CN112143795A - Clec2b基因做为结核病鉴别诊断的应用 - Google Patents

Clec2b基因做为结核病鉴别诊断的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种分子标记物CLEC2B在诊断结核病中的应用。本发明提供检测分子标记物CLEC2B表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。

Description

CLEC2B基因做为结核病鉴别诊断的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种分子标记物CLEC2B在诊断结核病中的应用。
背景技术
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)感染引发的一种严重威胁人类健康的慢性传染性疾病。在全球，每年有逾千万结核新发病例，130万死亡病例。同时，有近四分之一的人感染结核分枝杆菌并长期处于潜伏感染状态，其中5％～10％的人群可能会在一生中发展为活动性结核病。活动性结核患者只是结核感染者的冰山一角，从结核分枝杆菌潜伏感染发展到活动性疾病对结核的传播构成了持久的威胁，因此对结核感染及活动性结核的快速诊断是阻断结核病防控的重要组成部分之一。由于结核分枝杆菌的自身的细胞壁较厚、脂肪酸含量较高、胞内寄生等生物学特点，结核病早期以及快速诊断的灵敏度和检出率均较低，一直未有突破进展。目前，活动性结核诊断主要依据病原学检测方法，针对结核分枝杆菌组分的检测被认为是结核诊断的“金标准”，但临床中仍有相当比例的菌阴结核患者无法被检出。而其他辅助诊断方法也有各自的使用局限性，如人体影像学诊断存在假阳性高、无法区分肺结核与其他肺部感染的缺陷；针对宿主的免疫检测方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)和γ干扰素释放试验(interferon gamma release assays，IGRA)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核，且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此，如何实现结核病患者的早期和快速诊断、研发可用于结核病早期诊断的、新的特异性生物标识物成为我国和世界性的重大公共卫生领域亟需解决的关键科学问题。
目前临床应用的结核病诊断及辅助诊断主要是从病原学和宿主出发建立的的方法，其应用仍存在一定的缺陷和限制条件。(一)病原学检查：患者痰涂片检查，简便易行，但检出率低；痰培养方法，如罗氏斜面培养、MGIT960，虽准确性较高，但培养周期长，操作过程复杂，需要在标准参比实验室中进行；分子生物学检测，如GeneXpert等检测，是针对样本结核菌DNA分子，无法判定结核菌是否为活菌。病原学检测阳性是诊断活动性结核的“金标准”，然而，目前菌阳结核比例只占临床结核病例的30－40％，仍有过半的病例无法应用病原学结果做出诊断。(二)影像学检查：胸部X线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受；胸部CT可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般X线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆，需要专业医生确证。(三)宿主的免疫反应检测方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)和γ干扰素释放试验(interferon gamma release assays，IGRA)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核，且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此，迫切需要新的诊断方法，实现结核病的早期和快速诊断，从而达到有效治疗个体，控制、消灭结核传播的目标。
CLEC2B(C-type lectin domain family 2member B)基因编码C型凝集素，是C型凝集素样超家族一员。此家族基因共同分享蛋白折叠，具有多样性功能，比如细胞粘附，细胞间信号传导，糖蛋白周转，炎性因子和免疫调控。此蛋白的跨膜结构可以具有细胞激活抗原作用，有可选择的接合变异结构。此基因在染色体12P13上，紧密连接CTL/CELD超家族，具有天然杀伤基因复合域。此基因为已知基因，基因序列见参考文献(Hamann,J.et al.AICL:a new activation-induced antigen encoded by the human NK gene complex.1997，Immunogenetics 45,295–300。)最新报道其与肿瘤进展，血小板聚集等有关，但目前尚未发现其与结核病相关的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供分子标记物CLEC2B在诊断结核病中的应用。本发明所述的标记物能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌感染的标识，并且其具有良好的敏感性和特异性。
本发明所述的分子标记物CLEC2B，为已知基因，能够根据现有方法提取得到。
本发明更加详细的描述如下：
本发明目的在于提供，检测分子标记物CLEC2B表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。
检测CLEC2B蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。
其中，检测分子标记物CLEC2B表达水平方法为荧光定量PCR法。
本发明目的在于提供，检测分子标记物CLEC2B表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。
其中，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。
其中，所述结核病为肺结核或肺外结核。
本发明目的在于提供，CLEC2B在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。
本发明目的在于提供，CLEC2B在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以CLEC2B作为诊断分子标记物。
具体的，本发明的试剂盒，包括以下成分：
CD15+细胞特异抗体筛选磁珠(Invitrogen.)；
RNeasy Plus Mini Kit(Qiangen.)
SuperScriptTMIV Reverse Transcriptase(Invitrogen.)
TaqMan DNA polymerase
TaqMan探针及基因扩增特异引物
本发明的另一个目的在于提供检测方法，包括以下步骤：
(1)全血样本处理：取人或动物全血进行孵育；
(2)磁性分离：分离中性粒细胞并对中性粒细胞进行裂解；
(3)总RNA提取：对中性粒细胞的总RNA进行提取；
(4)cDNA的合成：对RNA进行反转录，得到样本cDNA，
(5)实时荧光定量PCR：以cDNA为模板，使用CLEC2B特异引物，内参引物进行实时荧光定量PCR检测，经过计算即可得到样本中CLEC2B基因的含量。
结论：
以该研究方法获得宿主体内的基因相对表达量，经统计学分析，得出该基因在活动性结核，结合潜伏感染及非结核感染的宿主中的表达量有明显的变化，可用于活动性结核与非结核感染者，结核潜伏感染与非结核感染者鉴别的分子标识。
优选的，本发明的检测方法，步骤如下：
1)全血样本处理
吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，以1：2的比例向流式管中加入1.6mL 的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在Hula Mixer上，4℃，8rpm旋转孵育 20min，
2)磁性分离
⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；
⑵加入1.6mL分离液，轻轻吹匀后转移至对应2mL蛋白低吸附管，磁力架上静置2min，吸去上清，
⑶从磁力架上取下，加入1.6mL分离液，轻轻吹匀，磁力架上静置2min，吸去上清，重复1次，
⑷加入350μL的Buffer RLT裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用，
3)总RNA提取
采用RNeasy Plus Mini Kit对磁珠分选的中性粒细胞总RNA进行提取，具体操作如下：
⑴配制反应体系1和反应体系2
将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gDNA去除柱中， 12,000rpm离心30s；
⑵向流穿液中加入350μL 70％乙醇，混匀，转移700μL至RNeasy Mini柱中， 12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
⑶加入700μL Buffer RW1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
⑷加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
⑸加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min，
⑹将RNeasy Mini柱放入标记好编号的1.5mL的EP管，向柱膜中心加入30μL 水，静置1min，12,000rpm，离心1min，所得RNA冰上放置备用，
4)cDNA的合成
取中性粒细胞总RNA，采用SuperScriptTMIV VILOTMMaster Mix(Invitrogen， US)进行反转录，得到中性粒细胞样本cDNA，
5)实时荧光定量PCR检测CLEC2B基因的相对表达量
采用上步骤中制备的cDNA为模板，对CLEC2B特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR，进而得到各个样本模板中CLEC2B基因的相对表达量。
其中，实时荧光定量PCR检测CLEC2B基因的相对表达量，包括以下步骤：
(1)配制反应体系1和反应体系2
反应体系1为20μL，由
Figure RE-GDA0002786804070000055
Fast Advanced Master Mix(2X)、CLEC2B
Figure RE-GDA0002786804070000056
Assay(20X)、cDNA(1pg-100ng)和无核酸酶水组成，
反应体系2为20μL，由
Figure RE-GDA0002786804070000058
Fast Advanced Master Mix(2X)、内参基因模板
Figure RE-GDA0002786804070000057
Assay(20X)、cDNA(1pg-100ng)和8μL无核酸酶水组成，
其中，CLEC2B及内参基因特异引物为商业化探针(Applied Biosystems，US)，分别在预配分装的qPCR反应液中加入1ul/孔。充分混匀后，上机，收集数据。
(2)实时定量PCR检测
将步骤(1)配制的各个反应体系在QuantStudioTM6 and 7Flex实时荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR检测，使用2-ΔΔCt法计算各个模板中CARD16基因的相对表达量，
反应条件：50℃2min；5℃预变性3min；95℃1s，60℃20sec，40个循环，荧光信号在延伸阶段采集，
(3)统计分析使用GraphPad Prism 7对步骤(2)的结果进行统计分析。
本发明相对于现有技术而言，有益效果在于：
现有结核病诊断方法主要依据病原学诊断，病原学阳性患者在人群中的检出率约为30-50％；其余病原性阴性患者无法被检出。CLEC2B基因可区分活动性结核病患者与结核潜伏感染，活动性结核与非结核感染者，以及活动性结核与其他肺部感染，可以作为活动性结核病诊断的候选生物标志物，故将CLEC2B基因申请专利。本发明为结核诊断的宿主分子标识，不限于病原学检测阳性人群，同时能够应用于结核菌病原检测阴性人群的分子诊断，可有效提高临床结核病检出率。
对于说明书中出现的术语，在此进行相应的解释和说明：
TB：Tuberculosis，结核病
M.tb：Mycobacterium tuberculosis，结核分枝杆菌
TST：tuberculin skin test，结核菌素试验
IGRA：interferon gamma release assays，γ干扰素释放试验
ATB：Active Tuberculosis,活动性结核
LTBI：Latent Tuberculosis Infection，结核潜伏感染者
HC：Health Control，非结核感染对照组
CD15：白细胞分化抗原15
Hula Mixer：Hula混匀器
Buffer RLT：RLT缓冲液
RNeasy Plus Mini Kit：RNA提取试剂盒
gDNA：基因组DNA
Buffer RW1：RW1缓冲液
Buffer RPE：RPE缓冲液
SuperScriptTMIV VILOTMMaster Mix:SuperScriptTMIV VILOTM混合液
cDNA：反转DNA
Figure RE-GDA0002786804070000061
Fast Advanced Master M ix：
Figure RE-GDA0002786804070000062
快速混合液
附图说明
图1、实时定量PCR结果。
图中：ATB：活动性肺结核患者；LTBI：潜伏感染者；HC：非活动性肺结核非潜伏感染者
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。
实施例1、检测方法
1.1研究对象和方法
1.1.1研究对象
研究对象及纳入标准
本研究对象包括活动性结核、结核潜伏感染及正常对照组。活动性结核 (ActiveTuberculosis,ATB)来自深圳第三人民医院的确诊住院患者，诊断标准依据《中华人民共和国卫生行业标准(WS 288—2017)肺结核诊断》标准，且病原学检测阳性即：痰涂片/培养/核酸检测三者至少1项为阳性，无既往结核病史(问诊及X射线胸片检查无陈旧性结核病灶)，初次抗结核治疗，用药少于7 天；潜伏感染者(LTBI,Latent Tuberculosis Infection)为有临床接触史，无临床症状，且IGRA阳性；正常对照组(HC，Health Control)，为体检相关指标正常， IGRA阴性。所有研究对象均年龄小于70岁或大于18岁、无妊娠或哺乳期妇女以及合并其它严重慢性疾病及免疫缺陷性疾病。遵循中国医学科学院/北京协和医学院病原生物学研究所和深圳第三人民医院伦理委员会制定的伦理标准，并签订知情意见通知书。
样本信息
本研究共收取152例宿主样本，分为三组，包括活动性结核组(ATB,ActiveTuberculosis,51例)、结核感染组(LTBI,Latent Tuberculosis Infection,54例)及正常对照组(HC，Health Control,102例)。样本详细信息见表1。
表1.样本人口统计学资料
Figure RE-GDA0002786804070000071
标本来源
分别抽取上述研究对象的外周血2.5mL，置于含肝素锂抗凝采血管(BDBiosciences，US)，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，得到外周血标本。
1.1.2研究方法
磁珠分选是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在分选柱内，而无该种表面抗原的细胞由于不能与连接有磁珠的特异性单抗相结合而没有磁性，不在分选柱内停留，进而使细胞得以分离。
本发明所述的试剂盒，包括以下组分：CD15+细胞富集磁珠及相关试剂，细胞总RNA提取分离柱及相关试剂，cDNA合成逆转录酶及相关试剂，CLEC2B 序列扩增特异性引物及实时荧光定量PCR相关试剂。
1.1.2.1全血样本处理
按照商业化试剂实验说明书操作，吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，已 1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠(Invitrogen，US)并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在Hula Mixer(Invitrogen，US)上，4℃，8rpm旋转孵育20min。
1.1.2.2磁性分离
⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；
⑵加入1.6mL分离液，轻轻吹匀后转移至对应2mL蛋白低吸附管。磁力架上静置2min，吸去上清。
⑶从磁力架上取下，加入1.6mL分离液，轻轻吹匀。磁力架上静置2min，吸去上清。重复1次。
⑷加入350μL的Buffer RLT(Qiagen,Germany)裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用。
1.1.3总RNA提取
采用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Germany)对磁珠分选的中性粒细胞总 RNA进行提取，具体操作如下：
⑴配制反应体系1和反应体系2
将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gDNA去除柱中， 12,000rpm离心30s；
⑵向流穿液中加入350μL 70％乙醇，混匀。转移700μL至RNeasy Mini柱中， 12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。
⑶加入700μL Buffer RW1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。
⑷加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。
⑸加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min。
⑹将RNeasy Mini柱放入标记好编号的1.5mL的EP管，向柱膜中心加入30μL 水，静置1min。12,000rpm，离心1min，所得RNA冰上放置备用。
1.1.4 cDNA的合成
取中性粒细胞总RNA，采用SuperScriptTMIV VILOTMMaster Mix(Invitrogen， US)进行反转录，得到中性粒细胞样本cDNA。
1.1.5实时荧光定量PCR检测CLEC2B基因的相对表达量
采用步骤1.1.4中制备的cDNA为模板，对CLEC2B特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR，进而得到各个样本模板中CLEC2B基因的相对表达量。具体步骤如下：
(1)配制反应体系1和反应体系2
反应体系1(目的基因)为20μL，由
Figure RE-GDA0002786804070000091
Fast Advanced Master Mix(2X)(Applied Biosystems，US)、CLEC2B
Figure RE-GDA0002786804070000092
Assay(20X)(Applied Biosystems， US)、cDNA(1pg-100ng)和无核酸酶水组成。
反应体系2(内参基因)为20μL，由
Figure RE-GDA0002786804070000093
Fast Advanced Master Mix(2X)、内参基因模板
Figure RE-GDA0002786804070000094
Assay(20X)、cDNA(1pg-100ng)和8μL无核酸酶水组成。
(2)实时定量PCR检测
将步骤(1)配制的各个反应体系在QuantStudioTM6and 7Flex实时荧光定量PCR 仪(Applied Biosystems，US)上进行实时定量PCR检测。使用2-ΔΔCt法计算各个模板中CLEC2B基因的相对表达量。
反应条件：50℃2min；5℃预变性3min；95℃1s，60℃20sec，40个循环，荧光信号在延伸阶段采集。
(3)统计分析使用GraphPad Prism 7对步骤(2)的结果进行统计分析。
2.研究结果
将定量PCR结果处理后，使用GraphPad Prism 7对数据进行分析，结果见图1.由图可见，与非活动性肺结核非潜伏感染组和潜伏感染组相比，活动性结核病组的中性粒细胞中CLEC2B基因的相对表达水平与健康对照组，差异显著 (*P<0.0001)，与潜伏感染组差异极显著量显著增加(*P<0.0001)。可以区别诊断健康人和结核病患者、潜伏感染和结核病患者，因此基因CLEC2B可以用做结核病的分子诊断标识。
3.结论：CLEC2B基因可区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者，可以作为成为诊断活动性结核病的候选生物标志物。
实施例2、试剂盒
本发明的试剂盒由以下成分组成：
1.特定细胞富集抗体标记磁珠，Dynabeads CD15(Invitrogen，US)
2.细胞总RNA提取试剂盒，RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Germany)
3.cDNA反转录酶，SuperScriptTMIV VILOTMMaster Mix(Invitrogen，US)
4.qPCR荧光定量PCR检测体系，包括
Figure RE-GDA0002786804070000101
PCR多聚酶，缓冲体系，以及
Figure RE-GDA0002786804070000102
Assay CLEC2B外显子区域特异性检测引物及探针。
本发明首次报道基于人体外周血内所包含的特定细胞CLEC2B基因表达量变化的检测，相比外周血全血相关基因表达变化检测更加灵敏和特异。通过系列商业化试剂的组合和流程优化，使该基因作为结核病分子诊断标识具有可能性和实用性。
参考文献：
1.Gao Y,Li Y,Niu X,Wu Y,Guan X,Hong Y,Chen H,Song B.Gao Y,etal.Identification and Validation of Prognostically Relevant Gene Signature inMelanoma.Biomed Res Int.2020 (8):5323614.
2.Xiong Y,Liu L,Xia Y,Wang J,Xi W,Bai Q,Qu Y,Long Q,Xu J,Guo J.XiongY,et al.High CLEC-2 expression associates with unfavorable postoperativeprognosis of patients with clear cell renal cell carcinoma.Oncotarget.2016Sep27；7(39):63661-63668

Claims (10)

1.检测分子标记物CLEC2B表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。
2.检测CLEC2B蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测分子标记物CLEC2B表达水平方法为荧光定量PCR法。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测分子标记物CLEC2B表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结核病为肺结核或肺外结核。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该试剂盒还包括如下组分：
CD15+细胞富集磁珠及相关试剂；
细胞总RNA提取分离柱及相关试剂；
cDNA合成逆转录酶及相关试剂；
CLEC2B序列扩增特异性引物；
实时荧光定量PCR相关试剂。
8.CLEC2B在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。
9.CLEC2B在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以CLEC2B作为诊断分子标记物。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)全血样本处理
吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，以1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在Hula Mixer上，4℃，8rpm旋转孵育20min，
2)磁性分离
⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；
⑵加入1.6mL分离液，轻轻吹匀后转移至对应2mL蛋白低吸附管，磁力架上静置2min，吸去上清，
⑶从磁力架上取下，加入1.6mL分离液，轻轻吹匀，磁力架上静置2min，吸去上清，重复1次，
⑷加入350μL的Buffer RLT裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用，
3)总RNA提取
采用RNeasy Plus Mini Kit对磁珠分选的中性粒细胞总RNA进行提取，具体操作如下：
⑴配制反应体系1和反应体系2
将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gDNA去除柱中，12,000rpm离心30s；
⑵向流穿液中加入350μL 70％乙醇，混匀，转移700μL至RNeasy Mini柱中，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
⑶加入700μL Buffer RW1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
⑷加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
⑸加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min，
⑹将RNeasy Mini柱放入标记好编号的1.5mL的EP管，向柱膜中心加入30μL水，静置1min，12,000rpm，离心1min，所得RNA冰上放置备用，
4)cDNA的合成
取中性粒细胞总RNA，采用SuperScriptTMIV VILOTMMaster Mix(Invitrogen，US)进行反转录，得到中性粒细胞样本cDNA，
5)实时荧光定量PCR检测CLEC2B基因的相对表达量
采用上步骤中制备的cDNA为模板，对CLEC2B特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR，进而得到各个样本模板中CLEC2B基因的相对表达量。
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