CN110286231A - 用于检测cd160蛋白的物质在制备用于诊断活动性结核病的产品中的应用 - Google Patents
用于检测cd160蛋白的物质在制备用于诊断活动性结核病的产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于检测CD160蛋白的物质在制备用于诊断活动性结核病的产品中的应用。与健康人和结核潜伏感染者相比，活动性结核病患者的PBMCs中CD160蛋白的表达量显著降低；CD160蛋白的表达量可以用于区分活动性结核病患者和结核潜伏感染者；CD160蛋白的表达量可以用于区分活动性结核病患者和健康人。因此，CD160蛋白和/或CD160基因可以作为标志物诊断活动性结核病和诊断活动性结核病的靶点。本发明具有重大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫学诊断技术领域，具体涉及用于检测CD160蛋白的物质在制备用于诊断活动性结核病的产品中的应用。
背景技术
结核病是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的传染病，主要通过呼吸道传播。MTB感染人体后可出现三种不同的结果，一是机体免疫力较好，MTB直接被清除；二是MTB被机体免疫抑制，但也不能完全清除，发展为结核潜伏感染(latenttuberculosis infection，LTBI)；三是MTB在机体内迅速增殖，发展成活动性结核病。结核病是我国需要重点防控的重大传染病。
目前结核病诊断主要有影像学诊断、结核菌诊断和免疫学诊断等方法，但都有一定的缺点。影像学诊断难以区分肺结核病和其它肺部疾病。结核菌诊断假阴性高。免疫学诊断主要分抗体检测和细胞免疫检测(如结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)和γ干扰素释放试验(interferon gamma release assays，IGRA))。TST及IGRA都是通过检测机体主要的抗结核免疫即细胞免疫应答来评价结核感染情况。国内现多将TST做为主要检测手段，一般将纯蛋白衍化物(PPD)强阳性或短期内从阴性转为阳性而无临床结核病证据者判断为结核菌潜伏感染者。由于TST特点是操作简单、价格低廉，其已成为目前临床上最常用且最简便的一种结核菌感染诊断方法。但PPD是从结核分枝杆菌中粗提的抗原混合物，包含200多种蛋白，其中很多是非结核分枝杆菌及卡介菌的共同抗原成分，因此决定了TST检测特异性差，在卡介苗(BCG)接种人群和非结核分枝杆菌感染人群中易产生假阳性结果。TST只能根据皮肤的反应强弱辅助诊断，其灵敏度只有70-80％。另外TST存在检测费时、需要受试者回访(72h)、皮试操作和结果解释存在主观依赖性等缺点。IGRA是采用酶联免疫吸附试验(ELISA)或酶联免疫斑点实验(ELISPOT)方法定量检出受检者全血或外周血单个核细胞对结核分枝杆菌特异性抗原(ESAT6、CFP10及TB7.7)的IFN-γ检测释放反应，从而用于结核菌感染的诊断，但是IGRA难以区分活动性结核病和潜伏结核感染。造成结核病流行现状有多方面的原因，其中缺乏快速、简便、敏感、特异的诊断方法是至关重要的。不能早期诊断活动性结核病，一方面导致延误病情，增加治疗费用和死亡率；另一方面不能有效控制传染源，造成结核病的扩散。因此，开发特异、有效的活动性结核病诊断试剂对结核病防治具有重要意义。
CD160蛋白是一种糖基化磷脂酰肌醇锚定的膜蛋白，主要在一些具有细胞毒活性的细胞(如CD8+T、NKT、NK细胞)表面表达。目前研究表明，CD160蛋白通过与不同的配体相互作用而发挥共刺激或共抑制的作用。
发明内容
本发明的目的是诊断活动性结核病。
本发明首先保护用于检测CD160蛋白的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下a1)至a3)中的至少一种：a1)诊断活动性结核病；a2)诊断待测者是否为活动性结核病患者；a3)防控结核病。
本发明还保护用于检测CD160蛋白的物质和装置在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下a1)至a3)中的至少一种：a1)诊断活动性结核病；a2)诊断待测者是否为活动性结核病患者；a3)防控结核病；
所述装置可为装置甲和/或装置丙；
所述装置甲包括数据输入设备1、数据记录模块1、数据比较模块1和结论输出模块1；
数据输入设备1用于输入CD160蛋白的表达量数值；
数据记录模块1用于存储CD160蛋白的表达量数值；
数据比较模块1用于将待测者外周血中CD160蛋白的表达量和对照外周血中CD160蛋白的表达量进行比较；
结论输出模块1用于显示结论，即如果待测者外周血中CD160蛋白的表达量低于对照外周血中CD160蛋白的表达量，则结论输出模块1显示待测者为活动性结核病患者；如果待测者外周血中CD160蛋白的表达量高于对照外周血中CD160蛋白的表达量，则结论输出模块1显示待测者为非活动性结核病患者；
所述装置丙包括数据输入设备3、数据记录模块3、数据比较模块3和结论输出模块3；
数据输入设备3用于输入CD160蛋白的浓度数值；
数据记录模块3用于存储CD160蛋白的浓度数值；
数据比较模块3用于将待测者外周血中CD160蛋白的浓度和对照外周血中CD160蛋白的浓度进行比较；
结论输出模块3用于显示结论，即如果待测者外周血中CD160蛋白的浓度低于对照外周血中CD160蛋白的浓度，则结论输出模块3显示待测者为活动性结核病患者；如果待测者外周血中CD160蛋白的浓度高于对照外周血中CD160蛋白的浓度，则结论输出模块3显示待测者为非活动性结核病患者；
所述对照外周血可为结核潜伏感染者或健康人的外周血。
所述装置甲具体可由数据输入设备1、数据记录模块1、数据比较模块1和结论输出模块1组成。
所述装置丙具体可由数据输入设备3、数据记录模块3、数据比较模块3和结论输出模块3组成。
所述外周血中CD160蛋白的表达量具体可为从外周血中分离的PBMCs中CD160蛋白的表达量、血清中CD160蛋白的表达量或血浆中CD160蛋白的表达量。
本发明还保护用于检测CD160基因的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下a1)至a3)中的至少一种：a1)诊断活动性结核病；a2)诊断待测者是否为活动性结核病患者；a3)防控结核病。
本发明还保护用于检测CD160基因的物质和装置乙在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下a1)至a3)中的至少一种：a1)诊断活动性结核病；a2)诊断待测者是否为活动性结核病患者；a3)防控结核病；
所述装置乙可包括数据输入设备2、数据记录模块2、数据比较模块2和结论输出模块2；
数据输入设备2用于输入CD160基因的表达量数值；
数据记录模块2用于存储CD160基因的表达量数值；
数据比较模块2用于将待测者外周血中CD160基因的表达量和对照外周血中CD160基因的表达量进行比较；
结论输出模块2用于显示结论，即如果待测者外周血中CD160基因的表达量低于对照外周血中CD160基因的表达量，则结论输出模块2显示待测者为活动性结核病患者；如果待测者外周血中CD160基因的表达量高于对照外周血中CD160基因的表达量，则结论输出模块2显示待测者为非活动性结核病患者；
所述对照外周血可为结核潜伏感染者或健康人的外周血。
所述装置乙具体可由数据输入设备2、数据记录模块2、数据比较模块2和结论输出模块2组成。
所述外周血中CD160基因的表达量具体可为从外周血中分离的PBMCs中CD160基因的表达量。
本发明还保护一种试剂盒，可包括用于检测CD160蛋白的物质和/或用于检测CD160基因的物质；所述试剂盒可具有如下a1)至a3)中至少一种功能：a1)诊断活动性结核病；a2)诊断待测者是否为活动性结核病患者；a3)防控结核病。
上述任一所述“用于检测CD160蛋白的物质”可为用于检测CD160蛋白的表达量的物质和/或用于检测CD160蛋白浓度的物质。
上述任一所述“用于检测CD160基因的物质”可为用于检测CD160基因的表达量的物质。
上述任一所述CD160蛋白的表达量可为CD160蛋白参比内参蛋白的相对表达量。
上述任一所述CD160基因的表达量可为CD160基因参比内参基因的相对表达量。
上述任一所述CD160蛋白的表达量或CD160蛋白浓度可通过流式细胞术检测。上述任一所述“用于检测CD160蛋白的表达量的物质”或所述“用于检测CD160蛋白浓度的物质”可为利用流式细胞术检测CD160蛋白的表达量所需的试剂和/或仪器。所述试剂具体可为CD160蛋白的抗体。
上述任一所述检测CD160蛋白的表达量具体还可采用Western Blot实验进行。
上述任一所述检测CD160蛋白的浓度具体可用于Elisa实验进行。
上述任一所述用于检测CD160基因的表达量的物质或上述任一所述用于检测“CD160基因参比内参基因的相对表达量”的物质可包括特异引物对和内参引物对组成的引物对组合；
所述特异引物对可由引物CD160-F和引物CD160-R组成；所述特异引物对的靶基因含有序列表的序列6自5’末端起第38至170位所示的DNA片段；
所述内参引物对可由引物F和引物R组成；所述内参引物对的靶基因可为人内参基因的全部或部分。
所述引物CD160-F可为如下a1)或a2)：
a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子。
所述引物CD160-R可为如下a3)或a4)：
a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
所述引物F可为如下b1)或b2)：
b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。
所述引物R可为如下b3)或b4)：
b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。
上述任一所述用于检测CD160基因的表达量的物质或上述任一所述用于检测“CD160基因参比内参基因的相对表达量”的物质具体可为所述引物对组合。
上述任一所述特异引物对也属于本发明的保护范围。
采用上述任一所述特异引物对检测CD160基因的表达量或检测CD160基因参比内参基因的相对表达量也属于本发明的保护范围。
采用上述任一所述引物对组合检测CD160基因的表达量或检测CD160基因参比内参基因的相对表达量也属于本发明的保护范围。
上文中，采用上述任一所述引物对组合检测待测者cDNA中CD160基因参比内参基因的相对表达量的方法具体可为：以待测者cDNA为模板，采用上述任一所述特异引物对或上述任一所述内参引物对进行实时荧光定量PCR，然后使用2-ΔCt法计算获得。所述待测者cDNA可为待测者外周血中分离的PBMCs的cDNA。
上述任一所述内参蛋白可为GAPDH蛋白。
上述任一所述内参基因可为GAPDH基因。
本发明还保护Y1)或Y2)或Y3)或Y4)。
Y1)CD160蛋白作为标志物在开发诊断活动性结核病的试剂中的应用。
Y2)CD160蛋白作为标志物在诊断活动性结核病中的应用。
Y3)CD160基因作为标志物在开发诊断活动性结核病的试剂中的应用。
Y4)CD160基因作为标志物在诊断活动性结核病中的应用。
上述任一所述CD160蛋白(GeneID号为：NP_008984.1)的氨基酸序列如序列表中序列5所示。上述任一所述CD160基因(Genebank号为：NM_007053.3)的核苷酸序列如序列表中序列6所示。
上文中，所述低于可为在统计学上的低于。所述高于可为在统计学上的高于。
实验证明，与健康人和结核潜伏感染者相比，活动性结核病患者的PBMCs中CD160蛋白的表达量显著降低；CD160蛋白的表达量可以用于区分活动性结核病患者和结核潜伏感染者；CD160蛋白的表达量可以用于区分活动性结核病患者和健康人。因此，CD160蛋白和/或CD160基因可以作为标志物诊断活动性结核病和诊断活动性结核病的靶点。本发明具有重大的应用价值。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR检测活动性结核病患者、结核潜伏感染者和健康人的PBMCs中CD160基因的相对表达量。
图2为ROC曲线分析活动性结核病患者和结核潜伏感染者的PBMCs中CD160基因的相对表达量。
图3为ROC曲线分析活动性结核病患者和健康人的PBMCs中CD160基因的相对表达量。
图4为流式细胞术检测活动性结核病患者和健康人的PBMCs中CD160蛋白的表达水平。
图5为ROC曲线分析活动性结核病患者和健康人的PBMCs中CD160蛋白的表达水平。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
Ficoll-Paque PLUS为美国GE公司的产品。96孔板为Millipore公司的产品。AIMVTMMedium无血清培养基为gibco公司的产品，产品目录号为12055091。RPMI 1640培养液为Gibco公司的产品，产品目录号为11875-093。IFN-γELISPOT检测试剂盒为达科为公司的产品。IFN-γ单克隆捕获抗体、IFN-γ检测抗体、结核杆菌特异混合多肽A、结核杆菌特异混合多肽B和植物血凝素均为IFN-γELISPOT检测试剂盒中的组件。TRIzolTM Reagent为Invitrogen公司的产品。PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser为TaKaRaBiotechnology公司的产品。KAPATM 快速定量PCR试剂盒为Kapa Biosystems公司的产品。2×Green Master Mix为KAPATM 快速定量PCR试剂盒中的组件。无核酸酶水为美国Ambion公司的产品。480Ⅱ荧光定量PCR仪为罗氏公司的产品。
洗涤液：含0.05％(v/v)吐温20的pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。
CD160蛋白(GeneID号为：NP_008984.1)的氨基酸序列如序列表中序列5所示。编码CD160蛋白的基因(简称CD160基因，Genebank号为：NM_007053.3)的核苷酸序列如序列表中序列6所示。
实施例1、CD160基因的相对表达量在诊断活动性结核病中的应用
一、外周血标本的获得
1、区分结核潜伏感染者的外周血标本与健康人的外周血标本
结核潜伏感染者和健康人均无结核发病的迹象或症状，按照如下步骤区分：
a、包被
(1)取96孔板，每孔加入100μL IFN-γ单克隆捕获抗体，4℃包被过夜。
(2)完成步骤(1)后，取所述96孔板，弃液相，加入pH7.4、0.01M的PBS缓冲液洗涤两次(每次1min)，拍干。
(3)完成步骤(2)后，取所述96孔板，每孔加入200μL含2％(v/v)BSA的pH7.4、0.01M的PBS缓冲液，37℃孵育1h。
(4)完成步骤(3)后，取所述96孔板，弃液相，加入RPMI 1640培养液润洗一次。
b、PBMCs悬液的制备
(1)将2mL待测外周血和2mL的RPMI 1640培养液混合均匀；然后缓缓加入至装有3mL Ficoll-Paque PLUS的无菌离心管中，室温、2000rcf离心20min，由上而下分为三层。
(2)完成步骤(1)后，吸取中层并转移至装有10mL的RPMI 1640培养液的离心管中，用滴管轻轻吹打混匀，室温、1400rpm离心7min。
(3)完成步骤(2)后，取所述离心管，弃上清，加入6mL预热至37℃的RPMI 1640培养液重悬，室温、1400rpm离心7min。
(4)完成步骤(3)后，取所述离心管，弃上清，加入预热至37℃的AIM VTMMedium无血清培养基重悬，得到浓度为2.5×106个/mL的PBMCs悬液。
c、免疫斑点检测
参考IFN-γELISPOT检测试剂盒的说明书，采用该试剂盒进行免疫斑点检测。试剂用量均按说明书进行。具体步骤如下：
(1)取完成步骤a的所述96孔板，每孔加入100μL步骤b制备的PBMCs悬液(约2.5×105个PBMC)。
(2)完成步骤(1)后，每个检测孔加入结核杆菌特异混合多肽A或结核杆菌特异混合多肽B；每个阴性对照孔加入无血清培养基；每个阳性对照孔加入植物血凝素。
(3)完成步骤(2)后，将所述96孔板置于培养箱，37℃、5％CO2培养20h。
(4)完成步骤(3)后，取所述96孔板，弃上清，加入200μL预冷的冰水，4℃放置10min(目的为裂解细胞)。
(5)完成步骤(4)后，取所述96孔板，弃上清，用洗涤液洗涤5次(每次加入200μL洗涤液，每次洗涤1min)，拍干。
(6)完成步骤(5)后，取所述96孔板，每孔加入100μL IFN-γ检测抗体(亲和素标记)稀释液(由99体积份pH7.4、0.01M的PBS缓冲液和1体积份IFN-γ检测抗体混合而成)，37℃孵育1h。
(7)完成步骤(6)后，取所述96孔板，弃上清，用洗涤液洗涤5次(每次加入200μL洗涤液，每次洗涤1min)，拍干。
(8)完成步骤(7)后，取所述96孔板，每孔加入100μLHRP标记的链霉素的稀释液(由99体积份pH7.4、0.01M的PBS缓冲液和1体积份HRP标记的链霉素混合而成)，37℃孵育1h。
(9)完成步骤(8)后，取所述96孔板，弃上清，用洗涤液洗涤5次(每次加入200μL洗涤液，每次洗涤1min)，拍干。
(10)完成步骤(9)后，取所述96孔板，每孔加入酶底物，室温下闭光显色15-45min。
(11)完成步骤(10)后，取所述96孔板，用蒸馏水冲洗3次(目的为中止反应)，然后将所述96孔板室温静置，自然晾干。
(12)完成步骤(11)后，取所述96孔板，使用免疫斑点计数仪(CellularTechnology Ltd，USA)进行图像和斑点计数，然后进行如下判断：阴性对照孔的斑点数目小于6时，如果检测孔的斑点数目减去阴性对照孔的斑点数目为6以上、则检测孔为阳性，如果检测孔的斑点数目减去阴性对照孔的斑点数目为小于6、则检测孔为阴性；阴性对照孔的斑点数目为6个以上时，如果检测孔的斑点数目为阴性对照孔的斑点数目的2倍以上、则检测孔为阳性，如果检测孔的斑点数目比阴性对照孔的斑点数目小于2倍、则检测孔为阴性。检测孔为阳性，则待测外周血由结核潜伏感染者提供(即结核潜伏感染者的外周血标本)；检测孔为阴性，则待测外周血由健康人提供(即健康人的外周血标本)。
2、外周血标本的获得
(1)活动性结核病组：40个外周血标本。
40个外周血标本：分别抽取临床上已确诊为活动性肺结核病的40例患者(所有患者均知情同意)的外周血2-3mL，置于含EDTA抗凝采血管，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，得到40个外周血标本。
(2)结核潜伏感染组：25个外周血标本。
25个外周血标本：分别抽取临床上已确诊为结核潜伏感染的25例结核潜伏感染者(均知情同意)的外周血2-3mL，置于含EDTA抗凝采血管，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，得到25个外周血标本。
(3)健康对照组：46个外周血标本。
46个外周血标本：分别抽取46例健康人(均知情同意)的外周血2-3mL，置于含EDTA抗凝采血管，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，得到46个外周血标本。
111个外周血标本需置于室温(勿冷冻或冷藏)，且放置时间小于6h。
二、CD160基因的相对表达量在诊断活动性结核病中的应用
1、111个外周血标本的cDNA的获得
(1)PBMCs悬液的制备
将步骤一1中b的待测外周血分别替换为步骤一中2的111个外周血标本，其它步骤均不变，得到111个外周血标本的PBMCs悬液(浓度为2.5×106个/mL)。
(2)RNA提取
①分别取111个外周血标本的PBMCs悬液(每个样本约1×106个细胞)，400rcf离心5min，收集沉淀。
②完成步骤①后，取所述沉淀，采用TRIzolTM Reagent提取RNA。
(3)cDNA的合成
分别取111个外周血标本的PBMCs悬液的RNA，采用PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser进行反转录，得到111个外周血标本的cDNA。
2、引物对组合的制备
根据CD160基因的核苷酸序列，设计并合成表1所示的特异引物对。
根据GAPDH基因的核苷酸序列，设计并合成表1所示的内参引物对。
引物对组合由特异引物对和内参引物对组成。
由上海生工生物科技有限公司合成各个引物(HPLC纯化)。
表1
3、实时荧光定量PCR检测CD160基因的相对表达量
分别以111个外周血标本的cDNA为模板，采用步骤2制备的特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR，进而得到各个模板中CD160基因的相对表达量。具体步骤如下：
(1)配制反应体系1和反应体系2
反应体系1为20μL，由10μL2×Green Master Mix、0.4μLCD160-F水溶液(浓度为10μM)、0.4μL CD160-R水溶液(浓度为10μM)、2μL模板(5-20ng)和7.2μL无核酸酶水组成。
反应体系2为20μL，由10μL2×Green Master Mix、0.4μL GAPDH-F水溶液(浓度为10μM)、0.4μL GAPDH-R水溶液(浓度为10μM)、2μL模板(5-20ng)和7.2μL无核酸酶水组成。
(2)实时定量PCR检测
将步骤(1)配制的各个反应体系在480Ⅱ荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR检测。使用2-ΔCt法计算各个模板中CD160基因的相对表达量。
反应条件：95℃预变性3min；95℃5s，60℃30sec，40个循环，荧光信号在延伸阶段采集。
实验结果见图1(TB为活动性结核病组，LI为结核潜伏感染组，Nor为健康对照组)。结果表明，与健康对照组和结核潜伏感染组相比，活动性结核病组的PBMCs中CD160基因的相对表达量显著降低。
(3)统计分析
使用GraphPad Prism 5对步骤(2)的结果进行统计分析。
根据活动性结核病组和结核潜伏感染组的PBMCs中CD160基因的相对表达量，使用GraphPad Prism 5进行受试者工作特征曲线分析。结果见图2。结果表明，ROC曲线下面积为0.891(p<0.0001)，说明CD160基因的相对表达量可以用于区分活动性结核病患者和结核潜伏感染者。当CD160基因的转录水平cut-off值取0.0007392时，约登指数(Youden’s index，YI)最大，此时灵敏度为95.00％，特异性为80.00％。
根据活动性结核病组和健康对照组的PBMCs中CD160基因的相对表达量，使用GraphPad Prism 5进行受试者工作特征曲线分析。结果见图3。结果表明，ROC曲线下面积为0.894(p<0.0001)，说明CD160基因的相对表达量可以用于区分活动性结核病患者和健康人。当CD160基因的转录水平cut-off值取0.0005515时，约登指数最大，此时灵敏度为87.50％，特异性为84.78％。
上述结果表明，CD160基因的相对表达量在诊断活动性结核病方面具有重要的应用价值。
实施例2、CD160蛋白的表达水平在诊断活动性结核病中的应用
一、外周血标本的获得
1、活动性结核病组：80个外周血标本。
80个外周血标本：分别抽取临床上已确诊为活动性肺结核病的80例患者(所有患者均知情同意)的外周血2-3mL，置于含EDTA抗凝采血管，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，得到80个外周血标本。
2、健康对照组：25个外周血标本。
25个外周血标本：分别抽取25例健康人(指没有结核分枝杆菌感染症状的人，均知情同意)的外周血2-3mL，置于含EDTA抗凝采血管，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，得到25个外周血标本。
105个外周血标本需置于室温(勿冷冻或冷藏)，且放置时间小于6h。
二、CD160蛋白的表达水平在诊断活动性结核病中的应用
1、将实施例1步骤一1中b的待测外周血分别替换为步骤一中2的105个外周血标本，其它步骤均不变，得到105个外周血标本的PBMCs悬液(浓度为2.5×106个/mL)。
2、取EP管，先分别加入105个外周血标本的PBMCs悬液(每管100μL)，再加入含2％FBS(v/v)的pH7.4、0.01MPBS缓冲液洗涤一次。
3、完成步骤2后，每个EP管加入5μL的抗-CD160抗体(Biolegend公司的产品)，4℃孵育30min。
4、完成步骤3后，用含2％FBS(v/v)的pH7.4、0.01MPBS缓冲液洗涤一次，然后用流式细胞仪(FC500，Beckman Coulter)检测。
流式细胞仪检测结果见图4(TB为活动性结核病组，HC为健康对照组)。结果表明，与健康对照组相比，活动性结核病组的PBMCs中CD160蛋白的表达水平显著降低。
5、根据活动性结核病组和健康对照组的PBMCs中CD160蛋白的表达水平，使用CXP分析软件进行受试者工作特征曲线分析。结果见图5。结果表明，ROC曲线下面积为0.872(p<0.0001)，说明CD160蛋白的表达水平可以用于区分活动性结核病患者和健康人。当PBMCs表面CD160+的比例cut-off值取5.370％时，约登指数最大，此时灵敏度为72.15％，特异性为84.00％。
<110> 中国人民解放军总医院第八医学中心
<120> 用于检测CD160蛋白的物质在制备用于诊断活动性结核病的产品中的应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ggacaatctg aggactga 18
<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
acggatgtag tgaggtatg 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
tcgccccact tgattttgga 20
<210> 5
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 5
Met Leu Leu Glu Pro Gly Arg Gly Cys Cys Ala Leu Ala Ile Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ile Val Asp Ile Gln Ser Gly Gly Cys Ile Asn Ile Thr Ser Ser
20 25 30
Ala Ser Gln Glu Gly Thr Arg Leu Asn Leu Ile Cys Thr Val Trp His
35 40 45
Lys Lys Glu Glu Ala Glu Gly Phe Val Val Phe Leu Cys Lys Asp Arg
50 55 60
Ser Gly Asp Cys Ser Pro Glu Thr Ser Leu Lys Gln Leu Arg Leu Lys
65 70 75 80
Arg Asp Pro Gly Ile Asp Gly Val Gly Glu Ile Ser Ser Gln Leu Met
85 90 95
Phe Thr Ile Ser Gln Val Thr Pro Leu His Ser Gly Thr Tyr Gln Cys
100 105 110
Cys Ala Arg Ser Gln Lys Ser Gly Ile Arg Leu Gln Gly His Phe Phe
115 120 125
Ser Ile Leu Phe Thr Glu Thr Gly Asn Tyr Thr Val Thr Gly Leu Lys
130 135 140
Gln Arg Gln His Leu Glu Phe Ser His Asn Glu Gly Thr Leu Ser Ser
145 150 155 160
Gly Phe Leu Gln Glu Lys Val Trp Val Met Leu Val Thr Ser Leu Val
165 170 175
Ala Leu Gln Ala Leu
180
<210> 6
<211> 1633
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gacgaaactg gagagatagg gttttaacaa gatgcaagga caatctgagg actgagagcc 60
atttcaacgt gagcccccag tctgagaaca agaaagaaga acttctgtct cgagggtctc 120
actgtcaacc aggccagagt gcagtgaaga tcatacctca ctacatccgt gaactcccgg 180
gctcctccca cctaagtctc ttgagtagct gggacttcag gagactgaag ccaaggatac 240
cagcagagcc aacatttgct tcaagttcct gggcctgctg acagcgtgca ggatgctgtt 300
ggaacccggc agaggctgct gtgccctggc catcctgctg gcaattgtgg acatccagtc 360
tggtggatgc attaacatca ccagctcagc ttcccaggaa ggaacgcgac taaacttaat 420
ctgtactgta tggcataaga aagaagaggc tgaggggttt gtagtgtttt tgtgcaagga 480
caggtctgga gactgttctc ctgagaccag tttaaaacag ctgagactta aaagggatcc 540
tgggatagat ggtgttggtg aaatatcatc tcagttgatg ttcaccataa gccaagtcac 600
accgttgcac agtgggacct accagtgttg tgccagaagc cagaagtcag gtatccgcct 660
tcagggccat tttttctcca ttctattcac agagacaggg aactacacag tgacgggatt 720
gaaacaaaga caacaccttg agttcagcca taatgaaggc actctcagtt caggcttcct 780
acaagaaaag gtctgggtaa tgctggtcac cagccttgtg gcccttcaag ctttgtaagc 840
cttgtgccaa aagaaacttt taaaacagct acagcaagat gagtctgact atggcttagt 900
atctttctca ttacaatagg cacagagaag aatgcaacag ggcacagggg aagagatgct 960
aaatatacca agaatctgtg gaaatataag ctggggcaaa tcagtgtaat ccttgacttt 1020
gctcctcacc atcagggcaa acttgccttc ttccctccta agctccagta aataaacaga 1080
acagctttca ccaaagtggg tagtatagtc ctcaaatatc ggataaatat atgcgttttt 1140
gtaccccaga aaaacttttc ctccctcttc atcaacatag taaaataagt caaacaaaat 1200
gagaacacca aattttgggg gaataaattt ttatttaaca ctgcaaagga aagagagaga 1260
aaacaagcaa agataggtag gacagaaagg aagacagcca gatccagtga ttgacttggc 1320
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cctcttgtca tagttaagca gagagtgggc aggatattcc tgataggagg aactacatga 1620
ataaaggggt aag 1633
Claims (10)
1.用于检测CD160蛋白的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下a1)至a3)中的至少一种：a1)诊断活动性结核病；a2)诊断待测者是否为活动性结核病患者；a3)防控结核病。
2.用于检测CD160蛋白的物质和装置在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下a1)至a3)中的至少一种：a1)诊断活动性结核病；a2)诊断待测者是否为活动性结核病患者；a3)防控结核病；
所述装置为装置甲和/或装置丙；
所述装置甲包括数据输入设备1、数据记录模块1、数据比较模块1和结论输出模块1；
数据输入设备1用于输入CD160蛋白的表达量数值；
数据记录模块1用于存储CD160蛋白的表达量数值；
数据比较模块1用于将待测者外周血中CD160蛋白的表达量和对照外周血中CD160蛋白的表达量进行比较；
结论输出模块1用于显示结论，即如果待测者外周血中CD160蛋白的表达量低于对照外周血中CD160蛋白的表达量，则结论输出模块1显示待测者为活动性结核病患者；如果待测者外周血中CD160蛋白的表达量高于对照外周血中CD160蛋白的表达量，则结论输出模块1显示待测者为非活动性结核病患者；
所述装置丙包括数据输入设备3、数据记录模块3、数据比较模块3和结论输出模块3；
数据输入设备3用于输入CD160蛋白的浓度数值；
数据记录模块3用于存储CD160蛋白的浓度数值；
数据比较模块3用于将待测者外周血中CD160蛋白的浓度和对照外周血中CD160蛋白的浓度进行比较；
结论输出模块3用于显示结论，即如果待测者外周血中CD160蛋白的浓度低于对照外周血中CD160蛋白的浓度，则结论输出模块3显示待测者为活动性结核病患者；如果待测者外周血中CD160蛋白的浓度高于对照外周血中CD160蛋白的浓度，则结论输出模块3显示待测者为非活动性结核病患者；
所述对照外周血为结核潜伏感染者或健康人的外周血。
3.用于检测CD160基因的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下a1)至a3)中的至少一种：a1)诊断活动性结核病；a2)诊断待测者是否为活动性结核病患者；a3)防控结核病。
4.用于检测CD160基因的物质和装置乙在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下a1)至a3)中的至少一种：a1)诊断活动性结核病；a2)诊断待测者是否为活动性结核病患者；a3)防控结核病；
所述装置乙包括数据输入设备2、数据记录模块2、数据比较模块2和结论输出模块2；
数据输入设备2用于输入CD160基因的表达量数值；
数据记录模块2用于存储CD160基因的表达量数值；
数据比较模块2用于将待测者外周血中CD160基因的表达量和对照外周血中CD160基因的表达量进行比较；
结论输出模块2用于显示结论，即如果待测者外周血中CD160基因的表达量低于对照外周血中CD160基因的表达量，则结论输出模块2显示待测者为活动性结核病患者；如果待测者外周血中CD160基因的表达量高于对照外周血中CD160基因的表达量，则结论输出模块2显示待测者为非活动性结核病患者；
所述对照外周血为结核潜伏感染者或健康人的外周血。
5.一种试剂盒，包括用于检测CD160蛋白的物质和/或用于检测CD160基因的物质；所述试剂盒具有如下a1)至a3)中至少一种功能：a1)诊断活动性结核病；a2)诊断待测者是否为活动性结核病患者；a3)防控结核病。
6.如权利要求1至4任一所述的应用或权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：
所述“用于检测CD160蛋白的物质”为用于检测CD160蛋白的表达量的物质和/或用于检测CD160蛋白浓度的物质；
所述“用于检测CD160基因的物质”为用于检测CD160基因的表达量的物质。
7.如权利要求6所述的应用或试剂盒，其特征在于：
所述CD160蛋白的表达量或CD160蛋白浓度通过流式细胞术检测；
所述CD160基因的表达量为CD160基因参比内参基因的相对表达量。
所述“用于检测CD160蛋白的表达量的物质”或所述“用于检测CD160蛋白浓度的物质”可为利用流式细胞术检测CD160蛋白的表达量所需的试剂和/或仪器。
所述试剂具体可为CD160蛋白的抗体。
8.如权利要求6或7所述的应用或试剂盒，其特征在于：
所述用于检测CD160基因的表达量的物质或所述用于检测“CD160基因参比内参基因的相对表达量”的物质包括特异引物对和内参引物对组成的引物对组合；
所述特异引物对由引物CD160-F和引物CD160-R组成；所述特异引物对的靶基因含有序列表的序列6自5’末端起第38至170位所示的DNA片段；
所述内参引物对由引物F和引物R组成；所述内参引物对的靶基因为人内参基因的全部或部分。
9.权利要求8中所述特异引物对。
10.Y1)或Y2)或Y3)或Y4)：
Y1)CD160蛋白作为标志物在开发诊断活动性结核病的试剂中的应用；
Y2)CD160蛋白作为标志物在诊断活动性结核病中的应用；
Y3)CD160基因作为标志物在开发诊断活动性结核病的试剂中的应用；
Y4)CD160基因作为标志物在诊断活动性结核病中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN112143795A (zh) * | 2020-09-30 | 2020-12-29 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | Clec2b基因做为结核病鉴别诊断的应用 |
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-
2019
- 2019-06-19 CN CN201910531180.9A patent/CN110286231A/zh active Pending
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