CN110016502A - 一种辅助诊断原发性高血压的分子标记物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与原发性高血压相关的分子标记物，该分子标记物CCDC160在原发性高血压病人血液中表达下调。本发明还公开了CCDC160在制备辅助诊断原发性高血压试剂或ELISA试剂盒中的应用。利用该分子标记物及含有该分子标记物的诊断试剂或ELISA试剂盒不仅能够快速有效的做到早期诊断，而且为原发性高血压发病风险预测、新药开发、诊断和个体化治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

Description

一种辅助诊断原发性高血压的分子标记物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种辅助诊断原发性高血压的分子标记物及其应用。
背景技术
高血压是最常见的心血管疾病，也是心血管疾病最重要的危险因素，从115/75mmHg开始，随着血压的升高，心血管疾病如脑血管意外、冠状动脉疾病、外周血管疾病和进行性肾脏损害等疾病的发病风险也相应增加。
高血压是多种心脑血管疾病的重要病因、危险因素和主要的死亡原因之一，其发病机制十分复杂。根据近几年国内外学者的研究结果表明：高血压病是一种整合基因因素和环境因素(钠盐，酒精过量和肥胖)的疾病，高血压病一般可分为原发性高血压病和继发性高血压病，而原发性高血压病有很强的遗传倾向。
高血压发病机制涉及包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统，血管平滑肌和血管内皮功能障碍，以及受损的血小板功能和肾等相关因素。目前已经完成了对于已知基因如血管紧张素II、血管紧张素受体、肾素、激肽、G蛋白信号2调节基因及心钠素等在动物体内进行转基因过度表达或基因敲除的研究；高血压病的基因治疗，如过度表达舒张血管基因(心钠素，血管舒缓素，内皮一氧化氮合成酶)等，及敲除血管紧张素原，血管紧张素II受体，中性肽链内切酶等基因的研究正在开展中。
但是，目前医学界对高血压病发病机理及基因调控仍不清楚，其发病属于单基因还是多基因仍有争议。因此，鉴定出更多与高血压病致病相关基因，在人群中进一步筛选增加疾病风险的易感基因确定易感人群，将有助于无疑高血压发病风险预测、新药开发、诊断和个体化治疗。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供CCDC160在制备辅助诊断原发性高血压产品中的应用。
本发明的还一目的是提供该分子标记物在制备原发性高血压试剂或试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明首先提供一种辅助诊断原发性高血压的分子标记物，所述分子标记物为CCDC160或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物。
优选的，所述分子标记物CCDC160包含如SEQ ID NO:1所示的特异核苷酸序列。
本发明经研究发现CCDC160在原发性高血压病人血液中表达下调，显示CCDC160与原发性高血压发生、发展存在着密切的相关性。
进一步地，本发明提供了分子标记物CCDC160或其表达产物在制备辅助诊断原发性高血压产品中的应用。
优选的，所述产品包括芯片、试剂盒或生物试剂。
进一步地，本发明提供了一种辅助诊断原发性高血压的生物试剂，所述生物试剂包括用于检测原发性高血压的引物对，所述引物对具有SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；所述引物对通过转录介导扩增技术来检测人体体内CCDC160基因的表达水平，以判断原发性高血压发生的风险。
更进一步地，本发明还提供了一种辅助诊断原发性高血压的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括抗CCDC160蛋白的特异性抗体。
优选的，所述CCDC160蛋白抗体抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
更优选的，所述CCDC160蛋白抗体为辣根过氧化物酶标记的抗体。
所述试剂盒还包括抗CCDC160兔多克隆抗体包被的酶标板、蛋白标准品CCDC160、TMB底物溶液、稀释液、洗涤缓冲液、终止溶液。
本发明的有益效果如下：
本发明公开了一种与原发性高血压相关的新的分子标记物CCDC160，并进一步证实CCDC160在原发性高血压病人血液中表达下调，可在制备辅助诊断原发性高血压的产品中应用。利用该分子标记物及含有该分子标记物的诊断试剂或ELISA试剂盒不仅能够快速有效的做到早期诊断，而且为原发性高血压发病风险预测、新药开发、诊断和个体化治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1本发明中实施例2中原发性高血压病人血液样本中CCDC160表达下调。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
本发明对30例原发性高血压外周血样本及与其匹配的30例健康对照者外周血样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因CCDC160，现有研究中并没有CCDC160和原发性高血压相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了CCDC160在原发性高血压病人外周血中表达下调，其相关制剂或产品可用于辅助诊断原发性高血压。
本发明的CCDC160是在本发明之前的已知基因，其基本信息如下：
Genbank登录号：CCDC160Gene ID:347475，来源于人类基因组，其包含特异性核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
CCDC160(coiled-coil domain containing 160，卷曲螺旋结构域)，位于13号染色体上，是一个蛋白编码基因，属于卷曲螺旋结构域CCDC基因家族。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.利用高通量测序方法对30例原发性高血压患者的血液样本中CCDC160基因水平与30例健康对照者样本中进行差异比较。
2.采用RT-PCR方法检测CCDC160基因在原发性高血压患者和健康对照人群中的表达，并验证了该基因为原发性高血压表达下调基因。
3.原发性高血压的ELISA检测试剂盒组装和使用
(1)ELISA实验中常规试剂的配制
(2)多克隆抗体制备
(3)酶标板的包被
(4)酶标抗体的制备
(5)试剂盒的组装
利用本发明人制备的ELISA试剂盒检测待确诊的原发性高血压患者，测定受试者血液样本中CCDC160蛋白表达量，并与正常血液样本中CCDC160蛋白表达量进行比较，为临床医生快速判断患者的发病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明CCDC160的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明的蛋白(或其片段)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Soliod-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
本文使用的术语“表达下调”指对应于所表达基因的序列，其中序列量的测量证明，与从正常个体与患原发性高血压个体中分离的生物学样品中的同一基因相比，所述基因在从患原发性高血压个体中分离的生物学样品中的表达水平降低。根据本发明，“表达下调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表达降低，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更低。
实施例1高通量测序筛选差异表达基因
1、研究对象
选取30例原发性高血压病人和与其匹配的30例健康对照者，研究对象均为北京协和医院心内科在2016年10月到2017年12月期间招募，所有对照在性别和年龄方面匹配，是非吸烟者，并且没有其他临床可检测的心血管疾病因素。收集所有参与者的外周血样本，同时，记录、整理参与者的基本信息如表1所示。其中高血压的诊断标准依据世界卫生组织的国际疾病分类第10版(ICD-10)，原发性高血压(EH)诊断标准采用2013欧洲高血压学会欧洲心脏病学会高血压管理指南的标准，排除糖尿病、继发性高血压、心肌梗死、冠心病、脑卒中、肾脏疾病、药物成瘾或者其他严重的疾病后，最后确定原发性高血压。所有健康对照者均无原发性高血压家族史。所有程序均按照当地医院伦理审查委员会批准的方案进行，并从所有参与者获得知情同意书。
表1 30例高血压病人与30例正常血压人群的基本信息
2、血液中总RNA提取
(1)匀浆处理
取外周血样本，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μL血液收集的白细胞沉淀加入1mLTRIzol(Reagent，invitrogen，货号15596-018)。
(2)分层
a、样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。(不能即使处理的样品裂解后-80℃保存)。
b、4℃，12000rpm离心10分钟，取上清。
c、每1ml TRIzol加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分离。
(3)RNA沉淀
a、4℃12000rpm离心10-15min，样品分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(通常可吸取550μl)转移到新管中。
b、在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。
(4)RNA漂洗
a、RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1ml TRIzol加入1ml 75％乙醇。
b、4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置1-2分钟晾干沉淀。
5.溶解RNA(Redissolving the RNA)
沉淀中加入50-100μl RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。
3、RNA样品的质量分析
RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
4、高通量测序
测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。对样本进行差异基因表达分析，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了GeneOntology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因CCDC160，CCDC160在原发性高血压外周血样本中表达下调。
实施例2 RT-PCR验证原发性高血压和正常人中表达情况
1、研究对象
选取原发性高血压患者和正常人健康对照者各50例，均为北京协和医院心内科在2016年10月到2017年12月期间招募，所有对照在性别和年龄方面匹配，是非吸烟者，并且没有其他临床可检测的心血管疾病因素。收集所有参与者的外周血样本，同时，记录、整理参与者的基本信息如表2所示。其中高血压的诊断标准依据世界卫生组织的国际疾病分类第10版(ICD-10)，原发性高血压(EH)诊断标准采用2013欧洲高血压学会欧洲心脏病学会高血压管理指南的标准。排除糖尿病、继发性高血压、心肌梗死、冠心病、脑卒中、肾脏疾病、药物成瘾或者其他严重的疾病后，最后确定原发性高血压。所有健康对照者均无原发性高血压家族史。所有程序均按照当地医院伦理审查委员会批准的方案进行，并从所有参与者获得知情同意书。
表2 50例高血压病人与50例正常血压人群基本信息
2、血液总RNA提取
对被试者外周血样本进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。
3、逆转录合成cDNA
采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
4、Real-Time PCR
(1)引物设计
采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_001101357.2(CCDC160)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如表1所示：
表3引物序列
(2)反应体系：用PowerGreen PCR MasterMix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40个循环。
表4 RealTime反应体系
组分 加入量
2×mix 10μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
模板 2μL
加入灭菌蒸馏水 至25μL
(4)样本RealTime-PCR检测
以SYBR Green作为荧光标记物，在ABI 7500型荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，采用法进行数据的相对定量分析。
(5)实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；
RT-PCR产物琼脂糖电泳后切胶回收，在ABI3730全自动测序仪上测序，该104bp的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，用VectorNTI advance 10软件(Invitrogen公司)将该核苷酸序列与CCDC160整个mRNA序列进行比对，比对结果显示，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为CCDC160的一部分序列，符合率为100％。
根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔΔCt×100％，比较CCDC160在高血压病人和正常对照者中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中CCDC160在原发性高血压病人中的表达水平仅为健康对照者中的38％，如图1所示。以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析CCDC160在原发性高血压患者中表达下调的结果。
实施例3检测原发性高血压的ELISA试剂盒组装和使用
1.ELISA实验中常规试剂：
包被缓冲液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加蒸馏水至1000mL。
洗涤缓冲液(pH7.4PBS)：KH2PO40.2g；Na2HPO4·12H2O 2.9g；NaCl8.0g；KCl 0.2g；0.05％吐温-20 0.5mL，加蒸馏水至1000mL。
稀释液:牛血清白蛋白(BSA)0.1g，加洗涤缓冲液至100mL；
本发明使用的抗人CCDC160蛋白鼠源单克隆抗体均由abcam公司制备。
蛋白标准品CCDC160为人源重组蛋白均购自北京傲锐东源生物科技有限公司。
2.多克隆抗体制备：
采用固相合成法制备CCDC160蛋白；采用碳二亚胺偶联法将合成CCDC160蛋白与载体蛋白BSA(牛血清白蛋白)偶联制备免疫原CCDC160-BSA，联合UV(紫外扫描)和SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)监测偶联物CCDC160-BSA；将制备好的偶联物CCDC160-BSA作为免疫原，结合弗氏完全佐剂与不完全佐剂免疫新西兰大耳白兔，每次偶联物抗原免疫剂量为1mg，免疫方式为颈背部皮下多点注射；经3次免疫后检测免疫兔静脉血滴度，达到1:10000以上后，对免疫兔进行颈动脉取血收集免疫全血，离心分离后收集兔免疫血清；采用Protein A亲和层析柱对抗CCDC160蛋白的兔免疫血清进行纯化，制备抗CCDC160蛋白的多克隆抗体，检测多克隆抗体的滴度、特异性、灵敏性等，得到抗血清CCDC160蛋白抗体。
3.酶标板的包被：
所述的抗CCDC160兔多克隆抗体包被的酶标板通过如下方法制备：用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗CCDC160兔多克隆抗体稀释成目的浓度0.63μg/mL；将稀释好的抗体溶液混匀后加入微孔中，100μL/孔，4℃过夜；洗板3次，200μL/孔；加入3％BSA封闭液，300μL/孔，4℃过夜；洗板3次，200μL/孔；-20℃保存。
4.酶标抗体的制备：
取抗CCDC160蛋白鼠源单克隆抗体，分别与HRP进行偶联，得到酶标记抗体。取一定量的酶标记抗体加入到稀释液中，充分混匀，使其终浓度为2μg/mL(可根据具体的条件而定)，2-8℃避光保存。
5.试剂盒的组装：
检测原发性高血压的ELISA试剂盒包括表5中的组分：
表5 ELISA检测试剂盒
为方便使用，该试剂盒还可包含阳性对照：正常人AB血清或胎牛血清500μL和阴性对照：1％PBS 1mL。
该试剂盒的使用方法如下：
(1)取CCDC160标准蛋白浓度分别为900pg/mL，600pg/mL，300pg/mL，150pg/mL，75pg/mL溶液50μL加入包被抗体的酶标板绘制标准曲线；
(2)分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔，在酶标板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
(3)用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
(4)小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
(5)每孔加入酶标试剂50μL；
(6)温育，洗涤，步骤同上；
(7)每孔先加入TMB底物溶液A 50μL，再加入TMB底物溶液B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
(8)每孔加终止液50μL，终止反应；
(9)以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，计算各血清样本中蛋白含量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京致成生物医学科技有限公司
<120> 一种辅助诊断原发性高血压的分子标记物及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtggccaga gccgaacggg gggctgccgc gcgcgggtgg tggttgtctt tgaggaagag 60
aggttcgggc tctccagacg gcatccacgc ttccagatat tgga 104
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
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<400> 3
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<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims (10)

1.一种辅助诊断原发性高血压的分子标记物，其特征在于，所述分子标记物为CCDC160或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物。
2.如权利要求1所述的分子标记物，其特征在于，所述分子标记物CCDC160包含如SEQID NO:1所示的特异核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的分子标记物，其特征在于，所述分子标记物CCDC160在原发性高血压病人血液中表达下调。
4.如权利要求1-3所述的分子标记物或其表达产物在制备辅助诊断原发性高血压产品中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒或生物试剂。
6.一种辅助诊断原发性高血压的生物试剂，其特征在于，所述生物试剂包括用于检测原发性高血压的引物对，所述引物对具有SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；所述引物对通过转录介导扩增技术来检测人体体内CCDC160基因的表达水平，以判断原发性高血压发生的风险。
7.一种辅助诊断原发性高血压的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗CCDC160蛋白的特异性抗体。
8.如权利要求7所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述CCDC160蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
9.如权利要求8所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述CCDC160蛋白抗体为辣根过氧化物酶标记的抗体。
10.如权利要求7所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括抗CCDC160兔多克隆抗体包被的酶标板、蛋白标准品CCDC160、TMB底物溶液、稀释液、洗涤缓冲液、终止溶液。
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