS，然后加入50ul待检血清、阴性、阳性对照，37℃温育20分钟，用洗涤液洗板五次，拍干后加入1∶3000用含20％小牛血清PBS稀释的SARS病毒酶标抗原，37℃温育20分钟，洗板同前，加入显色剂A、B液各1滴，37℃显色10分钟，显色剂A含H2O2，显色剂B含TMB，显色完成后，每孔加入1滴2mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪在450nm波长读取结果，OD450nm≥2.1×阴性对照OD平均值者为阳性，OD450nm＜2.1×阴性对照平均值为阴性。

Claims (1)

  1. 一种SARS病毒抗体酶联免疫检测方法，其特征是包被用抗原和(或)酶标用抗原为基因工程方法制备；包被抗原和酶标抗原包括SARS病毒的N蛋白(核衣壳蛋白)、M蛋白(膜蛋白)和S蛋白(辐条样蛋白)、E蛋白(外膜蛋白)，四种蛋白(抗原)可单独组成双抗原夹心试剂，也可组合形成双抗原夹心试剂，实现对血清(浆)中的抗体进行双抗原夹心法ELISA检测。
CN 03126278 2003-08-04 2003-08-04 Sars病毒抗体双抗原夹心elisa检测法 Pending CN1580772A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 03126278 CN1580772A (zh) 2003-08-04 2003-08-04 Sars病毒抗体双抗原夹心elisa检测法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 03126278 CN1580772A (zh) 2003-08-04 2003-08-04 Sars病毒抗体双抗原夹心elisa检测法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1580772A true CN1580772A (zh) 2005-02-16

Family

ID=34578798

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 03126278 Pending CN1580772A (zh) 2003-08-04 2003-08-04 Sars病毒抗体双抗原夹心elisa检测法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1580772A (zh)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102331497A (zh) * 2011-06-15 2012-01-25 天津医科大学 牛奶过敏原检测试剂盒及其制备方法
CN106769928A (zh) * 2016-12-14 2017-05-31 中国医学科学院医学生物学研究所 轮状病毒抗原elisa定量检测方法
CN111024954A (zh) * 2020-03-09 2020-04-17 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 联合检测covid-19抗原和抗体的胶体金免疫层析装置及其使用法
CN111393532A (zh) * 2020-02-26 2020-07-10 北京丹大生物技术有限公司 新型冠状病毒优势表位融合蛋白、诊断试剂及应用
CN111505286A (zh) * 2020-04-28 2020-08-07 郑州伊美诺生物技术有限公司 一种新型冠状病毒特异性抗体双抗原夹心elisa检测试剂盒及其制备方法
CN111518176A (zh) * 2020-07-06 2020-08-11 北京金智准科技有限公司 一种用于新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测的配对抗原、检测试纸及其制备方法
CN111562391A (zh) * 2020-05-07 2020-08-21 北京康思润业生物技术有限公司 新型冠状病毒总抗体检测试纸条、包括其的检测装置及其制备方法和应用
CN111999496A (zh) * 2020-08-20 2020-11-27 必欧瀚生物技术（合肥）有限公司 一种SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒及其制备方法
CN112034166A (zh) * 2020-03-24 2020-12-04 郑州方欣生物科技有限责任公司 唾液中新型冠状病毒总抗体检测试剂盒及其制备方法
CN112034167A (zh) * 2020-03-24 2020-12-04 郑州方欣生物科技有限责任公司 用于血检的新型冠状病毒总抗体检测试剂盒
CN112034168A (zh) * 2020-03-24 2020-12-04 郑州方欣生物科技有限责任公司 用于尿检的新型冠状病毒总抗体检测试剂盒
WO2021179418A1 (en) * 2020-03-09 2021-09-16 Tsinghua University Detection of immune response to sars-cov-2

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102331497A (zh) * 2011-06-15 2012-01-25 天津医科大学 牛奶过敏原检测试剂盒及其制备方法
CN106769928A (zh) * 2016-12-14 2017-05-31 中国医学科学院医学生物学研究所 轮状病毒抗原elisa定量检测方法
CN111393532A (zh) * 2020-02-26 2020-07-10 北京丹大生物技术有限公司 新型冠状病毒优势表位融合蛋白、诊断试剂及应用
CN111024954A (zh) * 2020-03-09 2020-04-17 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 联合检测covid-19抗原和抗体的胶体金免疫层析装置及其使用法
WO2021179418A1 (en) * 2020-03-09 2021-09-16 Tsinghua University Detection of immune response to sars-cov-2
CN112034166A (zh) * 2020-03-24 2020-12-04 郑州方欣生物科技有限责任公司 唾液中新型冠状病毒总抗体检测试剂盒及其制备方法
CN112034167A (zh) * 2020-03-24 2020-12-04 郑州方欣生物科技有限责任公司 用于血检的新型冠状病毒总抗体检测试剂盒
CN112034168A (zh) * 2020-03-24 2020-12-04 郑州方欣生物科技有限责任公司 用于尿检的新型冠状病毒总抗体检测试剂盒
CN111505286A (zh) * 2020-04-28 2020-08-07 郑州伊美诺生物技术有限公司 一种新型冠状病毒特异性抗体双抗原夹心elisa检测试剂盒及其制备方法
CN111562391A (zh) * 2020-05-07 2020-08-21 北京康思润业生物技术有限公司 新型冠状病毒总抗体检测试纸条、包括其的检测装置及其制备方法和应用
CN111518176A (zh) * 2020-07-06 2020-08-11 北京金智准科技有限公司 一种用于新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测的配对抗原、检测试纸及其制备方法
CN111999496A (zh) * 2020-08-20 2020-11-27 必欧瀚生物技术（合肥）有限公司 一种SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2002248996B2 (en) Detection of candida
CN101738473B (zh) 梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法
CN211148669U (zh) 一种基于S抗原的新型冠状病毒2019-nCoV抗体快速检测试剂盒
AU2002248996A1 (en) Detection of candida
CN1580772A (zh) Sars病毒抗体双抗原夹心elisa检测法
CN101923091A (zh) 一种高敏感性的结核分枝杆菌的检测方法
CN102236017A (zh) 用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接elisa试剂盒及其用途
CN105319359B (zh) 人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用
CN101825634A (zh) 梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条及其制备方法
CN103091500A (zh) 一种抗体检测试剂盒(OmpC-IgA)
CN101393217A (zh) 一种原发性肝癌血清标志物的检测试剂盒
CN102236019A (zh) 一种用于检测非洲猪瘟病毒的间接elisa试剂盒
CN101825635B (zh) 梅毒特异性IgG抗体与特异性总抗体联合检测试剂条及其制备方法
CN103499693A (zh) 猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒及检测方法
CN105606803B (zh) 幽门螺杆菌抗体含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒
CN106188248A (zh) 一种eb病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的检测eb病毒抗体的快速检测试剂盒
EP2023142A1 (en) Immunoassay utilizing recombinant nucleocapsid-proteins for detection of antibodies to human coronaviruses
CN104833804A (zh) 一种幽门螺杆菌IgG抗体ELISA半定量检测试剂盒及其应用
CN100401067C (zh) 丙型肝炎病毒抗体桥式双抗原夹心elisa检测法
CN101377494B (zh) 一种检测结核抗体的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法
CN101368965A (zh) 一种检测巨细胞病毒IgM抗体的化学发光法免疫分析诊断试剂盒
CN101303349A (zh) 一种猪囊尾蚴病间接elisa检测试剂盒及其制备方法
CN111458498A (zh) 一种手足口ev71抗原检测试剂盒
CN102809653A (zh) 一种检测新布尼亚病毒抗原的elisa试剂盒的制备和应用
CN101021534A (zh) 幽门螺杆菌免疫印迹试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication