CN111549114B - 心力衰竭的生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种心力衰竭的生物标志物及其应用。该生物标志物为IL‑37，特别是IL‑37a和IL‑37b。本发明人从血浆mRNA和血浆蛋白层面均发现IL‑37a和IL‑37b在心力衰竭患者中高表达，可以区分心力衰竭患者及健康人群；针对三种类型的心力衰竭：HFrEF、HFmrEF和HFpEF，同时针对IL‑37a和IL‑37b从血浆mRNA和血浆蛋白层面进行研究比较，发现IL‑37a/IL‑37b比值可作为鉴别HFpEF的早筛、早诊标志物。本发明可以为心力衰竭(特别是HFpEF)的早筛、早诊等提供理论基础和指导意义，有利于提供患者生存率。

Description

心力衰竭的生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种心力衰竭(特别是射血分数保留性心力衰竭(Heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF))的生物标志物，如IL-37a和IL-37b，及其应用，特别是IL-37a/IL-37b比值在心力衰竭(特别是HFpEF)的诊断和预后中的应用。
背景技术
心力衰竭(heart failure，HF)简称心衰，是指由于心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群。根据射血分数(EF)高低，心衰可分为：
(1)射血分数降低的HF(HFrEF)，其中EF低于40％；
(2)中程射血分数的HF(HFmrEF)，其中EF在40～50％之间；
(3)射血分数保留性HF(HFpEF)，其中EF大于50％。
据统计，射血分数保留性心力衰竭(Heart failure with preserved ejectionfraction,HFpEF)患者占发达国家心力衰竭总人数的一半以上。同时据权威杂志报道，HFpEF的患病率在1％～3％之间，并且预计随着人类预期寿命的延长、诊断意识的提高以及肥胖、糖尿病、高血压和心房颤动患者的增多，HFpEF患病人数会进一步增加，是威胁人类健康和导致医疗负担增加的最主要病因之一。
然而，大规模的临床随机对照试验结果表明，临床治疗改善了HFrEF患者的预后，而HFpEF患者并未获益，这使得研究人员开始重新审视HFpEF的发病率、死亡率及其机制。此外，由于HFpEF患者射血分数正常，心衰的症状和体征常无特异性，因此，临床医生对HFpEF的诊断存在一定的困难。
发明内容
本发明第一方面提供一种检测IL-37基因和/或IL-37蛋白的产品在制备用于心力衰竭的诊断和/或预后的工具中的应用。
在本发明的一个实施例中，上述IL-37为IL-37a。
在本发明的一个实施例中，上述IL-37为IL-37b。
在本发明的一个实施例中，上述IL-37为IL-37a和IL-37b。
具体地，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)、中程射血分数的心力衰竭(HFmrEF)和射血分数保留性心力衰竭(HFpEF)；在本发明的一个实施例中，上述心力衰竭为射血分数保留性心力衰竭。
在本发明的一个实施方式中，在上述应用中，IL-37为IL-37a，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭、中程射血分数的心力衰竭和射血分数保留性心力衰竭，特别是射血分数保留性心力衰竭。
在本发明的另一个实施方式中，在上述应用中，IL-37为IL-37b，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭、中程射血分数的心力衰竭和射血分数保留性心力衰竭。
在本发明的另一个实施方式中，在上述应用中，IL-37为IL-37a和IL-37b，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭、中程射血分数的心力衰竭和射血分数保留性心力衰竭，特别是射血分数保留性心力衰竭。
具体地，上述检测IL-37基因和/或IL-37蛋白的产品包括检测IL-37基因和/或IL-37蛋白的表达水平的试剂。
在本发明的一个实施方式中，上述试剂包括能够定量IL-37基因mRNA的试剂。
在本发明的一个实施方式中，上述试剂包括能够定量IL-37蛋白的试剂。
具体地，上述能够定量IL-37基因mRNA的试剂可以包括IL-37基因引物和/或IL-37基因探针。
在本发明的一个实施方式中，上述IL-37基因引物包括IL-37a基因引物和/或IL-37b基因引物。
在本发明的一个实施方式中，上述IL-37a基因引物包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，特别是由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的上游序列和由如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列组成的下游序列。
在本发明的一个实施方式中，上述IL-37b基因的引物包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，特别是由如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列组成的上游序列和由如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列组成的下游序列。
在本发明的另一个实施方式中，上述IL-37a基因引物包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列，特别是由如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列组成的上游序列和由如SEQ ID NO：8所示核苷酸序列组成的下游序列。
在本发明的另一个实施方式中，上述IL-37b基因引物包括如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列，特别是由如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成的上游序列和由如SEQ ID NO：10所示核苷酸序列组成的下游序列。
具体地，上述能够定量IL-37蛋白的试剂可以包括能够特异性结合IL-37蛋白的物质(例如抗体或其片段)。
在本发明的一个实施方式中，上述检测IL-37基因和/或IL-37蛋白的产品可以为试剂盒、芯片、试纸等产品形式，其包含能够定量IL-37基因mRNA的试剂(例如本发明上述试剂)和/或能够定量IL-37蛋白的试剂。
具体地，上述芯片可以包括基因芯片、蛋白质芯片；基因芯片可用于检测包括IL-37(特别是IL-37a和/或IL-37b)基因在内的与心力衰竭(特别是射血分数保留性心力衰竭)相关的多个基因的表达水平；蛋白质芯片可用于检测包括IL-37(IL-37a和/或IL-37b)蛋白在内的多个与心力衰竭(特别是射血分数保留性心力衰竭)相关的蛋白质的表达水平。通过将IL-37基因和/或IL-37蛋白与多个心力衰竭(特别是射血分数保留性心力衰竭)的其他标志物同时检测，可大大提高诊断的准确率。
具体地，上述基因芯片可以包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，寡核苷酸探针可包括用于检测IL-37基因转录水平的针对IL-37基因的寡核苷酸探针。
具体地，上述蛋白质芯片可以包括固相载体以及固定在固相载体的IL-37蛋白的特异性抗体。
具体地，上述试剂盒可以包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒；该基因检测试剂盒可以包括用于检测IL-37基因转录水平的试剂；该蛋白免疫检测试剂盒可以包括IL-37蛋白的特异性抗体。
具体地，上述试纸可以包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，该寡核苷酸能够检测IL-37基因的转录水平。
具体地，上述IL-37蛋白的特异性抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。该IL-37蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等，只要该片段能够保留与IL-37蛋白的结合能力即可)。本领域技术人员可以使用任何已知的方法来制备该抗体。
在本发明的另一个实施方式中，上述检测IL-37基因和/或IL-37蛋白的产品可以为高通量测序平台，其使用能够定量IL-37基因mRNA的试剂和/或能够定量IL-37蛋白的试剂对IL-37进行检测。
本发明的检测IL-37基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如聚合酶链式反应(PCR)、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、高通量测序平台等等，特别是PCR方法，例如实时荧光定量PCR法。
本发明的检测IL-37蛋白的产品可基于使用蛋白分子的已知方法来发挥其功能：ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹、质谱法、电泳法等等。
在本发明的一个实施方式中，上述检测IL-37基因的产品为荧光定量PCR试剂盒，其包含特异性扩增IL-37基因的引物(例如本发明上述引物)，可选地，其还包含管家基因引物。
在本发明的一个实施例中，上述管家基因为GAPDH基因。
在本发明的一个实施例中，上述GAPDH基因引物包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，特别是由如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列组成的上游序列和由如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列组成的下游序列。
在本发明另一个实施例中，上述管家基因为β-肌动蛋白(beta-actin)。
在本发明的一个实施例中，上述β-肌动蛋白引物包括如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列，特别是由如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列组成的上游序列和由如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列组成的下游序列。
具体地，上述试剂盒还可以包含荧光定量PCR反应所需的其他组分，如无核酸酶水、cDNA模板、缓冲液、酶、染料等。
在本发明的一个实施方式中，上述检测IL-37基因的产品为ELISA试剂盒，其包含IL-37蛋白的特异性抗体。
具体地，上述试剂盒还可以包含ELISA反应所需的其他组分，如包被板、酶、缓冲液、稀释液、显色剂、终止液、洗涤液、标准品等。
具体地，用于上述检测IL-37基因和/或IL-37蛋白的样本可以使用例如自受试者获得的组织样品或流体；在本发明的一个实施例中，该样本为血液和/或血浆。
具体地，上述用于心力衰竭的诊断和/或预后的工具可以为试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台等形式。
本发明第二方面提供一种用于心力衰竭的诊断和/或预后的工具，其包含检测IL-37基因和/或IL-37蛋白的产品。
具体地，上述检测IL-37基因和/或IL-37蛋白的产品和用于心力衰竭的诊断和/或预后的工具具有本发明上述相应定义。
本发明第三方面提供一种用于心力衰竭的诊断和/或预后的IL-37基因引物，其可用于人类受试者。
具体地，上述IL-37基因引物包括IL-37a基因引物和/或IL-37b基因引物。
在本发明的一个实施方式中，上述IL-37a基因引物包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，特别是由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的上游序列和由如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列组成的下游序列。
在本发明的一个实施方式中，上述IL-37b基因引物包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，特别是由如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列组成的上游序列和由如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列组成的下游序列。
本发明第四方面提供一种用于心力衰竭的诊断和/或预后的试剂盒，其包括本发明第三方面所述的引物，可选地，其还包含管家基因引物。该试剂盒可用于人类受试者。
在本发明的一个实施例中，上述管家基因为GAPDH基因。
在本发明的一个实施例中，上述GAPDH基因引物包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，特别是由如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列组成的上游序列和由如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列组成的下游序列。
具体地，上述试剂盒还可以包含荧光定量PCR反应所需的其他组分，如无核酸酶水、cDNA模板、缓冲液、酶、染料等。
本发明第五方面提供一种用于心力衰竭的诊断和/或预后的IL-37基因引物，其可用于犬类受试者。
具体地，上述IL-37基因引物包括IL-37a基因引物和/或IL-37b基因引物。
在本发明的一个实施方式中，上述IL-37a基因引物包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列，特别是由如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列组成的上游序列和由如SEQ ID NO：8所示核苷酸序列组成的下游序列。
在本发明的一个实施方式中，上述IL-37b基因引物包括如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列，特别是由如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成的上游序列和由如SEQ ID NO：10所示核苷酸序列组成的下游序列。
本发明第六方面提供一种用于心力衰竭的诊断和/或预后的试剂盒，其包括本发明第五方面所述的引物，可选地，其还包含管家基因引物。该试剂盒可用于犬类受试者。
在本发明另一个实施例中，上述管家基因为β-肌动蛋白(beta-actin)。
在本发明的一个实施例中，上述β-肌动蛋白引物包括如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列，特别是由如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列组成的上游序列和由如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列组成的下游序列。
具体地，上述试剂盒还可以包含荧光定量PCR反应所需的其他组分，如无核酸酶水、cDNA模板、缓冲液、酶、染料等。
本发明第七方面提供了一种诊断心力衰竭和心力衰竭的预后的方法，其包括检测受试者中IL-37基因和/或IL-37蛋白的步骤。
具体地，上述方法可包括如下步骤：
(1)测量受试者样本中的IL-37基因和/或IL-37蛋白的水平；
(2)将测得的IL-37基因和/或IL-37蛋白的水平与指示存在或不存在心力衰竭的至少一种已知比值进行比较。
具体地，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭、中程射血分数的心力衰竭和射血分数保留性心力衰竭；在本发明的一个实施例中，上述心力衰竭为射血分数保留性心力衰竭。
具体地，上述方法中，测量为体外测量，可采用本发明上述检测IL-37基因和/或IL-37蛋白的产品，特别是利用本发明第三方面所述的引物、本发明第四方面所述的试剂盒来进行测量，也可采用现有技术中已知的其他测量方法测量。
具体地，上述方法中，样本为血液和/或血浆。
具体地，上述方法中，IL-37为IL-37a和/或IL-37b。
具体地，上述方法中，IL-37的基因水平为IL-37mRNA水平。
在本发明的一个实施方式中，在上述方法中，IL-37为IL-37a和IL-37b，该方法的步骤(2)包括：计算IL-37a的测量水平和IL-37b的测量水平的比值，将计算所得的比值与受试者的患病与否相关联起来；该比值为IL-37a的蛋白水平/IL-37b的蛋白水平、IL-37amRNA水平/IL-37b mRNA水平、IL-37a的蛋白水平/IL-37b的蛋白水平+IL-37a mRNA水平/IL-37b mRNA水平。
在本发明的一个实施方式中，在上述方法中，IL-37为IL-37a，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭、中程射血分数的心力衰竭和射血分数保留性心力衰竭，特别是射血分数保留性心力衰竭。
在本发明的另一个实施方式中，在上述方法中，IL-37为IL-37b，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭、中程射血分数的心力衰竭和射血分数保留性心力衰竭。
在本发明的另一个实施方式中，在上述方法中，IL-37为IL-37a和IL-37b，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭、中程射血分数的心力衰竭和射血分数保留性心力衰竭，特别是射血分数保留性心力衰竭。
具体地，上述方法还可以包括收集样本并处理样本的步骤。
具体地，对于IL-37基因的测量，上述收集样本并处理样本的步骤包括：采血，从所采集的血液中分离单核细胞，从所分离的单核细胞中提取总RNA。
具体地，对于IL-37蛋白的测量，上述收集样本并处理样本的步骤包括：收集血浆，从所收集的血浆中提取总蛋白。
本发明第八方面提供了一种IL-37作为治疗靶标在制备预防和/或治疗心力衰竭的药物中的应用，其通过降低IL-37的基因表达水平或IL-37蛋白活性，达到预防、缓解和/或改善心力衰竭的作用。
具体地，上述IL-37为IL-37a和/或IL-37b。
具体地，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)、中程射血分数的心力衰竭(HFmrEF)和射血分数保留性心力衰竭(HFpEF)；在本发明的一个实施例中，上述心力衰竭为射血分数保留性心力衰竭。
在本发明的一个实施方式中，在上述应用中，IL-37为IL-37a，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭、中程射血分数的心力衰竭和射血分数保留性心力衰竭，特别是射血分数保留性心力衰竭。
在本发明的另一个实施方式中，在上述应用中，IL-37为IL-37b，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭、中程射血分数的心力衰竭和射血分数保留性心力衰竭。
在本发明的另一个实施方式中，在上述应用中，IL-37为IL-37a和IL-37b，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭、中程射血分数的心力衰竭和射血分数保留性心力衰竭，特别是射血分数保留性心力衰竭。
本发明第九方面提供一种IL-37抑制剂在制备预防和/或治疗心力衰竭的药物中的应用。
具体地，上述IL-37为IL-37a和/或IL-37b。
具体地，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)、中程射血分数的心力衰竭(HFmrEF)和射血分数保留性心力衰竭(HFpEF)；在本发明的一个实施例中，上述心力衰竭为射血分数保留性心力衰竭。
在本发明的一个实施方式中，在上述应用中，IL-37为IL-37a，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭、中程射血分数的心力衰竭和射血分数保留性心力衰竭，特别是射血分数保留性心力衰竭。
在本发明的另一个实施方式中，在上述应用中，IL-37为IL-37b，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭、中程射血分数的心力衰竭和射血分数保留性心力衰竭。
在本发明的另一个实施方式中，在上述应用中，IL-37为IL-37a和IL-37b，上述心力衰竭选自：射血分数降低的心力衰竭、中程射血分数的心力衰竭和射血分数保留性心力衰竭，特别是射血分数保留性心力衰竭。
具体地，上述IL-37抑制剂是指对IL-37具有抑制效果的分子，该抑制效果包括但不限于：抑制IL-37的活性，抑制IL-37基因转录或表达。该IL-37抑制剂包括但不限于，抗体或其抗原结合片段、干扰RNA、小分子化合物等。
本领域技术人员还可以使用常规方法对IL-37的基因转录或表达进行调节，如基因敲除、同源重组、干扰RNA等。
发明人从血浆mRNA和血浆蛋白层面均发现IL-37a和IL-37b在心力衰竭患者中高表达，可以区分心力衰竭患者及健康人群；首次针对三种类型的心力衰竭：HFrEF、HFmrEF和HFpEF，同时针对IL-37a和IL-37b从血浆mRNA和血浆蛋白层面进行研究比较，发现IL-37a/IL-37b比值可作为鉴别HFpEF的早筛、早诊标志物。基于HFpEF的研究进一步认识HFpEF的病理生理学分子机制，本发明可以为心力衰竭(特别是HFpEF)的早筛、早诊等提供理论基础和指导意义，有利于提供患者生存率。
附图说明
图1所示为IL-37a和IL-37b mRNA在犬心衰动物模型中的表达情况。
图2所示为IL-37a和IL-37b mRNA在临床样本Ctrl组、HFrEF组、HFmrEF组和HFpEF组各组中的表达情况。
图3所示为ELISA检测IL-37a和IL-37b蛋白在临床样本Ctrl组、HFrEF组、HFmrEF组和HFpEF组各组中的表达情况。
图4所示为mRNA层面IL-37a/IL-37b比值和血浆层面IL-37a/IL-37b比值作为HFpEF早筛、早诊标志物的ROC曲线图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
IL-37(白细胞介素-37)，属于IL-1家族的7号成员，也称为IL-1F7，人IL-37具有5种同种型：a、b、c、d和e，当涉及本文中的IL-37时，除非另有明确说明，否则所有这些均包括在内。
在本发明中，“IL-37的基因”包括IL-37的基因以及其任何功能等同物的多核苷酸，例如与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中IL-37的基因DNA序列具有70％以上(例如80％以上，90％以上，95％以上，96％以上，97％以上，98％以上，99％以上，99.5％以上)同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
在本发明中，“表达水平”是指样品中基因产物的可测量的量，其中基因产物可以是转录产物或翻译产物。因此，表达水平与核酸基因产物(如mRNA或cDNA)或多肽基因产物有关。
“IL-37蛋白”包括IL-37蛋白以及IL-37蛋白的任何功能等同物。该功能等同物包括IL-37蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与IL-37的基因DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
在本发明中，“引物”通常指与靶序列互补和退火的线性寡核苷酸。引物长度的下限按杂交能力而定，因为非常短的引物(例如小于5个核苷酸)在大多数杂交条件下形不成热力学稳定的双链体。引物长度通常在8-50个核苷酸内变化。在某些实施方案中，引物介于大约15-25个核苷酸之间。本发明中“正向引物”是指与靶DNA的一条特定链退火的寡核苷酸，“反向引物”是指与靶DNA的相反链退火的寡核苷酸。总之，正向引物和反向引物通常以类似于PCR引物的方式定向在靶DNA序列上，使得其3'末端比其5'末端更接近靶序列。天然存在的核苷酸(尤其是鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，在下文称为“G”、“A”、“C”和“T”)以及核苷酸类似物，都可作为本发明的引物。
在本发明中，引物可以通过使用本领域技术人员已知的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备；探针可以通过使用本领域技术人员已知的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
在本发明中，抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽，抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测IL-37蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的IL-37蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对IL-37蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
在本发明中，疾病(如心力衰竭，特别是射血分数保留性心力衰竭)的“诊断”既包括判断受试者是否已经患有该疾病，也包括判断受试者是否存在患有该疾病的风险。
在本发明中，“预后”是指患者在通过手术处理等抑制或缓解疾病(如心力衰竭，特别是射血分数保留性心力衰竭)后的过程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理等抑制或缓解疾病(如心力衰竭，特别是射血分数保留性心力衰竭)后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生存状态。预后可以通过检查生物标志物来预测。预后预测可以这样进行：根据生物标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
在本发明中，“预后良好”是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解疾病(如心力衰竭，特别是射血分数保留性心力衰竭)之后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。
在本发明中，“预后不良”是指患者在通过手术处理等抑制或缓解疾病(如心力衰竭，特别是射血分数保留性心力衰竭)后的短时期(例如1、2、3、4、5年或更短)内发生致命状况。
预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，根据本发明的生物标志物的水平升高或降低的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。
在本发明中，术语“患者”、“受试者”、“个体”等等在本文中可交换使用，并指的是服从本文描述方法的任何动物或其细胞，不论是体外或原位受试者。在一些非限制性实施例中，受试者可以为哺乳动物，如，人类、非人灵长类动物、狗、兔等；在本发明的一个实施例中，受试者为人类。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：IL-37a和IL-37b mRNA在犬心衰动物模型中的表达情况
1.构建犬起搏性心力衰竭模型
通过心动过速诱发构建犬心力衰竭模型，即在模式动物犬的左心室或右心室植入起搏电极，使心率超常，通常是基线值的三倍，一般为3至5周。
心动过速诱发构建犬心力衰竭模型参考文献：Kiyotake Ishikawa(ed.),Experimental Models of Cardiovascular Diseases:Methods and Protocols,Methodsin Molecular Biology,vol.1816,Chapter 24,Canine Model of Pacing-Induced HeartFailure,Springer Science+Business Media,LLC,part of Springer Nature 2018。
2.建模前采血
采用后肢外侧小隐静脉采血：后肢外侧小隐静脉在后肢胫部下1/3的外侧浅表的皮下，由前侧方向后行走。抽血前，将狗固定在狗架上或使狗侧卧，请人帮忙将狗固定好。将抽血部位的毛剪去，碘酒、乙醇消毒皮肤。采血时将左手拇指和食指握紧剪毛区上部，使下肢静脉充盈，右手用连有6号或7号针头的注射器迅速刺入静脉，左手放松将针固定，以适应速度抽血(以无气泡为宜)，并防止抽瘪血管。采血部位剪毛、消毒，实验者用左手拇指和食指握紧剪毛区上部或扎紧止血带，便远端静脉充血，右手用接有7号针头的注射器刺入静脉，左手放松，以适当速度抽血。每次抽取10ml血。
3.建模后采血：6周后通过后肢外侧小隐静脉采血，方法同前。每次抽取10ml血。
4.IL-37a和IL-37b转录本引物设计及荧光定量PCR扩增
4.1分离单核细胞：采用Ficoll-paque plus(Invitrogen,USA)淋巴细胞分离液和UntouchedTMHuman Monocytes(invitrogen)针对全血分离获得单核细胞。
4.2提取总RNA：采用Trizol一步法提取实验样品总RNA。
4.3设计、合成犬的IL-37a和IL-37b引物序列：经MUSLE在线软件进行序列比对、然后采用Primer Premier 6设计引物序列，如表1所示；引物序列送上海生工合成。
表1引物序列
注：dIL-37a和dIL-37b是指物种犬的IL-37a和b亚型；以beta-actin为管家基因。
4.4荧光定量PCR扩增(以beta-actin为管家基因)：
按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific,USA)说明书进行反转录合成cDNA模板；
按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific,USA)和TransStart tip green qPCR supermix(2x)说明书，在实时荧光定量PCR仪(CFX96,BioRad)进行RT-qPCR实验。
4.5荧光定量PCR数据分析：动物实验结果如图1所示，其表明IL-37a和IL-37b转录本在心衰模型组相比对照组中均是高表达的，分别为差异显著(P＜0.05)和差异极显著(P＜0.01)；然后通过比较发现HF组IL-37a/IL-37b比值明显比对照组要低；而且在射血分数高于50％的心衰模型个体中IL-37a/IL-37b约为0.5050±0.0073，而在EF＜40％或EF值在40-50％之间的HF，IL-37a/IL-37b比值则比较分散跨度很大0.3121-0.7579。由此想看下如果基于临床样本是否在存在同样的规律，从而为射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)早筛、早诊这方面提供更多的研究基础。
实施例2：IL-37a和IL-37b mRNA在临床样本Ctrl组、HFrEF组、HFmrEF组和HFpEF组各组中的表达情况
1.针对健康体检者为正常对照组(Ctrl组)、HFrEF(HFrEF组)、HFmrEF(HFmrEF组)和HFpEF(HFpEF组)患者收集血液样本。
入组要求：心力衰竭的诊断标准参照2014年中国心力衰竭指南：具备心力衰竭的症状体征；NT-proBNP>300pg/ml。
排除标准：年龄小于18岁患者；LVEF<50％及各种先天性心脏病、心脏瓣膜病、心肌病、心包病、急性心肌梗死、急性心肌炎、原发性肺动脉高压、持续性房颤、甲亢、甲减、肿瘤等患者；主要临床资料不全者(如缺乏LVEF，NT-proBNP等)。对于一年内重复住院的患者，取首次住院记录。
于入院时收集并记录所有入选患者的人口统计学特点、查体结果、纽约心脏病协会(NYHA)心功能分级、心衰病因、伴随疾病及用药等情况。所有患者均根据指南给予标准治疗。入院24h内对患者行超声心动图检查评价心脏结构及左心室功能。依据左心室射血分数(LVEF)，把心衰分为射血分数降低型心衰(HFrEF)(LVEF<40％)和射血分数保留型心衰(HFpEF)(LVEF>50％)以及射血分数中间值型心衰(HFmrEF)(49％>LVEF>40％)三组。
2.IL-37a和IL-37b荧光定量PCR实验
2.1.分离单核细胞提取总RNA。
2.2设计、合成人的IL-37a和IL-37b引物，引物序列如表2所示。
表2引物序列
注：hIL-37a和hIL-37b是指物种人的IL-37a和b亚型，以GAPDH为管家基因。
2.3荧光定量PCR扩增(以GAPDH为管家基因)。
3.荧光定量PCR实验结果发现：
IL-37a和IL-37b mRNA在Ctrl组、HFrEF组、HFmrEF组和HFpEF组中表达情况如图2所示，其表明：
HFrEF组、HFmrEF组和HFpEF组分别相比于Ctrl组，IL-37a mRNA均高表达，差异显著(P＜0.05)；
HFrEF组、HFmrEF组和HFpEF组分别相比于Ctrl组，IL-37b mRNA均高表达，差异极显著(P＜0.01)；
mRNA层面，比较发现IL-37a和IL-37b在HFpEF患者中比值趋0.6588±0.0820，是在一个相对狭窄的范围内的，这跟动物模型层面类似；而在另外两组中，HFmrEF组IL-37a和IL-37b比值为0.4549±0.0649、HFrEF组IL-37a和IL-37b比值为0.4618±0.0764。
实施例3：ELISA检测IL-37a和IL-37b蛋白在临床样本Ctrl组、HFrEF组、HFmrEF组和HFpEF组各组中的表达情况
1.基于实施例2收集获得的临床血浆样本开展ELISA实验。
2.血浆总蛋白提取及测定
(1)取50μL血浆加入50μL裂解液(已预先加入100×PMSF，100×cocktail和磷酸酶抑制剂)，充分混匀后冰上裂解15min，13000g，4℃离心10min，取上清。
(2)BCA法测定蛋白浓度。
(3)根据BCA法测定的蛋白浓度计算上样量体积后，加入5×SDS-loading buffer，100℃煮开10min。
3.ELISA实验
按照ELISA试剂盒说明书对IL-37a和IL-37b蛋白开展ELISA实验并整理数据和计算各样品中IL-37a和IL-37b蛋白的实际浓度。
试剂盒购自卡迈舒(上海)生物科技有限公司，人(Human)白细胞介素37B(IL-37B)ELISA检测试剂盒和人(Human)白细胞介素37A(IL-37A)ELISA检测试剂盒货号分别为：H5580C和H5583C。
4.IL-37a和IL-37b蛋白在Ctrl组、HFrEF组、HFmrEF组和HFpEF组中表达情况如图3所示，其表明：
HFrEF组、HFmrEF组和HFpEF组分别相比于Ctrl组，ELISA结果发现IL-37a均高表达，差异显著(P＜0.05)；
HFrEF组、HFmrEF组和HFpEF组分别相比于Ctrl组，ELISA结果发现IL-37b均高表达，差异极显著(P＜0.01)；
蛋白层面，比较发现IL-37a和IL-37b在HFpEF患者中比值趋于1.8744±0.9142，是在一个相对狭窄的范围内的，和mRNA层面结果类似；而IL-37a和IL-37b比值在另外两组中，则分布为0.572±0.2262(HFrEF)；0.5594±0.2052(HFmrEF)。
实施例4：HFpEF IL-37a/IL-37b的ROC曲线分析
受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线)，是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以真阳性率(灵敏度)为纵坐标，假阳性率(1-特异度)为横坐标绘制的曲线。ROC曲线越靠近左上角，试验的准确性就越高，亦可通过计算每个ROC曲线下的面积(AUC)进行比较，面积越大，则诊断价值最佳。
mRNA层面IL-37a/IL-37b比值和血浆蛋白层面IL-37a/IL-37b比值作为HFpEF早筛、早诊标志物的ROC曲线图如图4所示。其中，血浆mRNA层面IL-37a/IL-37b作为HFpEF的早筛、早诊标志物，其ROC曲线下面积为0.9732(95％CI:0.9488-0.9976,P<0.0001)；血浆蛋白层面IL-37a/IL-37b作为HFpEF的早筛、早诊标志物，其ROC曲线下面积为0.7868(95％CI:0.7372-0.8364,P<0.0001)；血浆mRNA层面联合血浆蛋白IL-37a/IL-37b作为HFpEF的早筛、早诊标志物，其ROC曲线下面积为0.9840(95％CI:0.9672-0.9882,P<0.0001)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
在本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 承启医学（深圳）科技有限公司
<120> 心力衰竭的生物标志物及其应用
<130> 1
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
aggctgtgat aggagggaaa c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
gtccaggacc agtactttgt ga 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
ttgtggggga gaactcagga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
attcatggtg gggaggcttg 20
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<212> DNA
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<400> 5
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<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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ggactccacg acgtactca 19
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<212> DNA
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tggaggactc aggagtgaag a 21
<210> 8
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<212> DNA
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<400> 8
tcacttttgg accttctgag ca 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
ctacaaatgg atgaggacca ga 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
tgggcagagc ttatggaagt g 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 11
aggccaaccg cgagaagatg acc 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 12
gaagtccagg gcgacgtagc ac 22

Claims (8)

1.一种定量检测IL-37基因和/或IL-37蛋白的产品在制备用于心力衰竭的诊断的工具中的应用；
其中，所述IL-37为IL-37a和IL-37b；
其中，所述心力衰竭为射血分数保留性心力衰竭；
其中，所述检测IL-37基因和/或IL-37蛋白的产品包括检测IL-37基因和/或IL-37蛋白的表达水平的试剂，将IL-37a/IL-37b比值作为标志物；
其中，用于检测IL-37基因和/或IL-37蛋白的样本为受试者的血液或血浆。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测IL-37基因的引物和/或探针。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测IL-37基因的引物包括检测IL-37a基因的引物和检测IL-37b基因的引物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测IL-37a基因的引物包括由如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列组成的上游引物和由如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列组成的下游引物；和
所述检测IL-37b基因的引物包括由如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列组成的上游引物和由如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列组成的下游引物。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测IL-37基因的产品为试剂盒、芯片、试纸或高通量测序平台。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测IL-37蛋白的产品为试剂盒、芯片、试纸或高通量测序平台。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测IL-37基因的产品为PCR试剂盒。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测IL-37蛋白的产品为ELISA试剂盒。
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