CN115011681B

CN115011681B - 肥厚型心肌病相关的标志分子及其在诊断肥厚型心肌病中的应用

Info

Publication number: CN115011681B
Application number: CN202111662156.2A
Authority: CN
Inventors: 吴金涛; 李飞飞; 张雷明; 胡娟
Original assignee: Henan Provincial Peoples Hospital
Current assignee: Henan Provincial Peoples Hospital
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN115011681A

Abstract

本发明公开了肥厚型心肌病相关的标志分子及其在诊断肥厚型心肌病中的应用，所述肥厚型心肌病相关的标志分子为基因COMP和SERPINE1两者联合，经验证发现，所述标志分子用于诊断肥厚型心肌病时表现出较高的准确性、敏感性和特异性，采用本发明公开的方法进行肥厚型心肌病的诊断，具有准确、简便、快速和经济等特点，本发明为肥厚型心肌病的临床早期分子诊断和预防提供了一种全新的方法。

Description

肥厚型心肌病相关的标志分子及其在诊断肥厚型心肌病中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及肥厚型心肌病相关的标志分子及其在诊断肥厚型心肌病中的应用。

背景技术

肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是最常见的单基因遗传性心血管病，发病率为1/500(Maron B J.Hypertrophic cardiomyopathy:a systematicreview[J].Jama,2002,287(10):1308-1320.)。该疾病临床表现多样，从无症状到呼吸困难、晕厥、心律失常、心力衰竭不尽相同，最恶劣的并发症为心源性猝死(Sudden cardiacdeath，SCD)，发生率约为0.8％(Maron B J,Olivotto I,Spirito P,et al.Epidemiologyof hypertrophic cardiomyopathy–related death:revisited in a large non-referral-based patient population[J].Circulation,2000,102(8):858-864.)。肥厚型心肌病患者由于室间隔异常增厚使得左心室收缩时二尖瓣叶前移与室间隔的贴靠造成左心室流出道狭窄，射血量减少，进而导致患者活动时胸闷、晕厥等临床症状。肥厚型心肌病为35岁以下青年人和运动员发生猝死的最主要原因，给家庭和社会造成了重大损失。

目前，肥厚型心肌病的诊断和治疗方法还比较局限，治疗方法主要分为药物治疗和非药物治疗。其中，药物治疗主要使用的药物包括：受体阻滞剂、地尔硫卓、丙吡胺及维拉帕米等；非药物治疗包括手术治疗、起搏治疗以及介入治疗等，非药物治疗后依然建议患者继续使用药物治疗来改善后期的相关症状。此外，相关研究学者指出要借助基因工程的手段才有可能治愈肥厚型心肌病(Fosslien E.Mitochondrial medicine–cardiomyopathycaused by defective oxidative phosphorylation[J].Annals of Clinical&Laboratory Science,2003,33(4):371-395.)。目前，关于肥厚型心肌病的致病机制尚未完全明确，因此，揭示肥厚型心肌病的致病机制，识别其相关的重要生物标志物，对肥厚型心肌病的早期诊断和早期治疗均具有重要的科学意义与临床意义。

随着分子生物学理论和技术的快速发展，涉及疾病发生的多种生物学过程中的多种分子，如核酸、蛋白质、糖类、脂类、小分子代谢物乃至血液中游离的细胞，均可作为重要的疾病相关的生物标志物，给临床诊断、预防和治疗疾病提供了明确的依据。虽然国内外对肥厚型心肌病致病的分子机制研究有了较大的进展并取得了一定成果，但是已识别出的重要生物标志物比较有限。因此，目前本领域仍亟需寻找肥厚型心肌病相关的特异性生物标志物，并将其应用于临床肥厚型心肌病的早期筛查诊断中，以最大限度地预防、降低肥厚型心肌病引起的心源性猝死的发生。

发明内容

鉴于此，为了弥补目前本领域存在的上述技术空白，本发明的目的在于提供肥厚型心肌病相关的标志分子及其在诊断肥厚型心肌病中的应用，所述标志分子为COMP和SERPINE1两者联合。

为了实现本发明的上述目的，本发明采用了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断肥厚型心肌病的产品中的应用。

进一步，所述生物标志物为COMP和SERPINE1。

进一步，所述试剂选自：

特异性扩增所述生物标志物的引物；或

特异性识别所述生物标志物的探针。

进一步，特异性扩增所述生物标志物COMP和SERPINE1的引物的序列分别如SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4所示。

进一步，所述样本选自血液或组织。

进一步，所述生物标志物是指可用于预测个体的疾病状态的不同浓度存在于个体中的生物分子。生物标志物可包括(但不限于)核酸、蛋白质及其变体和片段。生物标志物可以是包含编码该生物标志物的全部或部分核酸序列或这类序列的互补体的DNA。可用于本发明的生物标志物核酸被认为包括包含任何目的核酸序列的全部或部分序列的DNA和RNA。

进一步，本发明中所述的生物标志物包括基因COMP和SERPINE1，以及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型，所述生物标志物涵盖全长未加工的生物标志物，以及源自细胞中加工的任何形式的生物标志物，同时涵盖生物标志物的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。gene ID可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/获得，本发明中所述的生物标志物的详细信息如下：

基因COMP：全称为Cartilage oligomeric matrix protein，基因在染色体上的具体位置为19p13.11，gene ID为1311；

基因SERPINE1：全称为Serpin family E member 1，基因在染色体上的具体位置为7q22.1，gene ID为5054。

进一步，所述引物是指包含5-100个核苷酸的核酸片段，优选地，是指包含能起始酶促反应(例如，酶促扩增反应)的15-30个核苷酸。

进一步，所述探针是指包括至少5个核苷酸的核酸序列，例如，包含5-100个核苷酸，其能在指定条件下与目标基因(生物标志物)的表达产物或者该表达产物的扩增产物杂交形成复合物，杂交探针上还可以包括用于检测的标记物，所述标记物包括(但不限于)用于荧光定量PCR或荧光原位杂交的标记物。

进一步，本发明中所述的引物或探针可以使用亚磷酰胺固相载体方法或其他公知的方法化学合成。这种核酸序列可以利用本领域中公知的多种手段来进行变形。这种变形的非限制性地包括甲基化、封装、天然核苷酸的一种以上的同源物的取代以及核苷酸之间的变形，例如，变形为不带电的连接体(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电的连接体(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。优选地，本发明中所述的引物的序列分别如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4所示。

进一步，在本发明的具体实施方式中，可通过优化步骤在一系列过程中确定使探针与cDNA分子杂交的合适条件。该步骤由本领域普通技术人员通过一系列过程进行，以建立用于在实验室中使用的条件。例如，温度、成分浓度、杂交及洗涤时间、缓冲液成分及其pH以及离子强度等条件取决于探针的长度、GC量及靶核苷酸序列等各种因素。

进一步，所述诊断肥厚型心肌病的产品包括通过核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术、测序技术、色谱技术、质谱技术检测所述生物标志物COMP和SERPINE1表达水平的试剂。

进一步，所述核酸杂交技术是指互补的核苷酸序列(DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA等)通过Watson-Crick碱基配对形成非共价键，从而形成稳定的同源或异源双链分子的过程，又称为核酸杂交。

进一步，所述核酸扩增技术是指一大类技术方法的总称，目前核酸扩增技术包括常规PCR、实时荧光PCR、等温核酸扩增技术等，可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品，具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点。

进一步，所述蛋白免疫技术是指包括放射免疫测定、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定、酶免疫测定、荧光免疫测定、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、基于任何颗粒的免疫测定(例如：使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)对目标物进行检测的一类方法的统称，可在微量滴定板或条的形式中实施蛋白免疫法。

进一步，所述测序技术包括(但不限于)一代测序、二代测序、三代测序，其中，一代测序也称Sanger测序，是利用DNA聚合酶合成反应的测序技术，一代测序是基于Sanger方法的测序技术；二代测序基于大规模平行测序技术(Massive parallel analysis，MPS)，它能同时完成测序模板互补链的合成和序列数据的获取；三代测序则基于单分子测序和大规模平行测序技术。

进一步，所述色谱技术是指分离和分析复杂混合物中各个组分的方法，利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。

进一步，所述质谱技术是指利用电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片、有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子-分子相互作用产生的离子)按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出离子准确质量即可确定离子的化合物组成。

第二方面，本发明提供了一种用于早期诊断肥厚型心肌病的产品。

进一步，所述产品包括检测样本中生物标志物COMP和SERPINE1的试剂。

所述检测样本中生物标志物COMP和SERPINE1的试剂包括检测样本中生物标志物COMP和SERPINE1mRNA表达水平的试剂、检测样本中生物标志物COMP和SERPINE1编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂。

进一步，所述检测样本中生物标志物COMP和SERPINE1mRNA表达水平的试剂包括特异性识别所述生物标志物的探针、特异性扩增所述生物标志物的引物；

所述检测样本中生物标志物COMP和SERPINE1编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂包括特异性结合所述生物标志物的抗体、抗体片段、亲和性蛋白。

进一步，所述样本选自血液或组织。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片；

所述试剂盒包括特异性结合COMP和SERPINE1的引物、探针或芯片；

所述芯片包括固相载体、附着在固相载体上的特异性识别COMP和SERPINE1的探针。

进一步，所述试剂盒还包括使用说明书或标签、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

进一步，所述使用说明书或标签注明了所述试剂盒用于早期诊断筛查肥厚型心肌病。

进一步，所述产品还包括蛋白芯片、核酸膜条。

进一步，所述蛋白芯片包括固相载体，以及固定在固相载体上的所述生物标志物COMP和SERPINE1编码的蛋白的特异性抗体或配体。

进一步，所述核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。其中示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

进一步，所述抗体是指针对抗原位点的特异性免疫球蛋白，本发明中的抗体是指与本发明中所述的生物标志物COMP和SERPINE1编码的多肽和/或蛋白特异性结合的抗体，可以根据本领域中的常规方法来制造抗体，抗体的形式包括多克隆抗体或单克隆抗体、抗体片段(例如：Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体(例如：双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物结合活性即可。

进一步，所述多肽是指由氨基酸以肽键连接组成的化合物，包括多肽的全长或氨基酸片段，所述生物标志物COMP和SERPINE1编码的多肽的表达水平，可以根据样本中总蛋白的量或管家基因所编码的多肽的量来标准化。

第三方面，本发明提供了一种早期诊断肥厚型心肌病的系统和/或装置。

进一步，所述系统和/或装置包括如下单元：

(1)分析单元：所述单元适于检测受试者样本中生物标志物COMP和SERPINE1的量；

(2)评估单元：其包含存储的参考和数据处理器，所述数据处理器已经实现了用于比较分析单元测量的生物标志物COMP和SERPINE1的量与存储的参考的算法，由此诊断受试者是否患有肥厚型心肌病或预测受试者是否存在患肥厚型心肌病的风险。

进一步，在本发明的具体实施方式中，所述受试者优选为人。

进一步，在本发明的具体实施方式中，所述样本优选为受试者来源的血液或组织。

第四方面，本发明提供了一种计算机可读存储介质。

进一步，所述计算机可读存储介质上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现本发明第三方面所述的系统和/或装置。

进一步，本发明中所述的AUC值是指ROC曲线图中的曲线下面积，ROC曲线下面积是一种概率的度量，使病症的正确鉴别成为可能。按照惯例，这个面积通常大于0.5。数值范围在1.0(两个群的测试数值完全分离)和0.5(两组测试数值之间没有明显的分布差异)之间。此面积不仅依赖于曲线图的某一特定部分，比如最接近斜线的点或特异性为90％的灵敏度，而取决于整个曲线图。这定量地、描述性地表达了ROC曲线图与完美曲线(面积＝1.0)的相近程度。

相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：

本发明首次发现COMP和SERPINE1两者联合可用于肥厚型心肌病的准确诊断中，且对于肥厚型心肌病的早期诊断具有较高的准确性、灵敏度和特异性，本发明为肥厚型心肌病的临床早期诊断和预防提供了一种全新的方法。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示基因COMP和SERPINE1在训练集中的差异表达的结果图，其中，A图：COMP，B图：SERPINE1；

图2显示基因COMP和SERPINE1在验证集中的差异表达的结果图，其中，A图：COMP，B图：SERPINE1；

图3显示基因COMP和SERPINE1在训练集中的ROC曲线结果图，其中，A图：COMP，B图：SERPINE1；

图4显示基因COMP+SERPINE1联合在训练集中的ROC曲线结果图；

图5显示基因COMP和SERPINE1在验证集中的ROC曲线结果图，其中，A图：COMP，B图：SERPINE1；

图6显示基因COMP+SERPINE1联合在验证集中的ROC曲线结果图；

图7显示利用QPCR检测COMP基因在肥厚型心肌病患者和健康对照人群之间差异表达的结果图；

图8显示利用QPCR检测SERPINE1基因在肥厚型心肌病患者和健康对照人群之间差异表达的结果图；

图9显示COMP基因对肥厚型心肌病诊断效能的ROC曲线结果图；

图10显示SERPINE1基因对肥厚型心肌病诊断效能的ROC曲线结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1筛选肥厚型心肌病中差异表达的基因

1、数据来源

在本实施例中，收集肥厚型心肌病患者(HCM)及健康对照者(Control)相关的数据，所采用的数据均来自于Gene Expression Omnibus(GEO)数据库，以“Hypertrophiccardiomyopathy”为检索关键词，在GEO数据库中进行检索，在排除细胞系或动物水平上的研究、以及单样本的研究后共有两套数据集被纳入，分别为GSE141910和GSE36961；其中，GSE141910包含了28个肥厚型心肌病患者来源的样本和166个健康对照者来源的正常样本；GSE36961数据集中包含有106肥厚型心肌病患者来源的样本和39个健康对照者来源的正常样本；

将上述从GEO数据库中下载的数据集GSE141910作为训练集，样本量为Control：HCM＝166：28；将上述从GEO数据库中下载的数据集GSE36961作为验证集，样本量为Control：HCM＝39：106。

2、数据预处理

对上述从GEO数据库下载的训练集和验证集的原始数据进行了标准化处理。其中，对于下载的数据集GSE141910和GSE36961的基因表达矩阵文件，使用GPL平台注释文件对基因表达谱进行注释，将基因探针转换成gene symbol，其中多个探针对应同一个基因的，取平均值作为该基因的表达量。

3、差异表达分析

使用R软件中的“limma”包分别对上述数据集GSE141910和GSE36961中经预处理的数据进行差异表达分析，其中，差异表达基因的筛选标准均为：adj.P.Value<0.05，|log₂FC|>1。

4、实验结果

结果显示，筛选得到的训练集和验证集中的差异表达基因取交集后得到50个共有的表达趋势一致的差异表达基因，其中，筛选出的差异表达基因COMP和SERPINE1在训练集中的差异表达情况见表1和图1，在验证集中的差异表达情况见表2和图2，基因COMP和SERPINE1在肥厚型心肌病中的表达情况分别为上调、下调，且差异具有显著的统计学意义(adj.P.Value<0.05)。

表1 基因在训练集中的差异表达结果

基因	<![CDATA[log<sub>2</sub>FC]]>	AveExpr	t	P.Value	adj.P.Val
						COMP	1.91456	8.62182	4.68287	5.30E-06	4.95E-05
SERPINE1	-1.41018	13.06595	-4.38577	1.89E-05	0.00015

表2 基因在验证集中的差异表达结果

基因	<![CDATA[log<sub>2</sub>FC]]>	AveExpr	t	P.Value	adj.P.Val
						COMP	1.09909	7.09205	6.11165	8.49E-09	9.23E-08
SERPINE1	-2.02012	7.05559	-10.42685	2.20E-19	1.32E-17

实施例2基因COMP和SERPINE1对肥厚型心肌病诊断效能的验证

1、实验方法

对实施例1中筛选出的在肥厚型心肌病中显著差异表达的基因COMP和SERPINE1，使用R包“pROC”(版本1.15.0)执行接收器工作特性(ROC)分析，计算曲线下面积(AUC)以评估基因COMP、基因SERPINE1、基因COMP+SERPINE1两者联合分别在训练集和验证集中对诊断肥厚型心肌病的准确性，以及其敏感性和特异性。AUC值的范围是0到1，其中，0.7是可接受的性能，而0.9是优异的性能；

在判断单独指标在训练集和验证集中的诊断效能时，直接使用基因的表达量进行分析，选择Youden指数最大的一点对应的水平作为其cutoff值，AUC在0.5<AUC<0.8的基因被用于联合分析；

在判断指标联合在训练集和验证集中的诊断效能时，对各基因的表达水平进行Logistics回归分析，通过拟合出的回归曲线计算出每个个体患病与否的概率，确定不同的概率划分阈值，根据确定的概率划分阈值，计算得出联合诊断方案的灵敏度、特异性以及准确性等。

2、实验结果

结果见表3-4和图3-6，结果显示COMP+SERPINE1两者联合对肥厚型心肌病的诊断效能显著优于单个基因COMP、SERPINE1的诊断效能，COMP+SERPINE1两者联合在训练集和验证集中的AUC值、敏感性和特异性均较高，表明了COMP+SERPINE1两者联合对肥厚型心肌病诊断的准确性高，能够应用于肥厚型心肌病的早期筛查诊断中。

表3 基因在训练集中的诊断效能结果

基因	AUC	敏感性	特异性
				COMP	0.749	0.857	0.554
SERPINE1	0.758	0.536	0.940
				COMP+SERPINE1	0.885	0.893	0.807

表4 基因在验证集中的诊断效能结果

基因	AUC	敏感性	特异性
				COMP	0.825	0.689	0.846
SERPINE1	0.884	0.821	0.846
				COMP+SERPINE1	0.935	0.953	0.821

实施例3 QPCR验证基因COMP和SERPINE1的差异表达情况及其诊断效能

1、样本收集

分别收集15例健康对照者的血液样本和23例肥厚型心肌病患者的血液样本各5mL，EDTA抗凝，-80℃冷冻储存。上述所有参与者均已知情同意，所述肥厚型心肌病患者均经心脏彩超检查，并经过临床诊断确诊，上述所有样本的取得均通过组织伦理委员会的同意；

其中，肥厚型心肌病组的纳入标准和排除标准如下：

(1)纳入标准：通过心脏彩超的测量，室间隔或左心室壁厚度≥15mm，或室间隔与左室后壁之比≥1：3；

(2)排除标准：先天性心脏病患者、先天性心脏病术后患者、淀粉样变心脏病患者、风湿性心脏病患者、起搏器植入患者、房室传导阻滞患者，既往高血压预激综合征等引起继发性心室肥厚患者。

2、总RNA的提取

取出冰冻血液样本，于37℃水浴或室温水浴中融化血液，进一步利用Invitrogen的血液RNA提取试剂盒提取RNA样品(具体操作详见说明书)，并保存于-80℃备用。加入TRIzol后室温下放置10min，使收集的血液样品充分裂解(注：如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存)。每1mL TRIzol加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀后，室温放置3-5min，使其自然分相。4℃、12,000rpm离心15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中。在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15min。4℃、12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。RNA沉淀中加入1mL 75％乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1mL TRIzol加入1mL 75％乙醇。4℃、8,000rpm离心5min，弃上清。室温放置晾干后，在沉淀内加入50μL RNase-free水，以充分溶解RNA，-70℃保存。

3、RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8-2.2之间。

4、逆转录

取总RNA 2μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μL，充分混匀。70℃水浴5min后，立即冰浴2-3min；继续加入5×逆转录缓冲液5μL，dNTP(2.5mM)5μL，RNasin 40U/μL，反转录酶M-MLV 200U/μL，补无核酶水至预期体积，42℃水浴60min后，95℃水浴5min以灭活反转录酶M-MLV。

5、QPCR扩增反应

(1)引物设计

根据Genbank中基因COMP和基因SERPINE1的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

COMP基因：

正向引物为5’-ATACAGGAGACACAGAGT-3’(SEQ ID NO:1)；

反向引物为5’-AACCAACGATAGGACTTC-3’(SEQ ID NO:2)；

SERPINE1基因：

正向引物为5’-TTGAGTGCTTGTTAGAGA-3’(SEQ ID NO:3)；

反向引物为5’-CTGGACTTCCTGAGATAC-3’(SEQ ID NO:4)；

GAPDH基因：

正向引物为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO:5)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO:6)。

(2)配制PCR反应体系

正向引物和反向引物各1μL，SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μL，模板2μL，加入去离子水补足至25μL。

(3)PCR反应条件

95℃3min，(95℃15s，58℃60s，72℃30s)*40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

6、统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异分析采用t检验，认为当P<0.05时差异具有统计学意义。

7、实验结果

结果显示，与健康对照组的血液相比，COMP基因mRNA的表达水平在肥厚型心肌病患者组中呈现显著上调(见图7)，SERPINE1基因mRNA的表达水平在肥厚型心肌病患者组中呈现显著下调(见图8)，差异具有显著的统计学意义(*P<0.05)，其对肥厚型心肌病的诊断效能结果见图9和图10，AUC值分别为0.759和0.829，这一结果进一步表明了基因COMP和SERPINE1可作为肥厚型心肌病的诊断标志物。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 河南省人民医院

<120> 肥厚型心肌病相关的标志分子及其在诊断肥厚型心肌病中的应用

<141> 2021-12-31

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atacaggaga cacagagt 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaccaacgat aggacttc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgagtgctt gttagaga 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctggacttcc tgagatac 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims

1.检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断肥厚型心肌病的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物为COMP和SERPINE1；

所述试剂为特异性扩增COMP的引物和特异性扩增SERPINE1的引物；

所述特异性扩增COMP的引物如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示；

所述特异性扩增SERPINE1的引物如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4所示；

所述样本为血液。