CN101825634A - 梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条及其制备方法，涉及一种梅毒特异性抗体检测试剂。提供一种梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条及其制备方法。试剂条设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgG抗体检测线、梅毒特异性IgM抗体检测线、对照线和吸收垫。制备梅毒重组抗原TPN17和TPN47硝酸纤维素膜的点样；制备胶体金；胶体金与梅毒特异性抗原TPN17、TPN47的标记；制备梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条。

Description

梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种梅毒特异性抗体检测试剂，尤其是涉及一种采用金标免疫层析技术(immunochromatography)进行的梅毒特异性IgM与IgG抗体联合快速检测试剂条及其制备方法。

背景技术

梅毒(Syphilis)是一种由梅毒螺旋体(Treponema pallidum，TP)引起的性传播性疾病，其病原体是梅毒螺旋体，属螺旋体科。梅毒螺旋体主要通过性接触、输血、创口或者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液，播散全身，使机体几乎所有的组织及器官受累，临床表现为全身性，可分为不同临床阶段，包括一期、二期、三期和潜伏期。世界卫生组织(WHO)曾乐观地预言：“由于有高敏度检测方法和高效的治疗方案，梅毒是一种能够通过公共卫生措施得到成功控制的性传播性疾病”。遗憾的是，至今梅毒依然是世界范围的公共卫生问题，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大约有1200万的患者，其中60万孕妇患者。(参见：Health Protection Agency Centre for Infections.International Encyclopediaof Public Health-Syphilis[M].London，UK：Health Protection Agency Centre，2008，289-297.)事实上，梅毒的感染现状可能要比想象中的更让人悲观。

调查发现，梅毒感染者已经较广泛地存在于普通人群中。

梅毒螺旋体尚不能进行体外培养，梅毒诊断与流行病学调查主要依赖于血清学试验，包括特异性抗体和反应素检测两大类型。梅毒特异性抗体IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG)抗体分别于2周和4周后产生，即使患者经过足够治疗，其仍能长期存在，甚至终身不消失(参见：Luis J F，Felipe U S，Santa G C，et al.Evaluation of a rapid strip and a particle agglutinationtests for syphilis diagnosis[J].Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2007，59：123-126)；而另一种抗体物质反应素产生较晚，一般在受感染后5～7周产生(参见：林月圆.TPPA和TRUST在梅毒诊断中的价值与临床相关问题[J].放射免疫学杂志，2009，22(3)：295-297.)，而且晚期梅毒、梅毒治疗后期以及潜伏梅毒可能阴性。因此梅毒特异性抗体的阳性率、敏感性显著高于反应素。TP-IgM是梅毒感染后，机体最先出现的特异性抗体。只要有活的梅毒螺旋体存在，其TP-IgM将会维持在一定的水平。Martina H等(参见：Martina H，Daan W N，Mart M，et al.Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19S fluorescenttreponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis[J].DiagnosticMicrobiology and Infectious Disease，2007，59：61-66.)认为TP-IgM是梅毒早期感染并活动的一项血清学标志，李步荣等(参见：李步荣，贺军涛，张毅，等.梅毒螺旋体IgM抗体检测的临床意义[J].第四军医大学学报，2007，28(16)：1495-1497)认为TP-IgM与TP-DNA一样，代表着梅毒传染性指标。在排除近期抗梅毒治疗的前提下，TP-IgM若不转阴，提示体内可能残存梅毒螺旋体或治疗不彻底。TP-IgM阴转者随访时再转阳性，表明再次感染梅毒(参见：Rawstron SA，Mehta S，Bromberg K，et al.Evaluation of a Treponema pallidum2specific IgMenzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in the diagnosisofmaternal and congenital syphilis[J].Sex Transm Dis，2004，31(2)：123-126)。尽管TP-IgM阴性不能完全排除传染性，但TP-IgM阳性必定提示该患者具有传染性。TP-IgG的出现要迟于IgM，能长期存在，甚至终身不消失，因此，TP-IgG是梅毒诊断和流行病学调查的一项重要指标。

早期的血清学方法使用完整梅毒螺旋体作为抗原，研究和诊断用的TP是以TP感染兔睾丸获得，这种方法花费大、获得的TP量少、不纯(混有宿主蛋白)，与其他病原体存在交叉反应，因此假阳性也时有发生。随着分子生物学技术的普及及梅毒螺旋体抗原的相继克隆，将重组抗原应用于梅毒实验已经越来越多。目前研究比较多的TP抗原有TPN17、TPN47、TPN15、TPN44.5、TPN36、TP0453、TP0684及TPr家族。采用重组DNA技术制备的重组抗原可以克服完整TP抗原的缺点，能快速、经济地制备无限量特异重组TP抗原。

梅毒特异性抗体检测是梅毒确证试验，包括TPHA，TPPA，ELISA，FTA-ABS及Western-blot等，其特异性均较高。然而，面对严峻的防制形式，不但需要特异准确的检测手段，还需要一种更简便快捷的试剂来筛查，以便为临床和疾病防控提供对策。

发明内容

本发明的目的是提供一种梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条及其制备方法。

本发明所述梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜(NC膜)、梅毒特异性IgG抗体检测线、梅毒特异性IgM抗体检测线、对照线和吸收垫。加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgG抗体检测线、梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体。

所述载体板可采用PVC板。

本发明所述梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，包括以下步骤：

1)制备梅毒重组抗原TPN17和TPN47：采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒重组抗原TPN17和TPN47；

2)硝酸纤维素膜的点样：在硝酸纤维素膜上的梅毒特异性IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在硝酸纤维素膜上的梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在硝酸纤维素膜上的对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体，晾干；

3)制备胶体金：采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1％氯金酸1mL加入到100mL去离子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01％，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.0mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中4℃冰箱保存备用；

4)胶体金与梅毒特异性抗原TPN17、TPN47的标记：

胶体金与梅毒特异性抗原TPN17的标记：取胶体金10ml，用0.1mol/L NaOH调至pH5.4，加100μg TPN17，混匀，放置5min，加入5％BSA 1ml混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10ml，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用TBS稀释至1ml，得胶体金标记的TPN17抗原；

胶体金与梅毒特异性抗原TPN47的标记同上操作，得胶体金标记的TPN47抗原；

将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合后，均匀地涂于玻璃纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫；

5)制备梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条：

将加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgG抗体检测线、梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体，用切条机切成条状，得梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条。

在步骤2)中，所述抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体、抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度为1～4mg/mL，羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体由抗TPN17-IgG抗体与抗TPN47-IgG抗体按体积比1∶1混合，其终浓度为1～4mg/mL；三者点样量为1μL/cm。

在步骤3)中，所述柠檬酸三钠的浓度可为2％。

在步骤4)中，所述将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合，最好胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原以体积比1∶(0.2～5)混合；所述烘干的温度可为37℃。

本发明采用梅毒特异性重组蛋白作为梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条的抗原，设定荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)(德国欧蒙公司)和梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)(日本富士株式会社)为参照，建立梅毒特异性IgM与IgG抗体胶体金免疫层析技术联合快速检测试剂，实现了特异性IgM和IgG抗体联合检测，不仅具有简便快速、特异性强、灵敏度高、准确可靠、成本低等优点，而且检测所需标本量极小，不需要特殊仪器，可肉眼直接判读结果的，对梅毒诊断和防治具有非常重要的社会和经济价值。

梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性IgM和IgG抗体的检测。

附图说明

图1为本发明梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条实施例的结构组成示意图。

图2为实验结果模式示意图。在图2中，A为使用前的示意图，B为无效试验(产品质量问题)，C为阴性结果，D为TP-IgG阳性结果，E为TP-IgM阳性结果，F为TP-IgG和TP-IgM均阳性结果；5为梅毒特异性IgG抗体检测线，6为梅毒特异性IgM抗体检测线，7为对照线。

具体实施方式

如图1所示，本发明所述梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条设有载体板1、加样垫2、胶体金垫3、硝酸纤维膜(NC膜)4、梅毒特异性IgG抗体检测线5、梅毒特异性IgM抗体检测线6、对照线7、吸收垫8。加样垫2、胶体金垫3、硝酸纤维膜(NC膜)4和吸收垫8依次粘贴在载体板1上表面，加样垫2的一端设在胶体金垫3的一端上，胶体金垫3的另一端设在硝酸纤维膜(NC膜)4的一端上，吸收垫8的一端设在硝酸纤维膜(NC膜)4的另一端上，梅毒特异性IgG抗体检测线5、梅毒特异性IgM抗体检测线6和对照线7从胶体金垫3开始依次设在硝酸纤维膜(NC膜)4上。在梅毒特异性IgG抗体检测线5上包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在梅毒特异性IgM抗体检测线6上包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在对照线7上包被羊抗梅毒抗原(TPN17和TPN47)IgG抗体。

所述载体板采用PVC板，载体板的长度为6～10cm，载体板的宽度为2～4mm，载体板的厚度为1～2mm。加样垫的材料为玻璃纤维，胶体金垫的材料是涂布胶体金结合物的玻璃纤维，所述吸收垫的长度为1～2cm，吸收垫可采用吸液纸。

实施例1

本发明所述梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，包括以下步骤：

1)制备梅毒重组抗原TPN17和TPN47：采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒重组抗原TPN17和TPN47。

2)硝酸纤维素膜的点样：在硝酸纤维素膜(NC膜)上的梅毒特异性IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在硝酸纤维素膜(NC膜)上的梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在硝酸纤维素膜(NC膜)上的对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体，室温晾干，密封室温保存备用；所述抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体、抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度为1～4mg/mL，羊抗梅毒抗原(TPN17和TPN47)IgG抗体由抗TPN17-IgG抗体与抗TPN47-IgG抗体按体积比1∶1混合，其终浓度为1～4mg/mL；三者点样量为1μL/cm。

3)制备胶体金：采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1％氯金酸1mL加入到100mL去离子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01％，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.0mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中4℃冰箱保存备用；所述柠檬酸三钠的浓度可为2％。

4)胶体金与梅毒特异性抗原TPN17、TPN47的标记：

胶体金与梅毒特异性抗原TPN17的标记：取胶体金10ml，用0.1mol/L NaOH调至pH5.4，加100μg TPN17，混匀，放置5min，加入5％BSA 1ml混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10ml，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用TBS稀释至1ml，得胶体金标记的TPN17抗原；

胶体金与梅毒特异性抗原TPN47的标记同上操作，得胶体金标记的TPN47抗原；

将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原以体积比(0～5)∶(0～5)混合后，均匀地涂于玻璃纤维膜上，在37℃烘干，制备成胶体金垫，密封备用。

5)制备梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条：

将加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜(NC膜)和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜(NC膜)的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜(NC膜)的另一端上，梅毒特异性IgG抗体检测线、梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜(NC膜)上；在梅毒特异性IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体，用切条机切成条状，得梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条。

取待检标本血清10μl，加样于免疫层析检测条加样区，同时滴加100μl生理盐水，静置20min观察结果。只在检测条对照区有一紫红色条带出现，则判为阴性；在检测区及对照区均有一紫红色条带出现，则判为阳性；加样检测后，检测区和对照区均不出现紫红色条带，为无效结果(见图2)。

实施例2

与实施例1相似，区别在于金结合物垫仅由TPN17组成，不含有TPN47。结果判断与实施例1相同。

实施例3

与实施例1相似，区别在于金结合物垫仅由TPN47组成，不含有TPN17。结果判断与实施例1相同。

实施例4

与实施例1相似，区别在于待检标本为脑脊液标本，结果判断与实施例1相同。

实施例5

性能验证试验：按实施例1的方案制备梅毒特异性IgM与IgG抗体联合快速检测试剂，然后进行性能验证。

1)外观检查：白色包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，试剂条宽度在3±0.1mm，无切斜现象。

2)阳性标本符合率：50份经FTA-ABS(德国欧蒙公司)检测确定的TP-IgM阳性参比血清，采用发明的试剂条检出TP-IgM阳性50份，阳性标本符合率100％；而50份经FTA-ABS(德国欧蒙公司)检测确定的TP-IgG阳性参比血清，采用发明的试剂条检出TP-IgG阳性49份，阳性标本符合率98％。

3)阴性标本符合率：50份梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)(日本富士株式会社)阴性参比血清，采用发明的试剂条检测未检出阳性标本，阴性标本符合率100％。

4)灵敏度检测：用卫生部室内质控血清(批号：200902001)检测，最低检出限度4NCU/mL。

5)批内差异：同一批次试剂条，用特征性阳性血清(FTA-ABS(德国欧蒙公司)检测确定的临床标本阳性TP-IgG、TP-IgM参比高、中、低血清)检测，相同滴度检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

6)批间差异：不同批次试剂条，用特征性阳性血清(FTA-ABS(德国欧蒙公司)检测确定的临床标本阳性TP-IgG、TP-IgM参比高、中、低血清)检测，相同滴度检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

7)干扰试验：检测结果不受标本溶血(n＝50)、脂血(n＝50)和黄疸(n＝50)的干扰。

8)交叉反应：采用本试剂条，进行系统性红斑狼疮(n＝30)、类风湿病(n＝38)、免疫性肝炎(n＝40)等自身免疫系统疾病的检测，未发现交叉反应。

9)稳定性检测：将试剂条放置37℃20天后检测，以上各项指标无显著变化。

Claims (8)

1.梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条，其特征在于设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgG抗体检测线、梅毒特异性IgM抗体检测线、对照线和吸收垫；加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgG抗体检测线、梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体。

2.如权利要求1所述的梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条，其特征在于所述载体板为PVC板。

3.如权利要求1所述的梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备梅毒重组抗原TPN17和TPN47：采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒重组抗原TPN17和TPN47

2)硝酸纤维素膜的点样：在硝酸纤维素膜上的梅毒特异性IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在硝酸纤维素膜上的梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在硝酸纤维素膜上的对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体，晾干；

3)制备胶体金：采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1％氯金酸1mL加入到100mL去离子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01％，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.0mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中4℃冰箱保存备用；

4)胶体金与梅毒特异性抗原TPN17、TPN47的标记：

胶体金与梅毒特异性抗原TPN17的标记：取胶体金10ml，用0.1mol/L NaOH调至pH5.4，加100μg TPN17，混匀，放置5min，加入5％BSA 1ml混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10ml，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用TBS稀释至1ml，得胶体金标记的TPN17抗原；

胶体金与梅毒特异性抗原TPN47的标记同上操作，得胶体金标记的TPN47抗原；

将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合后，均匀地涂于玻璃纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫；

5)制备梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条：

将加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgG抗体检测线、梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体，用切条机切成条状，得梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条。

4.如权利要求3所述的梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体、抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度为1～4mg/mL。

5.如权利要求3所述的梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体由抗TPN17-IgG抗体与抗TPN47-IgG抗体按体积比1∶1混合，其终浓度为1～4mg/mL；三者点样量为1μL/cm。

6.如权利要求3所述的梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述柠檬酸三钠的浓度为2％。

7.如权利要求3所述的梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合，是胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原以体积比1∶(0.2～5)混合。

8.如权利要求3所述的梅毒特异性IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述烘干的温度为37℃。

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