CN102246040A - 用于诊断结核病的方法和装置 - Google Patents

Abstract

描述了用于诊断受试者中结核病(TB)的快速的方法。使用抗体检测来自于受试者的未受刺激的样品中特异性生物标志诸如细胞因子或趋化因子特别是IFN-γ或IP-10的存在。使用指示剂指示抗体与生物标志的结合，指示患者患有活动性肺外的结核病。所述方法可以使用含有抗体和指示剂的测试条并向该测试条放置样品来实施，使用ELISA测定，或使用流式细胞术，生物分析仪，波导生物传感器或表面增强拉曼光谱学来实施。根据所用测试装置的类型，结果可在几分钟至几小时获得。所述方法可检测肺外的结核病并且可区分活动性和潜伏性结核病。还描述了包含抗体和色谱指示剂和使用说明书的试剂盒。

Description

用于诊断结核病的方法和装置

发明背景

本发明涉及用于活动性结核病(TB)的诊断的方法。 

结核病(tuberculosis)是世界上生育年龄妇女最大的传染性杀手和患有HIV/AIDS的人中主要的死亡原因。它由分枝杆菌(mycobacteria)、在人中通常是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)导致，据信世界人口的三分之一被结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染。人中大部分感染导致无症状、潜伏感染(LTBI)，但是有些潜伏感染最终进展为活动性疾病，其如果不治疗，杀死超过一半的其受害者。 

当疾病变为活动性的，75-85％的病例是肺TB。在其余15-25％的活动性病例中，感染从肺中移动，导致肺外的结核病(EPTB)。肺外的感染位点包括胸膜(在结核性胸膜炎中)，中枢神经系统和蛛网膜下腔(在脑膜炎中)，淋巴系统外周淋巴结，生殖泌尿系统(在泌尿生殖器结核中)，心包腔，腹腔，和骨和关节(在波特病(Pott′s disease)中)。活动性TB在非洲和亚洲特别常见，在受影响的社区导致重大死亡率、发病率和经济衰退。 

诊断结核感染的常用方法是结核菌素皮肤试验(Tuberculin Skin Test(TST))，其是应答结核抗原(PPD)刺激的细胞介导的免疫的复合测量。然而，其需要2至3天后才能获得结果并经常给出假阳性或假阴性结果。这种试验也不能从活动性疾病中区分潜伏感染，这在临床环境中是重要的。 

最近，已经开发并商业化了两种检测应答分枝杆菌-特异性蛋白的干扰素γ(IFN-γ)释放的测定法：QuantiFERON-TB Gold In-tube(ELISA测定法)和T-SPOT.TB，(ELISPOT测定法)。这些干扰素-γ释放测定法(IGRAs)是基于这样的能力，即结核分枝杆菌抗原早期分泌抗原靶标6(early secretory antigen target 6(ESAT-6))和培养滤过蛋白10(culture filtrate protein 10(CFP-10))刺激宿主淋巴细胞产生干扰素-γ的能力。来自于患者血液的淋巴细胞与抗原一起培养并温育16至24小时。如果患者以前已经暴露于结核病，T淋巴细胞应答产生干扰素γ。两种测试都是血液测试，尽管一种使 用全血而另一种使用外周血单核细胞。测试之间的区别是QuantiFERON-TB Gold定量当全血暴露于抗原时上清液中干扰素γ的总量，而T-SPOT.TB通过计数ELISPOT孔内点的数目来计数产生干扰素γ的活化的T淋巴细胞的数目。测试是费时的(从样品收集到获得结果它们需要大约2天)并且是劳动密集的，需要使用实验室和复杂仪器。此外，它们不从潜伏结核病中区分活动性结核病。需要临床评价和另外的测试，诸如培养来自于怀疑受感染区的血液或流体，用来从潜伏TB感染中区分活动性结核病。 

肺外的TB难以诊断。培养仅在少量病例中有帮助。由于通常仅有少数细菌存在于样品中，在实验室培养这种生长缓慢的生物需要相当长的时间(大约4至6周)，并且并不总是成功的。这样长度的延迟是不可接受的，因为到患者被诊断为活动性TB时，他们可能已经死亡或遭受严重残疾，诸如在TB脑膜炎病例中的脑损伤。 

因此开发用于活动性结核病的快速且廉价的诊断测试将非常有价值，特别是在发展中国家中。 

发明概述

根据本发明的第一实施方案，提供诊断受试者中结核病的方法，所述方法包括步骤： 

(i)提供来自于所述受试者的流体样品； 

(ii)在不用抗原刺激流体样品的情况下，使所述流体样品与结核病的生物标志的抗体接触；和 

(iii)检测所述抗体是否结合来自于所述样品的生物标志。 

所述抗体与生物标志的结合可以指示所述受试者患有结核病，和更特别地，活动性结核病。 

所述结核病可以是肺外的结核病。 

所述生物标志可以是细胞因子，诸如IFN-γ，或趋化因子，诸如IP-10。 

所述抗体可以是抗-IFN-γ抗体或抗-IP-10抗体，或其组合，由此用来检测IFN-γ和/或IP-10是否存在于所述样品中。 

能够结合所述抗-生物标志抗体或结合所述生物标志的捕获抗体也可 以用于所述方法中。 

所述抗体或捕获抗体可以是单克隆抗体。 

所述抗体可以与颗粒诸如胶体金复合(complexed)。 

可以使用指示剂(indicator)来指示所述抗体与所述生物标志的结合。所述指示剂可以是色谱的、荧光的、光学的、酶联的或放射性标记的指示剂。 

所述方法可以是及时现场护理(point-of-care)免疫测定法，并且例如所述抗体和指示剂可以设置于测试条测定上，所述样品可放置到所述测试条测定上。备选地，或者除了所述条-测试(strip-test)测定之外，所述方法可以在实验室中使用ELISA测定、流式细胞术、生物分析仪、波导生物传感器或SERS实施。 

典型地，所述方法可以在大约5小时内，更优选地在大约3小时内和甚至更优选地在大约10分钟内实施。 

根据本发明的第二实施方案，提供用于在来自于受试者的未受刺激的流体样品中诊断结核病的测试装置(test device)，所述测试装置包括： 

(i)能够结合结核病生物标志的抗体；和 

(ii)当所述抗体结合所述生物标志时进行指示的指示剂。 

所述测试装置可以是条-测试装置，来自于所述受试者的所述流体样品被放置到所述条-测试装置上，或者可以是ELISA测定板，所述ELISA测定板具有其中可放置来自于单个受试者的流体样品的孔。备选地，所述测试装置可被配置用于流式细胞仪、生物分析仪、波导生物传感器或SERS分光计中。 

根据本发明的第三实施方案，提供用于在来自于受试者的未受刺激的样品中诊断结核病的试剂盒，所述试剂盒包含： 

(i)能够结合结核病标志的抗体；和 

(ii)当所述抗体已经结合所述生物标志时进行指示的指示剂。 

所述试剂盒还可以包含用于实施上文描述的方法的说明书。所述试剂盒还可以包含捕获抗体。 

附图简述

图1显示74个患有胸膜TB的患者相对于非-TB对照的IP-10水平的 散点图(左组)和ROC下面积(右组)。在4035pg/ml的切割点(cut-point)(左手组中的实线)，灵敏度是100％并且NPV是100％。ROC曲线下面积是0.82。 

图2显示使用来自于74个有TB和非-TB渗出液的连续募集的患者的胸膜液的未受刺激的IFN-γ的散点图(左组)和ROC下面积(右组)。在0.31IU/l的切割点，未受刺激的IFN-γ的灵敏度、特异性、PPV和NPV(95％CI)分别是97％(85-99)；100％(81-100)；100％(90-100)和94％(73-99)。精确度是98％(90-100)和ROC下面积是0.99。 

图3从140TB脑膜炎疑似患者获得的脑脊液中未受刺激的IFN-γ水平。这些数据显示未受刺激的干扰素-γ作为脑脊液中TB诊断标志的优异表现结果。 

图4显示使用染色微球的侧向流测试技术(lateral flow test technology)的原理，该微球沿着条迁移，如果目的生物标志存在，结合检测线，其改变颜色(抗体1＝与A和B组中左手侧上的微球结合的抗体；抗体2＝A、B和C组中自左边的第二列抗体中的抗体和D组中结合抗原的抗体；抗体3是A至D组中最后一列的抗体(最右边)。 

图5显示可在本发明中使用的条测试仪器(strip test apparatus)的实例。 

发明详述

本发明提供用于在来自于受试者的未受刺激的流体样品中诊断结核病(TB)的快速方法。不像其它商业上可获得的方法，本发明的方法能够区分活动性和潜伏性结核病，这对于确定受试者的治疗是重要的。所述方法还可检测肺外的结核病。非常重要地，不像其它需要温育样品超过12小时的测试，所述方法还在大约数分钟内提供结果。 

活动性结核病是这样的疾病状态，即其中在具有活动性疾病的临床和放射学特征的受试者中，生物学流体或组织关于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的显微镜涂片或培养阳性，或通过核酸扩增测试可检测结核分枝杆菌；常常存在全身症状。潜伏性结核感染是其中可能活的结核分枝杆菌存在于人组织中但个体无症状，并且没有活动性疾病的临床-放射学特征。 

如前文所提及，可获得的用于检测结核病的测试具有差的灵敏度并且是费时和劳动密集的。在临床环境中快速、精确诊断疾病是重要的。还有利地是拥有能够容易地使用和在及时现场护理(诸如在诊室、医院病房或家中)使用的诊断方法。 

本发明在来自于患者的未受刺激的样品(即该样品未用抗原刺激(或处理))中利用抗体检测特异性生物标志，诸如细胞因子或趋化因子，特别是干扰素-γ或IP-10的存在。一般而言，在抗体与生物标志结合时色谱的指示剂将改变颜色，指示患者患有活动性肺外的结核病。然而，目的生物标志也可以通过其它光学的、分子生物学的、微流体的或纳米技术等(例如SERS(surface enhanced Raman spectroscopy，表面增强拉曼光谱学))或波导生物传感器(诸如槽式波导生物传感器(slot-waveguide biosensor)来检测。 

生物标志在生物流体本身中检测，在其它方法中必需的过夜抗原刺激是不需要的。

样品可以是来自于胸膜腔、心包腔、腹腔或蛛网膜下腔的流体，或来自于血液样品的血浆或血清、唾液或尿。更特别地，样品可以是来自于胸腔积液(pleural effusion)的流体。不像商业上可获得的测试，样品优选地不是血液样品。 

样品可应用于条上，所述的条与妊娠测试和其它尿液分析测试中常用的类型相似，所述的条包含生物标志抗体和用于检测干扰素-γ和/或IP-10与该抗体的结合的色谱指示剂。 

所述的条可包含针对IFN-γ或IP-10的抗体或针对干扰素-γ和IP-10两者的抗体。包含这些生物标志两者将使得测试更不可能返回假阳性或假阴性结果，因为干扰素-γ是良好的列入(rule-in)标志并且IP-10是良好的排除(rule-out)标志。 

这些条-测试的结果可在应用样品至所述条的数分钟(诸如2-3分钟)内获得。 

备选地或另外，可以使用免疫测定(例如ELISA)、流式细胞术或生物分析仪。也可以提供包含至少抗体、色谱指示剂和使用说明书的试剂盒。 

尽管这种测试条将足够用于一些类型的肺外的TB，例如胸膜TB，在一些难以诊断类型的结核病诸如TB脑膜炎中，上文描述的条测试可与免 疫测定诸如ELISA测定联合以保证作出精确的诊断。 

商业上可获得的IFN-γELISA测定板可与适宜抗体和适当指示方式一起获得。所述板具有96个孔，一次能够测试24个样品。因为每个板费用在～US＄300和500之间，在发展中国家环境中使用板一次仅测试一个样品是非常昂贵的，因此并不是特别适合于本发明。 

对于本发明，将提供用于进行单个样品测定的IFN-γELISA测定板。例如，测定板可以仅有8个孔(4个标准，1个阳性对照，1个阴性对照，2个样品孔)。这种测定的结果可在2至3小时内获得。 

申请人评价了数种用于诊断TB胸腔积液的新工具和生物标志，包括T细胞测定、LAM抗原检测、PCR、IP-10、IFN-γ、ADA、显微镜涂片、培养和胸膜活检。病例-对照原则研究的初步证据已经表明T细胞测定可能是有帮助的。然而，当在临床环境中评价时，它们表现差。IP-10是有前途的但仍然在5个TB受试者中漏掉1个并且在5个中过度诊断(over-diagnosed)1个，相比之下在更高切割点IP-10具有100％阴性预测值(表明对于TB胸腔积液它是优异的排除测试(图1))。然而，最精确的鉴别物(discriminator)是未受刺激的IFN-γ，其具有接近100％的灵敏度和特异性(图2)。因此IFN-γ是非常精确的用于TB胸腔积液的标志。 

本发明通过下述实施例进一步描述。然而，这种实施例不应解释为以任何方式限制本发明的精神或范围。 

实施例

图3显示从140个TB脑膜炎疑似患者中获得的脑脊液中未受刺激的IFN-γ水平。数据显示当与其它容易且快速可得的测试结果(例如革兰氏染色和隐球菌的乳胶凝聚试验)联合时，未受刺激的IFN-γ具有接近95％的灵敏度和特异性。 

图4提供了适当测试如何工作的总结概要。提供具有硝化纤维素膜载体(nitrocellulase membrane carrier)的条测试(图5)，所述载体带有与抗-IFN-γ抗体和可能也与抗-IP-10抗体复合的胶体金缀合物溶液(色谱指示剂)，和捕获抗体带，其被封闭于塑料盒中。 

将少量来自于患者的样品，例如从特定身体区室诸如胸膜腔抽吸的流 体放置到测试条上。 

如果IFN-γ细胞因子(还有可能的IP-10生物标志/趋化因子)存在于来自患者的未受刺激的样品中，它们将在硝化纤维素膜上分别结合抗-IFN-γ和抗-IP-10抗体，并且这些复合物将向捕获抗体的带迁移。对于其它生物标志这将相似地工作。一旦结合，色谱指示剂将改变颜色，表示对于结核病的阳性测试。 

因此，申请人已经开发了用于诊断结核病的方法，其能够比目前诊断方法显著更快地提供结果。所述方法也是有成本效益的并且能够区分潜伏性和活动性结核病。此外，它是及时现场护理测试，并且它不必由具有专门技术的人实施或在实验室中实施。 

Claims (47)

1.诊断受试者中结核病的方法，所述方法包括步骤：

(i)在不用抗原刺激来自于所述受试者的流体样品的情况下，使所述流体样品与结核病的生物标志的抗体接触；和

(ii)检测所述抗体是否结合来自于所述样品的生物标志。

2.根据权利要求1的方法，其中所述抗体与生物标志的结合指示所述受试者患有结核病。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述结核病是肺外的结核病。

4.根据权利要求1至3中任意一项的方法，其中所述结核病是活动性结核病。

5.根据权利要求1至4中任意一项的方法，其中所述生物标志是细胞因子。

6.根据权利要求5的方法，其中所述细胞因子是IFN-γ。

7.根据权利要求6的方法，其中所述抗体是抗-IFN-γ抗体。

8.根据权利要求1至4中任意一项的方法，其中所述生物标志是趋化因子。

9.根据权利要求8的方法，其中所述趋化因子是IP-10。

10.根据权利要求9的方法，其中所述抗体是抗-IP-10抗体。

11.根据权利要求1至10中任意一项的方法，其中所述方法检测IFN-γ和IP-10是否存在于所述样品中。

12.根据权利要求11的方法，其中使用抗-IFN-γ抗体和抗-IP-10抗体。

13.根据权利要求1至12中任意一项的方法，其还包括使用能够结合所述生物标志或结合所述抗-生物标志抗体的捕获抗体。

14.根据权利要求1至13中任意一项的方法，其中所述抗体或捕获抗体是单克隆抗体。

15.根据权利要求1至14中任意一项的方法，其中使用指示剂来指示所述抗体与所述生物标志的结合。

16.根据权利要求15的方法，其中所述指示剂是色谱的、光学的、荧光的或放射性标记的指示剂。

17.根据权利要求15或16的方法，其中所述指示剂是胶体金指示剂，并且所述抗体结合金颗粒。

18.根据权利要求1至17中任意一项的方法，其中所述方法是及时现场护理方法。

19.根据权利要求1至18中任意一项的方法，其中所述抗体与所述生物标志的结合在5小时内进行检测。

20.根据权利要求1至19中任意一项的方法，其中所述抗体与所述生物标志的结合在3小时内进行检测。

21.根据权利要求1至20中任意一项的方法，其中所述抗体与所述生物标志的结合在10分钟内进行检测。

22.根据权利要求15至21中任意一项的方法，其中所述抗体和指示剂设置于测试条测定上，所述样品放置到所述测试条测定上。

23.根据权利要求15至21中任意一项的方法，其中所述抗体和指示剂设置于ELISA测定板中。

24.根据权利要求1至21中任意一项的方法，其中所述方法使用流式细胞仪、生物分析仪、波导生物传感器或表面增强拉曼光谱学实施。

25.用于在来自于受试者的未受刺激的流体样品中诊断结核病的测试装置，所述测试装置包括：

(i)能够结合结核病生物标志的抗体；和

(ii)当所述抗体结合所述生物标志时进行指示的指示剂。

26.根据权利要求25的测试装置，其能够检测受试者中活动性结核病。

27.根据权利要求25或26的测试装置，其能够检测受试者中肺外的结核病。

28.根据权利要求25至27中任意一项的测试装置，其中所述抗体是抗-IFN-γ抗体。

29.根据权利要求25至27中任意一项的测试装置，其中所述抗体是抗-IP-10抗体。

30.根据权利要求25至29中任意一项的测试装置，其包含抗-IFN-γ抗体和抗-IP-10抗体。

31.根据权利要求25至30中任意一项的测试装置，其还包含捕获抗体。

32.根据权利要求31的测试装置，其中所述捕获抗体能够结合所述生物标志或所述生物标志抗体。

33.根据权利要求25至32中任意一项的测试装置，其中所述生物标志抗体和/或捕获抗体是单克隆抗体。

34.根据权利要求25至33中任意一项的测试装置，其中所述指示剂是色谱的、光学的、荧光的或放射性标记的指示剂。

35.根据权利要求25至34中任意一项的测试装置，其中所述指示剂是胶体金指示剂，并且所述抗体结合金颗粒。

36.根据权利要求25至35中任意一项的测试装置，其是及时现场护理装置。

37.根据权利要求25至36中任意一项的测试装置，其是条-测试装置，来自于所述受试者的所述流体样品被放置到所述条-测试装置上。

38.根据权利要求25至36中任意一项的测试装置，其是ELISA测定板，所述ELISA测定板具有用于测试来自于单个受试者的流体样品的孔。

39.根据权利要求25至35中任意一项的测试装置，其被配置用于流式细胞仪、生物分析仪、波导生物传感器或表面增强拉曼光谱学中。

40.用于在来自于受试者的未受刺激的样品中诊断结核病的试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)能够结合结核病标志的抗体；和

(ii)当所述抗体已经结合所述生物标志时进行指示的指示剂。

41.根据权利要求40的试剂盒，其还包含用于实施权利要求1至24中任意一项的方法的说明书。

42.根据权利要求40或41的试剂盒，其用于诊断肺外的结核病。

43.根据权利要求40至42中任意一项的试剂盒，其用于诊断活动性结核病。

44.根据权利要求40至43中任意一项的试剂盒，其中所述抗体是抗-IFN-γ抗体。

45.根据权利要求40至43中任意一项的试剂盒，其中所述抗体是抗-IP-10抗体。

46.根据权利要求40至45中任意一项的试剂盒，其包含抗IFN-γ和IP-10两者的抗体。

47.根据权利要求40至46中任意一项的试剂盒，其还包含捕获抗体。

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