CN101452000A - 快速检测牛γ干扰素的试剂条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种快速检测牛γ干扰素的试纸条及其制备方法。所说的试纸条由标记好对照线和检测线的NC膜、免疫金垫、样品垫、吸水滤纸和PVC底板构成。其中所说的对照线的成分是抗鼠IgG，检测线的成分是抗牛r－IFN单克隆抗体；所说的免疫金垫是载有胶体金标记的单克隆抗体的玻璃棉。上述试纸条包括胶体金标记抗体、喷金、制作硝酸纤维素膜和组装的步骤。本发明的试纸条用于检测样本中的牛γ干扰素，从而可以用于牛结核病等疫病检测和诊断。该方法简便、快速，可以用肉眼直接观察，5－10分钟即出结果，适用于基层各级兽医部门和出入境牛结核的快速大量筛选检测。该方法所需成本低廉，经济效益显著、应用前景广泛。

Description

快速检测牛γ干扰素的试剂条及其制备方法

技术领域：

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测牛γ干扰素的试剂条及其制备方法。

背景技术：

1.胶体金快速诊断技术的原理

胶体金(Colloidal gold)，是由金离子还原而成的许多单个金颗粒组成的悬乳液，胶体金颗粒是有一个基础的晶核(原子金周围包含有11个金原子的二十面体)及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子(AuCl₂ ^—)，外层离子层H⁺则分散在胶体间溶液(见图1)。金颗粒表面所包围的阴性电荷层，叫做zata电位，可以使胶体金颗粒之间相互排斥而使悬浮液保持稳定。

胶体金颗粒可以从5～150nm不等，制备胶体金仍基于还原法，常用的有鞣酸、柠檬酸三钠、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等各种有机或无机化合物。还原剂的浓度和还原力越高，那么所合成的胶体金颗粒就越小。胶体金2～5nm是桔黄色，10～20nm是酒红色，大颗粒30～64nm是深红色。小分子的胶体金颗粒基本上是圆球形，30～80nm为偏心圆形。

胶体金标记，实质上就是蛋白质等高分子物质被吸附到胶体金颗粒表面的过程。蛋白质与金颗粒的结合机制大概有以下几个方面：带负电荷的金颗粒与蛋白质上的带正电的氨基反应；其次，蛋白质通过疏水作用吸附于金颗粒表面；配位键是通过蛋白质中半胱氨酸的硫残基与金颗粒的电子层发生配位结合。在标记后需要加入一定量的稳定剂，常用的稳定剂有牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、明胶和干酪素等封闭金颗粒未被占据的位点以减少非特异性反应并稳定悬胶溶液。

胶体金免疫快速诊断技术是在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、层析分析技术、胶体金标记技术和新材料技术基础上完善起来的一项固相标记新型免疫检测技术。胶体金快速诊断技术是以胶体金作为示踪物或显色剂，将胶体金标记在抗体上，再利用抗原抗体的血清学反应原理，把金颗粒连接到抗原上，当抗原抗体反应处达到一定密度时(即金颗粒10⁷个/mm²)，出现肉眼可见的红色斑点。胶体金标记抗体实质是抗体被吸附到胶体金颗粒表面的过程，且这种吸附属于物理吸附，对抗体的生物活性影响很小，易获得较高的标记率；另外胶体金不属于生物活性物质，干扰检测结果的因素大大减少。目前在检验中的应用主要是有2种形式：穿流形式，又称为胶体金免疫渗滤试验(Dot-immunogold filtration assay DIGFA)；另一种为侧向横流形式，又称为胶体金免疫层析试验(Gold immunochromatography assay，GICA)。胶体金免疫渗滤试验始于1985年，最初以酶作为标记物。1989年Splelberg以胶体金为标记物成功检测了艾滋病病毒(HIV)抗体，确立了免疫渗滤试验的基本技术，即主要以层析微孔膜(硝酸纤维素膜，称NC膜)为固相载体，在NC膜上固定已知的抗原或抗体，封闭包被后，将其装入免疫渗滤装置(塑料小盒)中，加待测样品，洗涤后用胶体金探针检测相应的抗原或抗体。塑料小盒一般为扁平形，里面装满吸水材料，盒分为底和盖两部分，盖的中央有一直径0.4～0.8cm孔，小孔下紧贴吸水垫料放置硝酸纤维素膜。

胶体金免疫层析技术原理与免疫渗滤技术基本一致，只是将原来的渗滤改为层析。它同样以硝酸纤维素膜为固相载体，通过毛细管作用使样品溶液在层析条上移动，并同时使样品中的待测物质与层析材料上待测物的受体发生高特异高亲和性的免疫反应。层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过直接可目测的标记物胶体金而得到直观的实验现象(如显色)，而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离的目的。

2.牛结核病的诊断

牛结核病是一种由牛分支杆菌和结核分支杆菌所引起的人畜共患的慢性消耗性传染病；也是世界动物卫生组织规定必须强制报告的疫病。据世界卫生组织(WHO)统计资料，1986-1990年41.5％的发展中国家和25％的发达国家结核病的疫情在上升。1993年，WHO宣布人的结核处于全球紧急状态。据估计，结核病每年在世界范围内造成多至300万人的死亡。研究表明在圣地亚哥的1931个结核病例中，分离的菌株中有7％被确定为牛分支杆菌；而从儿童中分离的33％的菌株是牛分支杆菌。所以WHO专家又指出：“除非扑灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的”。因此，预防和根除牛结核病是摆在兽医科技工作者面前的严峻课题。控制牛结核病不仅关系到畜牧业的持续发展，而且直接影响人类健康。要控制牛结核病的发生与流行，必须加强对该病的诊断学研究，以便为控制和最终消灭牛结核病提供技术保证。

牛结核病血清学诊断试验由于其敏感性低、特异性较差，迄今为止还未被医学和兽医学实验室用于常规诊断。细菌学方法用于诊断牛结核病很费时，且检出率低、灵敏度差，不能满足临床要求。一些牛结核特异性基因已被确认，并建立了分子生物学实验室鉴定技术，但目前远不能用于基层推广应用。由于牛结核病是一类以细胞免疫反应为主要特征的疾病，因此在该病的诊断中应以T细胞反应机制为基础。牛结核病的结核菌素诊断试验就是以细胞免疫反应为基础的一种诊断技术。自从1891年Koch首先提出以来，该技术虽然在结核病诊断中被广泛应用，但也暴露出诸如灵敏度不高、检测不快速以及影响因素多等许多问题。在国外，目前建立了一种新颖的用于诊断牛结核病的牛γ干扰素的ELISA测定技术。该方法通过全血培养、牛牛分支杆菌抗原PPD作为刺激物，利用牛γ干扰素特异性抗体建立的ELISA方法检测全血培养中释放出的γ干扰素，从而对牛结核病进行诊断。而本发明在于利用胶体金试纸条这种简便快速，适于基层的操作方法检测牛干扰素，迅速诊断牛结核病。作为一种全新的牛结核病诊断技术，国外经过近十年的研究证明检测γ干扰素试验具有以下优点。

(1)灵敏度高高灵敏的诊断技术对牛结核病的控制与消灭尤为重要。用γ-IFN试验和结核菌素试验对已知感染牛结核的牛群的比较检测表明，γ-IFN试验的敏感性为93.6％，而结核菌素试验只为65.6％。

(2)特异强澳大利亚对非结核感染区的6000头牛试验后得出γ干扰素试验的特异性为96.3％。爱尔兰初步应用该技术也表明，牛γ干扰素试验有98.5％的特异性。同样，澳大利亚研究表明，人γ干扰素试验的敏感性和特异性也分别达到90％和98％左右。

(3)快速性γ干扰素试验报告可在24h内完成，而结核菌素试验则需要72h后得出结论；而且结核菌素试验中，动物往往由于抗原没有进入体内而被延误诊断。γ干扰素试验还具有可随时重复性；而结核菌素试验在检测后60天内，牛不能再次用结核菌素试验对其进行检测。

(4)标准化由于γ干扰素试验采用的是全血培养，结果判定明确，易标准化。目前，国外已经有相应的ELISA试剂盒生产，但试纸条方法还没有。

由于用于牛结核病诊断的γ干扰素试验具有以上优点，牛γ干扰素检测的广泛临床试验已在世界上许多国家(包括澳大利亚、爱尔兰、新西兰、阿根廷、西班牙、意大利和美国)完成。在澳大利亚，γ干扰素试验已被农业委员会确认为牛结核的诊断试验，被称为自20世纪结核菌素试验问世以来诊断牛结核病的最新诊断试验方法。因此，γ干扰素试验的发展是牛结核病诊断的一个主要发展趋势。近年，本课题组对牛γ干扰素进行了一系列研究。目前我们已经成功克隆了牛γ干扰素基因，获得了牛γ干扰素基因的原核以及真核表达蛋白，利用牛γ干扰素基因重组蛋白研制出了多株稳定分泌牛γ干扰素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，并对牛γ干扰素生物学功能进行了探索研究。在此前期工作的基础上，本发明是利用研制出的多株牛γ干扰素特异性单克隆抗体，通过标记胶体金颗粒，建立牛γ干扰素快速检测试纸条，以用于牛结核病诊断，为牛结核病的快速诊断、控制以及消灭提供强有力的保证。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测牛γ干扰素的试剂条及其制备方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种快速检测牛γ干扰素的试纸条：由标记好对照线和检测线的NC膜、免疫金垫、样品垫和吸水滤纸和PVC底板构成，样品垫、免疫金垫、NC膜和吸水滤纸依次设置在PVC底板上，并且它们的接头处有叠压，使层析能顺利进行；其中所说的对照线的成分是抗鼠IgG，检测线的成分是抗牛r-IFN单克隆抗体；所说的免疫金垫是载有胶体金标记的单克隆抗体的玻璃棉。

上述的试纸条可以和塑料卡组成更便于使用的试剂条，所说的塑料卡分为底座和面盖两部分；底座上有一个放试纸条的固定槽以及与面盖嵌合的卡齿；面盖有一个加样孔和一个观察窗以及与底座嵌合的卡齿；察窗旁边分别印有字母T和C，T表示检测线，在近加样孔一侧，C表示对照线，在远加样孔一侧。

本发明的快速检测牛γ干扰素的试纸条可通过以下步骤制备：

(1)胶体金标记抗体：在胶体金上标记抗牛γ干扰素特异性单克隆抗体

(2)喷金：将胶体金标记的抗体喷到玻璃纤维上，制成胶体金垫，

(3)制作硝酸纤维素膜：将兔抗鼠IgG和抗牛r-IFN单克隆抗体分别喷到硝酸纤维素膜上，制成对照线和检测线；

(4)将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组装在PVC底板上，然后切条得试纸条。

上述方法中，所说的抗牛r-IFN单克隆抗体优选抗牛r-IFN单克隆抗体4A3。

本发明的试纸条能用于检测细胞中释放的牛γ干扰素，从而对牛结核病进行诊断。该方法简便、快速，可以用肉眼直接观察，5-10分钟即出结果，适用于基层各级兽医部门和出入境牛结核的快速大量筛选检测。该方法所需成本低廉，经济效益显著、应用前景广泛。

附图说明

图1.胶体金颗粒结构

图2.试纸条组装示意图

1-PVC底板；2-样品垫；3-免疫金垫；4-NC膜；5-吸水垫；T-检测线；C-对照线。

图3.试纸条检测结果图解

图4.试纸条特异性试验

具体实施方式实例：

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

本发明中抗牛r-IFN单克隆抗体杂交瘤细胞株4A3(李瑞芳，秦爱建，许金俊.抗奶牛γ-干扰素特异性单克隆抗体的研制及其特性，中国人兽共患病杂志，2006，22(8)：755-758)由江苏省动物预防医学重点实验室保存。

一、主要材料制备方法概述

1.1牛r-IFN单克隆抗体的制备

以原核表达牛r-IFN免疫8周龄Balb/c小鼠，应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选和建立稳定分泌高亲和力、高特异性的抗牛r-IFN单克隆抗体杂交瘤细胞株(4A3)。采用体内诱生腹水法进行单克隆抗体制备。以高亲和力和高特异性的单克隆抗体为基础，保证了检测试纸的敏感性与特异性。

1.2 兔抗鼠IgG的制备

将小鼠IgG免疫2kg左右家兔，3次皮下注射免疫后，当血清琼脂凝胶沉淀试验(AGP)效价≥1：40时采血，分离血清。然后以饱和硫酸盐盐析法和凝胶层析法提取兔抗鼠IgG。

1.3 胶体金的制备

用柠檬酸三钠还原法制备粒径为30nm的胶体金，4℃保存。

1.4 检测方法的建立

采用细胞工程技术和现代免疫学技术制备、筛选、纯化高亲和力特异的单克隆抗体，以柠檬酸三钠还原法制备优选标准的胶休金，将纯化的单抗和胶体金按比例进行标记。以高亲和力特异的单克隆抗体和胶体金技术为基础，根据双抗体夹心膜层析原理进行设计，将胶体金标记单抗吸附于实验筛选的玻璃纤维，将检测线(牛r-IFN)和对照线(兔抗鼠IgG)固化于筛选的硝酸纤维素膜，而后连同其它所需的吸水纤维、支撑材料、覆盖材料等按照设计工艺进行制作和组装，制成快速检测试纸，并进行严格的质量检验合格后，用于快速检测。

二、快速检测试纸生产工艺

2.1 生产过程

2.1.1 抗牛r-IFN单克隆抗体的制备

2.1.1.1 制备

将牛r-IFN4A3株杂交瘤细胞系置5％二氧化碳培养箱内37℃培养。Balb/c小鼠(接种细胞前10日注射灭菌液体石蜡0.5ml)腹腔内注射杂交瘤细胞10⁶-10⁷个，1周后抽取腹水，ELISA效价应≥1:10⁴。用饱和硫酸铵盐析法提纯单抗，用生理盐水2-8℃透析24-48小时，然后用GE公司的HiTrap Protein G纯化，透析后置-20℃保存。

2.1.1.2 检验

用SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测蛋白纯度应)90％，用分光光度计法检测蛋白含量应不低于5mg/ml，用间接ELISA法检测效价应)1:10⁵

2.1.2 兔抗鼠IgG的制备及检验

2.1.2.1 制备

将小鼠IgG与福氏佐剂乳化后，对2kg左右家兔进行皮下注射，当血清AGP效价≥1：40时采血，分离血清。然后用饱和硫酸盐盐析法和凝胶层析法提取兔抗IgG。

2.1.2.2 检验

用AGP法检测效价应≥1:40。

2.1.3 检测线和对照线的制备及检验

2.1.3.1 硝酸纤维素膜(NC膜)印迹(简称NC印膜)，购自Whatman公司

2.1.3.1.1 NC膜

宽度为2.5cm，孔径为5μ。

2.1.3.1.2 制备

将NC膜放Bio-Dot三维喷点平台上展平，并放上压条，分别将抗牛r-IFN单克隆抗体4A3和兔抗鼠IgG放在两个贮存池中。开机后，抗牛r-IFN单克隆抗体4A3及兔抗鼠IgG分别呈线条状喷于NC膜上形成检测线和对照线。置室温自然干燥后，用BSA-PBS 37℃温育2小时，然后用PBST洗涤三次，每次10min，待室温干燥后再冷冻抽真空。

2.1.4 胶体金标记的单克隆抗体玻璃棉的制备及检验

2.1.4.1 胶体金的制备及检验

2.1.4.1.1 制备

各取200ml去离子水置于1000ml洁净的锥形瓶中煮沸，弃去沸水，以预热系统。重新加入400ml，加入4ml1％氯金酸溶液，待煮沸后加入6ml新鲜配制的1％柠檬酸三钠，混匀，煮沸，当颜色由黄色变为黑色，再变为紫红色时，继续煮沸10min，取下搅拌冷却至室温，用K₂CO₃调pH值至适当。胶体金溶液用铝箔包裹，4℃保存。

2.1.4.1.2 检验

肉眼观察应为紫红色、无沉淀、透明状，或用电镜观测胶体金粒径应为20-30nm。

2.1.4.2 胶体金标记单克隆抗体的制备及检验

2.1.4.2.1 制备

2.1.4.2.1.1 标记蛋白浓度确定

用0.01M磷酸盐缓冲液将待标记抗牛r-IFN3A4株单抗作倍比稀释成1∶10，1∶20，1∶320，设置不加单抗作对照，每个稀释度各加1ml胶体金溶液。5min后，各加入100ul 10％ NaCl溶液，观察1小时，以颜色由红变蓝的前1管蛋白浓度为最适标记浓度，标记时增加10％蛋白用量。

2.1.4.2.1.2 单抗的胶体金标记

以标记100ml胶体金为例，在200ml体积烧杯中(经过泡酸，干烘处理过)加入100ml胶体金溶液，置于磁力搅拌器上搅拌，待其温度升为室温时，逐滴加入与之标记的单抗，搅拌30min，加入2ml 10％BSA溶液，继续搅拌30min，然后逐滴加入5ml 10％PEG-20000，搅拌30min后，置4℃静置2hr。1500rpm 4℃离心20min分钟，弃去底部未结合的杂质成分，然后10000rpm 4℃离心60min，弃去上清。用3ml 0.02M PB、250ul PEG-20000重新悬浮胶体金。贴标签，置4℃保存。

2.1.4.2.2 检验

用分光光度计法，检测胶体金标记单克隆抗体结合物在524nm波长处的OD值应>1.50。

2.1.4.3 胶体金标记的单克隆抗体玻璃棉的制备及检验

2.1.4.3.1 制备

用缓冲液(100ul 10％ NaCl溶液，200ul 10％BSA，800ul 0.01M PB)将胶体金标记抗体作1∶1倍稀释。然后用BIO-DOT三维喷点仪将标记抗体喷射在规格为1cm×30cm玻璃棉上制成胶体金抗体棉，自然干燥后，冷冻抽真空，置28℃保存。

2.1.4.3.2 检验

玻璃棉上的胶体金着色均匀为合格。

2.1.5 试纸芯制备及检验

2.1.5.1 NC印膜粘贴

将NC印膜4平贴于7.5 x 30cm PVC支持板1的中央，应注意伸展平贴，贴后不能有空隙或气泡。

2.1.5.2 试纸芯样品端的制备及检验

2.1.5.2.1 制备

2.1.5.2.1.1 胶体金抗体玻璃棉(免疫金垫)粘贴

将1 x 30cm的胶体金抗体玻璃棉(免疫金垫)3平贴于NC印膜4检测线T的下方，重叠印膜0.25cm；然后均匀平压即可。

2.1.5.2.1.2 玻璃棉(样品垫)粘贴

将2.8×30cm的空白玻璃棉2，平贴于胶体金抗体玻璃棉3的下方，重叠胶体金抗体玻璃棉0.3cm，然后均匀平压即可。

2.1.5.2.2 检验

粘贴后的试纸芯样品端应为边沿整齐、平展、无空隙。

2.1.5.3 试纸芯吸水端的制各及检验

2.1.5.3.1 制备

吸水滤纸5的粘贴：将3.25 x 30cm吸水滤纸5平放于NC印膜4对照线C的一端，重叠NC印膜0.25cm，平放后均匀平压即可。

2.1.5.3.2 检验粘贴后试纸芯手柄端应为边沿整齐、平展、无空隙。

2.1.6 切割

将标记好C、T线的NC膜4、制备好的免疫金垫3、样品垫2和吸水滤纸5先后粘贴在PVC底板1上(见图2)，调整NC膜的粘贴位置及相互间重叠长度，然后启动CM4000型BIO-DOT切割机，选择设定试纸芯宽度及切割速度，进行切割。切条机切割成3～5mm宽的试纸条。

2.1.7 试纸装配

试纸由塑料卡和试纸芯组成，塑料卡分为底座和面盖两部分。底座上有一个放试纸芯的固定槽以及与面盖嵌合的卡齿。面盖有一个加样孔和一个观察窗以及与底座嵌合的卡齿。察窗旁边分别印有字母T和C，T表示检测线，在近加样孔一侧，C表示对照线，在远加样孔一侧。

将试纸芯固定在底座固定槽中，再将底座和面盖嵌合在一起即成试纸盒。注意加样孔与试纸芯的样品垫相对应，观察窗与试纸芯的包被膜相对应，其旁边印有的T和C分别与包被膜上的检测线和对照线相对应。

2.1.8 试纸检测

2.1.8.1 阳性检测液的处理

采集已知感染牛结核病的牛的全血5-10mL，全血混匀后分散至消毒的培养板中培养，并加入分支杆菌抗原刺激物，血样和抗原混匀。培养一定时间后收集上清，4℃ 1000rpm离心8min，取上清分装于1.5mL的指形管，-20℃保存备用。或取重组杆状病毒表达的牛r-IFN基因产物作为对照，分装于1.5mL的指形管，4℃保存备用。

2.1.8.2 阴性检测液的处理

采集已知未感染牛的全血5-10mL，全血混匀后无菌分散至消毒的培养板中培养，并加入分支杆菌抗原刺激物，血样和抗原混匀。培养一定时间后收集上清，4℃1000rpm离心8min，取上清分装于1.5mL的指形管，-20℃保存备用。

2.1.8.2 待检检测液的处理

采集待检牛的全血5-10mL，全血混匀后等分无菌分散至消毒的培养板中培养，并分别加入分支杆菌抗原刺激物和对照抗原，血样和抗原混匀。培养一定时间后收集上清，4℃1000rpm离心8min，取上清即为待检样品。

2.1.8.3 试纸条检测结果判定

用移液器吸取60μL待检样品直接滴加到试纸条的样品垫上，可见样品通过层析作用向前移行，在移行过程中NC膜上会出现肉眼可见的红色条带，于加样后3～10min观察结果，目测结果的阴性和阳性(如图3)。

若C、T线同时出现，说明样品中含有待检抗原，判定为阳性；若C线出现而T线未出现，说明样品中不含待检抗原，判定为阴性；若C、T线均未出现或T线出现C线未出现，检测无效，说明试纸条出现质量问题或操作不当，应重新检测或更换试纸条。

2.1.8.4 试纸条特异性检测

用试纸条分别对PPD刺激的牛结核阳性牛全血细胞培养物、PPD刺激的猪全血细胞培养物、PPD刺激的羊全血细胞培养物、PPD刺激的犬全血细胞培养物检测，并同时以PBS和PPD刺激的牛结核阴性的牛全血细胞培养物检测作对照。结果PPD刺激的牛结核阳性的牛全血细胞培养物检测牛r-IFN阳性，检测液试纸的检测线(T线)对照线(C线)同时出现，而其他样品检测试纸T线无条带。

2.1.9 半成品检验

2.1.9.1 物理性状

试纸外观呈长方形，外层为环保性质的塑料外壳，中间为试纸芯。外壳面盖上有一个加样孔和一个观察窗，观察窗两端分别印有字母T和C>T在近加样孔一侧，C在远加样孔一侧。试纸芯宽度均匀一致，材料粘贴规范，附着牢固，NC印膜无损伤。

2.1.9.2 检测线和对照线检验

用移液器吸取60μL待检样品直接滴加到试纸条的样品垫上，可见样品通过层析作用向前移行，在移行过程中NC膜上会出现肉眼可见的红色条带，于加样后3～10min肉限观察其测试结果，5-10分钟检测线(T线)和对照线(C线)两条线一并出现，为阳性；用PBS检测，只有C线出现条带，T线无条带，判为阴性。且显色均匀一致、线形规则。若C、T线均未出现或T线出现C线未出现，检测无效，说明试纸条出现质量问题或操作不当，应重新检测或更换试纸条。

2.1.9.3 试纸条质量鉴定

用试纸分别对牛r-IFN阳性检测液、牛r-IFN阴性检测液进行检测，其中检测牛r-IFN阳性检测液试纸的检测线(T线)对照线(C线)同时出现，判定为阳性；而其他样品检测试纸T线无条带，判定为阴性；若C、T线均未出现或T线出现C线未出现，检测无效，说明试纸条出现质量问题或操作不当，应重新检测或更换试纸条。

Claims (4)

1、一种快速检测牛γ干扰素的试纸条，其特征在于：由标记好对照线和检测线的NC膜、免疫金垫、样品垫和吸水滤纸和PVC底板构成，样品垫、免疫金垫、NC膜和吸水滤纸依次设置在PVC底板上，并且它们的接头处有叠压，使层析能顺利进行；其中所说的对照线的成分是抗鼠IgG，检测线的成分是抗牛r-IFN单克隆抗体；所说的免疫金垫是载有胶体金标记的单克隆抗体的玻璃棉。

2、根据权利要求1所述的快速检测牛γ干扰素的试纸条，其特征在于：所说的抗牛r-IFN单克隆抗体是抗牛r-IFN单克隆抗体4A3。

3、一种快速检测牛γ干扰素的试剂条，其特征在于，由权利要求1所述的试纸条和塑料卡组成，所说的塑料卡分为底座和面盖两部分；底座上有一个放试纸条的固定槽以及与面盖嵌合的卡齿；面盖有一个加样孔和一个观察窗以及与底座嵌合的卡齿；察窗旁边分别印有字母T和C，T表示检测线，在近加样孔一侧，C表示对照线，在远加样孔一侧。

4、一种制备权利要求1所说的快速检测牛γ干扰素的试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)胶体金标记抗体：在胶体金上标记抗牛γ干扰素特异性单克隆抗体；

2)喷金：将胶体金标记的抗体喷到玻璃纤维上，制成胶体金垫；

3)制作硝酸纤维素膜：将抗鼠IgG和抗牛r-IFN单克隆抗体分别喷到硝酸纤维素膜上，制成对照线和检测线；

4)将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组装在PVC底板上，然后切条得试纸条。

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