CN108504736A - 检测orm1基因表达量的系统在诊断结核病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测ORM1基因表达量的系统在诊断结核病中的应用。本发明发现ORM1基因表达量在结核病患者与健康人中有显著差异，受试者工作特征曲线分析结果表明，利用ORM1基因表达量区分结核病患者与健康人有较高的灵敏度和特异性，说明，可通过检测待测对象ORM1基因表达量来诊断结核病。

Description

检测ORM1基因表达量的系统在诊断结核病中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，检测ORM1基因表达量的系统在诊断结核病中的应用。
背景技术
结核病是严重威胁人类健康的世界性传染病，据世界卫生组织(WHO)估计，2016年新增结核病患者1040万人，死亡人数达167万人，是致死性排行第一的感染性疾病。
造成结核病流行现状有多方面的原因，其中重要缺乏特异、有效的活动性结核病诊断技术是至关重要的。不能早期诊断，一方面导致延误病情，增加治疗费用和死亡率；另一方面不能有效控制传染源，造成结核病的扩散。因此研制特异有效的活动性结核病诊断试剂对结核病防治具有重要意义。
目前结核病诊断主要有影像学诊断、结核菌诊断和免疫学诊断等方法。影像学诊断难以区分肺结核病和其他肺部疾病；结核菌诊断假阴性高；免疫学诊断主要分抗体检测和细胞免疫检测，血清学检测特异性低，PPD皮试是目前最常用的结核菌感染的细胞免疫检查方法，无法区分BCG接种和结核菌感染，IGRA是目前最好的细胞免疫学检测，但是无法有效区分活动性结核病和潜伏感染。
血清类粘蛋白ORM1(orosomucoid 1)又称α酸性糖蛋白1，主要由肝细胞分泌表达，还由内皮细胞和肿瘤细胞合成，可作为肿瘤诊断和疗效评估的标志，但是目前没有ORM1作为结核病诊断标志的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何诊断结核病。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测ORM1基因表达量的系统的下述A1)或A2)的应用：
A1)在制备诊断或辅助诊断结核病产品中的应用；
A2)在诊断或辅助诊断结核病中的应用。
所述检测ORM1基因表达量的系统可为利用定量PCR检测ORM1基因表达量的系统。
所述利用定量PCR检测ORM1基因表达量的系统可包括能特异扩增ORM1基因的引物对。
所述引物对可由名称分别为ORM1-F和ORM1-R的单链DNA组成；
所述ORM1-F为(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述ORM1-R为(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
所述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加可为不超过十个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。
所述引物对中，所述ORM1-F和所述ORM1-R可独立包装，所述ORM1-F和所述ORM1-R的摩尔比可为1:1。
所述利用定量PCR检测ORM1基因表达量的系统还可包括数据处理装置，所述数据处理装置根据所述待测对象的ORM1基因表达量确定所述待测对象是否为结核病患者。
所述待测对象的ORM1基因表达量越高，患结核病的风险越高或候选越高。
具体的，诊断结核病患者的方法可包括：如果检测对象的ORM1基因表达量大于0.00139326，所述检测对象为或候选为结核病患者，如果所述检测对象的ORM1基因表达量小于或等于0.00139326，所述检测对象为或候选为非结核病患者。
所述利用定量PCR检测ORM1基因表达量的系统可仅由所述引物对组成，还可由所述引物对与所述数据处理装置组成。
所述利用定量PCR检测ORM1基因表达量的系统可为试剂盒。
所述ORM1基因表达量可为血液中ORM1基因的表达量。
进一步，所述ORM1基因表达量为血液中单个核细胞中ORM1基因的表达量。
本发明还提供了以ORM1基因作为结核病标志物的诊断或辅助诊断结核病的系统在制备诊断或辅助诊断结核病产品中的应用。
所述筛查或辅助诊断结核病的系统为所述检测ORM1基因表达量的系统。
本发明还提供了诊断或辅助诊断结核病产品，所述产品为所述检测ORM1基因表达量的系统。
本发明中，所述ORM1基因表达量可为所述ORM1基因的相对表达量。所述相对表达量可为所述ORM1基因相对于内参基因的表达量。所述内参基因可为GAPDH基因。
所述结核病可为活动性肺结核。
本发明发现ORM1基因表达量在结核病患者与健康人中有显著差异，受试者工作特征曲线分析结果表明，利用ORM1基因表达量区分结核病患者与健康人有较高的灵敏度和特异性，说明，可通过检测待测对象ORM1基因表达量来诊断结核病。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR检测结核病组(结核病患者)和健康对照组(正常对照)ORM1的表达水平。
图2为ROC曲线分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)反映了灵敏度与特异度间的平衡，ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标，ROC曲线下面积越大，试验的诊断价值越大。
灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％。
特异性(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异性越大越好，理想特异度为100％。
实施例1、ORM1基因的表达量可以用来区分结核病患者与健康人
一、研究对象
结核病组：16个活动性肺结核患者，该组的入选标准为痰涂片抗酸染色阳性，无糖尿病、肿瘤和免疫相关疾病，不使用免疫抑制剂。
健康对照组：16个性别年龄与结核病组相当的健康人，该组的入选标准为没有发热、咳嗽等症状，胸片无活动性病灶。
二、ORM1在外周血中表达量的检测
1、采集结核病组和健康对照组各对象的外周血。
2、分离外周血单个核细胞(PBMCs)：将采集的外周血2ml，先用基础培养基1640培养基进行稀释，然后使用Ficoll(GE Biosciences,USA)进行密度梯度离心，收集中间单个核细胞层的细胞，然后用1640培养基洗两遍后，再用无血清培养基AIMⅤ重悬细胞得到细胞悬液，将细胞悬液滴入96孔细胞培养板，加入结核分枝杆菌H37Rv裂解液、共刺激因子CD28和CD49，37℃、5％CO2培养箱培养过夜。
3、RNA提取与逆转录：步骤2结束后，利用TRIzolTM Reagent(Invitrogen，USA)提取各样本RNA，用20μl无核酶水溶解RNA后作为模板逆转录得到cDNA。
4、实时荧光定量PCR：以步骤3得到的各样本的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测ORM1基因的表达量，所用试剂盒为Kapa Biosystems公司的KAPATM 快速定量PCR试剂盒，所用内参为GAPDH基因，所用ORM1基因与GAPDH基因的引物如表1所示。
表1、引物序列
实时荧光定量PCR反应体系：2×Green Master Mix 10μl，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，cDNA 0.2μl，用无核酶水补足20μl。该反应体系中正向引物与反向引物的浓度均为200nM，反应体系中cDNA的含量为10ng。
然后使用罗氏公司的480Ⅱ荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR检测。反应条件：预变性：95℃3分钟；扩增反应：95℃5秒，60℃30秒，在延伸阶段检测荧光信号，40个循环。使用2-ΔCt计算相对表达量。
5、统计分析：组间差别使用GraphPad Prism 5用t-test分析，使用SPSSStatistics 17.0进行ROC曲线分析。
二、结果分析
实时荧光定量PCR结果显示，ORM1基因的表达量在结核病组显著升高，结核病组中ORM1基因的相对表达量显著高于健康对照组(图1)。
ORM1基因用于诊断活动性肺结核患者具有较高的准确性。根据结核病组和健康对照组PBMCs中ORM1基因的相对表达量，使用SPSS 17.0进行受试者工作特征曲线分析。结果如图2所示，ROC曲线下面积为0.939，p<0.0001，说明根据ORM1基因的表达量诊断活动性肺结核患者具有较高的准确性。当ORM1基因的转录水平cut-off值取0.00139326时，约登指数(Youden’s index,YI)最大，此时灵敏度为93.8％，特异性为87.5％。
具体的，根据上述结果，得到诊断活动性肺结核患者的方法如下：如果检测对象的PBMCs中ORM1基因的相对表达量大于0.00139326，该检测对象疑似为活动性肺结核患者，如果检测对象的PBMCs中ORM1基因的相对表达量小于或等于0.00139326，该检测对象为非活动性肺结核患者。
<110> 中国人民解放军第三0九医院
<120> 检测ORM1基因表达量的系统在诊断结核病中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
aataagtcgg ttcaggagat 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
aggtaggtgg tgttatagat g 21

Claims (10)

1.检测ORM1基因表达量的系统的下述A1)或A2)的应用：
A1)在制备诊断或辅助诊断结核病产品中的应用；
A2)在诊断或辅助诊断结核病中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测ORM1基因表达量的系统为利用定量PCR检测ORM1基因表达量的系统。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述利用定量PCR检测ORM1基因表达量的系统包括能特异扩增ORM1基因的引物对。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述引物对由名称分别为ORM1-F和ORM1-R的单链DNA组成；
所述ORM1-F为(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述ORM1-R为(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述利用定量PCR检测ORM1基因表达量的系统还包括数据处理装置，所述数据处理装置根据所述待测对象的ORM1基因表达量确定所述待测对象是否为结核病患者。
6.根据权利要求1-5中任一所述应用，其特征在于：所述ORM1基因表达量为血液中ORM1基因的表达量。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述ORM1基因表达量为血液中单个核细胞中ORM1基因的表达量。
8.以ORM1基因作为结核病标志物的诊断或辅助诊断结核病的系统在制备诊断或辅助诊断结核病产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述筛查或辅助诊断结核病的系统为权利要求1-5中任一所述检测ORM1基因表达量的系统。
10.诊断或辅助诊断结核病产品，为权利要求1-5中任一所述检测ORM1基因表达量的系统。
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