KR20110014983A - 심장 동종이식 만성 거부반응 진단방법 - Google Patents

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바브리엘라 코헨프레우이
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Abstract

본 발명은 유전자 발현 프로파일, 단백질 발현 프로파일, 또는 조합적 유전자 및 단백질 발현 프로파일을 이용하여 심장동종이식에 대한 만성 거부반응을 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

심장 동종이식 만성 거부반응 진단방법{METHODS OF DIAGNOSING CHRONIC CARDIAC ALLOGRAFT REJECTION}
본 출원은 본원에 참조로 포함되는 2008년4월10일 출원된 미국임시출원 61/071,056; 및 2009년3월3일 출원된 미국출원 61/157,166의 우선권 이익을 주장한다.
본 발명은 유전자 발현 프로파일, 단백질 발현 프로파일 또는 유전자 및 단백질 발현 프로파일을 이용한 심장 동종이식 만성 거부반응을 진단하는 방법에 관한 것이다.
말기 주요 장기 부전 환자들에게 이식은 일차적인 치료방법으로 고려된다. 사이클로스포린 및 타크로리무스와 같은 면역억제제가 동종이식 수령자 생존 및 복지를 개선하지만, 동종이식 거부반응을 가능한 조기에 확인하고 유효한 검사 및 면역억제제 투여 조절은 동종이식 수령자의 생존에 있어 여전히 중요하다.
일반적으로 동종이식 거부반응은 제공조직에 의해 발현되는 비자기 항원에 대한 수령자 면역반응으로 기술된다. 급성 거부반응은 이식 수일 또는 수주 내에 발생하며, 만성 거부반응은 더 지연된 과정으로 이식 후 수개월 또는 수년에 발생할 수 있다.
현재, 심내막심장근, 간 중심(core), 및 신장 세침흡인 생검과 같은 침입적 생검이 동종이식 거부반응에 대한 감시 및 진단의 최적 표준으로 널리 인식되고 있으나, 침입적 절차는 그 자체 위험성을 동반한다 (참고. Mehra MR, 등. Curr.Opin.Cardiol. 2002 3월;17(2):131-136). 또한 생검 결과는 간 동종이식 거부반응 등급을 위한 반프 모형(Ormonde 등. 1999. Liver Transplantation 5:261-268) 또는 개정 ISHLT 이식 스케일 (Stewart 등. 2005. J Heart Lung Transplant, 2005; 24: 1710-20)과 같은 국제적 가이드라인이 존재하지만 시료취급 오류 및 관찰자 간의 변동성으로 인하여 재현 및 해석의 문제가 있다. 만성 심장 거부반응을 검사하기 위한 덜 침입적인 (영상) 기법 예를들면 혈관조영술 및 FVUS이 개발되었지만, 이들 역시 생검과 관련된 문제들과 유사한 한계가 있다.
심장 동종이식 혈관증 (CAV) 진행은 심장이식 수령자 장기 생존에 중요한 제한요인 및 동종이식 만성 거부반응 (CR) 지표로 널리 인식된다. 현재, 가장 일반적으로 적용되는 CAV 발견 표준은 관상혈관조영술이며, 이는 침입적이고 상대적으로 둔감한 방법이다. CAV는 전형적으로 심장 동종이식편에서 훼손된 관상혈관을 따라 혈관 손상 및 동심적 섬유 내막 과형성/혈관 병변에 특징이 있다. CAV가 이식 후 첫해 생존 환자 사망의 주요 원인으로 인식되므로, 조기 발견은 점차로 중요해진다. 그러나 부분적으로는 심장 탈신경 결과 허혈에 대한 임상적 증상이 없으므로 조기-CAV 진단은 때로 어려운 작업이다. 현재 관상 혈관조영술이 CAV 표준진단법으로 적용된다. 이식센터에서 널리 사용되지는 않지만 상대적으로 더욱 민감한 기술인 혈관내초음파 (IVUS)가 CAV 진단의 대체 도구이다 (Schmauss 등., 2008. Circulation 117:2131-2141 검토). 수명 기대치 역시 심장 거부반응에 따라 영향을 받고 - 심장 수령자의 장기 (예를들면 10년) 생존율은 거의 50%이며, 만성 거부반응 (CR) 발현에 의한 심장 동종이식 혈관증 (CAV) 진행으로 크게 제한된다.
생검으로 결정되는 동종이식 급성 거부반응 경중도는 표준화 참조 지표에 의해 등급화된다. 심장 및 폐 이식 국제협회 스케일 (ISHLT)에 따르면 심장 이식 개체에 대한 생검 시료 등급화 수단을 제공한다 (표 1).
병리조직학적 생검 분석을 위한 심장 및 폐 이식 국제협회의 급성 심장이식 거부반응 등급화.
등급 참고
OR 급성 세포성 거부반응 없음: 단핵염증 또는 근세포 손상 또는 괴사 증거 없음
1R 가벼운, 낮은-등급의 급성 세포성 거부반응: 단핵세포 존재 및 제한적인 근세포 손상 및 괴사
2R 중등도, 중간-등급의 급성 세포성 거부반응: 연관 근세포 손상 및 괴사를 가지는 둘 이상의 단핵세포 부위 존재. 손상은 동일 생검 또는 별개의 두 생검에서 발견. 호산구 존재.
3R 심각, 높은-등급의 급성 세포성 거부반응: 만연, 확산 근세포 손상 및 괴사, 및 여러 생검에 걸쳐 정상 구조 붕괴, 부종, 조직내 출현 및 혈관염 존재. 침윤물은 다형성일 수 있다.
동종이식 거부반응 지표들은 하나 이상의 국소적 또는 전신 염증, 조직 손상, 동종이식편의 면역세포 침윤, 조직- 및 혈액-유도 단백질 조성 및 농도 변경, 동종이식조직의 차등 산소화, 부종, 내피 후박화, 콜라겐 함량 증가, 심근내부 혈류 변경, 감염, 동종이식편 및/또는 주위 조직 괴사 등에 의해 나타나는 고조된 국소화 면역반응을 포함한다.
동종이식 거부반응은 '급성' 또는 '만성'으로 분류된다. 일반적으로 급성 거부반응은 개체가 동종이식편을 수령한 후 6개월 이내 조직 또는 장기 동종이식의 거부반응이다. 급성 거부반응은 제공조직의 세포 및 체액 손상에 특징이 있고 조직 또는 장기의 신속한 이식편 기능장애 및 기능상실로 이어진다. 만성 거부반응은 통상 동종이식편 수령 후 6개월 수년 이후 조직 또는 장기의 거부반응이다. 만성 거부반응은 동종면역반응으로 인한 점진적 조직 재형성에 특징이 있고 동맥 내에 신생 내막이 형성되어 폐색 혈관증, 실질조직 섬유증 및 따라서 이식편 상실 및 손실에 이른다. 개략적으로 IUVS (혈관내초음파), 혈관조영술 및/또는 심장초음파에 의해 임상적으로 평가되거나 진단되며 필요한 경우 생검을 포함한다 (참고, 예를들면, Tsutsui 등 2001 Circulation 104:653-7; Kobashigawa 등 2005. J. American College of Cardiology 45:1532-7; Tuzcu 등 2005. J American College of cardiology 45 : 1538-42). 거부반응의 특성 및 경중도에 따라 동종이식 거부반응 -만성 또는 급성-이 진행 중이거나 예상되는 개체에서 관찰되는 지표 또는 임상적 변수들이 중첩된다.
환자에 대한 생검 및 침입적 검사 횟수를 줄이기 위한 노력이 시도되었으나 전반적으로 성공적이지 못하였으며 이는 거부반응이 개시 또는 진행되는 부위를 정확히 찾기 어렵고 또한 실제로 생검을 수행함이 없이 조직 평가가 어렵기 때문이다. 비-침입적 검사기법이 연구되었고 동종이식 거부반응의 음성 예측을 제공하였으나 임상에서는 실제로 덜 사용되는 것으로 보인다 (Mehra 등., 상기).
동종이식 만성 거부반응 분야에서, 수많은 마커들이 나열되고 일부 경우 상반된 결과들이 존재한다. 이러한 문헌상의 모순이 유전체 (약 30,000개 이상의 전사 유닛들) 복잡성, 인체의 세포 유형 (약 200 종 이상), 장기 및 조직, 및 발현 단백질 또는 폴리펩티드 (약 80,000개 이상) 다양성에 더해져 장기 거부반응 진단에 유용한 잠재적 핵산 서열, 유전자, 단백질, 대사산물 또는 이들의 조합들의 개수는 엄청나다. 개개인 변동성뿐 아니라 혈장에서의 단백질 농도의 동적 변동 범위 (10-6 내지 103 ㎍/mL, 많은 단백질이 매우 낮은 농도로 존재) 및 적지만 가장 풍부한 혈장 단백질의 과도한 함량 (총 단백질 중량의 ~ 99% 해당)이 추가적인 장애로 존재한다.
PCT 공개 WO2006/083986, WO2006/ 122407, 미국공개 2008/0153092, 2006/0141493, 미국특허 7026121 및 미국특허 7235358에는, 암에서 장기이식에 이루는 다양한 질환 단계를 진단 또는 발견하기 위한 바이오마커들 (단백질 또는 유전자) 패널을 이용한 방법을 개시한다.
Borozdenkova 등. 2004 (J. Proteome Research 3:282-288)은 심장 이식 개체 군에서 알파 B-크리스탈린 및 트로프마이오신이 상승된 것을 개시한다.
Roussoulieres 등. 2005 (Circulation 111 :2636-44)은 인간 심장이식의 생쥐모델에서 급성 거부반응에서의 CHD5 영향을 개시한다.
Ishihara, 2008 (J. Mol Cell Cardiology 45:S33)는 심장이식에서 ADIPOQ가 중요한 기능이 있음을 개시하고, 및 Nakano (Transplant Immunology 2007 17:130-136)은 간 이식 개체에서 거부반응을 극복하기 위하여 ADIPOQ의 상향조절이 필요하다는 것을 제안한다.
Hedman 등, 2007 (Pediatr Transplantation 11 :481-490)은, 소아 심장 동종이식 수령자에서 혈관조영술에 의해 발견되는 혈관증은 APOB/APOA1의 높은 비율과 연관되고, 낮은 HDL-C는 프라바스타틴 치료에 있어서 이식 혈관증 발생 예측을 개시한다.
신장 동종이식 급성 거부반응에서 IGFBP3, MSTl, CDH5 수준 변경이 관찰된다 (Fukuda 등., 1998 Growth Horm IGF Res 8:481-6; Sarwal 등., 2003. New England J. Med 349:125-138; Roussoulieres 등., 2007 J. Biomed Biotechnol . doi:l 0.1155/2007/41705).
Matsui 등, 2003 (Physiol Genomics 15:199-208)은 생쥐 심장 이식모델에서 공동자극 신호 차단 이후 동종이식 내성 유도 유전자 발현 프로파일을 개시한다.
Fildes 등 2008 (Transplant Immunology 19:1-11)에 의한 검토서에서 폐 이식 후 면역 프로세스에서 세포 유형의 기능이 논의되고, 급성 및 만성 거부반응에서의 AICL (CLEC2B)의 NK 세포 단백질과의 상호작용 기능이 개시된다.
다양한 암을 진단하고 검사하기 위한 다중 플랫폼 (단백질, 유전자)의 일체화가 제안되었으나 단백질 및 mRNA 발현 간 불일치가 본 분야에서 확인되었다 (Chen 등, 2002.Mol Cell Proteomics1:.304-313; Nishizuka 등., 2003 Cancer Research 63:5243-5250). 선행 연구들은 유전자 및 단백질 자료들 사이 낮은 상관을 보고한다 (Gygi SP 등. 1999. Mol Cell Biol.19:1720-1730; Huber 등., 2004 Mol Cell Proteomics 3:43-55).
덜 침입적이고, 재현 가능하고 더욱 신뢰할 수 있는 (시료채취 및 오류 해석에 덜 민감한), 만성 거부반응을 포함한 동종이식 거부반응 평가 또는 진단방법이 매우 요망된다.
본 발명은 유전자 발현 프로파일, 단백질 발현 프로파일 또는 유전자 및 단백질 발현 프로파일을 이용한 심장 동종이식 만성 거부반응 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명은 유전자 또는 단백질 발현 프로파일을 이용한, 만성 거부반응을 포함한 심장 동종이식 거부반응 진단방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 개체에서 동종이식 만성 거부반응 진단방법이 제공되며, 이는 a) 개체의 생물학적 시료에서, CHPTl, RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4, OSBP2, IFIT5로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 마커들의 유전자 발현 프로파일을 결정하는 단계; b) 하나 이상의 유전자 마커들의 발현 프로파일을 비-거부자 프로파일과 비교하는 단계; 및 c) 하나 이상의 유전자 마커들 발현 수준이 비-거부자 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 유전자 마커들의 증가 또는 감소는 개체의 거부반응 상태를 표시한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 개체에서 동종이식 만성 거부반응 진단용 키트가 제공되며, 이는 a) CHPTl, RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4, OSBP2, 또는 IFIT5의 하나 이상을 특정하고 정량 검출하기 위한 시약 및 이러한 시약의 사용 및 선택적으로 결과 자료를 분석하는 방법의 지시서로 구성된다. 본 키트는 또한 CHPTl, RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4, OSBP2 또는 IFIT5의 일부 또는 부분을 코딩하는 하나 이상의 유전자 또는 전사체와의 선택적 혼성화를 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 더욱 포함한다. 비-거부반응 컷오프 지표 또는 대조를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, CHPTl, RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4 및IFIT5은 대조군 대비 감소되고 OSBP2은 대조군 대비 증가될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 방법은 하나 이상의 임상 지표를 위한 수치를 획득하는 단계 및 하나 이상의 임상 지표를 대조군과 대비하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 대조군은 자가 대조군이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 방법은 표 6에 나열된 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 대조군은 비-거부반응, 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체이다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 하나 이상의 유전자 마커들의 발현 프로파일은 하나 이상의 마커들에 상응하는 RNA 서열 검출에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 하나 이상의 유전자 마커들의 유전자 발현 프로파일은 PCR에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 하나 이상의 유전자 마커들의 유전자 발현 프로파일은 혼성화에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 혼성화는 올리고뉴클레오티드에 대한 것이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 생물학적 시료는 혈액 시료이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, a) 개체의 생물학적 시료에서, IGFBP3, MSTl, CDH5, ClQB, CFHR2, CPNl, APOB, HBB, GC 및 C9에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 마커들의 단백질 발현 프로파일을 결정하는 단계; b) 하나 이상의 단백질 마커들의 발현 프로파일을 비-거부자 프로파일과 비교하는 단계; 및 c) 하나 이상의 단백질 마커들 발현 수준이 비-거부자 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 단백질 마커들 수준의 증가 또는 감소는 개체의 거부반응 상태를 표시하는, 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 개체에서 동종이식 만성 거부반응 진단용 키트가 제공되며, 이는 a) CFHR2, CPNl, APOB, HBB, GC, C9, IGFBP3, MSTl, CDH5 및 ClQB에 의해 코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드를 특정하고 정량 검출하기 위한 시약 및 이러한 시약의 사용 및 결과 자료를 분석하는 방법의 지시서로 구성된다. 비-거부반응 컷오프 지표 또는 대조를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, IGFBP3, MSTl, CDH5 및 ClQB에 의해 코딩되는 폴리펩티드 수준은 대조군 대비 감소하고 CFHR2, CPNl, APOB, HBB, GC 및 C9은 대조군 대비 증가할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 방법은 하나 이상의 임상지표 수치를 획득하는 단계 및 하나 이상의 임상지표를 대조군과 대비하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 대조군은 자가 대조군이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 비-거부자 프로파일은 비-거부반응 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체에서 얻어진다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 단백질 발현 프로파일은 면역검정에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 단백질 발현 프로파일은 ELISA에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 단백질 발현 프로파일은 질량 스펙트럼에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 단백질 발현 프로파일은 동위원소 또는 동중원소 표지방법에 의해 결정될 수 있다.
따라서 본 발명 일부 측면들의 이점은 이식조직 또는 장기에 대한 생검없이 만성 동종이식 거부반응 진단방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 유전자 발현 및 단백질 발현 프로파일을 이용한 동종이식 만성 거부반응 진단방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 측면에 의하면, 개체에서의 동종이식 거부반응 진단방법이 제공되며, 이는 a) 개체의 생물학적 시료에서, 유전자 마커 OSBP2, CHPTl, RPS26, GBP3, KLRCl, ZCCHC2, 242907, CLEC2B, PDK4 및 IFIT5로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마커들의 유전자 발현 프로파일을 결정하는 단계; b) 생물학적 시료에서, CFHR2, CPNl, APOB, HBB, GC, C9, IGFBP3, MSTl, CDH5 및 ClQB에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 단백질 마커들의 단백질 발현 프로파일을 결정하는 단계; c) 유전자 및 단백질 발현 프로파일들을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및 d) 하나 이상의 마커들의 유전자 또는 단백질 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 마커들의 증가 또는 감소는 거부반응 상태를 표시한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 유전자 및 단백질 마커들의 조합 패널을 이용한 개체에서의 동종이식 만성 거부반응 결정방법이 제공되며, 이는 a) 개체의 생물학적 시료에서, CHPTl , GBP3, 242907_at 및 CLEC2B의 유전자 발현 프로파일을 결정하는 단계; b) 생물학적 시료에서 CFHR2 , CPNl, GC 및ClQB에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 단백질 마커들의 단백질 발현 프로파일을 결정하는 단계; c) 유전자 및 단백질 발현 프로파일들을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및 d) 유전자 및 단백질 마커들의 유전자 또는 단백질 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 유전자 마크들 CLDC2B, CHPTl, 242907 at, GB3의 증가 및 CFHR2, CPNl 및 GC에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 증가 및 ClQB에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 감소는 개체의 만성 거부반응 상태를 표시한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 방법은 하나 이상의 임상지표들 수치를 얻는 단계 및 하나 이상의 임상지표들을 대조군과 대비하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 대조군은 비-거부반응, 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 개체의 동종이식 만성 거부반응 평가, 예측 또는 진단 키트가 제공되며, 이는 유전자 마커들 OSBP2, CHPTl, RPS26, GBP3, KLRCl, ZCCHC2, 242907, CLEC2B, PDK4 및 IFIT5로 이루어진 유전자 마커들 및 CFHR2, CPNl, APOB, HBB, GC, C9, IGFBP3, MSTl, CDH5 및 ClQB에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 이루어진 단백질 마커들의 하나 이상의 특정 및 정량 검출을 위한 시약, 및 이러한 시약 사용 및 선택적으로 결과 자료의 분석 방법을 위한 지시서로 구성된다. 비-거부반응 컷오프 지표 또는 대조를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다.
따라서 본 발명의 일부 측면의 이점들은 이식조직 또는 장기 생검없이 만성 동종이식 거부반응 진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 요약은 본 발명의 모든 특성을 기술하지는 않는다. 기타 본 발명의 측면들, 특성들 및 이점들은 하기 특정 예들의 설명을 참조하면 본 분야의 기술자들에게 더욱 분명하여질 것이다.
본 발명 및 기타 특징은 첨부 도면을 참조한 하기 상세한 설명으로부터 더욱 명백하여질 것이다.
도 1은 10개 유전자의 바이오마커 패널이 안정한 개체 (n=6)(찬 원형)와 (만성 거부반응 (n=7) (찬 다이아몬드)을 구분하는데 사용된다. 본 바이오마커 패널에 대한 유전자 목록은: 콜린 포스포트란스페라아제 1, 리보솜단백질 S26, 구아닐산 결합단백질 3, 살해 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 C, 멤버 1, 아연 집게, CCHC 도메인 함유 2, 242907_at, C-타입 렉틴 도메인 패밀리 2, 멤버 B, 피루브산탈수소효소 키나아제, 동질효소 4, 옥시스테롤결합단백질 2, 테트라트리코펩티드 반복 5을 가지는 인터페론-유도 단백질을 포함한다.
도 2는 도 1에서 확인된 바이오마커 패널을 31개 시료들에 LDA을 적용하여 패널의 분류 성능을 평가하는 것이다. 상기 방법에 의해 확인되는 바와 같이 만성 거부반응 (실선)에 대하여 83% 올바르게 분류되었다. 안정한 개체 (점선)의 91%가 옳게 분류되었다.
도 3은 바이오마커들 NKG2C, NKGWa, PDK4 및 CHPTl 사이의 제안된 관계를 보인다.
도 4는 FDR < 10%에 있는 106개의 유전자에 상응하는 106개의 프로브 세트들에 기반한 히트맵을 도시한 것이다.
도 5는 14개의 차등 발현되는 단백질 군들 (p-값 <0.05)에 기반한 히트맵을 도시한 것이다. 우측을 따라 단백질그룹코드가 나열된다. 만성 시료들 (회색 막대) - 최 좌측 7개의 칼럼 (1-7); 안정한 시료들 (검은색 막대)- 최 우측 6개의 칼럼 (8-13).
도 6은, 유전자, 단백질 및 조합적 바이오마커 패널들을 이용한 12개의 실험집단 시료들의 분류결과에 기반한 스트리플롯(Striplot)을 도시한 것이다. 3개의 모든 분류자들 ('HP4', 'H4' 및 '조합' 은 각각 유전자, 단백질 및 조합적 분류자)에 대한 선형판별 (LD) 변수 수치들은 재-중앙화되어 분류 컷오프 선을 0으로 교정하였다. 훈련세트에서 CR (빈 별)및 S(찬 별)시료들에 대한 LD 변수수치 (또는 분류자 '점수')의 중앙이 도시되었다. 찬 원 및 찬 사각은 각각 실험집단에서의 S 및 CR 시료들 각각에 대한 LD 변수/분류자 점수에 해당된다.
도 7A-T는 만성 심장 동종이식 거부반응 진단에 유용한, 표 6에 나열된 핵산마커들의 표적서열(SEQ ID NO: 1-10, 37-46)을 보인다.
도 8A-R은 만성 심장동종이식 거부반응 진단에 유용한, 표 8에 나열된 단백질마커들의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 11-12, 14-17, 21-23, 25, 27-28 및 31-36)을 보인다.
도 9는 본 발명의 일부 예에 따른 iTRAQ 검정으로 확인된 예시적 펩티드를 보인다. 본 목록은 부여된 단백질그룹코드 및 SEQ ID NO: 47-421을 포함한다.
하기 상세한 설명에서, 상당히 많은 용어들이 사용되며 이하 정의들은 본 발명의 여러 측면들 이해가 용이하도록 제공된다. 명세서에서 용어들 및 예시들을 사용하는 것은 설명을 목적으로 하는 것이며 예시들의 범위 및 의미를 제한하는 것은 아니다. 수치 범위는 범위를 한정하는 숫자를 포함한다. 명세서에서, "구성하는"이란 개방적 의미로 사용되며 "포함하지만 제한적이지 않는" 구절과 실질적으로 동일하며, "구성한다"란 상응하는 의미를 가진다.
본 발명은 조직 또는 장기 동종이식 특히 심장 동종이식편을 받은 개체의 거부반응을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 개체의 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단과 관련되는 유전자, 핵산, 단백질 발현 프로파일 또는 유전자 및 단백질 발현 프로파일의 조합을 제공한다. 유전자 또는 단백질 발현 프로파일에서 여러 요소들은 개별적으로 공지되어 있지만, 유전자 또는 단백질 마커들 특정 세트의 변경 발현 수준 (대조군 대비 증가 또는 감소)의 특정 조합은 개체의 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단에 유용한 새로운 조합을 구성한다.
동종이식편 이란 동일 종이며 유전적으로 다른 두 개체들 사이 이식된 장기 또는 조직이다. 동종이식을 받은 개체는 "수령자"이고 동종이식편 제공 개체는 "제공자"이다. 조직 또는 장기 동종이식편은 달리 '이식체', '이식편', '동종이식편', '제공자 조직' 또는 '제공자 장기' 등의 유사한 용어로 언급될 수 있다. 다른 종들의 두 개체들 사이 이식체는 이종이식편이다.
개체들은 문헌에서 잘 알려진 다양한 증상 또는 임상지표들을 보일 수 있으나, 이들 자체 어느 것도 동종이식 거부반응을 예측하거나 진단할 수 없다. 동종이식 생검과 더불어 수많은 임상지표들이 동종이식 거부반응을 가지는 또는 의심되는 개체들을 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 임상지표들에서 얻어진 정보는 임상의사, 내과의사, 수의자 또는 기타 임상분야 진료의사에게 사용되어 거부반응이 발생하는지 및 어느 정도 신속하게 진행되는지 및 개체의 면역억제제 약물치료법의 변경 여부를 결정한다. 표 2에는 임상지표들이 기술된다.
임상지표들 (선택적으로 생검이 수반)은 현재 주류 의료실무에 있어서 임상의사들이 활용할 수 있는 유일한 실무도구이지만, 항상 CR(만성 거부자) 및 NR (비-거부자, 안정자, 또는 대조군) 사이를 명확하게 구분하지는 않는다. 극단적인 개체는 CR 또는 NR으로 옳게 분류되지만, 많은 개체들은 중간 범위에 속하고 이들의 상태는 명백하지 않다. 이러한 이유로 동종이식 거부반응을 평가함에 있어서 임상지표들 가치를 부정하지 못하지만, 다른 대안이 없는 경우 적용함에 한계가 있다.
[표 2] 동종이식 거부반응 평가에 잠재적으로 유용한 임상지표들
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
동종이식 거부반응 예측, 진단 및 평가에 있어서 다중요인적 특성으로 인하여 본 분야에서는 동종이식 거부반응의 예측, 진단 또는 평가 중 단 하나의 필요를 충족하는 단일 바이오마커 가능성을 배제한다. 다수의 마커들이 관여되는 전략이 이러한 다중요인적 특성을 감안하여 취하여진다. 달리, 다수의 마커들이 덜 침입적 (예를들면 생검이 불필요한) 임상지표들과 조합되어 평가되어 개체의 동종이식 거부반응 예측, 진단 및/또는 평가가 이루어진다.
동종이식 거부반응의 예측, 진단 및 평가에 사용되는 방법과 관계없이, 장기 또는 조직 기능을 보존하고 더 이상의 유해한 전신 영향을 방지한다는 관점에서 조기 발견이 바람직하다. 동종이식 거부반응에 대한 '치료'는 없으며 단지 개체를 적정하게 면역억제 상태로 유지하거나 또는 일부 경우 거부반응이 너무 빨리 진행되거나 너무 심각하여 면역억제제에 의한 치료가 불가능한 경우 장기를 대체하는 것이다.
다수의 수학적 및/또는 통계적 분석방법을 단백질 또는 폴리펩티드 데이터세트, 대사산물 농도 데이터세트, 또는 핵산 발현 데이터세트에 적용하면 유의한 마커들의 가변 부분집합을 표시할 수 있지만, 어떠한 방법이 '최적' 또는 '더욱 정확한'지에 대한 불확실성에 이른다. 수학적 방법과 무관하게, 중요한 생물적 현상은 데이터세트에 있어서 동일하다. 다수의 수학적 및/또는 통계적 방법을 마이크로어레이에 적용하고 공동 마커들 각각의 통계적으로 유의한 부분집합을 평가함으로써 불확실성은 줄어들고, 임상적으로 연관된 중요한 마커들이 확인될 수 있다.
"마커", "생물학적 마커", "바이오마커"는 상호 교환적으로 사용되며 일반적으로 생물학적 시료에서 검출 가능한 (및 일부 경우 정량 가능한) 분자들 또는 화합물을 언급한다. 동종이식편 이식 후 개체에서 마커는 하향-조절 (감소), 상향-조절 (증가) 또는 실질적으로 변하지 않을 수 있다. 마커는 핵산 (DNA 또는 RNA), 유전자 또는 전사체, 또는 '유전자 마커' (달리 "핵산 마커"로 칭함) 대비 전사체 일부 또는 단편; 폴리펩티드, 펩티드, 단백질 또는 기타 전구체 또는 이형체, 또는 '단백질'마커에 대한 이들의 단편 또는 일부, 또는 선택 분자, 이들의 전구체, 중간체 또는 절단 산물 (예를들면 지방산, 아미노산, 당, 호르몬, 또는 이들의 단편 또는 서브유닛)("대사산물 마커" 또는 "대사적 마커")을 포함할 수 있다. 단백질 마커는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드일 수 있다. 사용에 있어서, 이들 용어들은, 개체의 생물학적 시료에서, 특정 단백질, 펩티드, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 대사산물 (절대적 용어 또는 다른 시료 또는 표준수치에 대하여 상대적으로) 또는 두 단백질들, 폴리뉴클레오티드들, 펩티드들 또는 대사산물들 수준 비율을 언급할 수 있다. 수준은 농도로써 예를들면 밀리리터당 마이크로그램, 발색 강도로써, 예를들면 특정 빛 파장에서 0.0는 투명 및 1.0은 불투명이며 실험시료는 이에 따라 특정 파장에서 빛 투과 또는 흡수에 기하여 수치를 획득하여; 또는 본 분야에서 공지된 바와 같이 마커를 정량화하는 기타 수단과 관련하여 표기될 수 있다. 일부 예에서, 비율은 단위없는 수치로 표기된다. 또한 "마커"는 비율, 또는 기준선 수치를 차감한 후 알짜 수치를 언급할 수 있다. 또한 마커는 방향성 (증가 또는 감소/상향 또는 하향) 표시와 함께 또는 없이 "폴드-변화"로 나타낼 수 있다. 마커 발현의 증가 또는 감소는 또한 '하향-조절' 또는 '상향-조절' 또는 자극, 생리적 일련의 반응 또는 개체 조건에 대한 반응으로 유사한 증가 또는 감소로 언급될 수 있다. 마커는 제1 생물학적 시료에는 존재하며 제2 생물학적 시료에는 없을 수 있다; 달리 마커는 양쪽에 통계적으로 유의한 차이에서 존재할 수 있다. 생물학적 시료에서 마커의 존재, 부존재 또는 상대수준 표현은 마커 정량화 또는 평가를 위하여 적용되는 분석 특성에 따라 다르며 이러한 표현은 본 분야의 기술자에게 익숙하다.
동종이식을 거부하는 개체의 발현수준이 비-거부반응 개체에서 취한 시료와 차이가 있을 때 마커는 차등 발현된다고 기술될 수 있다. 차등 발현된 마커는 정상 또는 대조 시료 발현수준과 비교하여 과잉발현 또는 과소발현될 수 있다.
"프로파일"은 하나 이상의 마커들 및 이들의 존재, 부존재, 상대수준 또는 과다 (하나 이상의 대조군에 비하여)에 관한 하나의 세트이다. 예를들면, 대사산물 프로파일은 대사산물 마커들의 존재, 부존재, 상대수준 또는 과다성에 대한 데이터세트이다. 유전자 또는 핵산 프로파일은 발현된 핵산 (예를들면 전사체, mRNA, EST 등)의 존재, 부존재, 상대수준 또는 과다성에 대한 데이터세트이다. 프로파일은 달리 발현 프로파일로 언급될 수 있다.
생물학적 시료에서 마커의 증가 또는 감소 또는 정량화는 유전자 산물 또는 전사체의 존재 및/또는 상대적 과다를 측정하기 위하여 본 분야에서 공지된 임의의 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 마커 수준은 절대수치 또는 기준선에 대하여, 및 컷오프 지표 (예를들면 비-거부반응 컷오프 지표)와 비교된 개체 마커 수준으로 결정될 수 있다. 달리 마커 또는 마커들의 상대 과다는 대조군에 대하여 결정될 수 있다. 대조군은 임상적으로 정상인 개체 (예를들면 동종이식편을 받은 않은 개체) 또는 이전에 보여진 거부반응이 없는 동종이식 수령자일 수 있다.
일부 예에서, 대조군은 자가 대조군, 예를들면 동종이식편 이식 전에 개체에서 획득된 시료 또는 프로파일일 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 시점 (이식 전, 후 또는 전 및 후)에서 획득된 프로파일은 동일 개체에서 이전에 획득된 하나 이상의 프로파일과 비교될 수 있다. 경시에 따라 동일 개체에서 동일 생물학적 시료를 반복적으로 채취하여, 경시에 따른 마커 수준 또는 발현을 보이는 조성물 프로파일이 제공될 수 있다. 또한 연속 시료들이 개체에서 얻어지고 각각에 대한 프로파일이 획득되어, 경시에 따른 하나 이상의 마커들의 증가 또는 감소 경로를 알 수 있다. 예를들면 초기 시료 또는 시료들이 이식 전에 획득되고, 연속 시료가 주마다, 2주마다, 달마다, 2달마다 또는 기타 적합한 구간에서 얻어지고 이전에 취한 시료들의 프로파일과 비교된다. 또한 시료들은 약물 과정 예를들면 면역억제제 과정 이전, 동안 및 이후에 획득될 수 있다.
특정 마커 또는 마커들 세트를 검출 및/또는 정량화하는 기술, 방법, 도구, 알고리즘, 시약 및 기타 필요한 분석 특성들은 가변적이다. 마커 또는 마커들 세트를 검출하는데 사용되는 특정 방법이 중요한 것이 아니라, 중요한 것은 어떠한 마커들을 검색하는 것이다. 문헌에서 고려된 바와 같이, 상당한 가변성이 존재한다. 검색될 또는 정량화될 마커 또는 마커들 세트가 동정되면, 적당한 시약이 있다면 임의의 여러 기법들이 적용될 수 있다. 본 분야의 기술자는, 마커들 세트가 동정되면, 본원에서 개시된 방법을 수행하기 위하여, 적당한 분석법 (예를들면, 핵산 마커들을 위한 PCR 기반 또는 마이크로어레이 기반의 분석법, ELISA, 단백질 또는 항체 마이크로어레이 또는 유사한 면역학적 검정, 또는 일부 예에서, iTRAQ, iCAT 또는 SELDI 단백질 질량 스펙트럼 기반의 방법의 사용)을 선택할 수 있다.
본 발명은 개체의 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단과 관련되는 유전자, 핵산 및 단백질 발현 프로파일을 제공한다. 유전자 또는 단백질 발현 프로파일에서 여러 요소들은 개별적으로 공지되어 있지만, 유전자 또는 단백질 마커들 특정 세트의 변경 발현 수준 (대조군 대비 증가 또는 감소)의 특정 조합은 개체의 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단에 유용한 새로운 조합을 구성한다.
예를들면, 핵산의 검출 또는 결정, 및 일부 경우 정량화는 본 분야에서 공지된 재조합 DNA기술, 제한적이지는 않지만 예를들면 서열-특이적 혼성화, 중합효소 연쇄반응 (PCR), RT-PCR, 마이크로어레이 등을 이용한 다수의 방법 또는 분석 중 임의의 하나에 의해 달성될 수 있다. 이러한 검정은 서열-특이적 혼성화, 프라이머 신장, 또는 침입성 절단을 포함한다. 또한 각 유형의 반응 (예를들면 형광, 발광, 질량측량, 전기영동 등) 산물을 분석/검출하는 다수의 방법들이 있다. 또한, 반응은 액상에서 또는 유리 슬라이드, 칩, 비드 등과 같은 고체 지지체에서 일어날 수 있다.
마이크로어레이 또는 바이오칩 사용을 위한 프로브 설계 및 선택방법 또는 PCR-기반 검정에 사용되는 프라이머 선택 또는 설계방법은 본 분야에서 공지되어 있다. 마커 또는 마커들이 동정되고 예를들면 이러한 서열을 가지는 데이터베이스에 질의하거나 적당한 서열을 제공하여 (예를들면 본원에 제공된 서열목록) 핵산 서열이 결정되면, 본 분야의 기술자는 이러한 정보를 이용하여 적당한 프로브 또는 프라이머를 선택하여 선택된 분석법을 수행할 수 있다.
본 분야의 기술자에게 공지된 재조합 DNA기술의 일반원리를 제공하는 표준 참조 문서는 예를들면, Ausubel 등, Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998 및 2001 증보판); Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989); Kaufman 등, Eds., Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991)을 포함한다.
단백질, 단백질 복합체 또는 단백질 마커는 본 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 특히 검정 및/또는 정량화되며 이는 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 면역 또는 항체-기반 기법들로는 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 방사면역측정법(RIA), 웨스턴 블로팅 (western blotting) 면역형광법 (immunofluorescence), 마이크로어레이, 크로마토그래피 기술(즉, 항체친화성 크로마토그래피 (immunoaffinity chromatography)), 유동세포계수, 면역침강법 등을 포함한다. 이러한 방법은 관심있는 단백질 또는 단백질 복합체와 결합되는 특정 항원결정부(epitope) 또는 항원결정부 조합에 대한 항체 또는 항체들의 특이성에 기반한다. 비-면역적 방법으로는 단백질 또는 단백질 복합체 자체의 물성에 기반하는 것을 포함한다. 이러한 방법들의 예로는 전기영동, 크로마토그래피 기술 (예를들면, 고성능액체크로마토그래피 (HPLC), 신속단백질액체크로마토그래피 (FPLC), 친화성 크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 크기배제크로마토그래피 등), 질량 스펙트럼, 서열화, 단백질분해효소의 분해, 등을 포함한다. 이러한 방법은 질량, 전하, 소수성 또는 친수성에 기반하며, 이는 단백질 또는 단백질 혼합체의 아미노산 보체 (complement) 및 아미노산의 특정 서열에서 유래한다. 질량 스펙트럼을 이용한 방법 예시는 예를들면 PCT 공개 WO 2004/019000, WO 2000/00208, US 6670194에 기재된 것을 포함한다. 면역 및 비-면역적 방법은 조합되어 단백질 또는 단백질 복합체를 동정 또는 특정화할 수 있다. 또한, 각 유형의 반응 (예를들면 형광, 발광, 질량측량, 전기영동 등) 산물을 분석/검출하는 다수의 방법들이 있다. 또한, 반응은 액상에서 또는 유리 슬라이드, 칩, 비드 등과 같은 고체 지지체에서 일어날 수 있다.
단백질 또는 항체 어레이 사용을 위한 항체 제조방법 또는 기타 면역에 기반한 어레이 사용을 위한 항체 제조방법은 본 분야에서 공지되어있다. 마커 또는 마커들이 동정되고 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산서열이, 데이터베이스 질의 또는 적당한 서열이 제공되어 (예를들면 본원에 제공된 서열목록) 확인되면, 본 분야의 기술자는 이러한 정보를 이용하여 하나 이상의 적당한 항체를 준비하고 선택된 분석법을 수행할 수 있다.
바이오마커에 대한 단일클론 항체 제조와 관련하여, 세포주 계대배양에 의해 항체분자들을 제조할 수 있는 임의 기술들이 사용될 수 있다. 이러한 기술로는 제한적이지는 않지만, Kohler 및 Milstein (1975, Nature 256:495-497)에 의해 최초로 개발된 혼성세포 기술, 트리오마 기술(Gustafsson 등., 1991, Hum. Antibodies Hybridomas 2:26-32), 인간 B-세포 혼성세포 기술 (Kozbor 등., 1983, Immunology Today 4:72), 및 인간 단일클론 항체를 제공하는 EBV 혼성세포 기술 (Cole 등., 1985, In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 포함한다. 인간항체가 사용되고 인간 혼성세포들을 이용하여(Cote 등., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026- 2030) 또는 생체 외에서 인간 B 세포를 EBV 바이러스로 형질전환 (Cole 등., 1985, In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)으로 획득될 수 있다. 바이오마커에 특이적인 생쥐 항체분자를 적당한 생물학적 활성의 인간 항체분자로부터의 유전자와 함께 이어 맞추는 (splicing) "키메릭" 항체 제조용으로 개발된 기술 (Morrison 등, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851- 6855; Neuberger 등, 1984, Nature 312:604-608; Takeda 등, 1985, Nature 314:452-454)이 사용될 수 있고, 이러한 항체는 본 발명의 범위 내에 있다. 단일사슬 항체 제조용으로 기술된 기법 (미국특허 4,946,778)이 바이오마커-특이적 항체 제조에 적용될 수 있다. 본 발명의 추가적인 예로는 바이오마커 단백질에 특이성을 가지는 단일클론 Fab 단편을 신속하고 용이하게 동정할 수 있는 Fab 발현 라이브러리 구축 (Huse 등, 1989, Science 246:1275-1281)을 이용한다. 비-인간 항체는 공지방법 (예를들면, 미국특허 5,225,539)에 의해 "인간화"될 수 있다.
바이오마커의 전유전물질형을 함유하는 항체 단편은 본 분야에서 공지된 기술로 생성될 수 있다. 예를들면, 이러한 단편은 제한적이지는 않지만, 항체분자의 펩신 소화에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편; F(ab')2 단편의 이황화물 다리를 환원하여 (reducing) 생성될 수 있는 Fab1 단편; 항체분자를 파파인 및 환원제로 처리하여 생성될 수 있는 Fab 단편; 및 Fv 단편을 포함한다. 합성 항체 예를들면 화학합성에 의해 제조되는 항체는 본 발명에서 유용하다.
본원에서 기술되고 관련 분야 기술자에게 공지된 표준참조문헌은 면역 및 비-면역기법들, 이들의 특정 시료 유형, 항체, 단백질 또는 분해물에 대한 적합성이 기재된다. 본 분야의 기술자들에게 공지된 면역학 및 면역 방법을 이용한 검정을 개시하는 표준참조문헌들은 예를들면 Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2판., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1999); Harlow 및 Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Coligan 등. eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY (1992-2006); 및 Roitt 등., Immunology, 3판, Mosby-Year Book Europe Limited, London (1993)을 포함한다.
본 분야의 기술자에게 공지된 펩티드 합성 기술 및 방법의 일반원리를 설명한 표준참조문헌은 Chan 등., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood 등., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3판, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001 ; 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994)을 포함한다.
개체의 거부반응 상태는 "만성거부자" (CR) 또는 "비-거부자" (NR) 또는 "안정자" (S) 분류되고 마커들 농도 및 비-거부자 컷오프 지표를 비교하여 결정된다. "비-거부자 컷오프 지표"는 이를 벗어나거나 이보다 외부에 있으면 개체가 CR 거부반응 상태를 가지는 것으로 분류되는 수치 또는 점수이다. 비-거부자 컷오프 지표는 달리 '대조군 수치', '대조군 지표' 또는 단순히 '대조군'으로 언급될 수 있다. 비-거부자 컷오프-지표는 대조 개체군에서의 개별 마커들 농도이며 측정되는 각 마커들에 대하여 개별적으로 고려될 수 있다; 달리 비-거부자 컷오프 지표는 마커들 농도 조합일 수 있고, 진단을 위하여 제공되는 개체 시료에서 마커들 농도 조합과 비교될 수 있다. 대조 개체군은 정상 또는 건강한 대조군일 수 있거나 동종이식 거부반응을 가지지 않은 또는 거부반응이 없는 동종이식 수령군일 수 있다. 대조군은 단일 개체일 수 있고, 일부 예에서, 자가 대조군일 수 있다. 대조군 또는 대조군 풀은 예를들면 고정값으로 나타나는 고정치 또는 누적치일 수 있고, 이를 획득하기 위하여 사용된 시료 군은 장소마다 또는 경시에 따라 가변될 수 있고 추가 데이터 포인트를 포함한다. 예를들면, 중앙 건강정보시스템과 같은 중앙 데이터 보관소는 여러 장소들 (병원, 임상실험실, 등)에서 얻어진 데이터를 수신하고 보관하며 이러한 누적 데이터세트를 단일 병원에서, 공동체 치료실에서 최종 사용자가 접근하고 (즉, 개별 진료의사, 의료 치료실 또는 센터 등) 발명의 방법 적용하기 위하여 제공한다.
비-거부자 컷오프 지표는 달리 '대조값', '대조지표' 또는 단순히 '대조'라고 언급된다. 일부 예에서, 컷오프 지표는 대사산물 컷오프 지표 (개체의 대사산물 프로파일용), 유전자 컷오프 지표 (개체의 유전자 발현 프로파일용), 단백질 컷오프 지표 (개체의 단백질 프로파일용) 등으로 더욱 특징될 수 있다.
"생물학적 시료"는 개략적으로 개체의 체액 또는 조직 또는 장기를 언급한다. 예를들면, 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 림프액, 혈청, 소변 또는 침일 수 있다. 비-액상 조직시료와 같은 조직 또는 장기 시료는 분해, 추출 또는 달리 액상화될 수 있고-이러한 조직 또는 장기의 예시로는 배양세포, 혈구, 피부, 간, 심장, 신장, 췌장, 랑게르한스섬, 골수, 혈액, 혈관, 심판막, 폐, 장, 창자, 비장, 방광, 음경, 안면, 손, 뼈, 근육, 지방, 각막 등을 포함한다. 다수의 생물학적 시료들은 임의로 한번에 수집될 수 있다. 생물학적 시료 또는 시료들은 동종이식편 이식 전, 이식 시점 또는 이식 이후 임의시점을 포함한 임의 시간에 개체로부터 취할 수 있다. 생물학적 시료는 핵산 예를들면 단일 또는 이중-사슬 형태인, 디옥시리보핵산 또는 리보핵산, 또는 이의 조합일 수 있다. 제공자에게서 장기가 추출될 때, 제공자의 비장 또는 이의 일부가 생물학적 시료로 보관되어 이로부터 제공자 T-세포를 획득한다. 장기가 생존 제공자에게서 추출될 때, 혈액시료가 취하여지고 여기에서 제공자 T-세포가 획득될 수 있다. 동종반응성 T-세포는 동종이식편의 항원 (MHC 복합체 포함)과의 특이적 반응을 살펴서 단리 될 수 있다. 동종반응성 T-세포 특이적 단리를 가능하게 하는 방법은 예를들면 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 WO 2005/05721에 기재된다.
림프구는 림프성 원시 줄기세포의 유핵성 또는 '백'혈구 (백혈구)이다. 림프구는 T-세포, B-세포 자연살해세포 등 및 기타 면역조절세포를 포함한다. "T-세포"는 세포-중재 면역 및 B-세포 자극을 위한 림프구 군이다. 자극된 B-세포는 특이 항원을 위한 항체를 생성한다. B-세포 및 T-세포 모두 개체에서 비-자가 항원 인식 기능을 수행한다. 비-자가 항원은 동종이식편 뿐 아니라 바이러스, 박테리아 및 기타 감염체를 포함한다.
동종반응성 T-세포는 동종항원에 대한 반응으로 활성되는 T-세포이다. 이종항원에 반응하는 T-세포는 이종반응성 T-세포이다. 이종항원은 다른 종 또는 종의 조직 예를들면 이종이식편에서 유래한 항원이다. 동종반응성 T-세포는 이식 거부 면역반응의 전방선 (front-line)이다. 이들은 외부이식편에 존재하는 동종항원을 인식하는 말초혈액단핵구 (PBMC)의 부분집합 (~0.1-l%)이다. 이들은 외부이식편에 침윤하여 일련의 항-이식 면역반응을 일으키고, 만일 확인되지 않으면, 이식편 거부 및 상실에 이를 것이다. 동종반응성 T-세포는, 따라서 마커들의 다른 소스와 비교하여 특이성을 제공하거나 장기 거부반응 단계들 간 차별되는 보완 소스로 기능할 것이다.
용어 "개체" 또는 "환자"는 대체로 포유동물 및 기타 인간 및 기타 영장류를 포함한 기타 동물, 반려동물, 동물원 및 농장동물, 제한적이지는 않지만 고양이, 개, 설치류, 쥐, 생쥐, 햄스터, 토끼, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 가금류 등을 포함한다. 동종이식 거부반응에 대한 예측, 평가 또는 진단 검사를 받으려는 또는 받은 개체를 포함한다. 개체는 기타 방법 예를들면 본원에 기재된 방법 또는 현재 임상적 실무방법으로 이전에 평가 또는 진단을 받았을 수 있거나 일반 군 (대조개체)의 일부에서 선택될 수 있다.
대조군 대비 개체에서 마커의 폴드-변화는 최소한 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 또는 이상이거나 이들 사이 수치일 수 있다. 폴드 변화는 대조값 대비 감소 또는 증가로 나타난다.
하나 이상은 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 이상을 포함한다.
"하향-조절" 또는 "하향-조절된" 용어는 상호교환적으로 사용되며 마커 예를들면 유전자, 핵산, 대사산물, 전사체, 단백질 또는 폴리펩티드 수준의 감소를 의미한다. "상향-조절" 또는 "상향-조절된" 용어는 상호교환적으로 사용되며 마커 예를들면 유전자, 핵산, 대사산물, 전사체, 단백질 또는 폴리펩티드 수준의 증가를 의미한다. 또한 신호전달 또는 대사경로와 같은 경로는 상향- 또는 하향-조절된다.
임의 방법 (유전자, 단백질 또는 이의 조합)에 의해 개체가 만성 거부자 또는 위험성으로 확인되면, 동종이식에 대한 개체 면역반응을 변경하기 위한 치료적 수단이 구현될 수 있다. 개체는 더욱 자주 또는 더욱 민감한 검사방법을 사용하여 추가 임상지표 검사를 받을 수 있다. 또한 개체는 면역반응 감소 또는 증가를 위하여 면역억제제를 투여 받을 수 있다. 동종이식 거부반응을 방지하기 위하여 개체 면역반응이 너무 억제될 필요가 있는 경우에도, 기회감염 방지를 위한 적당한 수준의 면역기능도 필요하다. 개체에 투여 가능한 다양한 약물이 공지된다: 예를들면, 참고 Goodman 및 Gilman의 The Pharmacological Basis of Therapeutics 11판. Ch 52, pp 1405-1431 및 참고문헌; LL Brunton, JS Lazo, KL Parker 편집자. 본 분야의 기술자에게 알려진 의과생리학 및 약리학의 일반원리를 제공하는 표준참고문헌들은: Fauci 등. , Eds., Harrison 's Principles Of Internal Medicine, 14판, McGraw-Hill Companies, Inc. (1998)을 포함한다. 기타 예방적 및 치료적 전략은 의료문헌에서 검토된다- 참고, 예를들면 Kobashigawa 등. 2006. Nature Clinical Practice. Cardiovascular Medicine 3:203-21.
따라서, 본 발명은 동종이식 거부반응 예측, 평가 또는 진단 방법을 제공하며, 이는 CHPTl, RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4, OSBP2, IFIT5으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마커들의 증가 또는 감소를 측정하는 단계; 및 2) 개체의 '거부반응 상태' 정하는 단계로 구성되며, 개체의 '거부반응 상태' 결정은 개체의 마커 발현 프로파일 및 대조 마커 발현 프로파일 대비에 기초한다.
유전자 핵산 발현 프로파일 형성
본 발명에 의해 제공되는 바와 같이, 개체에서 동종이식 만성 거부반응 진단방법은, 1) 개체의 생물학적 시료에서, CHPTl, RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4, OSBP2, IFIT5으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계; 2) 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 비-거부자 대조 프로파일과 비교하는 단계; 및 3) 하나 이상의 마커들 발현 수준이 대조 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 마커들의 상향-조절 또는 하향-조절은 거부반응 상태를 표시한다.
유전자 방법을 적용하면, 7개의 만성 거부반응 (CR) 및 6개의 비-만성 거부반응/안정 (S) 시료들 사이 차등 발현되는 (FDR <10%) 것으로 동정되는 106개의 유전자들. 이들 중 10개를 바이오마커 패널로써, 더욱 엄격한 통계적 컷오프 (FDR <5% 및 폴드-변화 >2)에 기반하여 더욱 동정. 선형판별분석법을 이용하여 본 유전자 바이오마커 패널의 검증 결과 10개의 유전자 모두 12개의 새로운 '검사' 시료들을 83% 민감성 및 특이성으로 분류할 수 있음을 보였다.
본원에서 사용되는"유전자 발현 데이터", "유전자 발현 프로파일" 또는 "마커 발현 프로파일"이라는 용어들은 생물학적 시료에 있는 유전자 또는 유전자 세트의 상대적 또는 절대적 발현 수준에 관한 정보를 언급한다. 유전자 발현 수준은 유전자에 의해 코딩되는 예를들면 mRNA와 같은 RNA 수준에 기반하여 결정된다. 달리 발현수준은 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 단편 수준에 기초하여 결정된다.
본원에서 사용되는 '폴리뉴클레오티드', '올리고뉴클레오티드' 또는 '뉴클레오티드'는 센스 또는 안티센스 사슬인 RNA, DNA 또는 RNA 및 DNA을 포함한 핵산의 합성 또는 혼합 고분자를 포함하며, 본 분야의 기술자에게 쉽게 이해되는 바와 같이, 화학적 또는 생화학적으로 변경될 수 있거나 비-천연 또는 유도 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있다. 이러한 변경은, 예를들면 표지화, 메틸화, 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드를 유사체로 치환, 뉴클레오티드 사이 변경 예를들면 비전하 연결 (예를들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등), 전하 연결(예를들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 측쇄 잔기 (moieties) (예를들면, 폴리펩티드), 및 변경 연결 (예를들면, 알파 아노머 폴리뉴클레오티드 등)을 포함한다. 또한 수소결합 또는 기타 화학작용에 의해 지정된 서열과 결합될 수 있는 능력에 있어서 폴리뉴클레오티드와 유사한 합성분자들을 포함한다.
올리고뉴클레오티드는 다양한 길이의 핵산이며 특정 핵산 검출 및/또는 증폭을 위한 프로브, 프라이머 및 마이크로어레이 (어레이) 제조에 유용하다. 올리고뉴클레오티드는 DNA, RNA, PNA 또는 기타 예를들면 US 5,948,902에서 기재된 폴리뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 이러한 DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오티드 사슬은 불용성 지지체에 연결될 수 있는 성장 사슬에 활성 모노머의 서열적 부가 (5'-3' 또는 3'-5')에 의해 합성될 수 있다. 연속적인 개별적 용도 또는 불용성 지지체 일부로 예를들면 어레이에서 (Bernfield MR. 및 Rottman FM. J. Biol. Chem. (1967) 242(18):4134-43; Sulston J. 등. PNAS (1968) 60(2):409-415; Gillam S. 등. Nucleic Acid Res.(1975) 2(5):613-624; Bonora GM. 등. Nucleic Acid Res.(1990) 18(11):3155-9; Lashkari DA. 등. PNAS (1995) 92(17):7912-5; McGaIl G. 등. PNAS (1996) 93(24):13555- 60; Albert TJ. 등. Nucleic Acid Res.(2003) 31(7):e35; Gao X. 등. Biopolymers (2004) 73(5):579-96; 및 Moorcroft MJ. 등 Nucleic Acid Res.(2005) 33(8):e75). 올리고뉴클레오티드를 합성하는 다수의 방법들이 본 분야에 공지된다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 사용되는 방법에 의존되는 다양한 조건들 하에서 활성 및 보호된 모노머의 단계적 부가를 통하여 합성된다. 연속적으로, 특정 보호기는 제거되어 신장이 가능하고 연속하여 및 합성이 완료되면 모든 보호기는 제거되고 필요하다면 완료된 사슬의 정제를 위하여 올리고뉴클레오티드는 고상 지지체에서 분리된다.
"유전자"는 특정 염색체의 특정 위치에 있는 뉴클레오티드의 서열이며 특정 기능성 산물을 코딩하며 코딩 영역에 근접한 비-해독 및 비-전사 서열 (5' 및 3' 에서 코딩서열)을 포함한다. 이러한 비-코딩 서열은 서열의 전사 및 해독 또는 예를들면 인트론 스플라이싱에 필요한 조절서열을 가지며, 또는 관심있는 돌연변이 발생이 이상으로 기여하는 임의 기능을 가질 수 있다. 또한 유전자는 하나 이상의 프로모터, 증폭자, 결합부위 전사인자, 종결신호 또는 기타 조절요소를 포함할 수 있다. 유전자 또는 전사체는 핵산을 포함할 수 있다.
용어 "마이크로어레이", "어레이" 또는 "칩"은 정의된 위치에서 기질 표면에 결합된 다수의 정의된 핵산 프로브를 가진다. 기질은 바람직하게는 고체이다. 본 분야에서 마이크로어레이는 미국특허번호 5,143,854 (Pirrung), 5,424,186 (Fodor), 5,445,934 (Fodor), 5,677,195 (Winkler), 5,744,305 (Fodor), 5,800,992 (Fodor), 6,040,193 (Winkler), 및Fodor 등. 1991. Science, 251 :767-777에 일반적으로 기술된다. 이들 각 참고문헌들은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드의 정해진 방식 (서열-특이적)으로 수소결합에 의한 - 또는 '와트슨-클릭' 염기쌍이라고 칭하는- 안정 복합체를 형성하기 위하여 상호 작용하는 반응을 포함한다. 후그스틴 염기쌍을 포함한 비-전형적인 수소결합을 통한 다양한 염기쌍들도 가능하다. 일부 열역학적, 이온 또는 pH 조건하에서 특히 리보핵산의 삼중 나선들도 가능하다. 이들 및 기타 가변성 수소결합 또는 염기-쌍들은 본 분야에 공지되며 예를들면 Lehninger - Principles of Biochemistry, 3 판 (Nelson and Cox, eds. Worth Publishers, New York.)에 기재되고, 이는 참조로 본원에 포함된다.
혼성화 반응은 차별된 "엄격" ("stringency")조건에서 수행된다. 혼성화 반응의 엄격성은 임의 두 핵산분자들이 서로 혼성화되기 어려운 것을 포함된다. 예를들면 혼성화가 일어나는 온도를 높이고, 혼성화가 일어나는 이온농도를 낮추고, 또는 이들을 조합하여 엄격성은 증가될 수 있다. 엄격 조건하에서 최소한 60%, 65%, 70%, 75% 또는 이상의 상동성 핵산분자들은 상호 혼성화로 존재하지만, 낮은 상동성의 분자들은 혼성 상태로 잔존하지 않는다. 엄격 혼성화 조건들의 예로는 약 44-45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC), 이어 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 또는 이들 사이 온도에서 0.2xSSC, 0.1 % SDS의 1회 이상의 세척 조건에서의 혼성화를 포함한다.
두 핵산들 간 혼성화는 역평행 배열로 일어나며 이는 '아닐링'이라고 칭하고, 짝지은 핵산들은 상보적이라 기술된다. 이중-나선 폴리뉴클레오티드는, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드 나선들 사이 혼성화가 일어나면, "상보"적이다. 하나의 폴리뉴클레오티드가 다른 것과 상보적인 정도는 상동성이라 칭하며 이는 일반적으로 수용되는 염기-쌍 규칙에 따라 상호 수소결합이 예상되는 반대 나선들의 염기 비율로 정량화된다.
일반적으로, 서열-특이적 혼성화는 혼성화 프로브를 포함하며, 이는 정의된 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 이러한 프로브는 단지 하나 또는 소수의 뉴클레오티드에서의 가변 서열들을 차별하도록 설계될 수 있어 높은 특이성을 제공한다. 검출 및 서열 차별화와 연관된 전략은 "분자 비콘"을 이용하는 것이며, 이에 따라 혼성화 프로브 (분자비콘)은 3' 및 5' 보고자 및 켄처 분자들 및 3' 및 5' 서열을 가지며 이는 상보적이어서 프로브가 헤어핀 루프를 형성할 삽입서열에 대한 적당한 결합표적을 가지지 않는다. 헤어핀 루프는 보고자 및 켄처를 가까이 인접하게 유지하여 형광체 (보고자)를 켄칭하고 형광을 감소시킨다. 그러나, 분자비콘이 표적에 혼성화될 때, 형광체 및 켄처는 충분히 떨어져 있어 형광체로부터 형광 방사가 가능해진다.
혼성화에 사용하는 프로브는 이중-나선 DNA, 단일-나선 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드, 및 펩티드 핵산을 포함한다. 특정 프로브와 혼성화하는 마커들 동정을 위한 혼성화 조건 및 방법은 본 분야에, 예를들면 Brown, T. "Hybridization Analysis of DNA Blots" in Current Protocols in Molecular Biology. FM Ausubel 등, editors. Wiley & Sons, 2003. doi: 10.1002/0471142727.mb0210s21에 기술된다. 본 발명에 따라 사용하는 적당한 혼성화 프로브는 길이가 약 10 내지 약 400 뉴클레오티드, 달리 약 20 내지 약 200 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 변형 핵산을 포함한다.
특정 서열은 프라이머 또는 프로브와의 이후 검출되는 혼성화로 동정된다.
"프라이머"는 짧은 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 일반적으로 자유 3'-OH 기를 가지며 이는 관심있는 표적과의 혼성화에 의해 시료에 있는 표적 또는 "템플렛"과 결합하여 표적에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 중합을 촉진시킨다. "중합효소연쇄반응" (PCR)은 "업스트림" 및 "다운스트림" 프라이머를 포함한 "프라이머 쌍" 또는 "프라이머 세트", 및 중합촉매 예를들면 DNA 중합효소, 및 전형적으로 열-안정 중합효소를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드 복제본 제조 반응이다. PCR 방법은 본 분야에 공지되고 예를들면 Beverly, SM. Enzymatic Amplification of RNA by PCR (RT-PCR) in Current Protocols in Molecular Biology. FM Ausubel 등, editors. Wiley & Sons, 2003. doi: 10.1002/0471142727.mbl505s56에 교시된다 복제본 합성은 예를들면 형광분자, 바이오틴 또는 방사성 분자와 같은 표지 또는 태그를 가지는 뉴클레오티드 결합을 포함한다. 이후 복제본은 이들 태그를 통하여 종래 방법을 적용하여 검출될 수 있다.
또한 프라이머는 서던 또는 노던 블롯 분석과 같은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 수 있다 (참고, 예를들면 Sambrook, J., Fritsh, E. F., 및 Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
본원에서 사용되는 "프로브 세트"(또는 '프라이머 세트')는 하나 이상의 발현 핵산 또는 발현 유전자를 검출하기 위하여 사용되는 올리고뉴클레오티드 군을 의미한다. 검출은 예를들면 PCR 및 RT-PCR에서와 같은 증폭을 통하여, 또는 마이크로어레이에서와 같은 혼성화를 통하여, 또는 단일 또는 이중 나선 핵산의 선택적 효소분해에 기반하는 분석에서와 같이 선택적 분해 또는 보호를 통하여 이루어질 수 있다. 프로브 세트에서 프로브들은 하나 이상의 형광, 방사성 또는 기타 검출 잔기 (효소 포함)으로 표지화된다. 프로브는 원하는 유전자를 선택적으로 검출하기에 충분한 크기를 가질 수 있고, 일반적으로 약 15 내지 약 25 또는 약 30 뉴클레오티드 범위의 크기는 충분한 사이즈이다. 프로브 세트는 예를들면 다중 PCR용과 같이 용액에 있을 수 있다. 달리, 프로브 세트는 어레이 또는 마이크로어레이에서와 같이 고체 표면에 고착될 수 있다.
본 발명의 일부 예에서, 하나 이상의 CHPTl, RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4, OSBP2, IFIT5로 구성된 유전자 마커들 세트에 의해 발현되는 핵산을 검출하기 위한 프로브 세트가 제공된다. 이러한 프로브 세트는 개체의 거부반응 상태를 결정함에 유용하다. 프로브 세트는 하나 이상의 CHPTl, RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4, OSBP2, IFIT5에 상응되는 핵산 서열의 특이적 증폭 (예를들면 PCR 또는 RT-PCR)용 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 예에서, 프로브 세트는 마이크로어레이 일부이다.
서열을 구분하고 검출하는 기타 여러 방법들이 본 분야에서 공지되어 있다는 것을 이해하여야 하며 이하 더욱 상세하게 설명된다. 또한 어레이 프라이머 신장 미니 서열화, 태그 마이크로어레이 및 서열-특이적 신장과 같은 반응들은 마이크로어레이에서 수행될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 이러한 어레이 기반의 서열검사 플랫폼은 미소구체 기반의 태그-잇 고효율 어레이 (tag-it high throughput array) (Bortolin S. 등. 2004 Clinical Chemistry 50: 2028-36)이다. 본 방법은 PCR을 통하여 유전자 DNA 증폭 후 보편적 태그 프라이머로 서열-특이적 프라이머 신장이 이루어진다. 이후 산물은 태그-잇 어레이에서 분류되고 Luminex xMAP 시스템으로 검출된다.
본 분야의 기술자들은 서열에서 뉴클레오티드의 수치적 지정은 특정 서열에 대하여 상대적이라는 것을 이해할 것이다. 또한 동일영역은 서열이 수치화되고 선택되는 것에 따라 다른 수치가 지정될 수 있다. 또한 삽입 또는 결실과 같은 서열변이는 상대 위치 및 이어 돌연변이 자리 및 주위에 있는 특정 뉴클레오티드의 수치적 지정을 바꿀 수 있다. 예를들면, 기탁번호 CH471094.1, AC007068.17, AC91814.10, AY142147.1, BC005254.1, AB015628.1, AL550908.3, BG503026.1, BG540007.1, BG779377.1, X96719.1, DQ892509.2, DQ895723.2로 표시되는 서열들은 모두 인간 CLEC2B 뉴클레오티드 서열을 나타내지만, 일부 서열 차이, 및 이들 사이 수치 차이가 있을 수 있다. 다른 예로는, 기탁번호 NP_005118.2, EAW96127.1, BAA76495.1, BAG36638.1, CAA65480.1, Q92478.2로 표시되는 서열은 모두 인간 CLEC2B 폴리펩티드 서열이지만 일부 서열 차이, 및 이들 사이 수치 차이가 있을 수 있다.
상기 유전자를 포함한 관심있는 임의 유전자 발현에 대한 특이적 검출을 위한 프로브, 프라이머 또는 프로브 세트 선택 및/또는 설계는, 관심있는 유전자의 하나 이상의 핵산서열이 제공될 때, 관련 분야의 기술자 능력 내에 있는 것이다. 또한, 임의 여러 프로브, 프라이머 또는 프로브 세트 또는 다수의 프로브, 프라이머 또는 프로브 세트가 사용되어 관심있는 유전자를 검출할 수 있고, 예를들면 어레이는 단일 유전자 전사체에 대한 다중 프로브를 포함하며 - 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 측면은 예시된 임의 특정 프로브에 제한되지 않는다.
서열 상동성 또는 서열 유사성은 DNASIS (예를들면, 제한적이지는 않지만, 하기 인자들을 이용: GAP 패널티 5, 최상 대각선 # 5, 고정 GAP 패널티10, k-튜플 2, 플로팅 갭 10, 및 윈도우 사이즈 5)에서 제공되는 바와 같이, (DNA 또는 RNA 서열, 또는 이의 단편 또는 일부에 대하여는) 뉴클레오티드 서열 비교프로그램 또는 (단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 서열 또는 이의 단편 또는 일부에 대하여는) 아미노산 서열비교 비교프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 그러나 다른 서열 비교 정렬 방법이 본 분야에서 잘 알려져 있고 예를들면 Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482) 알고리즘, Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), 및 이들 알고리즘이 구현된 컴퓨터 (e.g. GAP, BESTFIT, FASTA, 및 BLAST), 또는 매뉴얼 정렬 및 시각적 관찰에 의해 가능하다.
관심있는 핵산 또는 유전자, 폴리펩티드 또는 서열이 확인되고 서열 일부 또는 단편 (또는 유전자 폴리펩티드 서열 등)이 제공되면, 유사한 또는 실질적으로 유사한 다른 서열은 상기 예의 프로그램을 이용하여 동정될 수 있다. 예를들면 마이크로어레이 또는 프로브 서열을 구축할 때, 서열 및 위치는 알려져 있어 마이크로어레이 실험이 '히트' 동정하면 (특정 위치에 있는 프로브가 시료의 하나 이상의 핵산과 혼성화), 프로브 서열이 알려진다 (마이크로어레이 제조업자 또는 생산업자에 의해, 또는 제조업자로부터 제공되는 데이터베이스로부터 - 예를들면 Affymetrix의 NetAffx 데이터베이스, 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이 제조업자). 서열 소스 동정이 제공되지 않으면, 하나 이상의 데이터페이스에 대한 서열-기반 검색에서 프로브 서열을 이용하여 결정된다. 단백질 어레이 예를들면 iTRAQ에 의해 동정된 펩티드 또는 펩티드 단편에 대하여는, 펩티드 또는 단편 서열이 사용되어 상기와 같이 아미노산 서열 데이터베이스에 질의한다. 이러한 데이터베이스의 예로는 National Centre for Biotechnology Information, 또는 European Bioinformatics Institute 데이터베이스를 포함한다.
단백질 또는 폴리펩티드, 핵산 또는 이의 단편 또는 일부는 서열이 동일한 계통발생학적 종, 속, 과, 목에서 발견되는 다른 것과 차별될 때 특이적으로 동정된다고 고려된다. 이러한 차별성은 서열비교로 확인된다. 서열 또는 서열들 비교는 BLAST 알고리즘 (Altschul 등. 1009. J. Mol Biol 215:403-410)에 의해 수행된다.
BLAST 검색을 통하여 질의서열 및 특이 서열 또는 서열 군 또는 더 큰 서열 라이브러리 또는 데이터베이스 (예를들면 GenBank 또는 GenPept)와 비교하여 100% 상동성을 보이는 서열뿐 아니라 덜한 상동성을 가지는 것을 동정할 수 있다. 예를들면, 다중 이형체 (예를들면 단리 유전자 또는 유전자로부터 핵산 전사체의 가변적 스플라이싱 또는 해독-후 조작 과정에서 유래)을 가진 단백질 경우, 하나의 이형체가 동일 또는 다른 종의 다른 이형체와 차별될 때, 구조, 서열 또는 하나의 이형체에 존재하고 존재하지 않는, 또는 하나 이상의 다른 이형체에서 검출되지 않는 부위의 특이 검출에 의해 특이적으로 동정된다.
본 발명의 방법은 예를들면 개별 마커 검사를 수행하는 임상실험실 또는 기타 검사기관에 의해 최종사용자에게 접근될 수 있으며 - 생물학적 시료들이 개별 검사 및 분석이 수행되는 기관에 제공되고 예측방법이 적용되며; 달리 의료진은 임상실험실로부터 마커수치를 수령하고 지역적 장치 또는 인터넷-기반의 장치를 이용하여 본 예측방법에 접근할 수 있다.
중앙값, 표준오차, 표준편차 등과 같은 통계적 인자뿐 아니라 기타 본원에서 기재된 통계분석을 결정하는 것은 관련 분야에 정통한 기술자에게 공지되어있다. 특정 계수, 수치 또는 지표를 사용하는 것은 예시적일 뿐이고 본원에 개시된 본 발명의 여러 측면을 제한하는 것은 아니다.
예를들면 마이크로어레이 실험 또는 복잡한 RT-PCR 실험에서 획득된 상당한 규모의 유전자 발현 데이터들을 해석하는 것은 엄청난 작업이지만 전체적인 특징을 조명하는 방법으로 데이터를 정리할 수 있는 알고리즘 및 통계적 도구를 사용하여 매우 용이하게 진행된다. 시각적 도구 예를들면 색의 강도 및 색조를 변경하여 차별적인 발현을 나타내는 것도 가치가 있다 (Eisen 등. 1998. Proc Natl Acad Sci 95:14863-14868). 알고리즘 및 사용 가능한 통계적 도구는 어레이 및 생성 데이터세트의 복잡성 증가, 처리속도, 컴퓨터 메모리 증가 및 이들의 상대적 가격 하락으로 정교함이 증가되었다.
유전자 발현 프로파일의 수학적 및 통계적 분석은 여러 목적을 달성할 수 있다 - 생물학적 시스템의 경로 또는 도메인에서 단순조절을 보이는 유전자 군들의 동정, 둘 이상의 생물학적 시료들 간 유사성 및 차별성의 분석, 개체에서 특정 이벤트 또는 조작과정들을 구별하는 유전자 발현 프로파일의 특징 분석 등. 이러한 것은 치료요법 또는 치료요법 변경의 효능 평가, 특정 병리 진행 검사 또는 검출, 달리 임상적으로 유사한 (또는 거의 동일한) 병리들 간 차별화 등을 포함한다.
군집화 기법이 공지되고 예를들면 계층적 군집, 자기조직화 형상지도, k-평균 또는 결정 아닐링이 마이크로어레이 데이터세트에 적용된다. (Eisen 등, 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95:14863-14868; Tamayo, P., 등. 1999. Proc Natl Acad Sci USA 96:2907-2912; Tavazoie, S., 등. 1999. Nat Genet 22:281-285; Alon, U., 등. 1999. Proc Natl Acad Sci USA 96:6745-6750). 이러한 방법은 유전자 발현 프로파일에서 단순조절을 보이는 유전자 군들을 동정함에 유용하고, 또한 단순조절을 보이는 것들과 동일한 경로 또는 시스템에 참여하는 것으로 보이는 달리 미지 기능의 새로운 유전자를 동정함에 유용할 수 있다.
생물학적 시료에서의 유전자 발현 패턴은 기능적 상태 및 식별성에 대한 차별적이며 접근 가능한 분자적 모형을 제공한다 (DeRisi 1997; Cho 1998; Chu 1998; Holstege 1998; Spellman 1998). 따라서 관련 유전자 발현 패턴을 가지는 두 개의 다른 시료들은 생물학적 및 기능적으로 서로 유사하거나, 역으로 유의한 차이를 보이는 두 시료들은 보여진 복잡한 발현 패턴에 의해 차별될 뿐 아니라 특이적 병리상태 또는 기타 생리적 조건 예를들면 동종이식 거부반응의 표시인 유전산물 또는 전사체의 진단적 부분집합을 표시한다.
다수의 수학적 및/또는 통계적 분석방법을 마이크로어레이 데이터세트에 적용하면 유의한 마커들의 가변 부분집합을 표시할 수 있지만, 어떠한 방법이 '최적' 또는 '더욱 정확한'지에 대한 불확실성에 이른다. 수학적 방법과 무관하게, 중요한 생물적 현상은 데이터세트에 있어서 동일하다. 다수의 수학적 및/또는 통계적 방법을 마이크로어레이에 적용하고 모두에 공동적인 마커들 각각의 통계적으로 유의한 부분집합을 평가함으로써 불확실성은 줄어들고, 임상적으로 연관된 중요한 마커들이 확인될 수 있다.
유전자 발현 프로파일 형성 마커들 ("유전자 마커들 ")
본 발명은 동종이식 만성 거부반응을 포함한 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단에 유용한 일군의 마커들을 제공하며, 이는 유전자 마커들 CHPTl, RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4, OSBP2, IFIT5으로 구성된다.
전혈 CR 시료들에서 검출, 정량화되고 3번의 변형 t 검정에서 최소한 한번에 대하여 비-거부반응 이식 (NR) 대조군과 대비하여 통계적으로 유의한 폴드 변화를 보이는 것으로 발견되는 22개의 유전자들 또는 전사체들 (표 6) 중에서, 10개의 마커들이 (모든 3번의 검정에 대하여) 통계적으로 유의한 결합집합에 존재한다. 더 큰 집합인 22개 각 마커의 폴드-변화는 최소한 2-배이고, 논의된 유전자 또는 전사체의 증가/상향-조절 또는 감소/하향-조절을 나타낼 수 있다.
콜린 포스포트란스페라아제 1 (CPT, CPTl) 유전자는 지질대사, 및 잠재적으로 세포성장조절에 관여하는 산물을 코딩한다. 인간 CHPTl 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 BC020819, BC050429, NW OO 1838061, 및 NW_925395).
C-타입 렉틴 도메인 패밀리 2, 멤버 B (CLEC2B, CLECSF2) 유전자는 C-타입 렉틴/C-타입 렉틴 유사 도메인 (CTL/CTLD) 슈퍼패밀리의 멤버를 코딩한다. 본 패밀리 멤버들은 공통의 단백질 폴드를 공유하며 다양한 기능을 가지고, 예를들면 세포부착, 세포-세포 신호, 당단백질 전환, 및 염증 및 면역반응에서의 역할을 수행한다. 코딩되는 타입 2 막관통단백질은 세포 활성 항원으로 기능할 수 있다. 인간 CLEC2B의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenBank 기탁번호 CH471094.1, AC007068.17,AC91814.10, AY142147.1, BC005254.1, AB015628.1,
AL550908.3, BG503026.1, BG540007.1, BG779377.1, X96719.1, DQ892509.2, DQ895723.2).
RPS26 (LOC644166/ LOC644191/ LOC728937/ )는 40S 리보솜 26 단백질과 유사한 리보솜단백질을 코딩한다. 본 위치와 관련된 뉴클레오티드 서열은 공지되어있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 XMOOl 721435.1, AC000134.1).
구아닐산 결합단백질 3(GBP3, DKFZp686E0974,
DKFZp686L15228, FLJ10961)을 코딩하는 유전자는 구아닐산-결합 단백질 패밀리의 멤버를 코딩하며, 배중심 키나아제 패밀리의 멤버와 상호 작용할 수 있다. 인간 GBP3 뉴클레오티드 서열은 알려져있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NW_001838589, NW_921795, 및 NM Ol8284).
KLRCl/ KLRC2 (살해 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 C, 멤버 1/ 살해 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 C, 멤버 2) 패밀리의 유전자는 우선적으로 NK 세포에서 발현되는 막관통단백질 산물을 코딩하고 NK 세포 및 일부 세포독성 T-세포들에 의한 MHC 클라스 I HLA-E 분자들 인식 수용체로 기능할 수 있다. 인간KLRCl 뉴클레오티드 서열은 공지된다 (예를들면 GenBank 기탁번호: NM_213658, NM_213657, NM_007328, NM_002259, BC012550, NW_001838052 및 NW 925328). 인간KLRC2 뉴클레오티드 서열은 공지된다 (예를들면 GenBank 기탁번호: NM_002260, NWJ)Ol 838052, NW_925328, BCl 12039, BC093644, 및 BC106069).
유전자 ZCCHC2 (아연 집게, CCHC 도메인 함유 2)는 FLJ20281; KIAA1744; MGC13269; DKFZp451A185으로도 알려져 있다. 인간 ZCCHC2 뉴클레오티드 서열은 알려져있다(예를들면 GenBank 기탁번호: NM_017742, NW_001838469, NW_927106, NT_025028.13 및 BC006340).
PDK4 (피루브산탈수소효소 키나아제, 동질효소 2) 유전자는 PDK/BCKDK 단백질 키나아제 패밀리의 멤버이고 미토콘드리아단백질을 코딩한다. 이는 El_알파 서브유닛의 인산화 반응으로 미토콘드리아 피루브산탈수소효소 복합체를 억제하여 포도당 대사조절에 기여한다. 인간 PDK4 뉴클레오티드 서열은 알려져있다 (예를들면 GenBank 기탁번호: NM 002612, NW_001839064, NT 079595, NW_923574, 및 BC040239).
OSBP2 (옥시스테롤결합단백질 2) - 본 유전자에 의해 코딩되는 막-결합 단백질은 플렉스트린 상동 (PH) 도메인 및 옥시스테롤-결합 영역을 포함한다. 인간 OSBP2의 뉴클레오티드 서열은 알려져있다 (예를들면 GenBank 기탁번호: NM 030758, NM_002556, BCl 18914, 및 AF288742).
IFIT5 (테트라트리코펩티드 반복 5를 가지는 인터페론-유도 단백질)의 유전자 산물은 인터페론-조절 신호 및/또는 성장에 역할을 수행한다. 인간 IFIT5의 뉴클레오티드 서열은 알려져있다 (예를들면 GenBank 기탁번호: NM_012420, BC025786, CR457031, NW_01838005, NW_924884, 및 NT_030059).
본 발명은 개체에서의 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단과 관련된 유전자 발현 프로파일을 제공한다. 유전자 발현 프로파일에서 여러 요소들은 개별적으로 알려져 있으나, 이들의 변경 발현 수준 (대조군에 대하여 증가 또는 감소)의 특정 조합은 개체의 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단에 있어서 유용한 새로운 조합으로 구성된다.
개체가 만성 거부자 또는 만성 거부자 진행 위험성이 확인되면, 동종이식에 대한 개체 면역반응을 변경하기 위한 치료적 수단이 구현될 수 있다. 개체는 더욱 자주 또는 더욱 민감한 검사방법을 사용하여 추가 임상지표 검사를 받을 수 있다. 또한 개체는 면역반응 감소 또는 증가를 위하여 면역억제제를 투여 받을 수 있다. 동종이식 거부반응을 방지하기 위하여 개체 면역반응이 상당히 억제될 필요가 있는 경우에도, 기회감염 방지를 위한 적당한 수준의 면역기능도 필요하다. 개체에 투여 가능한 다양한 약물이 공지된다: 예를들면, Goodman 및 Gilman의 The Pharmacological Basis of Therapeutics 11판. Ch 52, pp 1405-1431 및 참고문헌; LL Brunton, JS Lazo, KL Parker 편집자. 기타 예방적 및 치료적 전략은 의료문헌에서 검토된다- 참고, 예를들면 Kobashigawa 등. 2006. Nature Clinical Practice. Cardiovascular Medicine 3:203-21.
본 발명의 바이오마커들과 연관된 생물학적 경로
본 발명의 바이오마커들은 면역과정 및 동종이식 거부반응에 대한 개체 반응에 의해 특히 영향을 받는 경로와 연관된다. 이론에 구애되지 않고, 도 3은 바이오마커들 KLRC2, KLRCl, PKD4 및 CHPTl 사이의 경로-기반의 관계를 도시한 것이다.
1. NKG2C (KLRC2) -> CD94 -> NKG2A (KLRCl)
2. NKG2C / NKG2A (KLRC2 / KLRCl) -> SHPl -> ESRl ->PDK4 및 CHPTl
3. ESRl -> PDK4 및 CHPTl
따라서 KLRC2, KLRCl, PKD4 및 CHPTl은 동종이식 거부반응 과정에서 생물학적 역할을 하며 치료적 표적을 나타낼 수 있다.
이론에 구애됨이 없이, HLA 유전자/다형상은 이식 결과 (예를들면, 거부반응, 비-거부반응)에 영향을 줄 수 있다.
마이크로어레이와 같은 더 큰 규모의 유전자 발현 분석에 의하면 상호작용 유전자 군들 (때로는 2 이상의 분리도)은 함께 발현되고 공통의 조절요소를 가진다. 이러한 단순조절 (coordinate regulation)의 기타 예는 본 분야에 공지되며, 예를들면 참고로 효소의 이단 전이 (diauxic shift) (DiRisi 등 1997 Science 278:680-686; Eisen 등. 1998. Proc Natl Acad Sci 95:14863-14868)
이론에 구속되지 않고, 기타 본원에 기재된 유전자 또는 전사체, 예를들면 CHPTl, RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4, OSBP2 또는IFIT5는 동종이식 거부반응 과정에서 생물학적 역할을 수행할 수 있고, 치료적 표적이 될 수 있다.
또한 본 발명은 개체의 동종이식 거부반응 예측 또는 진단용 키트가 제공된다. 키트는 CHPTl, RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4, OSBP2, IFIT5의 하나 이상을 특정하고 정량 검출하기 위한 시약 및 이러한 시약의 사용 및 결과 자료 분석방법의 지시서로 구성된다. 본 키트는 또한 CHPTl, RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4, OSBP2, IFIT5의 하나 이상을 특정 및 정량 검출을 위한 시약을 포함한다. 본 키트는 개체 거부반응 예측 또는 진단을 위하여 단독으로 또는 임상지표들 결정을 위한 기타 방법 및 적합한 기타 검정과 함께 사용될 수 있다. 키트는 예를들면 마커에 선택적으로 혼성화할 수 있는 표지화 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 키트는 예를들면 마커 영역을 (예를들면 PCR에 의해) 증폭하도록 작동하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비-거부반응 컷오프 지표를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다. 키트는 동종반응성T-세포 단리를 위한 시약, 및 동종반응성 세포 단리용 기구 또는 도구 - 예를들면 자기성 비드, 채혈 튜브, 버퍼 등을 사용지시서와 함께 포함할 수 있다.
동종반응성 T-세포 프로파일 형성
동종반응성 림프구 예를들면 T-세포 또는 T-림프구에서 발현되는 핵산 프로파일 ("동종반응성 T-세포 프로파일 형성")은 동종이식 거부반응 진단에 사용될 수 있다. 동종반응성 T-세포 프로파일은 단독 또는 유전자 발현 프로파일, 단백질 프로파일 또는 대사산물 프로파일과 조합되어 사용될 수 있다.
동종반응성 T-세포는 이식 거부 면역반응의 전방선 (front-line)이다. 이들은 외부이식편에 존재하는 동종항원을 인식하는 말초혈액단핵구 (PBMC)의 부분집합 (~0.1- l%)이다. 이들은 외부이식편에 침윤하여 일련의 항-이식 면역반응을 일으키고, 만일 확인되지 않으면, 이식편 거부 및 상실에 이를 것이다. 동종반응성 T-세포는, 따라서 마커들의 다른 소스와 비교하여 특이성을 제공하거나, 장기 거부반응 단계들 간 차별하는 보완 소스로 기능할 것이다. 동종반응성 T-세포 군(population)에서의 유전자 발현 프로파일은 다른 장기 이식에 거쳐 사용될 수 있고 또한 기타 이유들 (알레르기, 바이러스 감염 등)로 인한 장기 거부반응 및 면역활성을 구분하기에 유용하다.
또한 동종반응성 T-세포 프로파일은 대사산물 ("대사체학"), 유전자 또는 단백질 프로파일과 조합으로 사용될 수 있다. 개체 게놈에서의 사소한 변경 예를들면 단일 염기 변화 또는 동질이상, 또는 게놈 발현 (예를들면 차등 유전자 발현)은 개체의 소분자 대사산물 프로파일에 신속한 반응으로 이어질 것이다. 또한 소분자 대사산물은 환경변화에 신속하게 반응하며 상당한 대사산물 변경은 환경변화 수초 내지 수분 내에 명백하며 - 반대로, 단백질 또는 유전자 발현 변경은 명백하게 되기 위하여는 수 시간 또는 수일 소요된다. 임상지표 목록은 예를들면 순환기질환, 비만, 대사증후군을 검사하기 위하여 사용되는 다양한 대사산물 - 예를들면 콜레스테롤, 호모시스테인, 포도당, 요산, 말론디알데히드 및 케톤체를 표시한다. 기타 비-제한적 소분자의 예는 표 3에 나열된다.
동종반응성 T-세포로부터의 마커들은 동종이식 거부반응 진단용으로 단독 사용될 수 있고, 또는 혈액 전체로부터의 마커들과 조합하여 사용될 수 있다.
동종이식 거부반응 진단을 위한 단백질 프로파일 형성
단백질 프로파일 역시 동종이식 거부반응 진단용으로 사용될 수 있다. 단백질 프로파일은 단독 또는 유전자 발현 프로파일, 대사산물 프로파일 또는 동종반응성 T-세포 프로파일과 조합하여 사용될 수 있다.
일부 예에서, 본 발명은 개체의 동종이식 만성 거부반응 진단 또는 결정을 위한 방법을 제공하며, 이는 1) 개체의 생물학적 시료에서, IGFBP3, MSTl, CDH5, ClQB, CFHR2, CPNl, APOB, HBB, GC 및 C9에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계; 2) 하나 이상의 단백질 마커들의 발현 프로파일을 대조 프로파일과 비교하는 단계; 및 3) 하나 이상의 단백질 마커들 발현 수준이 대조 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 단백질 마커들 증가 또는 감소는 개체의 만성 거부반응 상태를 표시한다.
또한 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 개체의 동종이식 거부반응 예측, 평가 또는 진단방법을 제공하며, 이는 1) IGFBP3, MSTl, CDH5, ClQB, CFHR2, CPNl, APOB, HBB, GC 및 C9에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 마커들 증가 또는 감소를 측정하는 단계; 및 2) 개체의 만성 '거부반응 상태'를 결정하는 단계를 포함하여 구성되며, 개체의 '거부반응 상태'결정은 개체의 단백질 마커 발현 프로파일을 대조 단백질 마커 발현 프로파일과 비교하여 결정된다.
다수의 단백질 동정 및 정량화 방법들이 현재 가능하며, 예를들면 글리코펩티드 캡처 (Zhang 등, 2005. Mol Cell Proteomics 4:144-155), 다차원 단백질 동정기법 (Mud-PIT) Washburn 등, 2001 Nature Biotechnology (19:242-247), 및 표면-강화 레이저 탈착 이온화 (SELDI-TOF) (Hutches 등., 1993. Rapid Commun Mass Spec 7:576-580). 다중 단백질 시료들 정량화를 가능하게 하는 다양한 동위원소 표지방법, 예를들면 절대 및 상대 단백질 정량화를 위한 동중원소 태그 (iTRAQ) (Ross 등, 2004 Mol Cell Proteomics 3:1154-1169); 동위원소 코드화 친화성 태그 (ICAT) (Gygi 등., 1999 Nature Biotecnology 17:994-999), 동위원소 코드화 단백질 표지화 (ICPL) (Schmidt 등., 2004. Proteomics 5:4-15), 및 N-말단 동위원소 태그화 (NIT) (Fedjaev 등, 2007 Rapid Commun Mass Spectrom 21:2671-2679; Nam 등, 2005. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sd. 826:91 -107)가 고효율 성능, 및 바이오마커 선별/동정 연구에 특히 유용한 특성으로 널리 이용된다.
혈장시료들에서 가장 풍부한 14개의 단백질 제거 및 iTRAQ-MALDI-TOF/TOF 조합에 의한 단백질체학 기법 적용 역시 대규모 CR 단백질 마커들의 선별 및 정량분석에 유효한 다른 접근법이라는 것이 입증되었다. 간단하게, 개체 혈장시료들 (대조군 및 동종이식 수령자)에서 가장 풍부한 14개의 단백질을 제거시키고 iTRAQ-MALDI-TOF/TOF에 의해 정량 분석된다. 본 분석 결과 최소한 2/3의 CR 및 S 시료들에서 검출되는 129 배지-대-소(low) 단백질 (군들)이 동정되었다. 이들 중, 14개가 통계적으로 유의한, 차별적 상대 농도를 가졌다 (p-값 <0.5). 14개의 후보에서 "최고" 단백질로서 p-값 컷오프 0.03에 기반하여 10개를 더욱 선택하였다. 단백질 바이오마커 패널을 구성하는 10개의 단백질은 검증 확인 결과 83% 민감성 및 특이성을 보였다.
따라서, 단일 후보 바이오마커들이 (일부 폴드-변화가 상대적으로 작은) 군들을 명확하게 구분하지는 않지만, 함께, 동정된 마커들은 약 83% 민감성 및 약 83% 특이성으로 분류될 수 있었다.
iTRAQ은 동종이식 만성 거부반응 단백질 마커들인 단백질, 펩티드 또는 이의 단편들의 수준을 탐색, 결정하기 위한 예시적 방법이다. 기타 본원에 기재된 방법들 예를들면 면역 기반 방법 예를들면 ELISA 역시 단백질 마커들 수준을 검출 또는 결정함에 유용할 수 있다. 달리, 특이 항체 역시 하나 이상의 단백질, 이형체, 전구체, 폴리펩티드, 펩티드, 이의 일부 또는 절편에 대하여 반응되며, 시료에서 하나 이상의 단백질 마커 존재를 탐색함에 특이 항체가 사용될 수 있다. 적합한 펩티드 선택, 면역혈청 제조를 위한 동물 (예를들면 생쥐, 토끼 등) 면역화 및/또는 단일클론 항체 제조를 위한 혼성세포 제조 및 선별 방법들은 본 분야에서 공지되며 본원에 참고문헌으로 기재된다.
단백질 발현 프로파일 마커들 ("단백질 마커들 ")
하나 이상의 전구체, 스플라이싱 이체, 이형체가 단일 유전자에 의해 코딩된다. 유전자 및 코딩화 이형체, 전구체 및 이체(variant) 예시는 표 8에 각 단백질 그룹 코드 (PGC)와 함께 제공된다.
CFHR2 (보체 인자H-관련 단백질2)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 혈청단백질을 포함하고 이는 구조적으로 및 면역학적으로 보체인자 H와 연관된다. CFHR2 코딩 뉴클레오티드 서열은 공지된다 (예를들면 GenBAnk 기탁번호NM_005666 BC022283.1, X64877.1 및BG566607.1). CFHR2에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열이 공지된다(예를들면 GenPept 기탁번호 P36980, CAA60375).
CPN 1 (카르복시펩티다아제 N 촉매 사슬 전구체)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 펩티드 및 단백질의 C말단에서 염기성 아미노산을 절단하는 혈장 금속단백질분해효소를 포함하고, 키닌 및 아나필라톡신과 같은 펩티드의 생물학적 활성을 조절한다. CPNl을 코딩하는 뉴클레오티드는 공지되어있다 (예를들면 GenBank 기탁번호NM_001308 CR608830.1, Xl 4329.1, AW950687.1). CPN1에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열이 알려져 있다 (예를들면 GenPept 기탁번호NP OO 1073982, P22792, NP_001295, NP_001299, Pl 5169).
APOB (아포리포단백질 B-100 (전구체), APOB 100)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 유상지립 및 저밀도지질단백질 (LDL)의 아포리포단백질을 포함하며 2 주요 형태, apoB48 및 apoBlOO의 혈장에서 발견된다. APOB을 코딩하는 핵산서열은 공지된다 (예를들면 GenBank 기탁번호NM_019287, AK290844, NM_000384). APOB에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열은 공지된다 (예를들면 GenPept 기탁번호 NP_OOO375, P41238, AAB60718, 139470).
HBB (헤모글로빈, 베타 위치, 베타 글로빈)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 혈액에서 산소수송에 중요한 기능을 한다. HBB을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 공지된다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM 000518, NG 000007, L48217.1). HBB에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열은 공지된다 (예를들면 GenPept 기탁번호NP_000509).
HBD (헤모글로빈, 델타 위치)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 헤모글로빈 성분을 포함한다. HBD을 코딩하는 뉴클레오티드는 공지된다 (예를들면 GenBank 기탁번호 AF339104.2, AYO.4468.1, BC069307.1, BC070282.1, BU664913.1). HBD에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 의한 아미노산 서열은 공지된다 (예를들면 GenPept 기탁번호P02042.2, Q4F786, AAH70282.1).
GC (그룹-특이적, DBP, VDBP, 비타민 D-결합 단백질)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 알부민 유전자 패밀리에서 혈청단백질을 포함하고 비타민 D을 표적조직에 결합 및 수송하는 기능을 한다. GC을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 공지된다 (예를들면 GenBank 기탁번호 AK298433, NM 000583, M12654.1 및 BC022310.1). GB에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열이 공지된다 (예를들면 GenPept 기탁번호 NP_000574, AAD14250, P02774).
C9에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 보체 성분 C9 전구체를 포함하며 이는 보체시스템에서 막공격복합체 (MAC)의 최종 성분이다. C9을 코딩하는 핵산서열은 공지된다(예를들면 GenBank 기탁번호NM_001737, BC020721.1, CB157001.1, K02766.1 및CB135741.L). C9에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열은 공지된다 (예를들면 GenPept 기탁번호 NP OOl 728, P02748).
IGFBP3 (인슐린-유사 성장인자 결합 단백질3, IBP3)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 혈액에서 IGF2 및 IGF2에 대한 운반체를 포함한다. IGFBP3을 코딩하는 핵산서열은 공지된다 (예를들면 GenBank 기탁번호NM_000596, NM_000598, NM_001013398). IGFBP3에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열은 공지된다 (예를들면 GenPept 기탁번호P17936, NP 001013416, NP_000589, NP_000587).
MSTl (대식세포 자극 1, 간세포 성장인자-유사 단백질, HGFL)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 세포성장, 세포전이 및 형태발생을 조절하는 폴리펩티드를 포함하며 배아 장기발생, 성인 장기재생 및 상처치유 기능을 수행한다. MST1을 코딩하는 핵산서열은 공지된다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_020998, DC315638.1, Ll 1924.1, AK222893.1 및 BM672747.L). MST1에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열이 공지된다 (예를들면 GenPept 기탁번호NP_066278, P26927).
CDH5 (카데린-5, 혈관내피 카데린, VE-카데린)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 내피부착분자를 포함하며 내피기능 및 혈관장벽 정확성을 조절한다. CDH5을 코딩하는 핵산서열은 공지된다 (예를들면 GenBank 기탁번호NM_001795, DC381809.1, X59796.1, U84722.1, AC 132186.3 및 X79981.1). CDH5에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열이 알려져있다 (예를들면 GenPept 기탁번호 NP_001786, P33151).
C1QB (보체 성분 1 , q 부성분, B 사슬)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 보체시스템에서 C1 단백질의 제1 부성분 Ciq 일부인 폴리펩티드를 포함한다. ClQB을 코딩하는 핵산서열은 공지된다(예를들면 GenBank 기탁번호 NG 007283, NM 000491). ClQB에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열은 공지된다 (예를들면 GenPept 기탁번호NP_000482.3, P02746.2).
유전자 및 단백질 발현 프로파일의 조합
본 발명은 개체의 동종이식 만성 거부반응 진단방법이 제공되며, 이는 1) 개체의 생물학적 시료에서, 유전자 마커 OSBP2, CHPTl, RPS26, GBP3, KLRCl, ZCCHC2, 242907, CLEC2B, PDK4 및 IFIT5, 및 CFHR2, CPNl, APOB, HBB, GC, C9, IGFBP3, MSTl, CDH5 및 ClQB에 의해 코딩되는 단백질 마커들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계; 2) 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 비-거부자 프로파일과 비교하는 단계; 및 3) 하나 이상의 마커들의 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 상향-조절 또는 하향-조절을 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 마커들의 상향-조절 또는 하향-조절이 거부반응 상태를 표시한다.
본원에 기재된 바와 같이, 신뢰할 수 있는 통계적 검증이 유전자 및 단백질 플랫폼에 적용되어 차등 발현 유전자 및 단백질을 동정한다. 동정된 유전자, 단백질 뿐 아니라 조합 후보를 이용하여, 바이오마커 패널들이 개발되어 만성 거부반응 (CR) 및 비-만성 거부반응/안정 (S) 시료들을 구별한다.
고효율 접근법 및 마이크로어레이 및 qPCR, 및 복합 iTRAQ 및 ELISA을 적용하여, 혈액 전체의 만성 거부반응에 대한 잠재적 유전자 및 혈장 단백질 바이오마커들을 동정한다.
흥미로운 것은, 현 연구에서 동정된 유전자 및 단백질 바이오마커 패널은 유사한 수준의 CR 및 S 시료 분별 성능을 가진다. 패널에 걸쳐 10개의 유전자 및 10개의 단백질 (군들) 동정이 중첩되지 않는 것으로 보인다. 혈장시료를 이용하는 단백질 플랫폼과는 달리, 말초혈액이 마이크로어레이에 사용되었다. 따라서 말초혈액에서 추가적인 순환 성분들 예를들면 적혈구, 혈소판 및 특히 백혈구가 차등 발현 유전자 검출에 기여한다. 만성 염증이 CAV 진행에 중요한 역할을 한다면, 말초혈액에 있는 단핵세포 (MNC) 및 다형핵세포 (PMS)로부터의 유전자 발현 영향이 상당할 수 있다.
유전자 존재론 (GO)-기반 분석에 의하면, 만성적 심장 동종이식 거부반응의 유전자 및 단백질 패널 간 상당한 정도의 일치를 보였다. 대략, 각 패널에 관련된 GO 조건들 목록은 독립적으로 고유하나 비교적 유사하다. 강화분석 (p<0.05)을 통하여 유전자 및 단백질 패널들로부터의 바이오마커들이 높은 수준 (GO 수준 3-5) 에서 여러 유사한 생물학적 및 분자적 과정에 관여하는 것으로 보여진다. 이러한 과정은 제한적이지는 않지만: 면역반응, 지질수송, 외부자극에 대한 반응 및 탄수화물 결합활성을 포함한다.
유전자 및 단백질 분류자에 대한 민감성 및 특이성이 유사하므로, '조합적'바이오마커 패널 가능성을 점검하고 구분 가능성을 검사하였다. 단계별 판별분석법 (SDA)을 유전자 및 단백질 바이오마커 패널들에 따로 적용하여 각 플랫폼으로부터 최적의 후보 조합을 생성한다. 생성된 바이오마커 패널은 4개의 프로브 세트 및 4개의 단백질 그룹 코드를 포함하였다.
조합적 바이오마커 패널/분류자는 분류 효율이 개선된다는 것을 보였다 (도 6). 조합적 분류자가 유전자 및 단백질 검증에 사용되는 동일 검사 집단(cohort)에 적용되었을 때, CR 및 S 시료들을 100% 민감성 및 83% 특이성으로 옳게 차별할 수 있었다 (유전자 및 단백질 분류자를 독립적으로 사용할 때 83% 민감성 및 특이성과 비교). 조합적 패널에서 관찰되는 보강 효율은 부분적으로는 단백질 및 유전자 접근법 모두를 적용하여, 집단에 걸쳐 차등 발현되는 것으로 발견되는 바이오마커들은 플랫폼 특이적 왜곡(bias)와 덜 관련되거나 이로부터 덜 영향을 받는다는 사실에 기인한다.
중요한 것은, 유전자 및 단백질 패널들은, 각각은 고유한 바이오마커들 세트를 포함하지만, CR 및 S 시료들을 차별하는 상당한 성능을 보였다는 것이다. 조합적 패널에 대한 내적 검증 (internal validation) 결과 또한 다중-플랫폼 접근과 관련된 잠재적 이점이 부각된다.
또한 본 발명은 개체의 동종이식 만성 거부반응 예측 또는 진단 키트를 제공한다. 본 키트는 유전자 마커들 OSBP2, CHPTl, RPS26, GBP3, KLRCl, ZCCHC2, 242907, CLEC2B, PDK4 및 IFIT5 및 CFHR2, CPNl, APOB, HBB, GC, C9, IGFBP3, MSTl, CDH5 및 ClQB에 의해 코딩되는 단백질 마커들의 특정 및 정량 검출을 위한 시약, 및 이러한 시약 사용 및 결과 자료의 분석 방법을 위한 지시서로 구성된다. 본 키트는 개체 거부반응 상태를 예측 또는 진단하기 위하여 단독으로, 또는 기타 임상지표 결정방법, 또는 적당한 기타 검정법과 함께 사용될 수 있다. 비-거부반응 컷오프 지표를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다.
기타 예시
동종반응성 T 세포 프로파일 형성, 대사체학
동종반응성 T-세포 프로파일 및/또는 대사산물 ("대사체학") 프로파일은, 유전자 및/또는 단백질 프로파일과 조합으로 사용될 수 있다. 개체 게놈에서의 사소한 변경 예를들면 단일 염기 변화 또는 동질이상, 또는 게놈 발현 (예를들면 차등 유전자 발현)은 개체의 소분자 대사산물 프로파일에 신속한 반응으로 이어질 것이다. 또한 소분자 대사산물은 환경변화에 신속하게 반응하며 상당한 대사산물 변경은 환경변화 수초 내지 수분 내에 명백하며- 반대로, 단백질 또는 유전자 발현 변경은 명백하게 되기 위하여는 수 시간 또는 수일 소요된다. 임상지표 목록은 예를들면 순환기질환, 비만, 대사증후군을 검사하기 위하여 사용되는 다양한 대사산물 - 예를들면 콜레스테롤, 호모시스테인, 포도당, 요산, 말론디알데히드 및 케톤체를 표시한다. 기타 비-제한적 소분자의 예는 표 3에 나열된다.
[ 표 3] 개체군에서 획득된 혈청 시료의 NMR 스펙트럼에서 동정되고 정량화된 대사산물들
Figure pct00006

개체의 대사산물 프로파일을 얻기 위하여 다양한 기술 및 방법이 적용될 수 있다. 적용되는 방법 및 또한 관심있는 대사산물에 따라 시료준비가 다르며 - 예를들면, 시료에서 아미노산 및 작은 대체적으로 수용성 분자들의 대사산물 프로파일을 획득하기 위하여 시료를 낮은 분자량 컷오프 2-10 kDa으로 여과하는 것이 필요하며, 지질, 지방산 및 기타 대체로 수불용성 분자들의 대사산물 프로파일을 얻기 위하여 하나 이상의 유기용매로의 추출 및/또는 건조 및 잔류물 재용해가 필요하다. 마커들 탐색 및/또는 정량화를 위한 일부 예시적 방법이 본원에 표기되나, 기타 방법들도 본 분야의 기술자에게 공지되어있으며, 쉽게 적용될 수 있다.
개체의 대사산물 프로파일을 얻기 위하여 사용되는 (단일로 또는 조합하여) 일부 예시적 기술 및 방법은 제한적이지는 않지만 핵자기공명 (NMR), 가스크로마토그래피 (GC), 질량분석기 결합 크로마토그래피 (GC-MS), 질량분석기, 푸리에 변환 MS (FT-MS), 고성능액체크로마토그래피 등을 포함한다. 대사산물 프로파일 획득을 위한 예시적 시료준비 방법 및 기술은, 예를들면 Human Metabolome Project website (Wishart DS 등., 2007. Nucleic Acids Research 35:D521-6)에서 찾을 수 있다.
본 발명은 하기 예들에서 설명될 것이다. 그러나 이러한 예들은 설명을 목적으로 하는 것이며 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 적용되어서는 아니 된다는 것을 이해하여야 한다.
방법
개체 및 시료
이식 표준수술절차에서의 바이오마커에 따라 개체가 등록되었다. 연구기획자는 St. Paul 병원 (Vancouver, BC)의 심장이식 대기 개체와 상의하여, 동의한 39 개체들이 본 연구에 등록되었다. 모든 심장이식은 British Columbia Transplant (BCT)에 의해 주관되고, 모든 개체들은 표준 면역억제제 치료를 받는다. 동의한 개체들로부터 이식전 (기준선) 및 이식후 1, 2, 3, 4,8, 12, 26주 및 3년까지 매 6개월마다 혈액시료들이 채취되었다. 또한 혈액시료들은 동의한 개체들로부터 이식후 1 내지 5년 사이 단일 시간-점에서 채취되었다. 혈액은 PAXGene 튜브에 수집되어 전달용 얼음조에 넣고 하루 동안 -20℃ 냉동 및 이후 RNA 추출까지 -80℃ 보관하였다.
심장이식 개체데이터가 검토되었고 분석을 위하여 25 개체들이 선발되었다. 이식후 1년 내지 13년 사이 단일 시간 또는 일련 시간의 총 40개 혈액시료들이 RNA 추출 및 마이크로어레이 분석용으로 선택되었다. 4개의 기준선 혈액시료들도 처리되었다.
두 부류의 개체들이 등록되었다: 이식대기 개체 (신입), 및 2005년3월부터 2008년2월까지 매년 검사를 위해 내방하는 개체 (기존). 신입개체에 대하여, 이식전 (기준선), 이식후 1, 2, 3, 4, 5, 12 및 26주, 3년까지 매 6개월마다 혈액 및 소변시료들이 수집되었다. 기존 개체에 대하여는, 통상적인 이식후 검사 동안, 이식후 늦어도 1년 내에 단일 시료가 수집되었다. 건강한 개인의 혈액시료가 유전자 (전혈) 및 단백질 (혈장) 분석용 대조군으로 설정되었다.
신입 및 기존 이식개체들 모두는 사이클로스포린, 프레디노손 및 미코페놀레이트모페틸로 이루어진 표준 3중 면역억제제 치료 후, 베시리막스 유도 (basilimax induction)를 받았다. 여성의 경우 사이클로스포린은 타크로리무스로, 신장장애자 경우 시로로무스로 대체되었다. 이식후 3개월 내 2R 또는3R ISHLT 거부반응 등급 이력이 있는 개체들은 메틸프레드니솔론을 투약받았다.
만성 거부반응 (CR) 선별은 St. Paul 심장센터에서 정한 '심장 동종이식 혈관증 장기 감시 프로토콜'지침에 따라 도부타민 부하 심초음파, 관상혈관조영술, 혈관내초음파 (FVUS)을 적용하여 통상적으로 수행되었다. 혈액시료 채취일자에 해당되는 시점들에서 검사표를 검토하여 (즉, 혈관조영술 및/또는 FVUS 측정값) 만성적 거부반응 진단이 이루어졌다. 본 연구를 목적으로 CR 및 안정 (S)는 각각 > 50% 및 < 25% 협착으로 정의되고 임상확인에 기반하여 확인되었다.
분석 집단
본 연구의 목적은 만성적 거부반응 (CR) [임상확인 및 협착 50% 이상] 및 안정 (S) [임상확인 및 협착 20% 이하] 시료들을 구별하는 전혈 유전자 및 혈장 단백질 바이오마커들을 동정하는 것이다. 이식후 1년 내지 5년 사이 17 환자들 (신입 11, 기존 6)에서 채취된 총 25개의 혈액시료들이 유전자 및 단백질 분석을 위하여 선택되었다. 개체시료들은 훈련집단 및 실험집단으로 분류하였다. 훈련집단은 13 시료들로 이루어지며, 13 환자들로부터 이식후 1년 (7CR 및 6S) 및 2년 (1CR)에 채집된 것이다. 실험집단은 12 시료들로 이루어진다 (6CR 및 6S). 이들 시료 중 7개 (2CR 및 5S)는 5 훈련집단 개체들로부터 이후 시점들에서 수집되며, 5 (4CR 및 1S)은 4개의 비-훈련집단 개체들에서 이후 시점들에서 수집되었다. 훈련 및 실험집단 사이 환자 통계는 비슷하다 (표 4).
[표 4] 심장이식 개체 집단들 통계자료
Figure pct00007
RNA 추출 및 마이크로어레이 분석
RNA 추출은 해동 시료를 대상으로 PAXgene™ 혈액 RNA Kit [Cat #762134]을 이용하여 수행되어 전체 RNA을 분리하였다. 2.5 ml 전혈에서 통상 4 내지 10㎍ RNA가 단리되며, RNA 품질은 Agilent Bio Analyzer으로 확인되었다. 1.5 ug의 RNA, RIN 수치 > 5, 및 A240/A280 >1.9인 시료들이 드라이아이스에 포장되어 Affymetrix 마이크로어레이 분석을 위하여 페덱스를 이용하여 Microarray Core (MAC) 실험실 (아동병원, Los Angeles, CA)으로 보내졌다. 마이크로어레이 분석은 CAP/CLIA 인증 MAC 실험실의 단독 기술자에 의해 수행되었다. 이중나선 cDNA 합성을 위하여 신생 RNA가 사용되었다. cDNA는 바이오틴으로 표지화, 절편, 혼성화 혼합액과 혼합되고 GeneChip Human Genome U 133 Plus 2.0 어레이에서 혼성화되었다. 정상 전혈에서 제조된 내부 RNA 대조군과 함께 48 배치에서 Affymetrix System으로 어레이가 스캔되었다. 마이크로어레이는 Affymetrix version 1.16.0 및 affyPLM version 1.14.0 BioConductor 패키지 (Bolstad, B., Low Level Analysis of High-density Oligonucleotide Array Data: Background, Normalization and Summarization. 2004, University of California, Berkeley; Irizarry 등 2003. Biostatistics 4(2): 249-64)을 이용하여 품질 문제가 확인되었다. 낮은 품질의 어레이는 동일 시점에서의 다른 RNA 분취량으로 반복되었다.
단백질체학 ( Proteomics ):
혈장 처리, 제거( depletion ), 트립신 분해( digest ) 및 iTRAQ 표지화
혈액시료들이 EDTA 튜브에 수집되고 즉시 얼음에 보관되며 보관 전 2시간 내에 혈장 처리되었다. 원심분리를 통해 각 전혈 시료에서 혈장이 얻어지고, 분취되고 및 단백질 분석될 때까지 -70℃에 보관되었다. 각 시료에서 100 마이크로그램의 총 단백질이 iTRAQ 시약으로 준비되었다. 간단하게, 혈장시료들에서 가장 풍부한 14개의 혈장단백질 (알부민, 피브리노겐, 트란스페린, IgG, IgA, IgM, 하프토글로빈, α2-마크로글로불린,α1-산 당단백질, α1-안티트립신, 아포리프단백질-I, 아포리프단백질-II, 보체 C3 및 아포리프단백질 B)가 면역-친화성 크로마토그래피(Genway Biotech; San Diego, CA)에 의해 제거되고, 서열화 등급 변형 트립신 (Promega; Madison, WI)으로 트립신 분해되며 제조업자 (Applied Biosystems; Foster City, CA) 프로토콜에 따라 iTRAQ 시약으로 표지화된다. 표지화 시료들은 pH 2.5-3.0으로 산성화된다. iTRAQ 표지화 펩티드는 강 양이온 교환 크로마토그래피 (PoIyLC Inc., Columbia, MD USA)로 분리된다. 생성 표지화 펩티드는 역상 크로마토그래피 (Michrom Bioresources Inc., Auburn, CA USA)으로 더욱 분리되고, Probot 마이크로분별수집기 (LC Packings, Amsterdam, Netherlands)을 이용하여, 실험당 4플레이트로 384 스폿MALDI ABI 4800 플레이트에 스폿된다.
질량스펙트럼 및 데이터 처리
MALDI 플레이트에 스폿된 (spotted) 펩티드는 4000 series Explorer version 3.5 소프트웨어에 의해 제어되는 4800 MALDI TOF/TOF 분석기(Applied Biosystems; Foster City, CA)으로 분석된다. 질량분석기는 MS/MS 충돌에너지 1 keV으로 양이온 모드에서 설정되었다. 각 MS/MS 동작에 최대 1400 쇼트/스펙트럼이 얻어지고, 총 매스(mass) 시간은 35 내지 40 시간 범위가 되었다. 펩티드 동정 및 정량화는 ProteinPilot™ 소프트웨어 v2.0 (Applied Biosystems/MDS Sciex, Foster City, CA USA)으로 수행되었으며 일체화 신Paragon™ 검색알고리즘 (Applied Biosystems) 및 Pro Group™ 알고리즘이 사용되었다. 데이터베이스 검색은 국제단백질지표 (IPI HUMAN v3.39) (Kersey 등., 2004. Proteomics 4:1985-1988)에 대하여 수행되었다. 전구체 허용오차 (precursor tolerance)는 150ppm으로 설정되고, iTRAQ 단편 허용오차는 0.2 Da으로 설정되었다. 동정 파라미터들은 트립신 절단, MMTS에 의한 시스테인 알킬화로 설정되고, 특정 인자들은 요소변성 및 생물학적 변이상 ID 포커스에서 설정되었다. 검출 단백질 역치는 85% 신뢰구간에서 설정되었다.
단백질체학 분석
Pro Group™ 알고리즘(Applied Biosystems)은 Paragon™ 알고리즘으로부터의 펩티드 증거를 시료에서의 단백질에 대하여 종합적으로 요약하였다.
각 iTRAQ 동작에서 동정된 단백질 세트는 단백질 군들로 조직화되어 불필요한 중복을 피하였다. 각 iTRAQ 동작에는 3개의 개체 시료들 및 하나의 대조시료들이 포함되고 - 대조군은 iTRAQ 시약 114으로 일관되게 표지화되며, 개체 시료들은 무작위로 시약들 115, 116 및 117으로 표지화되었다. 상대적인 단백질 수준 (표지 114에 대한 각각의 표지 115, 116 및 117 수준)은 각 단백질 군에 대하여 상응된 펩티드 비율을 이용한 Protein Pilot으로 추정되었다. 각 단백질 군이 하나 이상의 동정 단백질을 포함하므로, 소위 단백질 그룹 코드 알고리즘 (PGCA)가 적용되어 모든 iTRAQ 실험들에 걸쳐 단백질 군들을 연관시켰다. PGCA는 동정 코드를 각 iTRAQ 동작에서 모든 단백질 군들에 부여하고 공통코드를 유사한 단백질 그룹들에 동작들(runs)에 걸쳐 할당한다. 후자 코드 역시 단백질 그룹 코드 (PGC)라고도 칭하며 이후 다른 iTRAQ 동작에 걸친 단백질들을 매칭시키는데 사용되었다. 이러한 과정을 통하여 비교 목적으로 하는 모든 실험적 동작들에 걸쳐 관련된 단백질 및 단백질 패밀리에 대한 공통 동정자 분류 (common identifier nomenclature)가 보장된다.
통계적 분석
이식후 1년 만성 거부반응 (n=6) 또는 안정 경우 (n=7)인 개체들의 단일 시점 시료들이 IVUS, 혈관조영술, 도부타민 부하 심초음파 및/또는 임상적 검토를 통하여 진단되었다. 이러한 "클린 집단"은 만성 거부반응 바이오마커 패널 발견을 위하여 사용되었다.
유전자 및 단백질 데이터에 대한 통계적 분석은, R version 2.6.0을 이용하여 구현된 "깔대기 (funnel)" 접근법에 따라 수행되었다.
단계 1: 예비-필터링
- 예비-필터 프로브 세트를 제공하기 위하여, 마이크로어레이에 있는 모든 프로브 세트들 필터되었다.
- 예비-필터 단백질 군들을 제공하기 위하여, PGCA 사전에 있는 모든 단백질 군들은 필터되었다.
단계 2: 신뢰 t-검정
- 각각 차등 발현 (DE) 프로브 세트 또는 DE 단백질 군들을 제공하기 위하여, 모든 예비-필터 프로브 세트 및 단백질 군들은 신뢰 t-검정을 받았다.
단계 3: 패널 선택
각각 유전자 바이오마커 패널 또는 단백질 바이오마커 패널을 제공하기 위하여, DE 프로브 세트 또는 단백질 군들은 더욱 분석되었다.
단계 4: 차원 감소
- 조합적 바이오마커 패널을 제공하기 위하여 유전자 및 단백질 바이오마커 패널들을 폴링 (poled)하였다.
통계분석은 SAS version 9.1 , R version 2.6.1 및
BioConductor version 2.1 (Gentleman, R., 등., Genome Biology, 2004. 5: p. R80)을 이용하여 수행되었다. Affymetrix BioConductor 패키지에서 유용한 간섭교정, 정규화 및 요약화를 위하여 신뢰 멀티-어레이 평균 (RMA) (Bolstad, 등. Bioinformatics, 2003. 19(2): p. 185-93) 기술이 사용되었다. 잡음최소화가 이루어졌고; 최소한 3 시료들에 걸쳐 일관적으로 50 이하의 발현 수치를 가지는 프로브 세트가 잡음으로 간주되었고 이후 분석에서 제거되었다. 나머지 프로브 세트들은 3개의 다른 적합 T-검정들로 분석되었다. 두 방법은 마이크로어레이 데이터에 대한 선형모델 (limma) BioConductor 패키지 - eBayes 와 조합된 신뢰 피트 (robust fit) 및 eBayes 와 조합된 최소자승피트 - 에서 가능하다. 3번째 통계분석방법, 마이크로어레이의 통계분석 (SAM)은 동일 BioConductor 패키지에서 가능하다. 모든 3가지 방법에서 오류발견률 (FDR) <0.05 및 모든 3가지 적당한 T-검정들 (동종반응성 T-세포에 대하여 폴드 변화 > 1.6) 폴드 변화 > 2인 경우 유전자는 통계적으로 유의하다고 간주된다 (Smyth, G., Limma: linear models for microarray data, in Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor, R. Gentleman, 등., Editors. 2005, Springer: New York). 통계적으로 유의한 프로브 세트에 대한 전진선택법 (forward selection)과 함께 바이오마커 패널 유전자는 단계적 판별분석법 (SDA)을 적용하여 동정되었다. 선형판별분석법 (LDA)이 분류자로서의 바이오마커 패널을 훈련 및 실험하기 위하여 사용된다.
유전자체학 ( Genomics )
단계 1에서, 신뢰 멀티-어레이 평균 (RMA) 기술이 간섭교정, 정규화 및 요약화를 위하여 사용되었다 (Affy BioConductor package version 1.6.7). 잡음을 줄이기 위하여 모든 시료들에 걸쳐 일관되게 낮은 발현수치를 가지는 프로브 세트들은 이후 분석에서 제거되었다. 나머지 프로브 세트들은 limma BioConductor 패키지, version 1.9.6으로 신뢰 적합 t-검정 (단계 2)을 적용하여 분석되었다. 오류발견률 (FDR) < 10%인 프로브 세트는 통계적으로 유의하다고 간주되었다. 바이오마커 패널 유전자는 보다 엄격한 컷오프 기준, FDR <5% 및 폴드 변화 > 2 (단계 3)을 적용하여 동정되었다. 내적 검증은 선형판별분석법 (LDA)을 이용하여 수행되어 S와 CR 시료들을 차별하는 유전자 패널 성능을 예측하였다.
단백질체학
단계 1에서, 각 군에서 최소한 2/3 환자들 (즉 7 AR 중 5 및 6 NR 중 4)에서 검출되지 않은 PGC은 이후 분석에서 제거되었다. 나머지 단백질 군들은 limma Bioconductor 패키지, version 1.9.6으로 신뢰 적합 t-검정 (단계 2)을 적용하여 분석되었다. CR 및 S 시료 사이 차별적인 상대농도들 (대조군 수준에 대비)을 가지는 단백질 그룹 코드들이 동정되고 단백질 바이오마커 패널로 간주되었다. 단계 3에서, 더욱 엄한 컷오프가 적용되어 (p-값 < 0.03) 바이오마커 패널 단백질이 선택되었다. 내적 검증은 선형판별분석법 (LDA)을 이용하여 수행되어 S 시료에서 CR을 구분하는 단백질 패널 성능을 예측하였다. LDA에서, 환자시료(들) 및/또는 대조군에서 미-검출되는 각 단백질에 대한 상대농도는 훈련집단의 다른 시료들에서 계산된 평균상대농도를 이용한 (imputated) 것이다.
기능 강화 ( Functional Enrichment )
동정된 (단계 2) 차등 발견 유전자 및 단백질의 기능성 강화는 FatiGO (Al-Shahrour 등, 2007. Nucleic Acid Research 35:W91- 96)을 적용하여 검사되었고, 이는 기능성 분석을 위하여 설계된 웹-기반 도구인 Babelomics version 3 (Al-Shahrour 등., 2006. Nucleic Acids Research W472-476)에서 이용될 수 있다.
조합적 분석
조합적 바이오마커 패널을 생성하기 위하여, 단백질 및 프로브 세트의 부분집합이 단일잔류 교차검증(Weihs, C, Ligges, U., Luebke, K. 및 Raabe, N. (2005). klaR Analyzing German Business Cycles. In Baier, D., Decker, R. 및 Schmidt-Thieme, L. (eds.). Data Analysis and Decision Support, 335-343, Springer- Verlag, Berlin)에서 분류정확도를 최대화하는 단계적 판별분석법(SDA)을 이용하여 별개로 동정되었다 (단계 3). 생성된 단백질 및 프로브 세트의 부분집합은 조합적 바이오마커 패널로 조합되었다. 내적 검증은 선형판별분석법 (LDA)을 이용하여 수행되어 S 시료에서 CR을 분류하는 조합적 패널의 성능이 예측되었다. SDA 및 LDA에서, 일부 환자시료들 및/또는 대조군에서 미-검출되는 각 단백질에 대하여, 훈련집단의 다른 시료들로부터의 평균상대농도가 대체되어 사용되었다.
실시예 1
정규화 및 예비-필터링 이후, 25,215 프로브 세트가 남았고 이후 훈련집단시료를 사용한 분석 (단계 2)에 포함되었다. 신뢰-검정을 이용하여, 총 106 프로브 세트가 FDR < 10%을 가지는 것으로 확인되었다. 이들 프로브 세트에 대하여 CR 및 S 시료들 사이 상대 발현 수준을 시각화하기 위한 히트맵이 구축되었다 (도 4). 또한, 집중분석 (over representation analysis)이 수행되어, 마이크로어레이에 존재하는 유전자 나머지와 비교하여 차등 발현 유전자가 관여하는 생물학적 및 분자적 프로세스의 유형을 관찰하였다. 상당히 심화된 유전자 존재론 (GO)적 조건들이 확인되었고 p-값이 < 0.05인 것들은 표 5에 요약되었다.
[표 5] 심화분석 (FatiGo)에 의해 확인되는 유전자 발현 프로파일에 대한 통계적으로 유의한 유전자 존재론적 조건들. P-값 <0.05.도시된 GO 조건들 (생물학적 프로세스 및 분자적 기능)은 GO 수준 3 내지 5 사이에 있다.
Figure pct00008
106 바이오마커 후보들로부터, 22개의 차등 발현 프로브 세트들이 동정되었고, 이들 각각은 만성 거부반응 환자 (CR) 및 클린 집단 (미-거부반응 환자 (NR)) 사이 최소한 2-폴드 차이를 보였다. 10 프로브 세트의 부분집합은 더욱 엄격한 기준을 이용하여 확인되었다(FDR < 5% 및 폴드 변화> 2). 이들 10개의 프로브 세트는 유전자 바이오마커 패널을 구성하고 - CHPTl, LOC644166/LOC644191/LOC728937/RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4, OSBP2, IFIT5 및 각 시료들을 CR 또는 NR으로 분류하도록 할 수 있다. 바이오마커 패널 프로브 세트/유전자의 하나 (OSBP2)는 S에 비하여 CR에서 하향 조절되었고, 나머지 (CHPTl, RPS26, GBP3, KLRCl, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4, IFIT5)는 상향 조절되었고 242907_at (미지 4)은 최소한 2-배 증가를 보이는 미지명 표적이다
내적 검증이 수행되어 유전자 바이오마커 패널이 12개의 새로운 시료들 (6개 CR 및 6개 S)을 조합적으로 분류할 수 있는 능력을 예측하였다. 하나의 CR 및 하나의 S 시료가 잘못 분류되었고, 따라서 이는 만성 심장 동종이식 거부반응의 유전자 바이오마커 패널의 83% 민감성 및 특이성에 상응한다.
[표 6] 만성적, 심장동종이식 거부반응 전혈 유전자 바이오마커
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
* 242907_at - SEQ ID NO: 6으로 뉴클레오티드 BLAST 검색 결과 NT_032977.8 (인간 염색체 1 유전자 콘틱, 참조 어셈블리)의 뉴클레오티드 58544174-59543814와 98% 상동성을 보인다. 서열의 이 부분 측부(flanking) 특징은 다음을 포함한다: 5' 측 603 bp: 구아닐산 결합단백질 2, 인터페론-유도성 및 3' 측 42939 bp: 구아닐산 결합단백질 1 , 인터페론-유도성, 67kD.
실시예 2 생물학적 경로
생물정보학 및 문헌-기반 접근법을 이용하여, 선택된 차별 발현 유전자에 기반하여 다양한 경로들이 확인되었다. 이론에 구애됨이 없이, 이들 상호작용 역시 본 결과에 설명되었다. 도 3은 바이오마커들 NKG2A (KLRCl), NKG2C (KLRC2), PDK4 및 CHPTl 사이의 경로-기반 상호작용을 도시한 것이다.
이론에 구애되지 않고, 바이오마커 유전자 및/또는 유전산물들 사이 상호반응은 다음을 포함한다:
1. NKG2C (KLRC2) -> CD94 -> NKG2A (KLRCl)
NKG2C (KLRC2) -> CD94 {Ding 등 1999. Scand. J Immunol 49:459-65; Gunturi 등 2004. Immunol. Res 30:29-34)
CD94 -> NKG2A (KLRCl) (Brooks 등 1997. J Exp Med 185:795-800; Brooks 등 1999. J. Immunol. 162:305-13; Dulphy 등 2002. Int Immunol 14:471-9)
2. NKG2C / NKG2A (KLRC2 / KLRCl) -> SHPl -> ESRl -> PDK4 및 CHPTl
NKG2C / NKG2A (KLRC2 / KLRCl) -> SHPl (Lin Chua 등 2002. Cell
Immunol. 219:57-70; Le Drean 등 1998. Eur J Immunol 28:264-76)
SHPl -> ESRl (Grimaldi 등 2002. 109:1625-33)
3. ESRl -> PDK4 및 CHPTl
(Araki 등 2006. FEBS J. 273:1669-80; Laganiere 등 2005. Proc Natl Acad Sci USA. 102:11651-6)
실시예 3: 단백질 분석결과
총 ~2500 단백질 그룹코드 (PGC)가 훈련집단에 포함된 13 시료들 중 최소한 하나에서 발견되었다. 이들 PGC는 예비-필터되었다 (단계 1) - 7 CR 및 6S 시료들 (즉 5개 CR 및 6개 S 시료들)의 최소한 2/3에서 발견된 PGC가 다음 분석에 이용되었다. 통계분석에 의해 129 분석 단백질 중 14개가 p-값 <0.05인 차별된 상대농도를 가지는 것으로 확인되었다. S시료에서 CR을 구별할 때 이들 유의한 PGC의 성능을 시각화하기 위하여 히트맵이 구축되었다 (또 5). 집중분석이 수행되어 이들 단백질그룹코드에 속한 모든 단백질의 생물학적 및 분자적 기능이 연구되었다. P-값 <0.05인 유의한 심화 GO 조건들이 표 7에 기재된다.
[표 7] 심화분석 (FatiGo)에 의해 확인되는 단백질 발현 프로파일에 대한 통계적으로 유의한 유전자 존재론적 조건들. P-값 <0.05. 보여진 GO 조건들 (생물학적 프로세스 및 분자적 기능)은 GO 수준 3 내지 5 사이에 있다.
14개의 바이오마커 후보로부터 10 PGC가 더욱 엄격한 기준(p-값 < 0.03)으로 확인되고 단백질 바이오마커 패널을 구성하였다 (표 8). 6개의바이오마커 패널 PGC (CFHR2, CPNl, APOB, HBB, GC, C9)는 S 대비 CR에서 증가되었고, 4개 (IGFBP3, MSTl, CDH5, ClQB)는 감소되었다.
[표 8] 만성 심장동종이식 거부반응 단백질 바이오마커 패널
Figure pct00013
유전자 분석과 유사하게, 내적 검증이 수행되어 단백질 바이오마커 패널이 12개의 새로운 시료들 (6 CR 및 6 S)을 분류할 수 있는 능력을 예측하였다. 이들 시료는 유전자 내부 검증에서와 같이 동일 시점에서 동일 환자로부터 취하였다. 분류자 (바이오마커 패널에 기반하여 개발된)를 이용하여, 하나의 CR 및 하나의 S 시료가 잘못 분류되었고, 따라서 이는 만성 심장 동종이식 거부반응의 단백질 바이오마커 패널에 대하여 83% 민감성 및 특이성에 해당된다.
실시예 4: 조합적 분석결과
유전자 및 단백질 내부 검증 결과, CR 및 S시료 구분을 위한 양 패널들에 대하여 동일한 성능을 보였다. 따라서, 프로브 세트/유전자 및 단백질로 구성된 '조합적' 바이오마커의 유용성을 점검하였다. 4개의 프로브 세트/유전자 (CLEC2B, CHPTl, 242907_at, GBP3) 및 4개의 PGC (CFHR2, CPNl, ClQB, GC)가 단계적 분별분석법 (SDA)을 이용하여 개별적으로 확인되었다 (표 9).
[표 9] 만성 심장 동종이식 거부반응 조합적 바이오마커 패널
Figure pct00014
조합적 패널 역시 상기된 바와 같이 동일한 실험집합을 이용하여 평가되었다. 조합패널 성능은 유전자 또는 단백질 패널보다 우수하였다. 조합패널에 기반하여 제조된 분류자는 단지 S시료의 하나만을 잘못 분류하였고, 결과 100% 민감성 및 83% 특이성을 보였다 (유전자 및 단백질 분류자에 대한 83% 민감성 및 특이성과 대비)
유전자, 단백질, 및 조합적 만성 심장 동종이식 거부반응 바이오마커 패널들에 대한 내적 검증 결과에 대한 요약 및 비교를 위한 시각적 도구로 스트리플롯 (striplot)가 구축되었다 (도 6). 시각화를 단순화하기 위하여, 3개의 모든 분류자들에 대한 선형판별 (LD) 변수들이 재-중앙화되어 분류 컷오프 선을 0으로 교정하였다. 'HP4', 'H4' 및 '조합'은 유전자, 단백질 및 조합적 분류자를 각각 표시한다. 훈련세트에서 CR 및 S시료들에 대한 LD 변수수치 (또는 분류자 '점수')의 중앙은, 각각 빈 및 찬 별을 이용하여 도시되었다. 찬 원 및 찬 사각은 각각 실험집단에서의 S 및 CR 시료들 각각에 대한 LD 변수/분류자 점수에 해당된다. 정의 LD 수치를 가지는 시료들은 CR으로 분류된다. 찬 및 빈 별 사이 거리 (각각 훈련집단에서의 CR 및 S 시료들에 대한 평균 LD 수치)는 패널이 조합적으로 S에서 CR을 구분할 수 있는 성능이다. 새로운 시료들을 조합적으로 구분할 수 있는 각 패널 성능은 찬 원형 및 찬 사각형으로 표시된다.
각 개별적 공개문헌은 본원에 특정하게 및 개별적으로 참조로 표시되며 전부가 제공되는 것으로 모든 참조문헌들은 본원에 참조로 포함된다. 본원에서 참조문헌의 언급은 이러한 문헌들이 본 발명에 선행기술이라는 것을 인정하는 것이 아니며 이렇게 해석되어서는 안 된다.
하나 이상의 현존하는 바람직한 예들이 예시로 기재되었다. 본 발명은 예시 및 도면을 참조하여 개시된 모든 예시, 실질적인 변경 및 변형을 포함한다. 다양한 변경 및 변형이 청구항에 정의된 본 발명의 사상을 벗어남이 없이 가능하다는 것은 본 분야의 기술자에게 자명하다. 이러한 변경의 예로는 실질적으로 동일한 방법으로 동일한 결과를 달성하기 위한 본 발명의 임의 측면에 대한 공지된 균등적 치환을 포함한다.

Claims (20)

  1. 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법에 있어서,
    a. 개체의 생물학적 시료에서, CHPTl, RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4, OSBP2, 및 IFIT5으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 마커들의 유전자 발현 프로파일을 결정하는 단계;
    b. 하나 이상의 유전자 마커들의 발현 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및
    c. 하나 이상의 유전자 마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 유전자 마커들의 증가 또는 감소는 개체의 만성 거부반응 상태를 표시하는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  2. 제1항에 있어서, OSBP2은 비-거부자 프로파일 대비 증가되며, CHPTl, RPS26, GBP3, KLRC1/KLRC2, ZCCHC2, 242907_at, CLEC2B, PDK4 및IFIT5은 대조군 대비 감소되는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  3. 제1항에 있어서, 대조군 프로파일은 비-거부반응, 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체에서 획득되는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 임상지표를 위한 수치를 획득하는 단계를 더욱 포함하는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  5. 제1항에 있어서, a) 단계에서 표 6에서 선택되는 하나 이상의 마커들의 발현을 결정하는 단계를 더욱 포함하는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  6. 제1항에 있어서, 하나 이상의 유전자 마커들의 발현 프로파일은 하나 이상의 마커들에 해당되는 RNA 서열을 검출하여 결정되는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 유전자 마커들의 유전자 발현 프로파일은 PCR으로 결정되는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  8. 제1항에 있어서, 하나 이상의 유전자 마커들의 유전자 발현 프로파일은 혼성화로 결정되는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  9. 제8항에 있어서, 혼성화는 올리고뉴클레오티드에 혼성되는 것인, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  10. 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법에 있어서,
    a. 개체의 생물학적 시료에서, IGFBP3, MSTl, CDH5, ClQB, CFHR2, CPNl, APOB, HBB, GC 및 C9에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 마커들의 단백질 발현 프로파일을 결정하는 단계;
    b. 하나 이상의 단백질 마커들의 발현 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및
    c. 하나 이상의 단백질 마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 단백질 마커들 수준의 증가 또는 감소는 개체의 만성 거부반응 상태를 표시하는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  11. 제10항에 있어서, CFHR2, CPNl, APOB, HBB, GC 및 C9에 의해 코딩되는 폴리펩티드 수준은 대조군 프로파일 대비 증가하며, IGFBP3, MSTl, CDH5 및 ClQB에 의해 코딩되는 폴리펩티드 수준은 대조군 프로파일 대비 감소하는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  12. 제10항에 있어서, 대조군 프로파일은 비-거부반응, 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체에서 획득되는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  13. 제10항에 있어서, 하나 이상의 임상지표를 위한 수치를 획득하는 단계를 더욱 포함하는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  14. 제10항에 있어서, 단백질 발현 프로파일은 면역검정에 의해 결정되는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  15. 제10항에 있어서, 단백질 발현 프로파일은 ELISA에 의해 결정되는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  16. 제10항에 있어서, 단백질 발현 프로파일은 질량스펙트럼에 의해 결정되는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  17. 제10항에 있어서, 단백질 발현 프로파일은 동위원소 또는 동중원소 태그방법에 의해 결정되는, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  18. 제1항에 있어서, 대조군은 자가 대조군인, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  19. 제10항에 있어서, 대조군은 자가 대조군인, 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  20. 유전자 및 단백질 마커들의 조합적인 패널을 이용하여 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태를 결정하는 방법에 있어서,
    a) 개체의 생물학적 시료에서, 유전자 마커들 CHPTl, GBP3, 242907_at, 및 CLEC2B의 유전자 발현 프로파일을 결정하는 단계;
    b) 생물학적 시료에서, CFHR2, CPNl, GC 및ClQB에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 단백질 마커들의 단백질 발현 프로파일을 결정하는 단계;
    c) 유전자 및 단백질 발현 프로파일들을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및
    d) 유전자 및 단백질 마커들의 유전자 또는 단백질 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 유전자 마커들 CLEC2B, CHPTl, GBP3, 242907_at에서의 증가 및 CFHR2, CPNl 및 GC에 의해 코딩되는 폴리펩티드 증가 및 ClQB에 의해 코딩되는 폴리펩티드 감소는 개체의 만성 거부반응 상태를 표시하는, 유전자 및 단백질 마커들의 조합적인 패널을 이용하여 개체의 만성 동종이식 거부반응 상태를 결정하는 방법.
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