KR20110005708A - 심장 동종이식 급성 거부반응 진단방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유전자 발현 프로파일, 단백질 발현 프로파일, 대사산물 프로파일, 또는 동종반응성 T-세포 유전자 발현 프로파일을 이용하여 심장 동종이식에 대한 급성 거부반응을 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

심장 동종이식 급성 거부반응 진단방법{METHODS OF DIAGNOSING ACUTE CARDIAC ALLOGRAFT REJECTION}
본 출원은 본원에 참조로 포함되는 2008년4월9일 출원된 미국임시출원 61/071,038; 2008년4월9일 출원된 미국출원 61/071,037; 2008년4월10일 출원된 미국출원 61/071,07; 및 2009년3월3일 출원된 미국출원 61/157,161의 우선권 이익을 주장한다.
본 발명은 유전자 발현 프로파일, 단백질 발현 프로파일, 대사산물 발현 프로파일, 또는 동종반응성 T-세포 유전자 발현 프로파일을 이용한 심장 동종이식 급성 거부반응을 진단하는 방법에 관한 것이다.
말기 주요 장기 부전 환자들에게 이식은 일차적인 치료방법으로 고려된다. 사이클로스포린 및 타크로리무스와 같은 면역억제제가 동종이식 수령자 생존 및 복지를 개선하지만, 동종이식 거부반응을 가능한 조기에 확인하고 유효한 검사 및 면역억제제 투여 조절은 동종이식 수령자의 생존에 있어 여전히 중요하다.
일반적으로 동종이식 거부반응은 제공조직에 의해 발현되는 비자기 항원에 대한 수령자 면역반응으로 기술된다. 급성 거부반응은 이식 수일 또는 수주 내에 발생하며, 만성 거부반응은 더 지연된 과정으로 이식 후 수개월 또는 수년에 발생할 수 있다.
현재, 심내막심장근, 간 중심(core), 및 신장 세침흡인 생검과 같은 침입적 생검이 동종이식 거부반응에 대한 감시 및 진단의 최적 표준으로 널리 인식되고 있으나, 침입적 절차는 그 자체 위험성을 동반한다 (참고. Mehra MR, 등. Curr.Opin.Cardiol. 2002 Mar;17(2):131-136.). 또한 생검 결과는 간 동종이식 거부반응 등급을 위한 반프 모형(Ormonde 등. 1999. Liver Transplantation 5:261-268) 또는 개정 ISHLT 이식 스케일 (Stewart 등. 2005. J Heart Lung Transplant, 2005; 24: 1710-20)과 같은 국제적 가이드라인이 존재하지만 시료취급 오류 및 관찰자 간의 변동성으로 인하여 재현 및 해석의 문제가 있다. 만성 심장 거부반응을 검사하기 위한 덜 침입적인 (영상) 기법 예를들면 혈관조영술 및 FVUS이 개발되었지만, 이들 역시 생검과 관련된 문제들과 유사한 한계가 있다.
생검으로 결정되는 동종이식 급성 거부반응 경중도는 표준화 참조 지표에 의해 등급화된다. 심장 및 폐 이식 국제협회 스케일 (ISHLT)에 따르면 심장 이식 개체에 대한 생검 시료 등급화 수단을 제공한다 (표 1).
병리조직학적 생검 분석을 위한 심장 및 폐 이식 국제협회의 심장이식 거부반응 등급화.
등급 참고
OR 급성 세포성 거부반응 없음: 단핵염증 또는 근세포 손상 또는 괴사 증거 없음
1R 가벼운, 낮은-등급의 급성 세포성 거부반응: 단핵세포 존재 및 제한적인 근세포 손상 및 괴사
2R 중등도, 중간-등급의 급성 세포성 거부반응: 연관 근세포 손상 및 괴사를 가지는 둘 이상의 단핵세포 부위 존재. 손상은 동일 생검 또는 별개의 두 생검에서 발견. 호산구 존재.
3R 심각, 높은-등급의 급성 세포성 거부반응: 만연, 확산 근세포 손상 및 괴사, 및 여러 생검에 걸쳐 정상 구조 붕괴, 부종, 조직내 출현 및 혈관염 존재. 침윤물은 다형성일 수 있다.
동종이식 거부반응 지표들은 하나 이상의 국소적 또는 전신 염증, 조직 손상, 동종이식편의 면역세포 침윤, 조직-및 혈액 유도 단백질 조성 및 농도 변경, 동종이식조직의 차등 산소화, 부종, 내피 후박화, 콜라겐 함량 증가, 심근내부 혈류 변경, 감염, 동종이식편 및/또는 주위 조직 괴사 등에 의해 나타나는 고조된 국소화 면역반응을 포함한다.
동종이식 거부반응은 '급성' 또는 '만성'으로 분류된다. 일반적으로 급성 거부반응은 개체가 동종이식편을 수령한 후 6개월 이내 조직 또는 장기 동종이식의 거부반응이다. 급성 거부반응은 제공조직의 세포 및 체액 손상에 특징이 있고 조직 또는 장기의 신속한 이식편 기능장애 및 기능상실로 이어진다. 만성 거부반응은 통상 동종이식편 수령 후 6개월 수년 이후 조직 또는 장기의 거부반응이다. 만성 거부반응은 동종면역반응으로 인한 점진적 조직 재형성에 특징이 있고 동맥 내에 신생 내막이 형성되어 폐색 혈관증, 실질조직 섬유증 및 따라서 이식편의 상실 및 손실에 이른다. 거부반응의 특성 및 경중도에 따라 동종이식 거부반응 -만성 또는 급성-이 진행 중이거나 예상되는 개체에서 관찰되는 지표 또는 임상적 변수들이 중첩된다.
환자에 대한 생검 횟수를 줄이기 위한 노력이 시도되었으나 대체로 성공적이지 못하였으며 이는 거부반응이 개시 또는 진행되는 부위를 정확히 찾기 어렵고 또한 실질적인 생검을 수행함이 없이 조직 평가가 어렵기 때문이다. 비-침입적 검사기법이 연구되었고 동종이식 거부반응의 음성 예측을 제공하였으나 임상에서는 실제로 덜 사용되는 것으로 보인다 (Mehra 등., 상기).
과학적 및 특허 문헌들은 명명될 수 있는 모든 의료적 병태의 확인/진단/예측/치료에 중요한 이러한 마커들을 보고하고 있다. 동종이식 만성 거부반응 분야에서, 수많은 마커들 (때로는 단일)이 나열되고 일부 경우 상반된 결과들이 존재한다. 이러한 문헌상의 모순이 유전체 (약 30,000개 이상의 전사 유닛들) 복잡성, 인체의 세포 유형 (약 200 종 이상), 장기 및 조직, 및 발현 단백질 또는 폴리펩티드 (약 80,000개 이상) 다양성에 더해져 장기 급성 거부반응 진단에 유용한 잠재적 핵산 서열, 유전자, 단백질, 대사산물 또는 이들의 조합들의 개수는 엄청나다. 개개인 변동성뿐 아니라 관심있는 많은 잠재적 단백질이 매우 낮은 농도로 존재하는 혈장에서의 단백질 농도의 동적 변동 범위 (10-6 내지 103 ㎍/mL) 및 적지만 가장 풍부한 혈장 단백질의 과도한 함량 (총 단백질 중량의 ~ 99% 해당)이 추가적인 장애로 존재한다.
CARGO 연구 (심장 동종이식 거부반응 유전자 발현 관찰) (Deng 등., 2006. Am J. Transplantation 6:150-160)에서는 ~7300개의 유전자의 마이크로어레이 분석 및 RT-PCR을 이용하여 이식-후 6개월 이상의 시료에서 ISHLT 점수 3A 이상을 보이는 개체들의 유전자 발현 프로파일을 검사하였다.
장기 기능, 질병 상태 등을 평가하는 도구로 대사산물 프로파일이 제안되었다 (Wishart 2005. 5:2814-2820). 본 분야에 관련된 다양한 발표가 있고, 최근 인간 '대사체' 데이터베이스가 발표되었으나 (Wishart et al, 2007. Nucleic Acids Research 35:D521-D526), 동종이식 거부반응 평가 또는 진단에 유용한 특정 대사산물 프로파일 또는 신호의 확인은 결정되어야 하는 상태로 남아있다.
인식에 중요한 기능을 수행하는 면역세포는 동종이식 거부반응의 지표로 유용할 수 있다. WO/2005/05721에 의하면, 도너 항원 제공 세포에 특이적으로 결합하는 면역반응성 T-림프구 구분 및 도너 항원에 특이적으로 면역반응하는 T-림프구를 제공하는 방법이 기술된다. 그러나, 동종이식 거부반응 평가에 유용할 수 있는 특정 마커들은 결정되어야 하는 상태로 남아있다.
Traum 등, 2005 (Pediatr. Transplant 9(6):700-711)은 이식 단백질체학의 개괄적인 검토서를 제공한다. 혈장 전체 단백질에서 직접 바이오마커들을 개발하는 것은 두 가지 큰 도전을 제공한다 - 관심있는 많은 잠재적 단백질이 매우 낮은 농도로 존재하며 단백질 농도의 동적 변동 범위가 10-6 내지 103 ㎍/mL에 이르고 (Anderson 등 2004. Mol Cell Proteomics 3:311-326) 및 가장 풍부한 혈장 단백질은 총 단백질 중량의 ~ 99%를 포함한다는 것이다 .
심장이식 환자의 B2M 혈청 수준 유지 또는 측정이 장기 면역억제 치료 관리에 유용한 것으로 제안되었다 (Erez 등, 1998. J Heart Lung Transplant 17:538-541). PCT 공개 WO 2009/003142는 B2M은 기타 단백질과 함께 말초동맥질환에 대한 바이오마커로 유용할 수 있다는 것을 보인다.
Borozdenkova 등. 2004 (J. Proteome Research 3:282-288)은 심장이식 개체 군에서 알파 B-크리스탈린 및 트로프마이오신이 상승된 것을 개시한다.
Ishihara, 2008 (J. Mol Cell Cardiology 45:S33)는 심장이식에서 ADIPOQ가 중요한 기능이 있음을 개시하고, 및 Nakano (Transplant Immunology 2007 17:130-136)은 간 이식 개체에서 거부반응을 극복하기 위하여 ADIPOQ의 상향조절이 필요하다는 것을 제안한다.
SHBG (PCT 공개 WO 2007/024715) 및 F10 (PCT 공개 WO 2005/020927)와 결합하는 항체는 이식 거부반응에 유용한 것으로 제안된다.
SERPINF1 및 C1Q는 심혈관 발병의 높은 위험성과 연관되는 바이오마커로 개시되며; 본 바이오마커는 동맥경화성 플라그 시료에서 검출될 수 있고 (PCT 공개 WO 2009/017405); SERPINF1 서열 역시 최적 혈관이식을 선택하기 위한 검정에 유용할 수 있다 (US 공개 2006/0003338)
보체 역시 동종이식 거부반응에 관여하는 것으로 알려져 있다 - Csencits 등, 2008 (Am J. Transplantation 8:1622-1630)은 여러 보체 성분들에 대한 과거 연구를 정리하고 C1Q-/- 생쥐 동종이식 수령자의 체액성 면역반응 촉진을 관찰한다.
PCT 공개 WO2006/083986, WO2006/122407, 미국공개 2008/0153092, 2006/0141493, 및 미국특허 7235358는, 암에서 장기이식에 이루는 다양한 질환 단계를 진단 또는 발견하기 위한 바이오마커들 (단백질 또는 유전자) 패널을 이용한 방법을 개시한다.
Alakulppi 등, 2007 (Transplantation 83:791-798)은 8개의 마커들에 대하여 RT-PCR을 이용한 급성 간 동종이식 거부반응 진단에 대하여 개시하고 있다.
Fildes 등 2008 (Transplant Immunology 19:1-11)에 의한 검토서에서 폐 이식 후 면역 프로세스에서 세포 유형의 기능이 논의되고, 급성 및 만성 거부반응에서의 AICL (CLEC2B)의 NK 세포 단백질과의 상호작용 기능이 개시된다.
다양한 암을 진단하고 검사하기 위한 다중 플랫폼 (단백질, 유전자)의 일체화가 제안되었으나 단백질 및 mRNA 발현 간의 불일치가 본 분야에서 확인되었다 (Chen 등, 2002.Mol Cell Proteomics1:.304-313; Nishizuka 등., 2003 Cancer Research 63:5243-5250). 선행 연구들은 유전자 및 단백질 자료들 사이 낮은 상관을 보고한다 (Gygi SP 등. 1999. Mol Cell Biol.19:1720-1730; Huber 등., 2004 Mol Cell Proteomics 3:43-55).
덜 침입적이고, 재현 가능하고 더욱 신뢰할 수 있는 (시료채취 및 오류 해석에 덜 민감한), 동종이식 거부반응 평가 또는 진단방법이 매우 요망된다.
본 발명은 하나 이상의 유전자 발현 프로파일, 단백질 발현 프로파일, 대사산물 발현 프로파일, 또는 동종반응성 T-세포 유전자 발현 프로파일을 이용한 심장 동종이식 급성 거부반응 진단 방법에 관한 것이다.
본원에서 확인되는 마커들의 이질성에서 심장 동종이식 급성 거부반응의 복잡한 병리생물학이 반영된다. 본원에서 검정되는 마커들은 생물학적 프로세서 범위에 걸쳐 분포된다: 세포성 및 체액성 면역반응, 급성기 염증 경로, 기질 재형성 효과, 지질대사, 스트레스 반응 등.
본 발명의 일 측면에 의하면, 유전자 발현 프로파일을 이용하는 개체에서 동종이식 급성 거부반응 진단방법이 제공되며, 이는 a) 개체의 생물학적 시료에서, TRF2, SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, FGFR1OP2, MBD4로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계; b) 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및 c) 하나 이상의 유전자 마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 최소한 9개의 마커들의 증가 또는 감소는 급성 거부반응 상태를 표시한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 방법은 하나 이상의 임상 지표를 위한 수치를 획득하는 단계 및 하나 이상의 임상 지표를 대조군과 대비하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 방법은 표 6에 나열된 하나 이상의 마커들의 유전자 발현 프로파일을 결정하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, TRF2 및 FGFR1OP2은 대조군 대비 증가되고 SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, MBD4은 대조군 대비 감소될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 대조군은 비-거부반응, 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체이다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 대조군은 자가 대조군이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 유전자 발현 프로파일을 이용한 개체에서 동종이식 급성 거부반응 평가, 예측 또는 진단용 키트가 제공되며, 이는 a) TRF2, SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, FGFR1OP2, MBD4의 하나 이상을 특정하고 정량 검출하기 위한 시약 및 이러한 시약의 사용 및 결과 자료를 분석하는 방법의 지시서로 구성된다. 본 키트는 또한 TRF2, SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, FGFR1OP2, MBD4을 코딩하는 하나 이상의 유전자 또는 전사체와의 선택적 혼성화를 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 더욱 포함한다. 비-거부반응 컷오프 지표 또는 대조를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 개체의 급성 동종이식 거부반응 진단방법을 제공하며, 이는 a) 개체의 생물학적 시료에서, B2M, F10, CP, CST3, ECMP1, CFH, C1QC, CFI, APCS, C1R, SERPINF1, PLTP, ADIPOQ 및 SHBG에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 5개 이상의 마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계; b) 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및 c) 하나 이상의 마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 마커들 수준의 증가 또는 감소는 개체의 급성 거부반응 상태를 표시하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 5개 이상의 마커들은 PLTP, ADIPOQ, B2M, F10 및 CP을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 5개 이상의 마커들은 PLTP, ADIPOQ, B2M, F10 및 CP 및 하나 이상의 ECMP1, C1QC, C1R 및 SERPINF1을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 방법은 하나 이상의 임상지표 수치를 획득하는 단계 및 하나 이상의 임상지표를 대조군과 대비하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, B2M, F10, CP, CST3, ECMP1, CFH, C1QC, CFI, APCS, C1R, 및/또는 SERPINF1은 대조군 대비 증가하고 , PLTP, ADIPOQ 및/또는 SHBG은 대조군 대비 감소할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 대조군 프로파일은 비-거부반응 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체에서 얻어진다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 대조군은 자가 대조군이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 개체에서 동종이식 급성 거부반응 평가, 예측 또는 진단용 키트가 제공되며, 이는 a) B2M, F10, CP, CST3, ECMP1, CFH, C1QC, CFI, APCS, C1R, SERPINF1, PLTP, ADIPOQ 및 SHBG에 의해 코딩되는 5개 이상의 폴리펩티드를 특정하고 정량 검출하기 위한 시약 및 이러한 시약의 사용 및 결과 자료를 분석하는 방법의 지시서로 구성된다. 비-거부반응 컷오프 지표 또는 대조를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 5개 이상의 마커들은 PLTP, ADIPOQ, B2M, F10 및 CP에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 5개 이상의 마커들은 PLTP, ADIPOQ, B2M, F10 및 CP 및 하나 이상의 ECMP1, C1QC, C1R 및 SERPINF1을 포함한다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 개체에서 동종이식 급성 거부반응 진단방법이 제공되며, 이는 a) 개체의 동종반응성 T-세포를 포함한 생물학적 시료에서, KLF12, TTLL5, 239901_at, 241732_at, OFD1, MIRH1, WDR21A, EFCAB2, TNRC15, LENG10, MYSM1, 237060_at, C19orf59, MCL1, ANKRD25, MYL4로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계; b) 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 비-거부자 동종반응성 T-세포 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및 c) 마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 마커들의 상향-조절 또는 하향-조절은 급성 거부반응 상태를 표시한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, KLF12, TTLL5, 239901_at, 241732_at, OFD1, MIRH1, WDR21A, EFCAB2, TNRC15, LENG10 및 MYSM1은 대조군 대비 감소하고, 237060_at, C19orf59, MCL1, ANKRD25 및 MYL4은 대조군 대비 증가한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 개체에서 동종이식 급성 거부반응 진단용 키트가 제공되며, 이는 동종반응성 T-세포 단리를 위한 시약, KLF12, TTLL5, 239901_at, 241732_at, OFD1, MIRH1, WDR21A, EFCAB2, TNRC15, LENG10, MYSM1, 237060_at, C19orf59, MCL1, ANKRD25, MYL4을 특정하고 정량 검출하기 위한 시약 및 이러한 시약의 사용 및 결과 자료를 분석하는 방법의 지시서로 구성된다. 본 키트는 또한 KLF12, TTLL5, 239901_at, 241732_at, OFD1, MIRH1, WDR21A, EFCAB2, TNRC15, LENG10, MYSM1, 237060_at, C19orf59, MCL1, ANKRD25, MYL4의 일부 또는 부분을 코딩하는 하나 이상의 유전자 또는 전사체와의 선택적 혼성화를 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 더욱 포함한다. 비-거부반응 컷오프 지표 또는 대조를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 개체에서 동종이식 급성 거부반응 진단방법이 제공되며, 이는 a) 개체의 생물학적 시료에서, KLF12, TTLL5, 239901_at, 241732_at, OFD1, MIRH1, WDR21A, EFCAB2, TNRC15, LENG10, MYSM1, 237060_at, C19orf59, MCL1, ANKRD25, MYL4로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계; b) 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및 c) 마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 마커들의 상향-조절 또는 하향-조절은 급성 거부반응 상태를 표시한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 방법은 하나 이상의 임상 지표를 위한 수치를 획득하는 단계 및 하나 이상의 임상 지표를 대조군과 대비하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 대조군 프로파일은 비-거부반응 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체에서 얻어진다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 대조군은 자가 대조군이다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 개체의 대사산물 프로파일을 이용한 심장 동종이식 거부반응 진단방법이 제공되며, 이는 다음 단계들로 구성된다: 개체의 생물학적 시료에서 크레아틴, 타우린, 세린, 카르니틴 및 글리신으로 이루어진 군에서 선택된 최소한 3개의 마커들 농도를 측정하는 단계; 최소한 3개의 마커들 각각의 농도를 비-거부자 대사산물 프로파일 컷오프 지표와 비교하는 단계; 및 개체의 거부반응 상태를 결정하는 단계로 구성되며, 대조군 대사산물 프로파일 컷오프 지표 대비 최소한 3개의 마커들 각각의 농도의 증가 또는 감소는 개체의 거부반응 상태를 표시한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 최소한 3개의 마커들은 타우린, 세린 및 글리신이며, 마커들 농도는 절대 비교이며, 타우린, 세린 및 글리신 각각은 비-거부자 대사산물 컷오프 지표 대비 감소된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 최소한 3개의 마커들은 글리신, 크레아틴 및 카르니틴이며, 마커들 농도는 대사산물 기준선 대비 상대적이며, 크레아틴 및 카르니틴 마커들 각각은 비-거부반응 대사산물 컷오프 지표 대비 증가하고 글리신 마커는 비-거부반응 대사산물 컷오프 지표 대비 감소된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 대사산물 프로파일을 이용한 심장 동종이식 거부반응 진단방법은 하나 이상의 임상지표를 위한 수치를 획득하는 단계를 더욱 포함한다.
따라서 본 발명의 일부 측면의 이점들은 이식조직 또는 장기 생검없이 급성 동종이식 거부반응 진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 요약은 본 발명의 모든 특성을 기술하지는 않는다. 기타 본 발명의 측면들, 특성들 및 이점들은 하기 특정 예들의 설명을 참조하면 본 분야의 기술자들에게 더욱 분명하여질 것이다.
본 발명 및 기타 특징은 첨부 도면을 참조한 하기 상세한 설명으로부터 더욱 명백하여질 것이다.
도 1은 연구 개체들 시료 지도를 도시한 것이다. 사각형은 마이크로어레이 데이터를 위한 시료가 이용된 시점들을 표시한다. 관련 조직 생검에서 1R을 보이는 삼각형 대비 원은 ≥2R 거부반응 관련 조직 생검 진단을 표기한다. X는 거부반응이 없는 조직 생검과 연관된 시료이다.
도 2는 12개 유전자의 바이오마커 패널을 이용한 개체 분류 결과를 도시한 것이다. 개체들은 미리 급성 거부반응 (≥2R) 또는 무 거부반응 (0R)으로 결정되었다. 본 바이오마커 패널용 유전자 목록에는 다음을 포함한다: 트랜스페린 수용체 2 (TFR2), SLIT-ROBO 로 GTP가수분해효소 활성 단백질 2 위유전자 1 (SRGAP2P1), 크루펠-유사 인자 4 (KLF4), YLP 모티프 함유 1 (YLPM1), BH3 상호작용 도메인 사멸 작용자 (BID), 미리스토일화 알라닌-풍부 단백질 키나제 C 기질 (MARCKS), C-타입 렉틴 도메인 패밀리 2, 멤버 B (CLEC2B), Rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 (GEF) 7, (ARHGEF7/BETA-PIX), 리소포스포리파제-유사 1 (LYPLAL1), 트립토판 풍부 염기성 단백질 (WRB), FGFR1 암유전자 파트너 2 (FGFR1OP2), 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 4 (MBD4). 다이아몬드 - 급성 거부반응 (AR); 원 - 비-거부반응 (NR)
도 3은 바이오마커들 ARHGEF7, TRF2, BID, MARCKS, KLF4, CLEC2B 및 MBD4 사이 제안된 관계를 보인다.
도 4는 임상지표 프로파일을 적용한 개체 분류 요약을 보인다. 다이아몬드- 급성 거부반응 (AR); 원 - 무-거부반응 (NR)
도 5는 다른 펩티드 개수 (p)를 이용하여 동정된 단백질 그룹 코드 (PGC)의 비율이다. 다중 동작 (run)에서 동정되는 PGC에 대하여 iTRAQ동작에서의 평균 펩티드 개수가 사용되었다. “총” (수평선의 바), “분석” (대각선의 바) 및 “패널” (수직선의 바)는 각각 발굴에서 포함된 18개 시료들의 최소한 하나에서 검출되는, AR(급성 거부반응) 및 NR(비-거부반응) 군들의 최소한 2/3에서 검출되는, 및 유의한 차등적 상대농도를 가지는 것으로 동정되는, PGC 세트를 나타낸다.
도 6은 혈장단백질 패널 A 단백질 마커들이다. A. 각 시점에서 모든 가능한 AR(실선) 및 NR(점선) 시료에 대하여 패널 A에 기초하여 LDA에 의해 생성되는 점수 평균. B. 환자가 NR 및 AR 이력 사이에 존재할 때 점수. 제1 연속 AR 시점들이 고려되었고 AR 환자들(실선)로부터 평균화되었다(AR). AR 이전 NR (AR 이전 NR) 및 AR 이후 NR (AR 이후 NR)의 연속 시점들이 고려되었고 동일 환자들로부터 평균화되었다. 대조 곡선 (점선)은 가능한 시점들에 의해 AR 환자들과 가능한 인접하게 일치되는 NR 환자들에 대하여 구축되었다. 각 군 내의 표준편차는 수직 바로 표기된다.
도 7은 단백질 마커들의 내적 검증이다. 패널 A (FDA < 25%) 및 패널 B (SDA에 의해 선택)를 이용한 13개의 새로운 환자 시료들의 분류. 두 분류자들에 의해 생성된 점수들이 재-중심화되어 0에서 분류에 대한 컷-오프 선이 설정되었다. 훈련 세트에서 각 AR (빈 별) 및 NR (찬 별)시료들에 대한 평균 점수는 각각 적색 및 흑색 별표로 표시된다. 검사 세트에서 각 AR (찬 삼각형) 및 NR (찬 사각형) 시료들에 대한 점수가 표시된다. LDA에 의해 정의 수치를 가지는 시료들은 AR로 구분되며 음의 수치를 가지는 것들은 NR로 구분된다.
도 8은 단백질 마커들에 대한 기술적 검증이다. 발굴에서 사용된 18개 개체 시료들로부터의 5개의 검증 단백질의 iTRAQ 대 ELISA 상대 단백질 수준 (합동 대조군 대비). AR 시료 = 빈 원; NR 시료 = 찬 원. 정의(positive) 상관 검정에서의 스피어만 상관계수 (Cor) 및 p-값이 각 도표 우측 하부에 표시된다.
도 9는 대사산물 연구 개체들 시료 지도를 도시한 것이다. 사각형은 대사산물 데이터를 위한 시료가 이용된 시점들을 표시한다. 관련 조직 생검에서 1R을 보이는 삼각형 대비 원은 ≥2R 거부반응 관련 조직 생검 진단을 표기한다. X는 거부반응이 없는 조직 생검과 연관된 시료이다.
도 10은 대사산물 농도가 적합 t-검정으로 분석될 때 0R 또는 >2R의 심장 동종이식 거부반응을 보이는 대사산물 연구 개체군들을 보인다. 이식-후 시료의 절대농도가 분석될 때, 3개의 대사산물이 적합 t-검정에 의해 통계적으로 유의하였다. 수평선은 각 군의 평균을 나타낸다. 총 시료 집단은 급성 거부자 (AR) 개체로부터 6개의 시료들 및 비-거부자 (NR) 개체로부터 21개를 포함하였다. 다이아몬드 - 급성 거부자 (AR); 원 - 비 거부자 (NR)
도 11은 대사산물 농도가 적합 t-검정으로 분석될 때 0R 또는 >2R의 개체군들을 보인다. 이식-후 시료의 농도가 기준선 농도와 비교될 때, 3개의 대사산물이 적합 t-검정에 의해 통계적으로 유의하였다. 라인은 각 군의 평균을 나타낸다. 총 집단은 AR 개체로부터 6개의 시료들 및 NR 개체로부터 21개를 포함하였다. 다이아몬드 - 급성 거부자 (AR); 원 - 비 거부자 (NR)
도 12는 동종반응성 T-세포 집단 개체들 시료 지도를 도시한 것이다. 사각형은 마이크로어레이 데이터를 위한 시료가 이용된 시점들을 표시한다. 관련 조직 생검에서 1R을 보이는 삼각형 대비 원은 ≥2R 거부반응 관련 조직 생검 진단을 표기한다. X는 거부반응이 없는 조직 생검과 연관된 시료이다.
도 13은 동종반응성 T 세포 유전자 바이오마커들은 전혈 유전자 바이오마커들의 급성 및 무 거부반응 간 구별 성능을 높인다. 전혈 유전자 패널이 바이오마커 패널 (A)로 사용되어 급성 및 무 거부반응을 구별한다. 동종반응성 T 세포 목록에서 2개의 유전자가 추가될 때, 분류는 더욱 구별된다 (B). 다이아몬드 - 급성 거부자 (AR); 원 - 비 거부자 (NR)
도 14는 iTRAQ 실험용 (본 동작은 B-314-W12, B-314-W6 및 B-415-W12 처리에 사용되었다) 패널 A 및 B 에 있는 단백질들 (표 10)에 대한 단백질 포함범위 지도의 예를 도시한 것이다. 각 군의 단백질 (공동 단백질 그룹 코드, PGC 포함)이 도시되고, 둘 이상의 단백질이 PGC를 공유하면 정렬되었다. 굵지 않은 이중 아래선 = 신뢰 구간 (동정 신뢰) ≥ 95%에서 동정된 펩티드; 굵지 않은 단일 아래선 = 50% ≤CI < 95%; 굵고 아래선 없음 = 0% ≤CI < 50%; 및 보통 문자 (이중선 없고, 굵지 않음)은 검출되지 않은 펩티드. A: PGC 151: 인지질전달단백질 전구체 - IPI00643034.2 (PLTP) 인지질전달단백질 이형 1 전구체 (SEQ ID NO: 1); IPI00217778.1 (PLTP) 인지질전달단백질 이형 2 전구체 (SEQ ID NO: 2); IPI00022733.3 (PLTP) 45 kDa 단백질 (SEQ ID NO: 3). B: B: PGC 92: 아디포넥틴 전구체 IPI00020019.1 (SEQ ID NO: 4). C: PGC 61: 색소 상피성 인자 전구체 IPI00006114.4 (SEQ ID NO: 14). D: PGC 188: 베타-2-마이크로글로불린 - IPI00868938.1 (-) 베타-2-마이크로글로불린 (SEQ ID NO: 5); IPI00796379.1 (B2M) B2M 단백질 (SEQ ID NO: 6); IPI00004656.2 (B2M) 베타-2-마이크로글로불린 (SEQ ID NO: 7). E: PGC 84: 응고인자 X 전구체 IPI00019576.1 (SEQ ID NO: 8). F: PGC 6: 세룰로플라스민 (IPI00017601.1 (SEQ ID NO: 9). G: PGC 76: 보체 C1q 부성분 서브유닛 C 전구체 IPI00022394.2 (SEQ ID NO: 12). H: PGC 26: 보체 C1r 부성분 전구체 IPI00296165.5 (SEQ ID NO: 13). I: PGC 62: 세포외 기질단백질 - IPI00645849.1 세포외 기질단백질 1 (SEQ ID NO: 10); IPI00003351.2 세포외 기질단백질 1 전구체 (SEQ ID NO: 11). iTRAQ 실험에서 동정되는 펩티드는 도 17에 나열된다.
도 15는 iTRAQ 실험용 (본 동작은 B-314-W12, B-314-W6 및 B-415-W12 처리에 사용되었다) 패널 A 및 B에 있는 추가로 동정된 단백질 마커들 (표 10)에 대한 단백질 포함범위 지도의 예들을 도시한 것이다. 각 군의 단백질 (공동 단백질 그룹 코드, PGC 포함)이 도시되고, 둘 이상의 단백질이 PGC를 공유하면 정렬되었다. 굵지 않은 이중 아래선 = 신뢰 구간 (동정 신뢰) ≥ 95%에서 동정된 펩티드; 굵지 않은 단일 아래선 = 50% ≤CI < 95%; 굵고 아래선 없음 = 0% ≤CI < 50%; 및 보통 문자 (이중선 없고, 굵지 않음)은 검출되지 않은 펩티드. 이들 단백질은 패널 A 및 B 외에 있으나 AR 및 NR 개체들 사이 차등 발현을 보였다 (p값 <0.05)) A: PGC 110: 시스타틴-C 전구체 (CST3) IPI00032293.1 (SEQ ID NO: 15). B: PGC138 성-호르몬 결합 글로불린 (SHBG) 이형 2 IPI00219583.1 ( SEQ ID NO: 16); SHBG 이형 1 IPI00023019.1 (SEQ ID NO: 17). C: PGC 8: CFH 이형 1 IPI00029739.5 (SEQ ID NO: 18). D: PGC 50: 보체인자 I (CFI) 전구체 IPI00291867.3 (SEQ ID NO: 19); IPI00872555.2 (cDNA FLJ76262에 의해 코딩) (SEQ ID NO: 20). E: PGC 48: 혈청 아밀로이드 P-성분 전구체 IPI00022391.1 (SEQ ID NO: 21).
도 16A-L은 표 6에 나열된 심장 동종이식 급성 거부반응 진단에 유용한 12개의 핵산 마커들의 표적 서열(SEQ ID NO: 25-36)을 보인다.
도 17은 본 발명의 일부 예에 따른 iTRAQ 검정에서 동정된 전형 펩티드를 보인다. 목록에는 할당된 단백질 그룹 코드 및 SEQ ID NO 37-307가 포함된다.
도 18A-P는 표 9에 나열된 심장 동종이식 급성 거부반응 진단에 유용한 16개의 핵산 마커들의 표적 서열(SEQ ID NO: 345-360)을 보인다.
도 19A-Z는 표 10에 나열된 심장 동종이식 급성 거부반응 진단에 유용한 37개의 핵산 마커들의 표적 서열(SEQ ID NO: 361-397)을 보인다.
하기 상세한 설명에서, 상당히 많은 용어들이 사용되며 이하 정의들은 본 발명의 여러 측면들 이해를 용이하게 하기 위하여 제공된다. 명세서에서 용어들 및 예시들을 사용하는 것은 설명을 목적으로 하는 것이며 예시들의 범위 및 의미를 제한하는 것은 아니다. 수치 범위는 범위를 한정하는 숫자를 포함한다. 명세서에서, "구성하는"이란 개방적 의미로 사용되며 "포함하지만 제한적이지 않는" 구절과 실질적으로 동일하며, "구성한다"란 상응하는 의미를 가진다.
본 발명은 조직 또는 장기 동종이식 특히 심장 동종이식편을 받은 개체의 거부반응을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 개체의 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단과 관련되는 유전자, T-세포, 핵산, 단백질 발현 프로파일 또는 대사산물 발현 프로파일을 제공한다. 유전자 또는 T-세포 발현 프로파일, 단백질 발현 프로파일 또는 대사산물 프로파일에서 여러 요소들은 개별적으로 공지되어 있지만, 유전자, T-세포, 단백질 또는 대사산물 마커들 특정 세트의 변경 발현 수준 (대조군 대비 증가 또는 감소)의 특정 조합은 개체의 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단에 유용한 새로운 조합을 구성한다.
동종이식편 이란 동일 종의 유전적으로 다른 두 개체들 간 이식된 장기 또는 조직이다. 동종이식을 받은 개체는 "수령자"이고 동종이식편을 제공한 개체는 "제공자"이다. 조직 또는 장기 동종이식편은 달리 '이식체', '이식편', '동종이식편', '제공자 조직' 또는 '제공자 장기' 등의 유사한 용어로 언급될 수 있다. 다른 종들의 두 개체들 간 이식체는 이종이식편이다.
개체들은 문헌에서 잘 알려진 다양한 증상 또는 임상지표들을 보일 수 있으나, 이들 자체 어느 것도 동종이식 거부반응을 예측하거나 진단할 수 없다. 동종이식 생검과 더불어 수많은 임상지표들이 동종이식 거부반응을 가지는 또는 의심되는 개체들을 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 임상지표들에서 얻어진 정보는 임상의사, 내과의사, 수의자 또는 기타 임상분야 진료의사에게 사용되어 거부반응이 발생하는지 및 어느 정도 신속하게 진행되는지 및 개체의 면역억제제 약물치료법의 변경 여부를 결정한다. 표 2에는 임상지표들이 기술된다.
임상지표들 (선택적으로 생검이 수반)은 현재 주류 의료실무에 있어서 임상의사들이 활용할 수 있는 유일한 실무도구이지만, 도 4에서 보이는 바와 같이, 항상 AR("급성 거부자") 및 NR ("비-거부자") 사이를 명확하게 구분하지는 않는다. 극단적으로 좌측 또는 우측 개체들은 AR 또는 NR으로 옳게 분류되지만, 많은 개체는 중간 범위에 속하고 이들의 상태는 명백하지 않다. 이러한 이유로 동종이식 거부반응을 평가함에 있어서 임상지표들 가치를 부정하지 못하지만, 다른 대안이 없는 경우 적용함에 한계가 있다.
[표 2] 동종이식 거부반응 평가에 잠재적으로 유용한 임상지표들
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
동종이식 거부반응 예측, 진단 및 평가에 있어서 다중요인적 특성으로 인하여 본 분야에서는 동종이식 거부반응의 예측, 진단 또는 평가 중 단 하나의 필요를 충족하는 단일 바이오마커 가능성을 배제한다. 다수의 마커들이 관여되는 전략이 이러한 다중요인적 특성을 감안하여 취하여진다. 달리, 다수의 마커들이 덜 침입적 (예를들면 생검이 불필요한) 임상지표들과 조합되어 평가되어 개체의 동종이식 거부반응 예측, 진단 및/또는 평가가 이루어진다.
동종이식 거부반응의 예측, 진단 및 평가에 사용되는 방법과 관계없이, 장기 또는 조직 기능을 보존하고 더 이상의 유해한 전신 영향을 방지한다는 관점에서 조기 발견이 바람직하다. 동종이식 거부반응에 대한 '치료'는 없으며 단지 개체를 적정하게 면역억제 상태로 유지하거나 또는 일부 경우 거부반응이 너무 빨리 진행되거나 너무 심각하여 면역억제제에 의한 치료가 불가능한 경우 장기를 대체하는 것이다.
다수의 수학적 및/또는 통계적 분석방법을 단백질 또는 폴리펩티드 데이터세트, 대사산물 농도 데이터세트, 또는 핵산 발현 데이터세트에 적용하면 유의한 마커들의 가변 부분집합을 표시할 수 있지만, 어떠한 방법이 '최적' 또는 '더욱 정확한'지에 대한 불확실성에 이른다. 수학적 방법과 무관하게, 중요한 생물적 현상은 데이터세트에 있어서 동일하다. 다수의 수학적 및/또는 통계적 방법을 마이크로어레이에 적용하고 공동 마커들 각각의 통계적으로 유의한 부분집합을 평가함으로써 불확실성은 줄어들고, 임상적으로 연관된 중요한 마커들이 확인될 수 있다.
"마커", "생물학적 마커", "바이오마커"는 상호 교환적으로 사용되며 일반적으로 생물학적 시료에서 검출 가능한 (및 일부 경우 정량 가능한) 분자들 또는 화합물을 언급한다. 동종이식편 이식 후 개체에서 마커는 하향-조절 (감소), 상향-조절 (증가) 또는 실질적으로 변하지 않을 수 있다. 마커는 핵산 (DNA 또는 RNA), 유전자 또는 전사체, 또는 '유전자 마커' (달리 "핵산 마커"로 칭함) 대비 전사체 일부 또는 단편; 폴리펩티드, 펩티드, 단백질, 이형체, 또는 '단백질'마커에 대한 이들의 단편 또는 일부, 또는 선택 분자, 이들의 전구체, 중간체 또는 절단 산물 (예를들면 지방산, 아미노산, 당, 호르몬, 또는 이들의 단편 또는 서브유닛)("대사산물 마커" 또는 "대사적 마커")을 포함할 수 있다. 사용에 있어서, 이들 용어들은, 개체의 생물학적 시료에서, 특정 단백질, 펩티드, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 대사산물 (절대적 용어 또는 다른 시료 또는 표준수치에 대하여 상대적으로) 또는 두 단백질들, 폴리뉴클레오티드들, 펩티드들 또는 대사산물들 수준 비율을 언급할 수 있다. 수준은 농도로써 예를들면 밀리리터당 마이크로그램, 발색 강도로써, 예를들면 특정 빛 파장에서 0.0는 투명 및 1.0은 불투명이며 실험시료는 이에 따라 특정 파장에서 빛 투과 또는 흡수에 기하여 수치를 획득하여; 또는 본 분야에서 공지된 바와 같이 마커를 정량화하는 기타 수단과 관련하여 표기될 수 있다. 일부 예에서, 비율은 단위없는 수치로 표기된다. 또한 "마커"는 비율, 또는 기준선 수치를 차감한 후 알짜 수치를 언급할 수 있다. 또한 마커는 방향성 (증가 또는 감소/상향 또는 하향) 표시와 함께 또는 없이 "폴드-변화"로 나타낼 수 있다. 마커 발현의 증가 또는 감소는 또한 '하향-조절' 또는 '상향-조절' 또는 자극, 생리적 일련의 반응 또는 개체 조건에 대한 반응으로 유사한 증가 또는 감소로 언급될 수 있다. 마커는 제1 생물학적 시료에는 존재하며 제2 생물학적 시료에는 없을 수 있다; 달리 마커는 양쪽에 통계적으로 유의한 차이에서 존재할 수 있다. 생물학적 시료에서 마커의 존재, 부존재 또는 상대수준 표현은 마커 정량화 또는 평가를 위하여 적용되는 분석 특성에 따라 다르며 이러한 표현은 본 분야의 기술자에게 익숙하다.
동종이식을 거부하는 개체의 발현수준이 무-거부반응 개체에서 취한 시료와 차이가 있을 때 마커는 차등 발현된다고 기술될 수 있다. 차등 발현된 마커는 정상 또는 대조 시료 발현수준과 비교하여 과잉발현 또는 과소발현될 수 있다.
"프로파일"은 하나 이상의 마커들 및 이들의 존재, 부존재, 상대수준 또는 과다 (하나 이상의 대조군에 비하여)에 관한 하나의 세트이다. 예를들면, 대사산물 프로파일은 대사산물 마커들의 존재, 부존재, 상대수준 또는 과다성에 대한 데이터세트이다. 유전자 또는 핵산 프로파일은 발현된 핵산 (예를들면 전사체, mRNA, EST 등)의 존재, 부존재, 상대수준 또는 과다성에 대한 데이터세트이다. 프로파일은 달리 발현 프로파일로 언급될 수 있다.
생물학적 시료에서 마커의 증가 또는 감소 또는 정량화는, 특정 서열, 폴리펩티드 또는 단백질, 대사산물 등을 포함하는 유전자 산물 또는 전사체, 또는 핵산분자의 존재 및/또는 상대적 과다를 측정하기 위하여 본 분야에서 공지된 임의의 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 마커 수준은 절대수치 또는 기준선에 대하여, 및 컷오프 지표 (예를들면 비-거부반응 컷오프 지표)와 비교된 개체 마커 수준으로 결정될 수 있다. 달리 마커의 상대 과다는 대조군에 대하여 결정될 수 있다. 대조군은 임상적으로 정상인 개체 (예를들면 동종이식편을 받은 않은 개체) 또는 이전에 보여진 거부반응이 없는 동종이식 수령자일 수 있다.
일부 예에서, 대조군은 자가 대조군, 예를들면 동종이식편 이식 전에 개체에서 획득된 시료 또는 프로파일일 수 있다. 일부 예에서, 하나의 시점 (이식 전, 후 또는 전 및 후)에서 획득된 프로파일은 동일 개체에서 이전에 획득된 하나 이상의 프로파일과 비교될 수 있다. 경시에 따라 동일 개체에서 동일 생물학적 시료를 반복적으로 채취하여, 경시에 따른 마커 수준 또는 발현을 보이는 조성물 프로파일이 제공될 수 있다. 또한 연속 시료들이 개체에서 얻어지고 각각에 대한 프로파일이 획득되어, 경시에 따른 하나 이상의 마커들의 증가 또는 감소 경로를 알 수 있다. 예를들면 초기 시료 또는 시료들이 이식 전에 획득되고, 연속 시료가 주마다, 2주마다, 달마다, 2달마다 또는 기타 적합한 정기적 구간에서 얻어지고 이전에 취한 시료들의 프로파일과 비교된다. 또한 시료들은 약물 과정 예를들면 면역억제제 과정 이전, 동안 및 이후에 획득될 수 있다.
특정 마커 또는 마커들 세트를 검출 및/또는 정량화하는 기술, 방법, 도구, 알고리즘, 시약 및 기타 필요한 분석 특성들은 가변적이다. 마커 또는 마커들 세트를 검출하는데 사용되는 특정 방법이 중요한 것이 아니라, 중요한 것은 어떠한 마커들을 검색하는 것이다. 문헌에서 고려된 바와 같이, 상당한 가변성이 존재한다. 검색될 또는 정량화될 마커 또는 마커들 세트가 동정되면, 적당한 시약이 있다면 임의의 여러 기법들이 적용될 수 있다. 본 분야의 기술자는, 마커들 세트가 동정되면, 본원에서 개시된 방법을 수행하기 위하여, 적당한 분석법 (예를들면, 핵산 마커들을 위한 PCR 기반 또는 마이크로어레이 기반의 분석법, ELISA, 단백질 또는 항체 마이크로어레이 또는 유사한 면역학적 검정, 또는 일부 예에서, iTRAQ, iCAT 또는 SELDI 단백질 질량 스펙트럼 기반의 방법의 사용)을 선택할 수 있다.
본 발명은 개체의 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단과 관련되는 (유전자 및 T-세포) 핵산 발현 프로파일, 단백질 발현 프로파일 및 대사산물 프로파일을 제공한다. 유전자 또는 T-세포 또는 단백질 또는 대사산물 발현 프로파일에서 여러 요소들은 개별적으로 공지되어 있지만, 유전자, T-세포, 단백질 또는 대사산물 마커들 특정 세트의 변경 발현 수준 (대조군 대비 증가 또는 감소)의 특정 조합은 개체의 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단에 유용한 새로운 조합을 구성한다.
예를들면, 핵산의 검출 또는 결정, 및 일부 경우 정량화는 본 분야에서 공지된 재조합 DNA기술, 제한적이지는 않지만 예를들면 서열-특이적 혼성화, 중합효소 연쇄반응 (PCR), RT-PCR, 마이크로어레이 등을 이용한 다수의 방법 또는 분석 중 임의의 하나에 의해 달성될 수 있다. 이러한 검정은 서열-특이적 혼성화, 프라이머 신장, 또는 침입성 절단을 포함한다. 또한 각 유형의 반응 (예를들면 형광, 발광, 질량측량, 전기영동 등) 산물을 분석/검출하는 다수의 방법들이 있다. 또한, 반응은 액상에서 또는 유리 슬라이드, 칩, 비드 등과 같은 고체 지지체에서 일어날 수 있다.
마이크로어레이 또는 바이오칩 사용을 위한 프로브 설계 및 선택방법 또는 PCR-기반 검정에 사용되는 프라이머 선택 또는 설계방법은 본 분야에서 공지되어 있다. 마커 또는 마커들이 동정되고 예를들면 이러한 서열을 가지는 데이터베이스에 질의하거나 적당한 서열을 제공하여 (예를들면 본원에 제공된 서열목록) 핵산 서열이 결정되면, 본 분야의 기술자는 이러한 정보를 이용하여 적당한 프로브 또는 프라이머를 선택하여 선택된 분석법을 수행할 수 있다.
본 분야의 기술자에게 공지된 재조합 DNA기술의 일반원리를 제공하는 표준 참조 문서는 예를들면, Ausubel 등, Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998 및 2001 증보판); Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989); Kaufman 등, Eds., Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991)을 포함한다.
단백질, 단백질 복합체 또는 단백질 마커는 본 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 특히 검정 및/또는 정량화되며 이는 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 면역 또는 항체-기반 기법들로는 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 방사면역측정법(RIA), 웨스턴 블로팅 (western blotting) 면역형광법 (immunofluorescence), 마이크로어레이, 크로마토그래피 기술(즉, 항체친화성 크로마토그래피 (immunoaffinity chromatography)), 유동세포계수, 면역침강법 등을 포함한다. 이러한 방법은 관심있는 단백질 또는 단백질 복합체와 결합되는 특정 항원결정부(epitope) 또는 항원결정부 조합에 대한 항체 또는 항체들의 특이성에 기반한다. 비-면역적 방법으로는 단백질 또는 단백질 복합체 자체의 물성에 기반하는 것을 포함한다. 이러한 방법들의 예로는 전기영동, 크로마토그래피 기술 (예를들면, 고성능액체크로마토그래피 (HPLC), 신속단백질액체크로마토그래피 (FPLC), 친화성 크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 크기배제크로마토그래피 등), 질량 스펙트럼, 서열화, 단백질분해효소의 분해, 등을 포함한다. 이러한 방법은 질량, 전하, 소수성 또는 친수성에 기반하며, 이는 단백질 또는 단백질 혼합체의 아미노산 보체 (complement) 및 아미노산의 특정 서열에서 유래한다. 질량 스펙트럼을 이용한 방법 예시는 예를들면 PCT 공개 WO 2004/019000, WO 2000/00208, US 6670194에 기재된 것을 포함한다. 면역 및 비-면역적 방법은 조합되어 단백질 또는 단백질 복합체를 동정 또는 특정화할 수 있다. 또한, 각 유형의 반응 (예를들면 형광, 발광, 질량측량, 전기영동 등) 산물을 분석/검출하는 다수의 방법들이 있다. 또한, 반응은 액상에서 또는 유리 슬라이드, 칩, 비드 등과 같은 고체 지지체에서 일어날 수 있다.
단백질 또는 항체 어레이 사용을 위한 항체 제조방법 또는 기타 면역에 기반한 어레이 사용을 위한 항체 제조방법은 본 분야에서 공지되어있다. 마커 또는 마커들이 동정되고 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산서열이, 데이터베이스 질의 또는 적당한 서열이 제공되어 (예를들면 본원에 제공된 서열목록) 확인되면, 본 분야의 기술자는 이러한 정보를 이용하여 하나 이상의 적당한 항체를 준비하고 선택된 분석법을 수행할 수 있다.
바이오마커에 대한 단일클론 항체 제조와 관련하여, 세포주 계대배양에 의해 항체분자들을 제조할 수 있는 임의 기술들이 사용될 수 있다. 이러한 기술로는 제한적이지는 않지만, Kohler 및 Milstein (1975, Nature 256:495-497)에 의해 최초로 개발된 혼성세포 기술, 트리오마 기술(Gustafsson 등., 1991, Hum. Antibodies Hybridomas 2:26-32), 인간 B-세포 혼성세포 기술 (Kozbor 등., 1983, Immunology Today 4:72), 및 인간 단일클론 항체를 제공하는 EBV 혼성세포 기술 (Cole 등., 1985, In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 포함한다. 인간항체가 사용되고 인간 혼성세포들을 이용하여(Cote 등., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026- 2030) 또는 생체 외에서 인간 B 세포를 EBV 바이러스로 형질전환 (Cole 등., 1985, In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)으로 획득될 수 있다. 바이오마커에 특이적인 생쥐 항체분자를 적당한 생물학적 활성의 인간 항체분자로부터의 유전자와 함께 이어 맞추는 (splicing) "키메릭" 항체 제조용으로 개발된 기술 (Morrison 등, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851- 6855; Neuberger 등, 1984, Nature 312:604-608; Takeda 등, 1985, Nature 314:452-454)이 사용될 수 있고, 이러한 항체는 본 발명의 범위 내에 있다. 단일사슬 항체 제조용으로 기술된 기법 (미국특허 4,946,778)이 바이오마커-특이적 항체 제조에 적용될 수 있다. 본 발명의 추가적인 예로는 바이오마커 단백질에 특이성을 가지는 단일클론 Fab 단편을 신속하고 용이하게 동정할 수 있는 Fab 발현 라이브러리 구축 (Huse 등, 1989, Science 246:1275-1281)을 이용한다. 비-인간 항체는 공지방법 (예를들면, 미국특허 5,225,539)에 의해 "인간화"될 수 있다.
바이오마커의 전유전물질형을 함유하는 항체단편은 본 분야에서 공지된 기술로 생성될 수 있다. 예를들면, 이러한 단편은 제한적이지는 않지만, 항체분자의 펩신 소화에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편; F(ab')2 단편의 이황화물 다리를 환원하여 (reducing) 생성될 수 있는 Fab1 단편; 항체분자를 파파인 및 환원제로 처리하여 생성될 수 있는 Fab 단편; 및 Fv 단편을 포함한다. 합성 항체 예를들면 화학합성에 의해 제조되는 항체는 본 발명에서 유용하다.
본원에서 기술되고 관련 분야 기술자에게 공지된 표준참조문헌은 면역 및 비-면역기법들, 이들의 특정 시료 유형, 항체, 단백질 또는 분해물에 대한 적합성이 기재된다. 본 분야의 기술자들에게 공지된 면역학 및 면역 방법을 이용한 검정을 개시하는 표준참조문헌들은 예를들면 Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2판., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1999); Harlow 및 Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Coligan 등. eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY (1992-2006); 및 Roitt 등., Immunology, 3판, Mosby-Year Book Europe Limited, London (1993)을 포함한다.
본 분야의 기술자에게 공지된 펩티드 합성 기술 및 방법의 일반원리를 설명한 표준참조문헌은 Chan 등., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood 등., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3판, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001 ; 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates 및 John Wiley & Sons, NY, 1994)을 포함한다.
개체의 거부반응 상태는 "급성거부자" (AR) 또는 "비-거부자" (NR)로 분류되고 마커들 농도 및 비-거부자 컷오프 지표를 비교하여 결정된다. "비-거부자 컷오프 지표"는 이를 벗어나거나 이보다 외부에 있으면 개체가 AR 거부반응 상태를 가지는 것으로 분류되는 수치 또는 점수이다. 비-거부자 컷오프 지표는 달리 '대조군 수치', '대조군 지표' 또는 단순히 '대조군'으로 언급될 수 있다. 비-거부자 컷오프-지표는 대조 개체군에서의 개별 마커들 농도이며 측정되는 각 마커들에 대하여 개별적으로 고려될 수 있다; 달리 비-거부자 컷오프 지표는 마커들 농도 조합일 수 있고, 진단을 위하여 제공되는 개체 시료에서 마커들 농도 조합과 비교될 수 있다. 대조 개체군은 정상 또는 건강한 대조군일 수 있거나 동종이식 거부반응을 가지지 않은 또는 거부반응이 없는 동종이식 수령군일 수 있다. 대조군은 단일 개체일 수 있고, 일부 예에서, 자가 대조군일 수 있다. 대조군 또는 대조군 풀은 예를들면 고정값으로 나타나는 고정치 또는 누적치일 수 있고, 이를 획득하기 위하여 사용된 시료 군은 장소마다 또는 경시에 따라 가변될 수 있고 추가 데이터 포인트를 포함한다. 예를들면, 중앙 건강정보시스템과 같은 중앙 데이터 보관소는 여러 장소들 (병원, 임상실험실, 등)에서 얻어진 데이터를 수신하고 보관하며 이러한 누적 데이터세트를 단일 병원에서, 공동체 치료실에서 최종 사용자가 접근하고 (즉, 개별 진료의사, 의료 치료실 또는 센터 등) 발명의 방법 적용하기 위하여 제공한다.
비-거부자 컷오프 지표는 달리 '대조값', '대조지표' 또는 단순히 '대조'라고 언급된다. 일부 예에서, 컷오프 지표는 대사산물 컷오프 지표 (개체의 대사산물 프로파일용), 유전자 컷오프 지표 (개체의 유전자 발현 프로파일용), 단백질 컷오프 지표 (개체의 단백질 프로파일용) 등으로 더욱 특징될 수 있다.
"생물학적 시료"는 개략적으로 개체의 체액 또는 조직 또는 장기를 언급한다. 예를들면, 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 림프액, 혈청, 소변 또는 침일 수 있다. 비-액상 조직시료와 같은 조직 또는 장기 시료는 분해, 추출 또는 달리 액상화될 수 있고-이러한 조직 또는 장기의 예시로는 배양세포, 혈구, 피부, 간, 심장, 신장, 췌장, 랑게르한스섬, 골수, 혈액, 혈관, 심판막, 폐, 장, 창자, 비장, 방광, 음경, 안면, 손, 뼈, 근육, 지방, 각막 등을 포함한다. 다수의 생물학적 시료들은 임의로 한번에 수집될 수 있다. 생물학적 시료 또는 시료들은 동종이식편 이식 전, 이식 시점 또는 이식 이후 임의시점을 포함한 임의 시간에 개체로부터 취할 수 있다. 생물학적 시료는 핵산 예를들면 단일 또는 이중-사슬 형태인, 디옥시리보핵산 또는 리보핵산, 또는 이의 조합일 수 있다. 제공자에게서 장기가 추출될 때, 제공자의 비장 또는 이의 일부가 생물학적 시료로 보관되어 이로부터 제공자 T-세포를 획득한다. 장기가 생존 제공자에게서 추출될 때, 혈액시료가 취하여지고 여기에서 제공자 T-세포가 획득될 수 있다. 동종반응성 T-세포는 동종이식편의 항원 (MHC 복합체 포함)과의 특이적 반응을 살펴서 단리 될 수 있다. 동종반응성 T-세포 특이적 단리를 가능하게 하는 방법은 예를들면 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 WO 2005/05721에 기재된다.
림프구는 림프성 원시 줄기세포의 유핵성 또는 '백'혈구 (백혈구)이다. 림프구는 T-세포, B-세포 자연살해세포 등 및 기타 면역조절세포를 포함한다. "T-세포"는 세포-중재 면역 및 B-세포 자극을 위한 림프구 군이다. 자극된 B-세포는 특이 항원을 위한 항체를 생성한다. B-세포 및 T-세포 모두 개체에서 비-자가 항원 인식 기능을 수행한다. 비-자가 항원은 동종이식편 뿐 아니라 바이러스, 박테리아 및 기타 감염체를 포함한다.
동종반응성 T-세포는 동종항원에 대한 반응으로 활성되는 T-세포이다. 이종항원에 반응하는 T-세포는 이종반응성 T-세포이다. 이종항원은 다른 종 또는 종의 조직 예를들면 이종이식편에서 유래한 항원이다. 동종반응성 T-세포는 이식 거부 면역반응의 전방선 (front-line)이다. 이들은 외부이식편에 존재하는 동종항원을 인식하는 말초혈액단핵구 (PBMC)의 부분집합 (~0.1-l%)이다. 이들은 외부이식편에 침윤하여 일련의 항-이식 면역반응을 일으키고, 만일 확인되지 않으면, 이식편 거부 및 상실에 이를 것이다. 동종반응성 T-세포는, 따라서 마커들의 다른 소스와 비교하여 특이성을 제공하거나 장기 거부반응 단계들 간 차별되는 보완 소스로 기능할 것이다.
용어 "개체" 또는 "환자"는 대체로 포유동물 및 기타 인간 및 기타 영장류를 포함한 기타 동물, 반려동물, 동물원 및 농장동물, 제한적이지는 않지만 고양이, 개, 설치류, 쥐, 생쥐, 햄스터, 토끼, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 가금류 등을 포함한다. 동종이식 거부반응에 대한 예측, 평가 또는 진단 검사를 받으려는 또는 받은 개체를 포함한다. 개체는 기타 방법 예를들면 본원에 기재된 방법 또는 현재 임상적 실무방법으로 이전에 평가 또는 진단을 받았을 수 있거나 일반 군 (대조개체)의 일부에서 선택될 수 있다.
대조군 대비 개체에서 마커의 폴드-변화는 최소한 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 또는 이상이거나 이들 사이 수치일 수 있다. 폴드 변화는 대조값 대비 감소 또는 증가로 나타난다.
하나 이상은 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 이상을 포함한다.
"하향-조절" 또는 "하향-조절된" 용어는 상호교환적으로 사용되며 마커 예를들면 유전자, 핵산, 대사산물, 전사체, 단백질 또는 폴리펩티드 수준의 감소를 의미한다. "상향-조절" 또는 "상향-조절된" 용어는 상호교환적으로 사용되며 마커 예를들면 유전자, 핵산, 대사산물, 전사체, 단백질 또는 폴리펩티드 수준의 증가를 의미한다. 또한 신호전달 또는 대사경로와 같은 경로는 상향- 또는 하향-조절된다.
임의 방법 (유전자, 단백질, 대사산물 또는 이의 조합)에 의해 개체가 급성 거부자 또는 위험성으로 확인되면, 동종이식에 대한 개체 면역반응을 변경하기 위한 치료적 수단이 구현될 수 있다. 개체는 더욱 자주 또는 더욱 민감한 검사방법을 사용하여 추가 임상지표 검사를 받을 수 있다. 또한 개체는 면역반응 감소 또는 증가를 위하여 면역억제제를 투여 받을 수 있다. 동종이식 거부반응을 방지하기 위하여 개체 면역반응이 너무 억제될 필요가 있는 경우에도, 기회감염 방지를 위한 적당한 수준의 면역기능도 필요하다. 개체에 투여 가능한 다양한 약물이 공지된다: 예를들면, 참고 Goodman 및 Gilman의 The Pharmacological Basis of Therapeutics 11판. Ch 52, pp 1405-1431 및 참고문헌; LL Brunton, JS Lazo, KL Parker 편집자. 본 분야의 기술자에게 알려진 의과생리학 및 약리학의 일반원리를 제공하는 표준참고문헌들은: Fauci 등. , Eds., Harrison 's Principles Of Internal Medicine, 14판, McGraw-Hill Companies, Inc. (1998)을 포함한다. 기타 예방적 및 치료적 전략은 의료문헌에서 검토된다- 참고, 예를들면 Kobashigawa 등. 2006. Nature Clinical Practice. Cardiovascular Medicine 3:203-21.
유전자 핵산 발현 프로파일 형성
본 발명에 의해 제공되는 바와 같이, 개체에서 동종이식 급성 거부반응 진단방법은, 1) 개체의 생물학적 시료에서, TRF2, SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, FGFR1OP2, MBD4로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산 마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계; 2) 하나 이상의 핵산 마커들의 발현 프로파일을 비-거부자 대조 프로파일과 비교하는 단계; 및 3) 하나 이상의 핵산 마커들 발현 수준이 대조 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 핵산 마커들의 상향-조절 또는 하향-조절은 거부반응 상태를 표시한다.
따라서 또한 본 발명은, 개체에서 동종이식 거부반응 예측, 평가 또는 진단방법을 제공하며, 이는, 1) TRF2, SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, FGFR1OP2, MBD4로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산 마커들의 증가 또는 감소를 측정하는 단계; 2) 개체의 '거부반응 상태'를 결정하는 단계로 구성되며, 개체의 '거부반응 상태' 결정은 개체의 핵산 마커 발현 프로파일 및 대조군 핵산 마커 발현 프로파일을 대비하여 이루어진다.
본원에서 사용되는"유전자 발현 데이터", "유전자 발현 프로파일", "핵산 발현 프로파일" 또는 "마커 발현 프로파일"이라는 용어들은 생물학적 시료에 있는 유전자 또는 유전자 세트의 상대적 또는 절대적 발현 수준에 관한 정보를 언급한다. 유전자 발현 수준은 유전자에 의해 코딩되는 또는 전사되는 예를들면 mRNA와 같은 RNA와 같은 핵산 수준에 기반하여 결정된다.
본원에서 사용되는 '폴리뉴클레오티드', '올리고뉴클레오티드', '핵산' 또는 '뉴클레오티드 고분자'는 센스 또는 안티센스 사슬인 RNA, DNA 또는 RNA 및 DNA을 포함한 핵산의 합성 또는 혼합 고분자를 포함하며, 본 분야의 기술자에게 쉽게 이해되는 바와 같이, 화학적 또는 생화학적으로 변경될 수 있거나 비-천연 또는 유도 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있다. 이러한 변경은, 예를들면 표지화, 메틸화, 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드를 유사체로 치환, 뉴클레오티드 사이 변경 예를들면 비전하 연결 (예를들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등), 전하 연결(예를들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 측쇄 잔기 (moieties) (예를들면, 폴리펩티드), 및 변경 연결 (예를들면, 알파 아노머 폴리뉴클레오티드 등)을 포함한다. 또한 수소결합 또는 기타 화학작용에 의해 지정된 서열과 결합될 수 있는 능력에 있어서 폴리뉴클레오티드와 유사한 합성분자들을 포함한다.
올리고뉴클레오티드는 다양한 길이의 핵산이며 특정 핵산 검출 및/또는 증폭을 위한 프로브, 프라이머 및 마이크로어레이 (어레이) 제조에 유용하다. 올리고뉴클레오티드는 DNA, RNA, PNA 또는 기타 예를들면 US 5,948,902에서 기재된 폴리뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 이러한 DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오티드 사슬은 불용성 지지체에 연결될 수 있는 성장사슬에 활성 모노머의 서열적 부가 (5'-3' 또는 3'-5')에 의해 합성될 수 있다. 연속적인 개별적 용도 또는 불용성 지지체 일부로 예를들면 어레이에서 (BERNFIELD MR. 및 ROTTMAN FM. J. Biol. Chem. (1967) 242(18):4134-43; SULSTON J. 등 PNAS (1968) 60(2):409-415; GILLAM S. 등. Nucleic Acid Res.(1975) 2(5):613-624; BONORA GM. 등. Nucleic Acid Res.(1990) 18(11):3155-9; LASHKARI DA. 등. PNAS (1995) 92(17):7912-5; MCGALL G. 등. PNAS (1996) 93(24):13555- 60; ALBERT TJ. 등. Nucleic Acid Res.(2003) 31(7):e35; GAO X. 등. Biopolymers (2004) 73(5):579-96; 및 MOORCROFT MJ. 등 Nucleic Acid Res.(2005) 33(8):e75). 올리고뉴클레오티드를 합성하는 다수의 방법들이 본 분야에 공지된다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 사용되는 방법에 의존되는 다양한 조건들 하에서 활성 및 보호된 모노머의 단계적 부가를 통하여 합성된다. 연속적으로, 특정 보호기는 제거되어 신장이 가능하고 연속하여 및 합성이 완료되면 모든 보호기는 제거되고 필요하다면 완료된 사슬의 정제를 위하여 올리고뉴클레오티드는 고상 지지체에서 분리된다.
"유전자"는 특정 염색체의 특정 위치에 있는 뉴클레오티드의 서열이며 특정 기능성 산물을 코딩하며 코딩 영역에 근접한 비-해독 및 비-전사 서열 (5' 및 3' 에서 코딩서열)을 포함한다. 이러한 비-코딩 서열은 서열의 전사 및 해독 또는 예를들면 인트론 스플라이싱에 필요한 조절서열을 가지며, 또는 관심있는 돌연변이 발생이 이상으로 기여하는 임의 기능을 가질 수 있다. 또한 유전자는 하나 이상의 프로모터, 증폭자, 결합부위 전사인자, 종결신호 또는 기타 조절요소를 포함할 수 있다. 유전자는 '핵산'으로 언급될 수 있다.
용어 "마이크로어레이", "어레이" 또는 "칩"은 정의된 위치에서 기질 표면에 결합된 다수의 정의된 핵산 프로브를 가진다. 기질은 바람직하게는 고체이다. 본 분야에서 마이크로어레이, 제조, 사용 및 분석 방법은 미국특허번호 5,143,854 (Pirrung), 5,424,186 (Fodor), 5,445,934 (Fodor), 5,677,195 (Winkler), 5,744,305 (Fodor), 5,800,992 (Fodor), 6,040,193 (Winkler), 및Fodor 등. 1991. Science, 251 :767-777에 일반적으로 기술된다.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드의 정해진 방식 (서열-특이적)으로 수소결합에 의한 - 또는 '와트슨-클릭' 염기쌍이라고 칭하는- 안정 복합체를 형성하기 위하여 상호 작용하는 반응을 포함한다. 후그스틴 염기쌍을 포함한 비-전형적인 수소결합을 통한 다양한 염기쌍들도 가능하다. 일부 열역학적, 이온 또는 pH 조건하에서 특히 리보핵산의 삼중나선들도 가능하다. 이들 및 기타 가변성 수소결합 또는 염기-쌍들은 본 분야에 공지되며 예를들면 Lehninger - Principles of Biochemistry, 3 판 (Nelson 및 Cox, eds. Worth Publishers, New York.)에 기재된다.
혼성화 반응은 차별된 "엄격" ("stringency")조건에서 수행된다. 혼성화 반응의 엄격성은 임의 두 핵산분자들이 서로 혼성화되기 어려운 것을 포함된다. 예를들면 혼성화가 일어나는 온도를 높이고, 혼성화가 일어나는 이온농도를 낮추고, 또는 이들을 조합하여 엄격성은 증가될 수 있다. 엄격 조건하에서 최소한 60%, 65%, 70%, 75% 또는 이상의 상동성 핵산분자들은 상호 혼성화로 존재하지만, 낮은 상동성의 분자들은 혼성 상태로 잔존하지 않는다. 엄격 혼성화 조건들의 예로는 약 44-45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC), 이어 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 또는 이들 사이 온도에서 0.2xSSC, 0.1 % SDS의 1회 이상의 세척 조건에서의 혼성화를 포함한다.
두 핵산들 간 혼성화는 역평행 배열로 일어나며 이는 '아닐링'이라고 칭하고, 짝지은 핵산들은 상보적이라 기술된다. 이중-나선 폴리뉴클레오티드는, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드 나선들 사이 혼성화가 일어나면, "상보"적이다. 하나의 폴리뉴클레오티드가 다른 것과 상보적인 정도는 상동성이라 칭하며 이는 일반적으로 수용되는 염기-쌍 규칙에 따라 상호 수소결합이 예상되는 반대 나선들의 염기 비율로 정량화된다.
일반적으로, 서열-특이적 혼성화는 혼성화 프로브를 포함하며, 이는 정의된 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 이러한 프로브는 단지 하나 또는 소수의 뉴클레오티드에서의 가변 서열들을 차별하도록 설계될 수 있어 높은 특이성을 제공한다. 검출 및 서열 차별화와 연관된 전략은 "분자 비콘"을 이용하는 것이며, 이에 따라 혼성화 프로브 (분자비콘)은 3' 및 5' 보고자 및 켄처 분자들 및 3' 및 5' 서열을 가지며 이는 상보적이어서 프로브가 헤어핀 루프를 형성할 삽입서열에 대한 적당한 결합표적을 가지지 않는다. 헤어핀 루프는 보고자 및 켄처를 가까이 인접하게 유지하여 형광체 (보고자)를 켄칭하고 형광을 감소시킨다. 그러나, 분자비콘이 표적에 혼성화될 때, 형광체 및 켄처는 충분히 떨어져 있어 형광체로부터 형광 방사가 가능해진다.
혼성화에 사용하는 프로브는 이중-나선 DNA, 단일-나선 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드, 및 펩티드 핵산을 포함한다. 특정 프로브와 혼성화하는 마커들 동정을 위한 혼성화 조건 및 방법은 본 분야에, 예를들면 Brown, T. "Hybridization Analysis of DNA Blots" in Current Protocols in Molecular Biology. FM Ausubel 등, editors. Wiley & Sons, 2003. doi: 10.1002/0471142727.mb0210s21에 기술된다. 본 발명에 따라 사용하는 적당한 혼성화 프로브는 길이가 약 10 내지 약 400 뉴클레오티드, 달리 약 20 내지 약 200 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 변형 핵산을 포함한다.
특정 서열은 프라이머 또는 프로브와의 이후 검출되는 혼성화로 동정된다.
"프라이머"는 짧은 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 일반적으로 자유 3'-OH 기를 가지며 이는 관심있는 표적과의 혼성화에 의해 시료에 있는 표적 또는 "템플렛"과 결합하여 표적에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 중합을 촉진시킨다. "중합효소연쇄반응" ("PCR")은 "업스트림" 및 "다운스트림" 프라이머를 포함한 "프라이머 쌍" 또는 "프라이머 세트", 및 중합촉매 예를들면 DNA 중합효소, 및 전형적으로 열-안정 중합효소를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드 복제본 제조 반응이다. PCR 방법은 본 분야에 공지되고 예를들면 Beverly, SM. Enzymatic Amplification of RNA by PCR (RT-PCR) in Current Protocols in Molecular Biology. FM Ausubel 등, editors. Wiley & Sons, 2003. doi: 10.1002/0471142727.mbl505s56에 교시된다 복제본 합성은 예를들면 형광분자, 바이오틴 또는 방사성 분자와 같은 표지 또는 태그를 가지는 뉴클레오티드 결합을 포함한다. 이후 복제본은 이들 태그를 통하여 종래 방법을 적용하여 검출될 수 있다.
또한 프라이머는 서던 또는 노던 블롯 분석과 같은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 수 있다 (참고, 예를들면 Sambrook, J., Fritsh, E. F., 및 Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
본원에서 사용되는 "프로브 세트"(또는 '프라이머 세트')는 하나 이상의 발현 핵산 또는 발현 유전자를 검출하기 위하여 사용되는 올리고뉴클레오티드 군을 의미한다. 검출은 예를들면 PCR 및 RT-PCR에서와 같은 증폭을 통하여, 또는 마이크로어레이에서와 같은 혼성화를 통하여, 또는 단일 또는 이중 나선 핵산의 선택적 효소분해에 기반하는 분석에서와 같이 선택적 분해 또는 보호를 통하여 이루어질 수 있다. 프로브 세트에서 프로브들은 하나 이상의 형광, 방사성 또는 기타 검출 잔기 (효소 포함)으로 표지화된다. 프로브는 원하는 유전자를 선택적으로 검출하기에 충분한 크기를 가질 수 있고, 일반적으로 약 15 내지 약 25 또는 약 30 뉴클레오티드 범위의 크기는 충분한 사이즈이다. 프로브 세트는 예를들면 다중 PCR용과 같이 용액에 있을 수 있다. 달리, 프로브 세트는 어레이 또는 마이크로어레이에서와 같이 고체 표면에 고착될 수 있다.
본 발명의 일부 예에서, 하나 이상의 TRF2, SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, FGFR1OP2, 및 MBD4로 구성된 유전자 마커들 세트에 의해 발현되는 핵산을 검출하기 위한 프로브 세트가 제공된다. 이러한 프로브 세트는 개체의 거부반응 상태를 결정함에 유용하다. 프로브 세트는 하나 이상의 TRF2, SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, FGFR1OP2, 및 MBD4에 상응되는 핵산 서열의 특이적 증폭 (예를들면 PCR 또는 RT-PCR)용 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 예에서, 프로브 세트는 마이크로어레이 일부이다.
서열을 구분하고 검출하는 기타 여러 방법들이 본 분야에서 공지되어 있다는 것을 이해하여야 하며 이하 더욱 상세하게 설명된다. 또한 어레이 프라이머 신장 미니 서열화, 태그 마이크로어레이 및 서열-특이적 신장과 같은 반응들은 마이크로어레이에서 수행될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 이러한 어레이 기반의 서열검사 플랫폼은 미소구체 기반의 태그-잇 고효율 어레이 (tag-it high throughput array) (BORTOLIN S. 등. 2004 Clinical Chemistry 50: 2028-36)이다. 본 방법은 PCR을 통하여 유전자 DNA 증폭 후 보편적 태그 프라이머로 서열-특이적 프라이머 신장이 이루어진다. 이후 산물은 태그-잇 어레이에서 분류되고 Luminex xMAP 시스템으로 검출된다.
본 분야의 기술자들은 서열에서 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수치적 지정은 특정 서열에 대하여 상대적이라는 것을 이해할 것이다. 또한 동일영역은 서열이 수치화되고 선택되는 것에 따라 다른 수치가 지정될 수 있다. 또한 삽입 또는 결실과 같은 서열 변이는 상대 위치 및 이어 돌연변이 자리 또는 주위에 있는 특정 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수치적 지정을 바꿀 수 있다. 예를들면, 기탁번호 AC006825.13, AC016026.15, AY309933.2, AY4771193.1, CQ786436.1, AF042083.1, AF087891.1, AK094795.1, AY005151.1, BC009197.2, BM842561.1, BQ068464.1, CR407603.1, CR600736.1, NM_00196.2로 표시되는 서열들은 모두 인간 BID 뉴클레오티드 서열을 나타내지만, 일부 서열 차이, 및 이들 사이 수치 차이가 있을 수 있다. 다른 예로는, 기탁번호 NP_932070.1, NP_932071.1, NP_001187.1, EAW57770.1, CAG17894.1, AAC34365.1, AAP97190.1, AAQ15216.1, AAH36364.1, CAG28531.1, P55957.1로 표시되는 서열은 모두 인간 BID 폴리펩티드 서열이지만 일부 서열 차이, 및 이들 사이 수치 차이가 있을 수 있다.
상기 유전자를 포함한 관심있는 임의 유전자 발현에 대한 특이적 검출을 위한 프로브, 프라이머 또는 프로브 세트 선택 및/또는 설계는, 관심있는 유전자의 하나 이상의 핵산서열이 제공될 때, 관련 분야의 기술자 능력 내에 있는 것이다. 또한, 임의 여러 프로브, 프라이머 또는 프로브 세트 또는 다수의 프로브, 프라이머 또는 프로브 세트가 사용되어 관심있는 유전자를 검출할 수 있고, 예를들면 어레이는 단일 유전자 전사체에 대한 다중 프로브를 포함하며 - 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 측면은 예시된 임의 특정 프로브에 제한되지 않는다.
서열 상동성 또는 서열 유사성은 DNASIS (예를들면, 제한적이지는 않지만, 하기 인자들을 이용: GAP 패널티 5, 최상 대각선 # 5, 고정 GAP 패널티10, k-튜플 2, 플로팅 갭 10, 및 윈도우 사이즈 5)에서 제공되는 바와 같이, (DNA 또는 RNA 서열, 또는 이의 단편 또는 일부에 대하여는) 뉴클레오티드 서열 비교프로그램 또는 (단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 서열 또는 이의 단편 또는 일부에 대하여는) 아미노산 서열비교 비교프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 그러나 다른 서열 비교 정렬 방법이 본 분야에서 잘 알려져 있고 예를들면 Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482) 알고리즘, Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), 및 이들 알고리즘이 구현된 컴퓨터 (e.g. GAP, BESTFIT, FASTA, 및 BLAST), 또는 매뉴얼 정렬 및 시각적 관찰에 의해 가능하다.
관심있는 핵산 또는 유전자, 폴리펩티드 또는 서열이 확인되고 서열 일부 또는 단편 (또는 유전자 폴리펩티드 서열 등)이 제공되면, 유사한 또는 실질적으로 유사한 다른 서열은 상기 예의 프로그램을 이용하여 동정될 수 있다. 예를들면 마이크로어레이 또는 프로브 서열을 구축할 때, 서열 및 위치는 알려져 있어 마이크로어레이 실험이 '히트' 동정하면 (특정 위치에 있는 프로브가 시료의 하나 이상의 핵산과 혼성화), 프로브 서열이 알려진다 (마이크로어레이 제조업자 또는 생산업자에 의해, 또는 제조업자로부터 제공되는 데이터베이스로부터 - 예를들면 Affymetrix의 NetAffx 데이터베이스, 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이 제조업자). 서열 소스 동정이 제공되지 않으면, 하나 이상의 데이터페이스에 대한 서열-기반 검색에서 프로브 서열을 이용하여 결정된다. 단백질 어레이 예를들면 iTRAQ에 의해 동정된 펩티드 또는 펩티드 단편에 대하여는, 펩티드 또는 단편 서열이 사용되어 상기와 같이 아미노산 서열 데이터베이스에 질의한다. 이러한 데이터베이스의 예로는 National Centre for Biotechnology Information, 또는 European Bioinformatics Institute 데이터베이스를 포함한다.
단백질 또는 폴리펩티드, 핵산 또는 이의 단편 또는 일부는 서열이 동일한 계통발생학적 종, 속, 과, 목에서 발견되는 다른 것과 차별될 때 특이적으로 동정된다고 고려된다. 이러한 차별성은 서열비교로 확인된다. 서열 또는 서열들 비교는 BLAST 알고리즘 (Altschul 등. 1009. J. Mol Biol 215:403-410)에 의해 수행된다. BLAST 검색을 통하여 질의서열 및 특이 서열 또는 서열 군 또는 더 큰 서열 라이브러리 또는 데이터베이스 (예를들면 GenBank 또는 GenPept)와 비교하여 100% 상동성을 보이는 서열뿐 아니라 덜한 상동성을 가지는 것을 동정할 수 있다. 예를들면, 다중 이형체 (예를들면 단리 유전자 또는 유전자로부터 핵산 전사체의 가변적 스플라이싱 또는 해독-후 조작 과정에서 유래)을 가진 단백질 경우, 하나의 이형체가 동일 또는 다른 종의 다른 이형체와 차별될 때, 구조, 서열 또는 하나의 이형체에 존재하고 존재하지 않는, 또는 하나 이상의 다른 이형체에서 검출되지 않는 부위의 특이 검출에 의해 특이적으로 동정된다.
본 발명의 방법은 예를들면 개별 마커 검사를 수행하는 임상실험실 또는 기타 검사기관에 의해 최종사용자에게 접근될 수 있으며 - 생물학적 시료들이 개별 검사 및 분석이 수행되는 기관에 제공되고 예측방법이 적용되며; 달리 의료진은 임상실험실로부터 마커수치를 수령하고 지역적 장치 또는 인터넷-기반의 장치를 이용하여 본 예측방법에 접근할 수 있다.
중앙값, 표준오차, 표준편차 등과 같은 통계적 인자뿐 아니라 기타 본원에서 기재된 통계분석을 결정하는 것은 관련 분야에 정통한 기술자에게 공지되어있다. 특정 계수, 수치 또는 지표를 사용하는 것은 예시적일 뿐이고 본원에 개시된 본 발명의 여러 측면을 제한하는 것은 아니다.
예를들면 마이크로어레이 실험 또는 복잡한 RT-PCR 실험에서 획득된 상당한 규모의 유전자 발현 데이터들을 해석하는 것은 엄청난 작업이지만 전체적인 특징을 조명하는 방법으로 데이터를 정리할 수 있는 알고리즘 및 통계적 도구를 사용하여 매우 용이하게 진행된다. 시각적 도구 예를들면 색의 강도 및 색조를 변경하여 차별적인 발현을 나타내는 것도 가치가 있다 (Eisen 등. 1998. Proc Natl Acad Sci 95:14863-14868). 알고리즘 및 사용 가능한 통계적 도구는 어레이 및 생성 데이터세트의 복잡성 증가, 처리속도, 컴퓨터 메모리 증가 및 이들의 상대적 가격 하락으로 정교함이 증가되었다.
핵산 또는 단백질 발현 프로파일, 또는 대사산물 프로파일의 수학적 및 통계적 분석은 여러 목적을 달성할 수 있다 - 생물학적 시스템의 경로 또는 도메인에서 단순조절을 보이는 유전자 군들의 동정, 둘 이상의 생물학적 시료들 간 유사성 및 차별성의 분석, 개체에서 특정 이벤트 또는 조작과정들을 구별하는 유전자 발현 프로파일의 특징 분석 등. 이러한 것은 치료요법 또는 치료요법 변경의 효능 평가, 특정 병리 진행 검사 또는 검출, 달리 임상적으로 유사한 병리들 간 차별화 등을 포함한다.
군집화 기법이 공지되고 예를들면 계층적 군집, 자기조직화 형상지도, k-평균 또는 결정 아닐링이 마이크로어레이 데이터세트에 적용된다. (Eisen 등, 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95:14863- 14868; Tamayo, P., 등. 1999. Proc Natl Acad Sci USA 96:2907-2912; Tavazoie, S., 등. 1999. Nat Genet 22:281-285; Alon, U., 등. 1999. Proc Natl Acad Sci USA 96:6745-6750). 이러한 방법은 유전자 발현 프로파일에서 단순조절을 보이는 유전자 군들을 동정함에 유용하고, 또한 단순조절을 보이는 것들과 동일한 경로 또는 시스템에 참여하는 것으로 보이는 달리 미지 기능의 새로운 유전자를 동정함에 유용할 수 있다.
생물학적 시료에서의 핵산 또는 단백질 발현 패턴은 기능적 상태 및 식별성에 대한 차별적이며 접근 가능한 분자적 모형을 제공한다 (DeRisi 1997; Cho 1998; Chu 1998; Holstege 1998; Spellman 1998). 따라서 관련 유전자 발현 패턴을 가지는 두 개의 다른 시료들은 생물학적 및 기능적으로 서로 유사하거나, 역으로 유의한 차이를 보이는 두 시료들은 보여진 복잡한 발현 패턴에 의해 차별될 뿐 아니라 특이적 병리상태 또는 기타 생리적 조건 예를들면 동종이식 거부반응의 표시인 유전산물 또는 전사체의 진단적 부분집합을 표시한다.
다수의 수학적 및/또는 통계적 분석방법을 마이크로어레이 데이터세트에 적용하면 유의한 마커들의 가변 부분집합을 표시할 수 있지만, 어떠한 방법이 '최적' 또는 '더욱 정확한'지에 대한 불확실성에 이른다. 수학적 방법과 무관하게, 중요한 생물적 현상은 데이터세트에 있어서 동일하다. 다수의 수학적 및/또는 통계적 방법을 마이크로어레이에 적용하고 모두에 공동적인 마커들 각각의 통계적으로 유의한 부분집합을 평가함으로써 불확실성은 줄어들고, 임상적으로 연관된 중요한 마커들이 확인될 수 있다.
유전자 발현 프로파일 형성 마커들 ("유전자 마커들 ")
본 발명은 동종이식 급성 거부반응을 포함한 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단에 유용한 일군의 마커들을 제공하며, 이는 마커들 TRF2, SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, FGFR1OP2, MBD4로 구성된다.
AR 시료들에서 검출, 정량화되고 3번의 변형 t 검정에서 최소한 한번에 대하여 비-거부반응 이식 (NR) 대조군과 대비하여 통계적으로 유의한 폴드 변화를 보이는 것으로 발견되는 39개의 유전자들 또는 전사체들 (표 6) 중에서, 12개의 마커들이 (모든 3번의 검정에 대하여) 통계적으로 유의한 결합집합에 존재한다. 더 큰 집합인 39개 각 마커의 폴드-변화는 최소한 2-배이고, 논의된 유전자 또는 전사체의 증가/상향-조절 또는 감소/하향-조절을 나타낼 수 있다.
트랜스페린 수용체 2 (TFR2) 유전자의 산물은 비-철분 의존적 방식으로 트랜스페린-결합 철분의 세포흡수를 조절한다. TFR2는 철분대사, 간세포기능, 적혈구 발생 및 분화에 관여된다. 인간 TFR2의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다(예를들면 GenBank 기탁번호. AF053356, AK022002, AK000421).
SLIT-ROBO 로 GTP가수분해효소 활성 단백질 2 위유전자 1 (SRGAP2P1)은 SRGAP2와 서열유사성을 보이는 위유전자이다. 인간 SRGAP2P1의 뉴클레오티드 서열은 공지이다 (예를들면 GenBank 기탁번호 AL358175.18, BC017972.1, BC036880.1, BC112927.1, DQ786311.1).
크루펠-유사 인자 4 (KLF4) 유전자의 산물은 전사 활성자 또는 억제자로 기능한다. 인간 KLF4의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 CH410015.1, DQ658241.1, AF022184.1, AK095134.1).
YLP 모티프 함유 1 (YLPM1) 유전자의 산물은 텔로머레이트 활성 (telomerate activity) 및 세포분야 조절 기능을 한다. 인간 YLPM1 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 AK095760.1, AC006530.4, AC007956.5, AL832365.1, BC007792.1).
BH3 상호작용 도메인 사멸 작용자 (BID) 유전자는 작용자 BAX 또는 길항자 BCL2과 이종-이합체화 하는 사멸 작용자를 코딩한다. 코딩된 단백질은 세포사 조절자의 BCL-2 패밀리의 멤버이다. 이는 카스파제-8에 의해 유도되는 미토콘드리아 손상 중재자이다. 인간 BID 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 AC006825.13, AF042083.1, AF087891.1, AK094795.1).
미리스토일화 알라닌-풍부 단백질 키나제 C 기질 (MARCKS) 유전자의 산물은 액틴 섬유 교차 단백질 및 단백질 키나제 C의 기질이다. 단백질 키나제 C의 인산화 또는 칼슘-칼모듈린과의 결합에 의해 액틴 및 원형질막과의 결합을 억제하여 세포질에서 존재하도록 한다. 본 단백질은 세포 운동성, 식세포작용, 막 수송 및 유사분열에 관여되는 것으로 생각된다. 인간 MARCKS 뉴클레오티드 사열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 AL132660.14, CH471051.2, AI142997.1,BC013004.2).
C-타입 렉틴 도메인 패밀리 2, 멤버 B (CLEC2B) 유전자는 C-타입 렉틴/C-타입 렉틴 유사 도메인 (CTL/CTLD) 슈퍼패밀리의 멤버를 코딩한다. 본 패밀리 멤버들은 공통의 단백질 폴드를 공유하며 다양한 기능을 가지고, 예를들면 세포부착, 세포-세포 신호, 당단백질 전환, 및 염증 및 면역반응에서의 역할을 수행한다. 코딩되는 타입 2 막관통단백질은 세포 활성 항원으로 기능할 수 있다. 인간 CLEC2B의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 CH471094.1, AC007068.17, AY142147.1, BC005254.1).
Rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 (GEF, ARHGEF7, BETA-PIX) 유전자는 Rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 패밀리의 멤버를 코딩한다. 인간 BETA-PIX의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 BC050521.1, NM_003899.3).
리소포스포리파제-유사 1 (LYPLAL1) - 인간 LYPLAL1 뉴클레오티드 서열은 공지된다 (예를들면 GenBank 기탁번호 CH471100.2, AK291542.1, AY341430.1, BC016711.1)
트립토판 풍부 염기성 단백질 (WRB) 유전자는 성체 또는 태아조직에서 널리 발현되는 미지 기능의 염기성 핵단백질을 코딩한다. 인간 WRB 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 AL163279.2, CH471079.2, AK293113.1, BC012415.1).
FGFR1 암유전자 파트너 2 (FGFR1OP2)는 8;11 골수증식증후군 환자에게서 확인되는 염색체 12 x 8 전좌에 관여되는 융합유전자이다. 인간 FGR1OP2 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 CH471094.1, AF161472.1, AK001534.1, AL117608.1).
메틸-CpG 결합 도메인 단백질 4 (MBD4) 유전자 산물은 메틸-CpG 결합 도메인을 가지고 특이적으로 메틸화 DNBA에 결합할 수 있는 핵단백질을 코딩한다. 서열 유사성으로보아 DNA 회복 역할로 제안된다. 인간 MBD4 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 AF120999.1, CH471052.2, AF072250.1, AF532602.1)
본 발명의 유전자 바이오마커들과 연관된 생물학적 경로
본 발명의 바이오마커들은 면역과정 및 동종이식 거부반응에 대한 개체 반응에 의해 특히 영향을 받는 경로와 연관된다. 도 3은 바이오마커들 ARHGEF7, TRF2, BID, MARCKS, KLF4, CLEC2B 및 MBD4 사이의 경로-기반의 관계를 도시한 것이다. 예를들면:
1. BETAPIX → Rac1 → STAT1 → KLF4
2. KLF4 → (c-MYC → CREB1) → CLECSF2
3. STAT1 → BID
4. KLF → 베타-카테닌 → HDAC1 → MBD4
5. BETA-PIX → CDC42 → PKC-zeta → MARCKS
6. KLF4 → SP1 → HLA-H → TfR2
따라서 ARHGEF7, TRF2, BID, MARCKS, KLF4, CLEC2B 및 MBD4은 동종이식 거부반응 과정에서 생물학적 역할을 하며 치료적 표적을 나타낼 수 있다.
마이크로어레이와 같은 더 큰 규모의 유전자 발현 분석에 의하면 상호작용 유전자 군들 (때로는 2 이상의 분리도)은 함께 발현되고 공통의 조절요소를 가진다. 이러한 단순조절 (coordinate regulation)의 기타 예는 본 분야에 공지되며, 예를들면 참고로 효소의 이단 전이 (diauxic shift) (DiRisi 등 1997 Science 278:680-686; Eisen 등. 1998. Proc Natl Acad Sci 95:14863-14868)
BID는 유전자 산물 전사체가 AR 및 NR 개체 사이 통계적으로 유의한 차이를 보이는 유전자 산물의 하나이다. BID는 동물모델에서 허혈/재관류 동안 활성 단편들로 절단되는 것으로 알려져 있다 (Chen 등 2001. J. Biol Chem 276:30724-8). AR 개체에서 관찰되는 NR 개체 대비 BID 전사체 감소는 BID가 장기 거부반응에서 일어나는 세포성 과정에 중요한 기능을 하지만, BID를 통하여 효과를 보이는 경로는 예상되지 않을 수 있다. BID와 상호작용, 또는 BID의 상호작용자와 상호작용하여 동종이식 거부반응에 의해 촉발되는 경로에 참여하는 AR 및 NR 개체 사이 차별된 발현을 보이는 다른 마커들로는 제한적이지는 않지만 FasR (CD95), FLASH, Caspase-8, HGK (MAP4K4), MEKK1 (MAP3K1) 및 Myosin Va을 포함한다. 따라서 BID는 동종이식 거부반응 프로세스에서 생물학적 역할을 하며 치료적 표적을 나타낼 수 있다.
BETA-PIX는 유전자 산물 전사체가 AR 및 NR 개체 사이 통계적으로 유의한 차이를 보이는 유전자 산물의 또 다른 하나이다. 세포 거동 예를들면 중간대사, 이온채널 전도성 및 전사를 조절하기 위하여 다양한 신호분자들이 고리형 AMP-의존 단백질 키나제 (PKA)에 의해 영향받거나 또는 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. PKA는 세포골격 조절 및 세포이동에 중심 역할을 한다. BETA-PIX와 상호작용, 또는 BETA-PIX의 상호작용자와 상호작용하여 동종이식 거부반응에 의해 촉발되는 경로에 참여하는 다른 마커들로는 제한적이지는 않지만, ITGA4 (인테그린 알파 4), ITGB1 (인테그린 베타 1), ADCY7 (아데닐산고리화효소), PRKACB (PKA 촉매 서브유닛), PRKAR1A (PKA 조절 서브유닛), RAC1, RhoA , PPP1R12A (MLCP(조절 서브유닛)), MYL4 (MELC)을 포함한다. 따라서 BETA-PIX는 동종이식 거부반응 프로세스에서 생물학적 역할을 하며 치료적 표적을 나타낼 수 있다.
이론에 구속되지 않고, 기타 본원에 기재된 유전자 또는 전사체, 예를들면 TRF2, SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, FGFR1OP2 또는r MBD4는 동종이식 거부반응 과정에서 생물학적 역할을 수행할 수 있고, 치료적 표적이 될 수 있다.
또한 본 발명은 개체의 동종이식 거부반응 예측 또는 진단용 키트가 제공된다. 키트는 TRF2, SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, FGFR1OP2, MBD4을 특정하고 정량 검출하기 위한 시약 및 이러한 시약의 사용 및 결과 자료 분석방법의 지시서로 구성된다. 본 키트는 개체 거부반응 예측 또는 진단을 위하여 단독으로 또는 임상지표들 결정을 위한 기타 방법 또는 적합한 기타 검정과 함께 사용될 수 있다. 키트는 예를들면 마커에 선택적으로 혼성화할 수 있는 표지화 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 키트는 예를들면 마커 영역을 (예를들면 PCR에 의해) 증폭하도록 작동하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비-거부반응 컷오프 지표를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다.
동종반응성 T-세포 프로파일 형성
동종반응성 림프구 예를들면 T-세포 또는 T-림프구에서 발현되는 핵산 프로파일 ("동종반응성 T-세포 프로파일")은 동종이식 거부반응 진단에 사용될 수 있다. 동종반응성 T-세포 프로파일은 단독 또는 유전자 발현 프로파일, 단백질 프로파일 또는 대사산물 프로파일과 조합되어 사용될 수 있다.
동종반응성 T-세포는 이식 거부 면역반응의 전방선 (front-line)이다. 이들은 외부이식편에 존재하는 동종항원을 인식하는 말초혈액단핵구 (PBMC)의 부분집합 (~0.1- l%)이다. 이들은 외부이식편에 침윤하여 일련의 항-이식 면역반응을 일으키고, 만일 확인되지 않으면, 이식편 거부 및 상실에 이를 것이다. 동종반응성 T-세포는, 따라서 마커들의 다른 소스와 비교하여 특이성을 제공하거나, 장기 거부반응 단계들 간 차별하는 보완 소스로 기능할 것이다. 동종반응성 T-세포 군(population)에서의 유전자 발현 프로파일은 다른 장기 이식에 거쳐 사용될 수 있고 또한 기타 이유들 (알레르기, 바이러스 감염 등)로 인한 장기 거부반응 및 면역활성을 구분하기에 유용하다.
또한 동종반응성 T-세포 프로파일은 대사산물 ("대사체학"), 유전자 또는 단백질 프로파일과 조합으로 사용될 수 있다. 개체 게놈에서의 사소한 변경 예를들면 단일 염기 변화 또는 동질이상, 또는 게놈 발현 (예를들면 차등 유전자 발현)은 개체의 소분자 대사산물 프로파일에 신속한 반응으로 이어질 것이다. 또한 소분자 대사산물은 환경변화에 신속하게 반응하며 상당한 대사산물 변경은 환경변화 수초 내지 수분 내에 명백하며 - 반대로, 단백질 또는 유전자 발현 변경은 명백하게 되기 위하여는 수 시간 또는 수일 소요된다. 임상지표 목록은 예를들면 순환기질환, 비만, 대사증후군을 검사하기 위하여 사용되는 다양한 대사산물 - 예를들면 콜레스테롤, 호모시스테인, 포도당, 요산, 말론디알데히드 및 케톤체를 표시한다. 기타 비-제한적 소분자의 예는 표 3에 나열된다.
동종반응성 T-세포로부터의 마커들은 동종이식 거부반응 진단용으로 단독 사용될 수 있고, 또는 혈액 전체로부터의 마커들과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 동종이식 급성 거부반응을 포함한 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단에 유용한 일군의 마커들을 제공하며, 이는 마커들 KLF12, TTLL5, 239901_at, 241732_at, OFD1, MIRH1, WDR21A, EFCAB2, TNRC15, LENG10, MYSM1, 237060_at, C19orf59, MCL1, ANKRD25, MYL4로 구성된다.
AR 개체의 동종반응성 T-세포 시료들에서 검출, 정량화되고 비-거부반응 이식 (NR) 대조군과 대비하여 통계적으로 유의한 폴드 변화를 보이는 것으로 발견되는 16개 유전자들 또는 전사체들 (표 9)는 각 적합 t-검정이 적용될 때 통계적으로 유의하다. 각 마커의 폴드-변화는 최소한 1.6-배이고, 논의된 유전자 또는 전사체의 증가/상향-조절 또는 감소/하향-조절을 나타낼 수 있다.
본원에 제공되는 바와 같이, 개체에서 동종이식 급성 거부반응 진단방법이 제공되며, 이는 a) 개체의 생물학적 시료에서, KLF12, TTLL5, 239901_at, 241732_at, OFD1, MIRH1, WDR21A, EFCAB2, TNRC15, LENG10, MYSM1, 237060_at, C19orf59, MCL1, ANKRD25, MYL4로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계; b) 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 비-거부자 동종이식 T-세포 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및 c) 마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 마커들의 상향-조절 또는 하향-조절은 급성 거부반응 상태를 표시한다.
동종반응성 T-세포 유전자 발현 프로파일 형성 마커들 ("동종반응성 T-세포 마커들")
크루펠-유사 인자 12 (KLF12) 유전자는 발생적 조절 전사 인자를 코딩하고 척추 발생 및 발암에 관여한다. 인간 KLF12의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 CH471093.1, CQ834616,1, AJ243274.1, AK291397.1).
투불린 티로신 리가아제-유사 패밀리, 멤버 5 (TTLL5) 유전자는 알파-투불린의 ATP-의존 번역후 변형에 역할하는 단백질을 코딩한다. 인간 TTLL5 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 AC009399.5, AB023215.1, AK024259.1, AY237126.1).
OFD1 (구안지 증후군 1, 71-7A; SGBS2; CXorf5; MGC117039; MGC117040) 유전자는 X-염색체에 있고 중심체 단백질을 코딩한다. 인간 OFD1 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NT_011757, NM_003611).
MIRH1 (마이크로RNA 숙주 유전자 (비-단백질 코딩) 1, MIRH1, C13orf25, FLJ14178, MGC126270)은 마이크로RNA를 코딩한다. 인간 MIRH1의 뉴클레오티드 서열은 공지이다 (예를들면 GenBank 기탁번호 BC109081, NW_001838084).
WDR21A (WD 반복 도메인 21A, DKFZp434K114, MGC20547, MGC46524, WDR21) 유전자는 WD 반복-함유 단백질을 코딩한다. 인간 WDR21A 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NW_001838113, NW_925561n NM_181340, NM_181341).
EFCAB2 유전자 (EF-핸드 칼슘 결합 도메인 2, FLJ33608, MGC12458, RP11-290P14.1)는 칼슘이온 결합 단백질을 코딩한다. 인간 EFCAB2의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_032328, and BC005357).
TNRC15 (GIGYF2, GRB10 상호작용 GYF 단백질 2, PERQ2; PERQ3; FLJ23368; KIAA0642; DKFZp686I15154; DKFZp686J17223) 유전자는 Grb10와 상호작용하는 산물을 코딩한다. 인간 TNRC15 뉴클레오티드 서열은 공지이다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NW_001838867, NW_921618, 및 NT_005403).
LENG10는 백혈구 수용체 클러스터 (LRC), 멤버 10이다. 인간 LENG10의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있고, 예를들면 GenBank 기탁번호: AF211977이다.
유전자 MYSM1 (myb-유사, SWIRM 및 MPN 도메인 1, 2A-DUB; KIAA1915; RP4-592A1.1; DKFZp779J1554; DKFZp779J1721)는 탈유비퀴틴화효소를 코딩하며 히스톤 아세틸화 및 탈유비퀴틴화 조절을 통한 전사 조절 기능을 한다. 인간 MYSM1 뉴클레오티드 서열은 공지이고, 예를들면 GenBank 기탁번호: NM_001085487, 및 NW_001838579이다.
C19orf59 (염색체 19 전사해독틀 59, MCEMP1, MGC132456)은 단일-관통 막관통단백질을 코딩하며, 비만세포분열 또는 면역반응 조절 역할을 한다. 인간 C19orf59 뉴클레오티드 서열은 알려져 있으며, 예를들면 GenBank 기탁번호: NC_000019.8., 및 NM_174918이다.
MCL1 (골수세포 백혈병 서열 1 (BCL2-관련), EAT, MCL1L, MCL1S, MGC104264, MGC1839, TM). 본 유전자에 의해 코딩되는 산물은 세포자연자 조절에 관여한다. 인간 MCL1의 뉴클레오티드 서열은 공지이며, 예를들면: GenBank 기탁번호: NM_021960, 및 NM_182763이다.
KANK2 (KN 모티프 및 안키린 반복 도메인 2)로도 알려진 ANKRD25 , DKFZp434N161, FLJ20004, KIAA1518, MGC119707, MXRA3, SIP. 인간 MCL1 뉴클레오티드 서열은 알려져 있고, 예를들면: GenBank 기탁번호: NM_015493, AB284125, 및 DJ053242이다. ANKRD25 유전자 산물은 SRC 상호작용 단백질 (SIP)이며 세포질에서SRC 공활성자을 킬레이트시키고 이들 공활성자 이용성을 완충하는 역할을 하여 전사 조절자의 조절 기작을 제공한다.
ALC1로도 알려진 MYL4 (미오신, 경쇄 4, 알칼리; 심방, 배아), AMLC, GT1, 및 PRO1957. 인간 MYL4 뉴클레오티드 서열은 알려져 있고, 예를들면: GenBank 기탁번호: NM_000258, NW_001838448, NW_926883, NM_001002841 및 NM_002476이다. 본 유전자에 의해 코딩되는 산물은 미오신 알칼리 경쇄이며 배아 근육 및 성체 심방에서 발견된다.
또한 본 발명은 개체 거부반응 상태 예측 또는 진단용 키트를 제공한다. 본 키트는 KLF12, TTLL5, 239901_at, 241732_at, OFD1, MIRH1, WDR21A, EFCAB2, TNRC15, LENG10, MYSM1, 237060_at, C19orf59, MCL1, ANKRD25, MYL4을 특정하고 정량 검출하기 위한 시약 및 이러한 시약의 사용 및 결과 자료를 분석하는 방법의 지시서로 구성된다. 본 키트는 개체 거부반응 상태 예측 또는 진단을 위하여 단독으로 또는 임상지표들 결정을 위한 기타 방법 또는 적합한 기타 검정과 함께 사용될 수 있다. 키트는 예를들면 마커에 선택적으로 혼성화할 수 있는 표지화 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 키트는 예를들면 마커 영역을 (예를들면 PCR에 의해) 증폭하도록 작동하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비-거부반응 컷오프 지표를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 선택 및 제조 방법 및 '칩' 또는 어레이 상에 포함, 및 이러한 칩 또는 어레이의 사용방법은 본원에서 참조 또는 기술된다.
동종이식 거부반응 진단을 위한 단백질 프로파일 형성
단백질 프로파일 역시 동종이식 거부반응 진단용으로 사용될 수 있다. 단백질 프로파일은 단독 또는 유전자 발현 프로파일, 대사산물 프로파일 또는 동종반응성 T-세포 프로파일과 조합하여 사용될 수 있다.
일부 예에서, 본 발명은 개체의 동종이식 급성 거부반응 진단을 위한 방법을 제공하며, 이는 1) 개체의 생물학적 시료에서, B2M, F10, CP, CST3, ECMP1, CFH, C1QC, CFI, APCS, C1R, SERPINF1, PLTP, ADIPOQ 및 SHBG에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계; 2) 하나 이상의 단백질 마커들의 발현 프로파일을 비-거부자 프로파일과 비교하는 단계; 및 3) 하나 이상의 단백질 마커들 발현 수준이 대조 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 단백질 마커들 증가 또는 감소는 개체의 급성 거부반응 상태를 표시한다.
또한 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 개체의 동종이식 거부반응 예측, 평가 또는 진단방법을 제공하며, 이는 1) B2M, F10, CP, CST3, ECMP1, CFH, C1QC, CFI, APCS, C1R, SERPINF1, PLTP, ADIPOQ 및 SHBG에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 5개 이상의 단백질 마커들 증가 또는 감소를 측정하는 단계; 및 2) 개체의 '거부반응 상태'를 결정하는 단계를 포함하여 구성되며, 개체의 '거부반응 상태'결정은 개체의 단백질 마커 발현 프로파일을 대조 단백질 마커 발현 프로파일과 비교하여 결정된다. 5개 이상의 마커들은 PLTP, ADIPOQ, B2M, F10 및 CP에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, 5개 이상의 마커들은 PLTP, ADIPOQ, B2M, F10 및 CP에 의해, 및 하나 이상의 ECMP1, C1QC, C1R 및 SERPINF1에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다.
다수의 비-표지 단백질 동정 및 정량화 방법들이 현재 가능하며, 예를들면 글리코펩티드 캡처 (Zhang 등, 2005. Mol Cell Proteomics 4:144-155), 다차원 단백질 동정기법 (Mud-PIT) Washburn 등, 2001 Nature Biotechnology (19:242-247), 및 표면-강화 레이저 탈착 이온화 (SELDI-TOF) (Hutches 등., 1993. Rapid Commun Mass Spec 7:576-580). 또한, 다중 단백질 시료들 정량화를 가능하게 하는 다양한 동위원소 표지방법, 예를들면 절대 및 상대 단백질 정량화를 위한 동중원소 태그 (iTRAQ) (Ross 등, 2004 Mol Cell Proteomics 3:1154-1169); 동위원소 코드화 친화성 태그 (ICAT) (Gygi 등., 1999 Nature Biotecnology 17:994-999), 동위원소 코드화 단백질 표지화 (ICPL) (Schmidt 등., 2004. Proteomics 5:4-15), 및 N-말단 동위원소 태그화 (NIT) (Fedjaev 등, 2007 Rapid Commun Mass Spectrom 21:2671-2679; Nam 등, 2005. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sd. 826:91-107)가 고효율 성능, 및 바이오마커 선별/동정 연구에 특히 유용한 특성으로 널리 이용된다.
동종이식 수령자의 혈장 단백질 마커들의 검정에 멀티플렉스 iTRAQ 방법이 적용되었다. iTRAQ는 Ross 등, 2004 (Mol Cell Proteomics 3:1154-1169)에 의해 처음 기술되었다. 간단하게, 개체 혈장시료들 (대조군 및 동종이식 수령자)에서 가장 풍부한 14개의 단백질을 제거시키고 iTRAQ-MALDI-TOF/TOF에 의해 정량 분석되어, iTRAQ 런(동작) 당 약 200개의 배지-대-저 (medium-to-low) 풍부 단백질들 및 누적되어 1000개의 단백질이 확인되었다. 이들 중, 최소한 2/3의 AR 및 NR 그룹들에서 검출되는 129 단백질들이 동정, 통계 분석되었다. AR 및 NR 사이 차별적 상대 농도를 가지는 14개 후보 혈장 단백질이 확인되었다. 양 그룹들을 최적으로 차별하는 마커들의 선형조합을 찾기 위한 다변량 분석인 LDA를 이용하여 2개의 분류자가 구축되었다. 본 결과는 확대 환자 집단에서 얻은 추가 시료들 (실험 세트)로 더욱 유효성이 확인되었다. (ELISA를 이용한 기술적 검증이 수행되었고 iTRAQ 결과를 확증하였다. ELISA 결과 AR 대 NR 시료들에서 자체 차등적 단백질 수준을 보였다.
따라서, 단일 후보 바이오마커들이 (일부 폴드-변화가 상대적으로 작은) 군들을 명확하게 구분하지는 않지만, 함께, 동정 마커들은 만족스러운 분류를 달성할 수 있었다 (83% 민감성 및 >91% 특이성).
시료에서 검출되는 하나 이상의 단백질 마커들을 이루는 예시적 펩티드 서열은 도 17에 제공된다. 이들 펩티드는 트립신 분해 (본원에 기재)에 의해 제조되었으며 iTRAQ 실험으로 확인되었다. 시료에서 하나 이상의 펩티드를 검출하는 것은 시료에 단백질 마커가 존재한다는 것을 의미한다. iTRAQ은 펩티드를 탐색하기 위한 예시적 방법이지만, 기타 본원에 기재된 방법들 예를들면 면역 기반 방법 예를들면 ELISA 역시 유용할 수 있다. 달리, 특이 항체 역시 하나 이상의 단백질, 이형체, 전구체, 폴리펩티드, 펩티드, 이의 일부 또는 절편에 대하여 반응되며, 시료에서 하나 이상의 단백질 마커 존재를 탐색함에 특이 항체가 사용될 수 있다. 적합한 펩티드 선택, 면역혈청 제조를 위한 동물 (예를들면 생쥐, 토끼 등) 면역화 및/또는 단일클론 항체 제조를 위한 혼성세포 제조 및 선별 방법들은 본 분야에서 공지되며 본원에 참고문헌으로 기재된다.
단백질 발현 프로파일 마커들 ("단백질 마커들 ")
하나 이상의 전구체, 스플라이싱 이체, 이형체가 단일 유전자에 의해 코딩된다. 유전자 및 코딩화 이형체, 전구체 및 이체(variant) 예시는 표 8에 각 단백질 그룹 코드 (PGC)와 함께 제공된다.
PLTP (isoform 1) (인지질전달단백질 ; 달리 지질전달단백질 II로 언급, HDLCQ9)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 인간 혈청에 있는 지질전달단백질이며,고밀도지질단백질 (HDL) 재형성 및 콜레스테롤 대사에 역할을 한다. PLTP 코딩 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다(예를들면 GenBank 기탁번호 AY509570, NM_006227, NM_182676). PLTPㅇ에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenPept 기탁번호 AAA36443, NP_872617, NP_006218, P55058).
ADIPOQ (아디포넥틴; 달리 APM1로 언급, ADPN, 지방세포, C1q-, 및 콜라겐 도메인-함유, ACRP30)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 지방세포에 의해 분비되는 호르몬이며 에너지 항상성 및 포도당 및 지질대사를 조절한다. ADIPOQ 코딩 뉴클레오티드 서열은 공지이다 (예를들면 GenBank 기탁번호 EU420013, BC096308, NM_004797). ADOPOQ의 아미노산 서열은 공지이다 (예를들면 GenPept 기탁번호 NP_004788, CAB52413, Q60994, Q15848, BAA08227).
B2M (베타-2-마이크로글로불린)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 대부분의 핵세포 표면에서 주조직 적합성 복합체 (MHC) 클라스 1 중쇄와 결합하여 발견되는 혈청단백질이다. B2M 코딩 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_004048, BU658737.1, BC032589.1 및 AI686916.1.). B2M에 대한 아미노산 서열은 공지이다 (예를들면 GenPept 기탁번호 P61769, AAA51811, CAA23830).
F10 (응고인자 X, 인자 X)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 인자 Xa의 지모겐으로, 응고과정에서 중심위치를 차지하는 세린 단백질분해효소이다. 이는 접촉-활성 (내인성) 경로 또는 조직인자 (외인성) 경로에 의해 활성된다. 인자 V와 결합된 인자 Xa는, 이후 프로트롬빈을 활성하여 연속된 응고작용에 있어 작용기 효소를 형성한다. F10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NG_009258, NM_000504, CB158437.1, CR607773.1 및 BC046125.1.). F10에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면 AAA52490, AAA527644, AAA52486, P00742).
CP (세룰로플라스민, 또는 페록시다제로 알려짐; 철 (II):산소 산화환원효소, EC 1.16.3.1)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 혈장 구리의 90 내지 95%와 결합되는 알파-2- 당단백질이며 분자당 6 또는 7개의 구리이온을 가진다. 이는 Fe(II) 트랜스페린을 Fe(III) 트랜스페린으로 과산화시키는데 관여된다. CP는 혈장 금속단백질이다. CP 코딩 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NG_001106, NM_000096, DC334592.1, BC142714.1 and BC146801.1). CP에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenPept 기탁번호 NP_000087, DC334592.1, BC142714.1 and BC146801.1).
ECMP1 (ECM1, 세포외 기질단백질 1)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 여러 조직 유형에서 발현되고 결합조직과 관련되며 혈관형성을 촉진하는 것으로 밝혀졌고 내피세포 증식, 상처회복 및 기질 재형성에 역할을 한다. ECM1는 wnt/β-카테닌 신호경로에 관여된다. ECMP1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_022664, NM_004425, DA963826.1, U68186.1, CR593353.1 및 CA413352.1.). ECMP1의 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenPept 기탁번호 NP_073155, NP_004416, AAB88082, AAB88081).
C1QC (보체 성분 C1q, C 사슬)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 보체 성분 C1, 고전 보체 경로 개시자이다. CIQC을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_172369, NM_001114101, CB995661.1, DA849505.1, BC009016.1 및 BG060138.1). C1QC에 대한 아미노산 서열은 공지이다 (예를들면 GenPept 기탁번호 NP_001107573, NP_758957, P02747).
C1R (보체 성분1, r 부성분)은 보체 단백질 C1을 형성하는 C1q, C1r 및 C1을 포함한 복합체 일부이다. C1R 코딩 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_001733, BC035220.1.). C1R에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenPept 기탁번호 P00736, NP_001724, AAA58151, CAA28407).
SERPINF1 (PEDF, 색소 상피성 인자)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 세린 단백질분해효소 억제자이다. SERPINF1을 코딩하는 뉴클레오디트 서열은 공지이다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_002615, AA351026.1, CA405781.1, BU154385.1, BM981180.1, BQ773314.1,W22661.1 및 AA658568.1.). SERPINF1에 대한 아미노산 서열은 공지이다 (예를들면 GenPept 기탁번호 NP_002606, P36955, AAA60058).
CST3 (시스타틴 3, 시스타틴 C, 감마-트레이스)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 리소좀 단백질분해효소 억제자이다. CST3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_000099, BC13083.1 ). CST3에 대한 아미노산 서열은 공지이다 (예를들면 GenPept 기탁번호 NP_000090, CAG46785.1, CAA29096.1).
SHBG (성-호르몬 결합 글로불린, 안드로겐-결합 단백질, ABP, 테스토스테론-결합 베타-글로불린, TEBG)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 혈장 당단백질이며 성 스테로이드와 결합된다. SHBG 코딩 뉴클레오티드 서열은 공지이다 (예를들면 GenBank 기탁번호 AK302603.1, NM_001040.2). SHBG 아미노산 서열은 공지이다 (예를들면 GenPept 기탁번호 P04728.2, CAA34400.1, NP001031.2).
CFH (보체 인자 H, FH)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 혈류로 분비되고 보체 활성 조절에 중요한 역할을 한다. CFH을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 공지이다 (예를들면 GenBank 기탁번호 No. NM_000186.3, NM001014975.2, BM842566.1, Y00716.1,AL049744.8, BP324193.1 및 BC142699.1.). CFH 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenPept 기탁번호 NP_000177.2, NP_001014975.1, P08603.4, Q14006, Q5TFM2).
CFI (보체 성분 I (“눈”), 보체 인자 I, C3b 비활성자)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 보체 경로에 있는 C4b 및 C3b을 끊고 활성을 비활성화하는 세린 단백질분해효소이다. CFI을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 공지이다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_000204, DC392360.1, J02770.1, AK290625.1, N63668.1 및 BM955734.1.). CFI에 대한 아미노산 서열은 공지이다 (예를들면 GenPept 기탁번호 NP_000195, P05156, AAA52466).
APCS (아밀로이드 P 성분,혈청; 혈청 아밀로이드 P, SAP)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 펜트락신 패밀리의 멤버이며 아밀로이드 단백질 저장 성분이다. APCS을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_001639, CR450313, BC070178). APCS에 대한 아미노산 서열은 공지이다 (예를들면 GenPept 기탁번호 NP_001630, P02743, AAA60302, BAA00060).
예를들면 iTRAQ 단백질 또는 단백질체학 실험에서 획득된 상당한 규모의 발현 데이터들을 해석하는 것은 엄청난 작업이지만 전체적인 특징을 조명하는 방법으로 데이터를 정리할 수 있는 알고리즘 및 통계적 도구를 사용하여 매우 용이하게 진행된다. 시각적 도구 예를들면 색의 강도 및 색조를 변경하여 차별적인 발현을 나타내는 것도 가치가 있다. 알고리즘 및 사용 가능한 통계적 도구는 어레이 및 생성 데이터세트의 복잡성 증가, 처리속도, 컴퓨터 메모리 증가 및 이들의 상대적 가격 하락으로 정교함이 증가되었다.
단백질 또는 폴리펩티드 발현 프로파일의 수학적 및 통계적 분석은 여러 목적을 달성할 수 있다 - 생물학적 시스템의 경로 또는 도메인에서 단순조절을 보이는 유전자 군들의 동정, 둘 이상의 생물학적 시료들 간 유사성 및 차별성의 분석, 개체에서 특정 이벤트 또는 조작 과정들을 구별하는 유전자 발현 프로파일의 특징 분석 등. 이러한 것은 치료요법 또는 치료요법 변경의 효능 평가, 특정 병리 진행 검사 또는 검출, 달리 임상적으로 유사한 (또는 거의 동일한) 병리들 간 차별화 등을 포함한다.
생물학적 시료에서의 단백질 또는 폴리펩티드 발현 패턴은 기능적 상태 및 식별성에 대한 차별적이며 접근 가능한 분자적 모형을 제공한다 (DeRisi 1997; Cho 1998; Chu 1998; Holstege 1998; Spellman 1998). 따라서 관련 유전자 발현 패턴을 가지는 두 개의 다른 시료들은 생물학적 및 기능적으로 서로 유사하거나, 역으로 유의한 차이를 보이는 두 시료들은 보여진 복잡한 발현 패턴에 의해 차별될 뿐 아니라 특이적 병리상태 또는 기타 생리적 조건 예를들면 동종이식 거부반응의 표시인 유전산물 또는 전사체의 진단적 부분집합을 표시한다.
본 발명은 동종이식 급성 거부반응을 포함한 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단에 유용한 마커들 군을 제공하며, 이는 5개 이상의 B2M, F10, CP, CST3, ECMP1, CFH, C1QC, CFI, APCS, C1R, SERPINF1, PLTP, ADIPOQ 및 SHBG으로 구성된다.
또한 본 발명은 개체의 동종이식 거부반응 예측 또는 진단용 키트가 제공된다. 키트는 5개 이상의 B2M, F10, CP, CST3, ECMP1, CFH, C1QC, CFI, APCS, C1R, SERPINF1, PLTP, ADIPOQ 및 SHBG를 특정하고 정량 검출하기 위한 시약 및 이러한 시약의 사용 및 결과 자료를 분석하는 방법의 지시서로 구성된다. 예를들면 키트는 단백질 마커들 (1차 항체) 및 검출되는 수준으로 포함된 하나 이상의 2차 항체에 특이적인 항체 또는 이의 단편을 포함하며; 이러한 항체는 ELISA와 같은 검정법에서 사용될 수 있다. 달리, 항체 또는 이의 단편들은 고체 표면 예를들면 항체 어레이에 고정될 수 있다. 본 키트는 개체 거부반응 상태 예측 또는 진단을 위하여 단독으로 또는 임상지표들 결정을 위한 기타 방법 또는 적합한 기타 검정과 함께 사용될 수 있다. 비-거부반응 컷오프 지표를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다.
이러한 항체의 선택 및 제조 방법 및 '칩' 또는 어레이 상에 포함, 및 이러한 칩 또는 어레이의 사용방법은 본원에서 참조 또는 기술된다.
동종이식 거부반응 진단을 위한 대사산물 프로파일 형성
대사산물 프로파일 ("대사체학" 또는 "대사체학 프로파일") 역시 동종이식 거부반응 진단에 사용될 수 있다. 대사산물 프로파일은 유전자 발현 프로파일, 단백질 프로파일 또는 동종반응성 T-세포 프로파일과 조합으로 사용될 수 있다. 개체 게놈에서의 사소한 변경 예를들면 단일 염기 변화 또는 동질이상, 또는 게놈 발현 (예를들면 차등 유전자 발현)은 개체의 소분자 대사산물 프로파일에 신속한 반응으로 이어질 것이다. 또한 소분자 대사산물은 환경변화에 신속하게 반응하며 상당한 대사산물 변경은 환경변화 수초 내지 수분 내에 명백하며 - 반대로, 단백질 또는 유전자 발현 변경은 명백하게 되기 위하여는 수 시간 또는 수일 소요된다. 임상지표 목록은 예를들면 순환기질환, 비만, 대사증후군을 검사하기 위하여 사용되는 다양한 대사산물 - 예를들면 콜레스테롤, 호모시스테인, 포도당, 요산, 말론디알데히드 및 케톤체를 표시한다.
AR 개체 및 NR 개체군들에서 검출되고 정량화되는 33개의 대사산물 (표 3) 군에서, 5개가 NR 개체 대비 AR 개체에서 통계적 유의한 변화를 보였다. 폴드-변화는 마커 및 사용된 비교방법에 따라 다르다 - 절대 농도 기준 분석에 의하면 폴드-변화는 타우린에 대하여 최소한 0.44 (감소), 세린에 대하여 0.59 (감소) 및 글리신에 대하여 0.75 (감소); 또는 폴드 변화는 글리신에 대하여 최소한 0.65 (감소), 크레아틴에 대하여 2.9 (증가) 및 카르니틴에 대하여 1.89 (증가). 나머지 (balance) 대사산물들은 NR 개체군 대비 통계적으로 유의한 변화를 보이지 않았다.
대사산물 발현 프로파일 마커들 (" 대사체학 마커들 " 또는 " 대사산물 마커들")
크레아틴 (2-(카르바미미도일-메틸-아미노)아세트산; ; CAS 등록번호 57-00-1)은 여러 조직에서 발견되는 아미노산이다 -근육조직에서 인산화 형태 (포스포크레아틴)로 발견된다. 크레아틴은 생체에너지 ATP 대사에 관여되고, 소변에서 크레아틴으로 배설된다. ATP의 고에너지 인산기는 크레이틴으로 이동되어 포스포크레아틴을 형성하며 -이는 크레아틴 키나아제에 의해 가역적으로 촉매된다.
타우린 (2-아미노-에탄술폰산; CAS 등록번호107-35-7)은 황-함유 아미노산이다. 이는 인간 및 기타 종에서 조산 또는 신생아에서 필수 아미노산이다. 타우린은 신경전달물질, 세포막 안정화 및 이온수송을 포함하여 신체에서 여러 기능을 수행한다. 심근 타우린 수준 감소는 허혈성 심부전과 연관된다고 알려져 있다 (Kramer 등 1981 Am. J. Physiol. 240:H238-46).
카르니틴 ((L-)카르니틴; (3R)-3-히드록시-4-트리메틸암모니오-부타노에이트; CAS 등록번호 541-15-1)는 질소-함유 아미노산이며 대부분 건강한 유기체에서 합성될 수 있다. 이는 근육에서의 에너지 대사 (특히 미토콘드리아에서의 지방산 수송)에 중요한 역할을 한다.
글리신 (2-아미노아세트산; CAS 등록번호 56-40-6)은 여러 중요한 생체고분자 (단백질, 핵산, 콜라겐, 인지질) 생산 및 에너지 방출에 관여하는 비필수 아미노산이다.
세린 ((L-) 세린; 2-아미노-3-히드록시-피로피온산; CAS 등록번호 56-45-1)은 글리신에서 유래되는 비필수 아미노산이다. 세린은 세포막에 집중되며, 대사산물은 세포증식 및 CNS에서 특정 기능에 필수적이다 -L-세린은 푸린 뉴클레오티드 및 디옥시티미딘 1인산염의 데노보 합성에 탄소 소스이다. 최근, L-세린 및 이의 대사산물은 세포증식에 필수적일 뿐 아니라 중추신경계에서의 특정 기능에 필요한 것으로 인식되었다 (예를들면 De Konig 등 2003. Biochem J. 371:653-61). 이론에 구애되지 않고 세린이 글리신에서 유래되므로, AR 환자에게 관찰되는 상대적으로 낮은 수준의 세린은 글리신에 대하여 관찰되는 실험 결과에 일치할 수 있다.
[표 3] 개체군에서 획득된 혈청 시료의 NMR 스펙트럼에서 동정되고 정량화된 대사산물들
Figure pct00006
따라서 본 발명에서 제공되는 바와 같이, 개체의 동종이식 거부반응 진단방법은 1) 세린, 글리신, 타우린, 크레아틴 또는 카르니틴으로 이루어진 군에서 선택되는 최소한 3개의 마커들 농도를 측정하는 단계; 2) 최소한 3개 마커들의 각각의 농도를 비-거부자 컷오프 지표와 비교하는 단계, 및 3) '거부반응 상태'를 결정하는 단계로 구성되며, 개체의 거부반응 상태는 최소한 3개 마커들의 각각의 농도가 비-거부자 컷오프 지표 위 또는 아래에 있는지에 따라 표시된다.
개체의 대사산물 프로파일을 얻기 위하여 다양한 기술 및 방법이 적용될 수 있다. 적용되는 방법 및 또한 관심있는 대사산물에 따라 시료준비가 다르며 - 예를들면, 시료에서 아미노산 및 작은 대체적으로 수용성 분자들의 대사산물 프로파일을 획득하기 위하여 시료를 낮은 분자량 컷오프 2-10 kDa으로 여과하는 것이 필요하며, 지질, 지방산 및 기타 대체로 수불용성 분자들의 대사산물 프로파일을 얻기 위하여 하나 이상의 유기용매로의 추출 및/또는 건조 및 잔류물 재용해가 필요하다. 마커들 탐색 및/또는 정량화를 위한 일부 예시적 방법이 본원에 표기되나, 기타 방법들도 본 분야의 기술자에게 공지되어있으며, 쉽게 적용될 수 있다.
개체의 대사산물 프로파일을 얻기 위하여 사용되는 (단일로 또는 조합하여) 일부 예시적 기술 및 방법은 제한적이지는 않지만 핵자기공명 (NMR), 가스크로마토그래피 (GC), 질량분석기 결합 크로마토그래피 (GC-MS), 질량분석기, 푸리에 변환 MS (FT-MS), 고성능액체크로마토그래피 등을 포함한다. 대사산물 프로파일 획득을 위한 예시적 시료준비 방법 및 기술은, 예를들면 Human Metabolome Project website (Wishart DS 등., 2007. Nucleic Acids Research 35:D521-6)에서 찾을 수 있다.
대산산물 프로파일 형성에 유용한 이러한 방법들의 일반적인 원리를 보이는 표준적인 참조문헌들은 예를들면 Handbook of Pharmaceutical Biotechnology, (ed. SC Gad) John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, (2007), Chromatographic Methods in Clinical Chemistry and Toxicology (R Bertholf and R. Winecker, eds.) John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, (2007), Basic One - and Two - Dimensional NMR Spectroscopy by H., Friebolin. Wiley-VCH 4th Edition (2005)을 포함한다.
일 예에서, 최소한 3개의 마커들은 크레아틴, 타우린, 세린, 카르니틴, 글리신으로 이루어진 군에서 선택된다. 생물학적 시료에서 마커들의 정량화는 본 분야에 공지된 다양한 임의 방법으로 결정될 수 있다. 마커들 농도는 절대값 또는 기준선 수치에 대하여 상대적으로 및, 컷오프 지표 (예를들면 비-거부반응 컷오프 지표)에 대한 개체 마커들의 농도로 결정될 수 있다.
본 발명의 방법은 예를들면 개별 마커 검사를 수행하는 임상실험실 또는 기타 검사기관에 의해 최종사용자에게 접근될 수 있으며 - 생물학적 시료들이 개별 검사 및 분석이 수행되는 기관에 제공되고 예측방법이 적용되며; 달리 의료진은 임상실험실로부터 마커 수치를 수령하고 지역적 장치 또는 인터넷-기반의 장치를 이용하여 본 예측방법에 접근할 수 있다.
또한 본 발명은 개체의 동종이식 거부반응 예측 또는 진단용 키트가 제공된다. 키트는 타우린, 글리신, 카르니틴, 크레아틴 또는 세린을 특정하고 정량 검출하기 위한 시약 및 이러한 시약의 사용 및 결과 자료를 분석하는 방법의 지시서로 구성된다. 본 키트는 개체 거부반응 상태 예측 또는 진단을 위하여 단독으로 또는 임상지표들 결정을 위한 기타 방법 또는 적합한 기타 검정과 함께 사용될 수 있다. 비-거부반응 컷오프 지표를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다.
방법
유전자, 대사산물 및 동종반응성 T-세포 유전자 연구를 위한 개체 및 시료
이식 표준수술절차에서의 바이오마커에 따라 개체가 등록되었다. 연구기획자는 St. Paul 병원 (Vancouver, BC)의 심장이식 대기 개체와 상의하여, 동의한 39 개체들이 본 연구에 등록되었다. 모든 심장이식은 British Columbia Transplant (BCT)에 의해 주관되고, 모든 개체들은 표준 면역억제제 치료를 받는다. 개체 연령, 성별, 민족성 및 일차질환들은 하기 표 4에 정리된다. 동의한 개체들로부터 이식전 (기준선) 및 이식후 1, 2, 3, 4,8, 12, 26주 및 3년까지 매 6개월마다 혈액시료들이 채취되었다. 혈액은 PAXGene™ 튜브에 수집되어 전달용 얼음조에 넣고 하루 동안 -20℃ 냉동 및 이후 RNA 추출까지 -80℃ 보관하였다.
[표 4] 심장이식 개체 집단들 통계자료
Figure pct00007
심장이식 개체 데이터가 검토되었고 심각한 합병증이 없는 25 개체들이 선발되었다. 기준선 및 이식후 1, 2, 3, 4, 8 및 12주 시간별 시료들로부터의 PAXGene™ 혈액이 RNA 추출 및 마이크로어레이 분석용으로 선택되었다.
단백질 발현 연구를 위한 개체 및 방법
환자들
British Columbia 대학의 인간 연구 윤리위원회에서 승인된 종단적 연구가 St. Paul 병원 (Vancouver, British Columbia)에서 2005년3월 내지 2008년2월 심장 이식수술을 받은 일련의 서명 동의한 개체들에 대하여 수행되었다. 이식개체들은 사이클로스포린, 프레디노손 및 미코페놀레이트모페틸로 이루어진 표준 3중 면역억제제 치료를 받았다. 여성의 경우 사이클로스포린은 타크로리무스로, 신장장애자 경우 시로로무스로 대체되었다. 표준 프로토콜로써 베시리막스 유도 (basilimax induction)이 적용되었다. 혈액시료들은 이식전 및 이식후 일련의 3년까지 일렬로 및 거부반응 의심 시점에서 채집되었다. 이식전 및 프로토콜 심장조직 생검편이 채집되어 RNAlaterTM 조직 보호튜브에 직접 넣고 -80℃에 보관되었다. 생검편들은 여러 경험이 있는 심장 병리학자에 의해 검토되고 현재 ISHLT 등급 점수에 따라 분류되었다. 거부반응 등급 ≥ 2R인 환자들은 본 연구를 위하여 AR 로 식별되었다. 이러한 환자는 적당한 만성 거부반응 치료를 받았다.
본 단백질 연구는 26 내지 70세 연령의 77%가 남성인 심장 이식환자 23명에 기초하였다. 이들 환자 대부분은 백인 (92%)이고; 52%는 일차질환으로 이식전에 허혈성 심장질환을 보였다. 7명의 환자들은 ISHLT 등급 ≥2R인 최소한 한 번의 급성 거부반응 (AR)을 이식후 첫 5개월 이내에 보였다 (AR 환자들). 다른 16명의 환자들은 동일 기간 동안 AR 증상을 보이지 않았다 (NR 환자들). 23명의 환자들로부터 다른 시점에서 시료들이 채취되어 이 결과 연구집단 10 AR 시료들 및 10 NR 시료들 (ISHLT 등급=0R)이 AR 환자들로부터 그리고 NR 환자들로부터 40 NR 시료들이 얻어졌다.
심장 급성 거부반응 혈장 단백질 마커들의 잠재적 패널은 6명의 AR 환자들의 제1 시점 및 12명의 NR 환자들의 일치 시점을 이용하여 확인되었다. 내적 검증에서, 시료들의 검사 세트는 시료의 나머지 세트로부터 무작위로 선택된 환자당 단일 시료를 이용하여 구축되어, 이 결과 NR 환자들로부터 11 NR 시료들, 및 2 AR 시료들로 검사 세트가 이루어졌다. 추가적인 시점의 시료들은 단백질 분류자 패널 특성을 시각화하기 위하여 사용되었다.
시료 처리
혈액시료들은 EDTA 튜브에 채취되어 즉시 얼음에 보관되었다. 2시간 이내 각 전혈 시료로부터 원심분리에 의해 혈장이 얻어지고, 분주 및 -80℃에 보관되었다. 16명의 건강한 자로부터 얻은 말초혈액 혈장이 얻어지고 (pooled), 분주 및 -70℃에 보관되었다. 심장이식 환자 시료들은 2시간 이내 처리 전 즉시 얼음에 보관하고, -70℃에 보관되었다. 모든 혈액은 혈액 응고방지제인 EDTA (BD Biosciences; Franklin Lakes, NJ)와 함께 튜브로 수집되었다. 각 혈장 시료는 실온으로 해동되고, 10 mM 인산완충식염수 (PBS)로 5회 희석, 및 스핀-X 원심분리 튜브 필터 (Millipore)로 여과되었다. 희석 혈장은 325 uL 시료 루프를 통하여 5 mL 조류 항체 친화성 칼럼 (Genway Biotech; San Diego, CA)으로 주입하여 14개의 가장 풍부한 혈장 단백질: 알부민, 피브리노겐, 트랜스페린, IgG, IgA, IgM, 합토글로빈, α2-마크로글로불린, α1-산 당단백질, α1-항트립신, 아폴리프로테인-I, 아폴리프로테인-II, 보체 C3 및 아폴리프로테인 B)을 제거하였다. 유동 분획물을 얻어 TCA 첨가하여 최종 농도가 10%가 되도록 침전시키고 16-18 시간 동안 4℃에서 배양시켰다. 단백질 침전물은 1 시간 동안 4℃에서 3200g로 원심분리하여 회수되고 얼음 냉 아세톤 (EMD; Gibbstown, NJ)으로 3회 세척하고 45:45:10 포화 요소 (J.T. Baker; Phillipsburg, NJ), 0.05 M TEAB 완충액 (Sigma-Aldrich; St Louis, MO), 및 0.5% SDS (Sigma-Aldrich; St Louis, MO)로 이루어진 200-300 uL iTRAQ 완충액으로 재-수화시켰다. 이후 각 시료는 -70℃에 보관되었다. 혈장 단백질 제거 시료들, 100mg은 서열분석 등급 변형 트립신 (Promega; Madison, WI)으로 분해되고 제조업자 프로토콜에 따라 iTRAQ 시약 (Applied Biosystems; Foster City, CA)으로 표지화시켰다. 다른 동작(run)들에 걸쳐 해석될 수 있는 결과를 얻기 위하여 모든 동작(run)에서 공통 참조 시료가 3개의 환자 시료들과 함께 처리되었다. 참조시료는 16명의 건강한 자들로부터의 혈장 풀(pool)로 이루어지고 일관되게 iTRAQ 시약 114로 표지화되었다. 환자 시료들은 무작위로 iTRAQ 시약들 115, 116 및 117로 표지화 되었다. iTRAQ 표지 펩티드는 이후 수집되어 pH 2.5-3.0로 산성화되고, 먼저 강 양이온 교환 크로마토그래피(Michrom Bioresources Inc., Auburn, CA USA) 에 의해 이어 역상 크로마토그래피 (Michrom Bioresources Inc., Auburn, CA USA)에 의해 분리되고, Probot 마이크로분별 수집기 (LC Packings, Amsterdam, Netherlands)를 사용하여 384 스폿 MALDI ABI 4800 플레이트, 실험당 4개의 플레이트에 직접 스폿되었다.
트립신 분해 및 iTRAQ 표지화
총 단백질 농도는 바이신코닌산 검정 (BCA) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO USA)으로 결정되며 -20℃에서 HPLC 등급 아세톤 10 부피 함량을 첨가하면 각 시료들로부터 총 단백질 100 ug이 침전되고 -20℃에서 16-18시간 동안 배양하였다. 단백질 침전물은 10분 동안 16 110 xg로 원심분리하여 회수되고 50 mM TEAB 완충액 (Sigma-Aldrich; St Louis, MO) 및 0.2% 전기영동 등급 SDS (Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ)에 용해되었다. 각 시료에 있는 단백질은 TCEP (Sigma-Aldrich; St Louis, MO) 3.3 mM으로 환원되었고 (reduced) 60분 동안 60℃에서 배양되었다. 시스테인은 최종 농도 6.7 mM에서 메틸 메탄 티오술포네이트로 저해되었고 (blocked) 실온에서 10분 동안 배양되었다.
환원되고 저해된 시료들은 서열분석 등급 변형 트립신 (Promega; Madison, WI)으로 분해되고 16-18 시간 동안 37℃에서 배양되었다. 트립신 분해 펩티드 시료들은 진공농축기(Thermo Savant; Holbrook, NY)에서 건조되고 제조업자 프로토콜에 따라 iTRAQ 시약 (Applied Biosystems; Foster City, CA)으로 표지화시켰다. 표지화 시료들은 수집되어 (pooled) 농축 인산 (ACP Chemicals Inc; Montreal, QC, Canada)을 이용하여 pH 2.5-3.0으로 산성화되었다.
2D- LC 크로마토그래피
iTRAQ 표지 펩티드는 VISION 워크스테이션 (Applied Biosystems; Foster City, CA) 상에서 내부 직경 (ID) 4.6 mm 및 길이 100mm의 300Å 공극을 가지는 5um 비드 충진 폴리술포에틸 A 칼럼 (PolyLC Inc., Columbia, MD USA)을 사용한 강 양이온 교환 크로마토그래피(SCX)로 분리되었다. 사용되는 이동상은 10 mM 제1인산칼륨 (Sigma-Aldrich; St Louis, MO) 및 25% 아세토니트릴 (EMD Chemicals; Gibbstown, NJ) pH 2.7로 이루어진 버퍼 A, 및 0.5M 염화칼륨 (Sigma-Aldrich St Louis, MO, USA)이 추가된 것을 제외하고 A와 동일한 버퍼 B이었다. 500 uL의 분획물들이 1) 0-30 분, 5% 내지 35%의 버퍼 B, 및 2) 30-80 분, 35% 내지 100%의 버퍼 B의 두 선형 프로파일들로 나누어진 80분 구배에 걸쳐 수집되었다. 가장 높은 수준의 펩티드를 가지는, UV에 의해 검출되는, 20 내지 30 분획물들이 선택되고 부피는 150 uL의 예비 분획물로 감소되었다. 분획물을 C18 PepMap 가드 칼럼 (300 um ID x 5 mm, 5um, 100Å, LC 팩킹, Amsterdam)에 로딩하고, 물/아세토니트릴/TFA 98:2:0.1 (v/v)로 이루어진 이동상 A로 15분 동안 50 uL/분 조건으로 세척되어, 펩티드는 탈염되었다 (desalted). 이후 트래핑 칼럼은 200 nL/분에서의 나노 유동 흐름으로 전환되고 (switched), 여기에서 고해상 크로마토그래피를 위하여 펩티드는 Magic C18 나노 LC 칼럼(15 cm, 5um 공극 크기, 100Å, Michrom Bioresources Inc., Auburn CA, USA)에 로딩되었다. 펩티드는 다음 구배에 따라 용출되었다: 0-45 분, 5% 내지 15% B (아세토니트릴/물/TFA 98:2:0.1, v/v); 45-100 분, 15% 내지 40% B, 및 100-105 분, 40% 내지 75% B. 용출액은 Probot 마이크로분별 수집기 (LC Packings, Amsterdam, Netherlands)를 사용하여 96 스폿 MALDI ABI 4800 플레이트, 실험당 4개의 플레이트에 직접 스폿되었다. 기질 용액 (matrix solution), 50% ACN, 0.1% TFA 에 녹인 3 mg/mL α-시아노-4-히드록시신남산 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO USA)이 스폿 당 0.75 uL 첨가되었다.
질량스펙트럼 및 데이터 처리
MALDI 플레이트에 스폿된 (spotted) 펩티드는 4000 시리즈 Explorer version 3.5 소프트웨어에 의해 제어되는 4800 MALDI TOF/TOF 분석기(Applied Biosystems; Foster City, CA)으로 분석된다. 질량분석기는 MS/MS 충돌에너지 1 keV으로 양이온 모드에서 설정되었다. 각 MS/MS 동작에 최대 1400 쇼트/스펙트럼이 얻어지고, 총 매스(mass) 시간은 35 내지 40 시간 범위가 되었다. 펩티드 동정 및 정량화는 ProteinPilot™ 소프트웨어 v2.0 (Applied Biosystems/MDS Sciex, Foster City, CA USA)(Shilov 등, 2007)으로 수행되었으며 일체화 신 Paragon™ 검색 알고리즘 (Applied Biosystems) 및 Pro Group™ 알고리즘이 사용되었다. 데이터베이스 검색은 국제 단백질 지표 (IPI HUMAN v3.39) (Kersey 등, 2004)에 대하여 수행되었다. 전구체 허용오차 (precursor tolerance)는 150ppm으로 설정되고, iTRAQ 단편 허용오차는 0.2 Da으로 설정되었다. 동정 파라미터들은 트립신 절단, MMTS에 의한 시스테인 알킬화로 설정되고, 특정 인자들은 요소변성 및 생물학적 변이상 ID 포커스에서 설정되었다. 검출 단백질 역치는 85% 신뢰구간에서 설정되었다.
Pro Group™ 알고리즘(Applied Biosystems)은 Paragon™ 알고리즘으로부터의 펩티드 증거를 시료에서의 단백질에 대하여 종합적으로 요약하고 각 iTRAQ 동작에서 동정 단백질 세트를 단백질 군들로 조직화하여 동정 단백질의 최소 세트를 유지시켰다. 상대적인 단백질 수준 (표지 114에 대한 각각의 표지 115, 116 및 117 수준의 단백질 농도 비율)은 상응된 펩티드 비율 (단일 피크들을 포함)을 이용한 Protein Pilot으로 추정되었다. 각 단백질 비율은 각 단백질에 대한 개별 펩티드의 로그 비율의 가중평균에 기초하여 ProteinPilot에 의해 계산되었다. 각 로그 비율의 가중치는 Pro Group 알고리즘에 의해 계산되는 정량화 오류의 예측치인, 편차 인자의 역이다. 가중평균은 이후 선형 공간으로 다시 전환되어 Pro Group 알고리즘에 있는 Auto Bias 교정 옵션을 이용하여 실험적 편차를 교정하였다. 다음의 경우의 펩티드 비율은 해당 평균 단백질 비율을 계산하는데 제외되었다: 공유 펩티드 (즉, 동일 펩티드 서열은 하나 이상의 단백질로 속함(claimed)), 전구체 중첩된 펩티드 (즉, 동정 펩티드를 보이는 스펙트럼 또한 다른 단백질에 속하나, 비-관련 펩티드 서열을 가짐), 낮은 신뢰성을 가지는 펩티드 (즉, 펩티드 ID 신뢰성 < 1.0%), iTRAQ 변형이 없는 펩티드, 단지 시약 쌍의 하나의 멤버가 동정되는 펩티드, 모든 피크 쌍들에 대한 신호-대-잡음 비율이 9 이하인 펩티드 비율을 가지는 펩티드.이들 및 각 단백질에 할당된 기타 정량적 측정 및 편차 교정에 대한 추가 정보는 ProteinPilot 소프트웨어 문서에서 주어진다.
본 연구에서, 14개의 가장 풍부한 단백질이 제거되고 총 혈장 단백질 중량의 5% 이내로 이루어진 혈장 단백질들이 분석되어 급성 심장 거부반응의 혈장 단백질 마커들을 동정한다. 다른 산탄식(shotgun) 단백질 방법에서와 같이, iTRAQ 방법에서 펩티드 및 단백질 동정은 MS/MS 펩티드 스펙트럼 및 데이터베이스 검색에 기반한다. 단백질 분석 과정에서 통상 직면하는 애매함으로 인하여, ProteinPilot와 같은 많은 소프트웨어 도구는 각 실험 동작 내에서 유사한 서열을 가지는 단백질을 포함한 단백질 그룹으로 데이터를 조직화한다 (Nesvizhiskii 및 Aebersold, 2005). 일반적으로, 각 그룹을 나타내기 위하여 가장 그럴듯하게 제시된 단백질로 각 참조 이름 (동정자)이 선택되고 해당 평균 iTRAQ 비율과 함께 단백질 요약표로 옮겨진다. 그러나, 일부 경우, 그룹에서 다른 단백질들을 구분하는 방법이 없고, 일반적으로 그룹에서 최상위가 아닌 (non-top) 단백질 결여에 대한 결론적인 증거가 없다. 이러한 문제는, 다른 복제물을 일치시킬 때 일부 단백질이 존재하지만 그룹의 다른 멤버로 나타나고 일부 복제물에 검출되지 않은 것으로 나타나므로 문제를 일으킨다. 이러한 문제를 해결하고 분석되는 단백질 개수를 최대화하기 위하여 새로운 알고리즘, 소위 단백질 그룹 코드 알고리즘 (PGCA)가 개발되었다. PGCA는 각 동작에서 동정 코드를 모든 단백질 군들에 부여하고 공통코드를 유사한 단백질 그룹들에 동작들(runs)에 걸쳐 부여한다. 이후 부여된 단백질 그룹 코드 (PGC)는 실험의 다른 복제물에 걸쳐 단백질을 매칭시키기 위하여 사용된다. 이러한 과정을 통하여 모든 실험적 동작들에 걸쳐 관련된 단백질 및 단백질 패밀리에 대한 공통 동정자 분류 (common identifier nomenclature)가 보장된다.
통계적 분석
일 시점에서 차등적 상대 수준을 가지는 일-단백질 평가 (eBayes - Smyth GK. 마이크로어레이 실험에서 차등 발현을 평가하기 위한 선형 모델 및 실험적 베이즈 방법. Stat Appl Genet Mol Biol . 2004;3:Article3 (Berkeley Electronic Press)가 PGCA에 의해 부여된 단백질 그룹 코드로 지정되고 6개 AR 시료들 중 최소한 4개 및 12개 NR 시료들 중 8개에서 검출되는 (즉 각 분석 그룹 내에서 최소한 2/3 검출) 단백질 세트에 대하여 신뢰 적합 t-검정을 이용하여 수행되었다. 원래 유전자 발현 분석을 위하여 설계된 eBayes는 연구 대상 샘플 크기가 줄어들면 인위적으로 낮은 샘플 분산추정치에 의해 유도되는 위양성 수를 줄인다. 추가로, eBayes 신뢰 버전은 고전적, 비-신뢰 검정보다 데이터 크기로부터 벗어나는 관측에 덜 민감하다. AR 및 NR 간 유의적으로 차별되는 (p-값 < 0.05) 평균 상대농도 (대조군 수준 대비)을 가지는 단백질 그룹 코드는 더욱 분석되는 것으로 고려되었다. 두 잠재적 혈장 단백질 패널을 동정하기 위하여 다른 기준이 사용되었다: A) 오류발견률 (FDR) 25% 이하, 및 B) AR 및 NR 군들 분리 능력을 최대화한 전진 선택 단계적 판별분석 (SDA) (R 패키지 klaR 이용 In R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria).
선형판별법 (LDA)이 수행되어 새로운 시료들을 분류하기 위한 단백질 패널 성능을 추정하였다. 동일 훈련 (18개 개체 시료들) 및 실험 (13개 개체 시료들) 세트 모두가 양 경우에서 (환자 부분 참조) 사용되었다. SDA 및 LDA에서, 환자 시료(들) 및/또는 대조군에서 미-검출된 각 단백질의 상대 농도가 각 군에서 훈련 시료들로부터 계산된 평균 상대농도를 이용하여 입력되었다 (AR 및 NR 평균). 모든 통계적 분석은 R 버전 2.6.0을 이용하여 구현되었다.
14개의 미커들 패널로부터, 5개의 단백질들이 상업적 키트 및 다음 제조업자 지시: 아디포넥틴, 베타-2 마이크로글로불린, 시스타틴 C (모두 R&D Systems, Minneapolis, MN로부터 입수), 인자 X (Diapharma, West Chester, OH), 및 성 호르몬-결합 글로불린 (Alpco, Salem, NH), 에 따라 효소결합면역흡착검사 (ELISA)에 의해 검증되었다. 환자 시료들 및 iTRAQ 실험에서 사용된 동일한 채집 대조군들이 ELISA에 의해 2회 검정되었고 VersaMax Tunable 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 분석되었다.
동종반응성 T-세포 단리
[표 5] 동종반응성 T-세포 유전자 발현 프로파일에 대한 심장 이식 개체 통계자료
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급성 전혈 RNA 추출 및 마이크로어레이 분석을 위하여, 심장이식 개체 데이터가 검토되었고 심각한 합병증이 없는 25 개체들이 선발되었다. 기준선 및 이식후 1, 2, 3, 4, 8 및 12주 시간별 시료들로부터의 PAXGene™ 혈액이 RNA 추출 및 마이크로어레이 분석용으로 선택되었다 (도 1). 동종반응성 T-세포 분리, RNA 추출 및 마이크로어레이 분석을 위하여, 혈액 또는 비장 시료들이 이식 전, 이식 시, 또는 이식 후 즉시 동의한 제공자로부터 채취되었다. 9명의 이식 개체들이 제공자 동의서에 기초하여 연구용으로 선택되었다. 본 개체 분포 및 샘플링 시간 선이 도 12에 도시되며, 개체 통계자료는 표 5에 표시된다.
APC 막의 바이오틴화
바이오틴 결합 항원표출세포 (APC) 막을 생성하기 위하여, 먼저 제공자 비장 또는 제공자 나트륨 헤파린 혈액에서 백혈구가 분리되었다. 이후 세포는 5분 동안 1500 RPM으로 원심 분리되어 펠렛화 되었다. PBS 중의 NHS-바이오틴 (바이오틴) 0.2 mg/mL 을 함유한 완충액이 준비되었다. 상등액이 제거되고 3000 세포당 1 uL의 완충액 비율로 첨가된 바이오틴 용액에 APC을 재현탁 시켰다. 양호한 혼합을 위하여 튜브를 여러 번 뒤집고 30분 동안 4℃에서 배양되었다. 이후 튜브에 FACS 완충액을 채우고 5분 동안 1500 RPM으로 원심 분리하여 세포를 펠렛화 시켰다. 세포는 FACS 완충액에 재현탁, 분취되어 SA-PE 염색법으로 바이오틴화 정도를 결정하였다. 나머지 APC은 다음과 같이 막으로 준비되었다. APC 현탁액은 5분 동안 1500 RPM으로 15 mL 튜브에서 원심 분리되어 세포를 펠렛화 시켰다. 상등액을 빨아내고 펠렛을 2 x 107 세포당 세포용해 완충액 1 mL에 재현탁시켰다. 이후 균질화 단계를 효과적으로 하기 위하여 최소 2 mL의 세포용해 완충액이 사용되었다. 용해물은 5분간 얼음에 정치되었다. 이후 세포는 Polytron PT 3000 자동 균질장치 (Brinkmann)로 용해되었다. 균질발생장치 (generator)가 충분히 튜브 내부에 삽입되었는지를 확인하였다. 너무 많은 프로스 (froth)가 발생되지 않는 속도까지 균질장치 RPM을 점차로 높이고 (>10,000 RPM), 시료는 이 속도에서 2분 동안 균질화되었다. 이후 튜브 내용물은 5분 동안 2000 RPM에서 원심 분리되어 나머지 비-균질화 세포들 및 원하지 않은 조직파편을 펠렛화하였다. 현탁액의 1 mL 분취량이 별도의 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮겨졌다. 이들 튜브는 4℃에서 5분 동안 14,000 RPM으로 원심 분리되어 세포막을 펠렛화시켰다. 상등액을 빨아내고 펠렛은 재현탁 완충액 100 uL에 재현탁 되었다. 다음, 단백질 결정이 수행되어 용액에서 막 함량 - 1% BAS를 참조하여 분광광도계로 A280에서 흡광도 측정-이 정량화되었다. 이후 재현탁 완충액은 uL 당 단백질 2 ug을 함유한 세포막 현탁액 100 uL 분취량을 생성하는데 이용되었다.
적당한 바이오틴화를 보장하기 위하여, FACS 완충액 100uL 중의 100,000 세포들을 함유한 분취량이 취하여지고 5 uL의 SA-PE가 첨가되었다. 피펫으로 혼합한 후, 세포들은 30분 동안 4℃의 암실 혼합장치 (nutator)에 놓았다. 이후 튜브는 FACS 완충액으로 채워졌고 5분 동안 1500 RPM으로 원심 분리되어 세포를 펠렛화 시켰다. 상등액은 제거되고 이러한 세척 단계는 2회 이상 반복되어 과잉 SA-PE를 제거하였다. 마지막으로, 유세포 분석을 위하여 세포는 300 uL의 FACS 완충액에 재현탁 되었다.
바이오틴화 APC 막의 응답자 세포로의 결합
10 ug의 바이오틴화 막은 > 1.5 x 105 세포 (PBMC, 플로오로크롬-부착 항-CD3 항체로 염색된 PBMC, 또는 순수 CD3+ T 세포)가 함유된 각 웰에 첨가되었다. 막 조제물은 FACS 완충액 100 uL 중의 200 ug 분취량으로 통상 보관되므로, 첨가된 막은 보통 5 uL이었다. 세포들은 4℃ 암실에서 60분 동안 혼합장치에서 배양되었다. 웰에 FACS 완충액이 채워지고 시료는 5분 동안 1500 RPM으로 원심 분리되었다. 상등액이 제거되고 더 많은 FACS 완충액이 첨가되었다. 이러한 세척 단계는 총 3회 수행되었다. 상등액이 다시 제거되고 세포는 100 uL의 FACS 완충액에 재현탁 되었다. 이후 플루오로크롬과 부착된 SA 2 uL 가 첨가되었다 (만약 이전에 PBMC가 플루오로크롬 부착 항-CD3 항체로 염색되었다면, 플루오로크롬 부착 SA 가 유일한 것을 확신하였다). 시료들은 4℃ 암실에서 60분 동안 혼합장치에서 배양되었다. 이후 웰에 FACS 완충액이 채워지고 시료는 5분 동안 1500 RPM으로 원심 분리되었다. 상등액이 제거되고 더 많은 FACS 완충액이 첨가되었다. 이러한 세척 단계는 총 3회 수행되었다. 300 uL의 FACS 완충액에서의 유세포 분석을 위하여 시료는 적당한 튜브로 옮겨졌다.
동종반응성 T 세포 ( 바이오틴화 APC 막과 결합된 세포) 추출
동종의 바이오틴화 APC 막과 결합된 응답자 PBMC은 EasySep®바이오틴 선택 키트 (StemCell Technologies, Vancouver)를 이용하여 분리될 수 있다. 이로써 3개의 응답자 세포의 부차 집단에 대한 연구가 가능하였다: 미-조작 PBMC, 동종 APC 막과 결합된 PBMC (즉, 동종반응성 T 세포), 및 동종 APC 막과 부착되지 않은 PBMC (즉, 동종반응성 T 세포가 제거된 전체 PBMC). 15 mL FalconTM폴리스틸렌 환저 튜브에서, 1 x 106 PBMC은 [동질유전자적 (대조군) 또는 동종의 (실험) 소스로부터의] APC 막 300ug과 함께 5 uM Mg2 +가 보충된 3mL 염색 완충액에서 1시간 동안 4℃로 혼합장치에서 배양되었다. 이후 이러한 세척 단계는 다시 반복되고 세포 펠렛은 1 mL FACS 완충액에서 재현탁 되었고 5 mL FalconTM 폴리스틸렌 환저 튜브에 옮겨졌다. 이후 100 uL 의 EasySep® 바이오틴 선택 혼합액 (4중체 항체 복합체를 포함)이 첨가되었고 세포는 15분 동안 실온에서 배양되었다. 이후 잘 혼합된 EasySep® 나노 자성입자들 50 uL이 세포에 첨가되었고 튜브는 10분 동안 실온에서 배양되었다. 이후 튜브는 2.5 mL FACS 완충액으로 채워지고 EasySep®마그네틱 내부에 5분 동안 놓였다. 튜브 및 마그네틱을 함께 들어올려 튜브 내용물 (바이오틴화 APC 막과 결합되지 않은 PBMC)은 새로운 5 mL 튜브로 도치시켰고 - 이러한 도치 위치는 3분 동안 유지되었다. 이러한 네거티브 분획물 (negative fraction)은 바이오틴화 APC 막과 결합되지 않은 PBMC을 함유한다. 비드에 결합된 세포는 동종반응성 T 세포가 풍부한 생물학적 시료 일부를 포함하였고, 이는 이후 RNA 추출되었다.
RNA 추출 및 마이크로어레이 분석
RNA 추출은 해동 시료를 대상으로 PAXgene™ 혈액 RNA Kit [Cat #762134]을 이용하여 수행되어 전체 RNA을 분리하였다. 2.5 ml 전혈에서 통상 4 내지 10㎍ RNA가 단리되며, RNA 품질은 Agilent Bio Analyzer으로 확인되었다. 1.5 ug의 RNA, RIN 수치 > 5, 및 A240/A280 >1.9인 시료들이 드라이아이스에 포장되어 Affymetrix 마이크로어레이 분석을 위하여 페덱스를 이용하여 Microarray Core (MAC) 실험실 (아동병원, Los Angeles, CA)으로 보내졌다. 마이크로어레이 분석은 CAP/CLIA 인증 MAC 실험실의 단독 기술자에 의해 수행되었다. 이중나선 cDNA 합성을 위하여 신생 RNA가 사용되었다. cDNA는 바이오틴으로 표지화, 절편, 혼성화 혼합액과 혼합되고 GeneChip Human Genome U 133 Plus 2.0 어레이에서 혼성화되었다. 정상 전혈에서 제조된 내부 RNA 대조군과 함께 48개의 배치에서 Affymetrix 시스템으로 어레이가 스캔되었다. 마이크로어레이는 Affymetrix 버젼 1.16.0 및 affyPLM 버젼 1.14.0 BioConductor 패키지 (Bolstad, B., Low Level Analysis of High-density Oligonucleotide Array Data: Background, Normalization and Summarization. 2004, University of California, Berkeley; Irizarry 등 2003. Biostatistics 4(2): 249-64)을 이용하여 품질 문제가 확인되었다. 낮은 품질의 어레이는 동일 시점에서의 다른 RNA 분취량으로 반복되었다.
( 대사산물 연구를 위한) NMR 화합물 확인
선택된 혈청 시료들에 대하여 3 kDa MW 500 uL 최대 부피 컷오프 필터 (Pall Life Sciences)를 사용하여 관심있는 대사산물로부터 더 큰 분자량 성분들을 분리하기 위하여 초미세여과가 수행되었다. 300 uL 분취량의 초미세여과 유체를 1.5 mL Eppendorf 튜브에 옮기고 이어 35 uL D2O 및 15 uL 표준용액 (3.73 mM DSS (디소듐-2,2-디메틸-2-실라펜탄-5-술포네이트), 233 mM 이미다졸, 및 H2O 중의 0.47% NaN3, Sigma-Aldrich, Mississauga, ON)을 첨가하여 NMR-준비 시료가 제조되었다. 이러한 방식으로 제조된 각 혈청 시료는 pH 7.3-7.7에서 0.16 mM DSS, 10 mM 이미다졸, 및 0.02% NaN3 을 함유하였다. 이후 시료 (350 uL)는 표준 SHIGEMI 마이크로셀 NMR 튜브로 옮겨져 NMR 스펙트럼 분석되었다.
모든 1H-NMR 스펙트럼은 5 mm HCN Z-구배 펄스-장 구배 (PFG) 실온 프로브 또는 Z-구배 PFG Varian 냉-프로브가 구비된 500 MHz Inova (Varian Inc., Palo Alto, CA) 분광기에서 얻어졌다. 1H-NMR 스펙트럼은 25 ℃에서 tnnoesy-예비포화 펄스 시퀀스의 제1 트랜션트 (transient)를 이용하여 획득되며, 이는 고도의 높은 정량적 정확성을 위하여 선택되었다 (E.J. Saude, C.M. Slupsky, B.D. Sykes, Metabolomics 2 (2006) 113.).
스펙트럼 분석 전에, 모든 FID는 64k 데이터 점들을 0-충전하고, 0.5 Hz 선폭 증가를 적용하였다. 완충액 성분 DSS의 메틸 단일선은 화학적 이동 참조 (0 ppm으로 설정) 및 정량화를 위한 내부 표준으로 작용하였다. 모든 1H-NMR 스펙트럼은 Chenomx NMR Suite Professional 소프트웨어 패키지 버전 4.6 (Chenomx Inc., Edmonton, AB)을 이용하여 처리, 분석되었다. Chenomx NMR Suite 소프트웨어를 사용하여 참조 스펙트럼의 내부 데이터베이스 스펙트럼 신호들을 완전한 NMR 스펙트럼과 "일치"시킴으로써 정성적 및 정량적 NMR 스펙트럼 분석이 가능하다 (A.M. Weljie, J. Newton, P. Mercier, E. Carlson, C.M. Slupsky, Anal. Chem. 78 (2006) 4430). 각 대사산물에 대항 스펙트럼 일치는 표준 Chenomx 500 MHz (pH 6-8) 대사산물 라이브러리를 이용하여 실시되었다. 농도 데이터는 상기된 바와 같이 대역통과 필터 감쇄에 대하여 보정되었다 (E.J. Saude, B.D. Sykes, Metabolomics 3 (2007) 19). 이들 확인과 더불어, 시료 소량 첨가 (sample spiking)로 인하여 NMR 스펙트럼에서 보이는 많은 스펙트럼 신호들의 정체를 확인하였다. 시료 소량 첨가는 20-200 uM의 추정 화합물을 선택된 혈청 시료들에 첨가하고 해당 1H NMR 신호가 예상된 바와 같이 변화되었는지를 확인함으로써 수행되었다.
통계적 분석
통계 분석은 SAS version 9.1 , R version 2.6.1 및
BioConductor version 2.1 (Gentleman, R., 등., Genome Biology, 2004. 5: p. R80)을 이용하여 수행되었다.
유전자 및 T-세포 마이크로어레이 데이터 분석을 위하여, Affymetrix BioConductor 패키지에서 유용한 간섭교정, 정규화 및 요약화를 위한 신뢰 멀티-어레이 평균 (RMA) (Bolstad, 등. Bioinformatics, 2003. 19(2): p. 185-93) 기술이 사용되었다. 잡음 최소화가 이루어졌고; 최소한 3 시료들에 걸쳐 일관적으로 50 이하의 발현 수치를 가지는 프로브 세트가 잡음으로 간주되고 이후 분석에서 제거되었다. 나머지 프로브 세트들은 3개의 다른 적합 T-검정들로 분석되었다. 두 방법은 마이크로어레이 데이터에 대한 선형모델 (limma) BioConductor 패키지 - eBayes 와 조합된 신뢰 피트 (robust fit) 및 eBayes와 조합된 최소자승피트 - 에서 가능하다. 3번째 통계분석방법, 마이크로어레이의 통계분석 (SAM)은 동일 BioConductor 패키지에서 가능하다. 모든 3가지 방법에서 오류발견률 (FDR) <0.05 및 모든 3가지 적당한 T-검정들에서 폴드 변화 > 2인 경우 유전자는 통계적으로 유의하다고 간주된다 (Smyth, G., Limma: linear models for microarray data, in Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor, R. Gentleman, 등., Editors. 2005, Springer: New York). 통계적으로 유의한 프로브 세트에 대한 전진선택법 (forward selection)과 함께 바이오마커 패널 유전자는 단계적 판별분석법 (SDA)을 적용하여 동정되었다. 선형판별분석법 (LDA)이 분류자자로서의 바이오마커 패널을 훈련 및 실험하기 위하여 사용되었다.
대사산물 데이터는 두 가지 다른 방법들로 분석되었다. 첫째, 급성 거부반응 (AR) 시료 (ISHLT 등급 ≥2R)의 절대농도가 비-거부반응 (NR) 시료 (ISHLT 등급 0R)과 비교되었다. 둘째, AR 시료의 기준선에 대한 상대농도가 NR 시료의 기준선에 대한 상대농도와 대비되었다. 상대농도는 각 개체에 대하여 이식 후 시료 농도 수치를 기준선 시료 농도 수준으로 나누어 계산된다. 각 분석에 있어서 두 개의 다른 적합 T-검정이 사용되고 양 분석에서 FDR (오류발견률) <0.05인 대사산물이 통계적으로 유의하다고 추정되었다. 두 다른-검정들은 마이크로어레이 유의 분석 (SAM) 및 신뢰 eBayes이다. 대사산물은 어느 하나의 t-검정으로부터 유의하다고 추정되었다. SAM은 기준선 대비 상대농도 데이터에 대하여 유의한 대사산물을 확인하며, 신뢰 eBayes t-검정은 절대농도 데이터에 대하여 유의한 대사산물을 확인하였다.
실시예 1 유전자 발현 프로파일
차등 발현되는 39개의 프로브 세트가 동정되고, 이들 각각은 급성 거부반응 환자 (AR) 및 비-거부반응 환자 (NR) 사이 최소한 2-배(fold) 차이를 보였다 (표 6). 12개의 마커들 서브세트는 일관되게 AR 및 NR 서브세트를 구별하는 것으로 확인되었다 (표 6에서 "++"로 표기). 도 2에 의하면, TRF2, SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, FGFR1OP2 및 MBD4 마커들의 증가 또는 감소는 각 시료를 AR 또는 NR로 분류할 수 있었다.
[표 6] AR 및 NR개체 사이 최소한 2-배 차이를 보이는 차등적으로 발현되는 프로브 세트. 표적 서열은 공통 또는 전형 서열 일부이며 이로부터 프로브 서열이 선택되었다. 공통 또는 전형 서열은 GeneChip U133 2.0 프로브 세트 측정 전사체를 나타내기 위한 어레이 설계 시에 사용된 서열이다. 공통 서열은 서열 데이터를 군들로 정렬하고 결합하는 염기-결정 알고리즘으로부터의 결과이다. 전형 서열은 각 유전자의 대표적 cDNA 서열이다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013

실시예 2 생물학적 경로
생물정보학 및 문헌-기반 접근법을 이용하여, 선택된 차별 발현 유전자에 기반하여 다양한 경로들이 확인되었다. 이들 간의 상호작용 역시 본 결과에서 설명되었다. 도 3은 바이오마커들 ARHGEF7, TRF2, BID, MARCKS, KLF4, CLEC2B 및 MBD4 사이의 경로-기반 상호작용을 도시한 것이다.
바이오마커 유전자 및/또는 유전산물들 사이 상호반응은 다음을 포함한다:
1. BETAPIX → Rac1 → STAT1 → KLF4
BETA-PIX → Rac 1 (Park 등, 2004. Mol Cell Biol 24:4384-94)
Rac1 → STAT1 → KLF4 (Uddin 등, 2000 J.Biol Chem 275:27634-40;Feinberg 등 2005. J. Biol.Chem 280:38247-58 )
2. KLF4 → (c-MYC → CREB1) → CLECSF2
KLF4 → c-MYC (Kharas 등 2007. Blood. 109:747-55)
c-MYC → CREB1 (Tamura 등 2005 EMBO J. 24:2590-601)
CREB1 → CLECSF2 (Zhang 등 2005. Proc Natl Acad Sci. 102:4459-64)
3. STAT1 → BID
STAT1 → KLF4 (Uddin 등, 2000 J.Biol Chem 275:27634-40;Feinberg 등 2005. J. Biol.Chem 280:38247-58 )
STAT1 → BID (Hartmann 등 2005. Genes & Development 19:2953-2968)
4. KLF → 베타-카테닌 → HDAC1 → MBD4
KLF → 베타-카테닌 (Zhang 등, 2006. Mol. Cell Biol. 26:2055-64)
베타-카테닌 → HDAC1 (Baek 등 2003. Proc Natl Acad Sci 100:3245-50)
HDAC1 → MBD4 (Kondo 등 2005. mo. Cell Biol 25:4388-96)
5. BETA-PIX → CDC42 → PKC-제타 → MARCKS
BETA-PIX → CDC42 (Feng 등 2002. J Biol Chem 277:5644-50)
CDC42 → PKC-제타 (Slater 등 2001. Biochemistry 40:4437-45)
PKC-제타 → MARCKS (Hartwig 등 1992. Nature 356:618-22)
6. KLF4 → SP1 → HLA-H → TfR2
KLF4→ SP1 (Kanai 등 2006. Clin Cancer Res 12:6395-402)
SP1 → HLA-H (Mura 등 2004. FASEB J. 18:1922-4)
HLA-H → TFR2 (Goswami 등 2006. J. Biol Chem. 281:28494-8)
실시예 3: 대사산물 프로파일
개체의 대사산물 프로파일은 상기된 바와 같이 얻어졌다. 33개의 대사산물들 (표 3)은 개체군에서 얻어진 53개의 혈청 시료들에서 동정되고 정량화되었다. AR 및 NR 개체들 사이 비교. 개체 시료들은 ISHLT 생검 점수에 기반하여 AR 또는 NR로 확인되었다 (AR에 대하여는 ≥ 2R, NR에 대하여는 0R). ISHLT 생검 점수는 심근내막 생검에 대한 병리학자의 평가로 결정된다 (Stewart et al 2005, 상기.)
통계적으로 유의한 변화를 보이는 대사산물은 표 7a-d에 나열된다.
도 10에 도시된 바와 같이, 타우린, 세린 및 글리신에 대한 절대농도로 검사 집단에서 각 개체의 거부반응 상태가 결정되었다. 대사산물 프로파일에 따라 ISHLT 생검 점수 ≥ 2R 인 모든 개체는 AR의 거부반응 상태로 할당되었다; ISHLT 생검 점수 0R 인 모든 개체는 NR의 거부반응 상태로 할당되었다.
이식-후 시료의 농도가 기준선 농도와 대비될 때, 적합 t-검정을 이용하여 3개의 대사산물은 통계적으로 유의하였다. 선은 각 군의 평균을 표시한다. 총 시료 집단은 AR 개체로부터의 6개의 시료들 및 NR 개체들로부터의 21개의 시료들을 포함하였다.
[표 7a] AR 및 NR 개체들에서 타우린, 세린 및 글리신의 절대농도 수치
Figure pct00014
[표 7b] 심장 대사산물 마커들 -절대 농도: 표 7a의 AR 및 NR개체들에 대한 평균, 표준편차
Figure pct00015
[표 7c] AR 및 NR 개체들에서 글리신, 크레아틴 및 카르니틴의 기준선에 대한 상대농도 수치
Figure pct00016
도 11에 도시된 바와 같이, 각각의 글리신, 크레아틴 및 카르니틴에 대한 기준선 대비 상대농도로 검사 집단에서 각 개체의 거부반응 상태가 결정되었다. ISHLT 생검 점수 ≥ 2R 인 모든 개체는 AR의 거부반응 상태로 옳게 할당되었다; ISHLT 생검 점수 0R 인 모든 개체는 NR의 거부반응 상태로 옳게 할당되었다.
[표 7d] 심장 대사산물 마커들 -기준선 대비 상대 농도: 표 7c의 AR 및 NR 개체들에 대한 평균, 표준편차
Figure pct00017
[표 8] 폴드-변화의 크기 및 방향
Figure pct00018
"절대농도"는 AR 및 NR 시료들 사이의 비교이다. "기준선에 대한 상대농도"는 AR/BL 또는 NR/BL 비율 및 이어 얻어진 비율의 비교이다. 절대농도방법을 이용하여 평가하면, 크레아틴 및 카르니틴은 유의한 변화를 보이지 않는다 (데이터 미도시). 대사산물을 기준선 대비 상대적 방법으로 평가하면, 타우린 및 세린은 유의한 변화를 보이지 않는다 (데이터 미도시).
NR 대비 AR에서 더 높은 수준의 크레아틴이 발견되며 - 이는 AR 환자에서 크레아틴 키나아제 (CK) 수준을 반영할 것일 수 있다. CK 상향조절은 임상적으로 골격근 또는 심근 손상 (예를들면 심근경색증)을 표시하는데 사용될 수 있다. 급성 거부반응은 이식장기에 대한 면역-매개적 손상일 수 있으므로, CK와 같이 카르니틴 역시 (NR 에 비하여) AR 에서 동종이식 손상의 다른 표시로써 증가될 가능성이 있다.
타우린 수준은 (NR에 비하여) AR 개체에서 더 낮게 발견된다 (표 8). 낮은 수준의 타우린이 고혈압과 같은 병태에서 발견되므로, 타우린은, 심장에서 혈압 증가의 특정 표시 보다, 압박을 받는 심장에 대한 일반적인 바이오마커로 기능할 가능성이 있다.
거부반응 환자에게서 보이는 카르니틴의 증가 수준은 부분적으로 동종이식 (보상적) 반응에 부분적으로 기인할 수 있고 - 지방 활용을 상향조절하고 따라서 허혈/재관류, 산소 라디칼 생성 및 동종면역 반응이 심근 에너지 대사에 미칠 수 있는 부정적 영향을 심장이 보상하기 위하여 더 많은 에너지를 생성할 수 있다.
또한 상기 결과는 타우린의 차등적 발현 수준이 동종이식 거부반응 (특히 본 데이터에서 NR에서 관찰되는 타우린의 더 높은 수준을 고려하면) 바이오마커로 기능할 수 있다는 증거를 제공한다. 상기 Rashke 등에 의한 연구에 기반하여, NR은 높은 수준의 타우린 이로 인하여 궁극적으로 PMN-유도 재관류 손상 및 산화부담으로 심장을 보호하는 이점이 있다는 것은 생물학적으로 타당하다.
이론에 구애되지 않고, 상기 결과는, 바이오마커 제조에서 글리신 역할을 가정하면, 동종이식 거부반응에 관여되는 면역세포 (예를들면 CD4+ 및 8+ 세포, NK 세포 등) 조건을 충족시키기 위하여 DNA 및 인지질 (예를들면 세포막에 대한) 생성을 지지 또는 상향조절하기 위하여 개체는 글리신에 대한 추가적인 요구를 보일 수 있다는 것을 제안한다. 달리, 글리신 수준은 NR보다 AR에서 낮고, 이는 동종이식에 대한 동종이식 거부반응 및 손상이 수령자의 주변 세포 및 조직의 정상적인 세포대사 및 에너지 생성을 왜곡시키기 때문일 수 있다.
실시예 4: 동종반응성 T-세포 프로파일
196개의 유전자에 대응되는 200개의 프로브 세트들은 AR 및 NR 시료들에 속하는 동종반응성 T 세포 시료들 사이에서 차등 발현된다 (p>0.01). 이들 프로브 세트의 발현 수치에 기반하여, AR 개체 시료들은 NR 개체 시료들 (데이터 미도시)로부터 떨어져 함께 군집된다. 239901_at, 241732_at 및 237060_at는 이전에 동종반응성 T 세포에 특이한 미확인 전사체 또는 유전자를 나타내거나 또는 달리 종래 기법을 이용하여 마스킹 되기에는 충분히 낮은 카피 수로 존재할 수 있다.
상기된 바와 같이, 각 차등적 발현 프로브 세트는 급성 거부반응 환자 (AR) 및 비-거부반응환자 (NR) 시료들 간 최소한 1.6-배 차등을 보였고, 일관되게 AR 및 NR 개체를 구별하는 12개의 유전자 마커들 서브세트가 동정되었다. 개체 시료들로부터 동종반응성 T-세포가 분리되어 동종반응성 T-세포 유전자 마커들 동정을 위하여 마이크로어레이 분석이 수행되었다. 표 9는 최소한 1.6 폴드-변화를 보이는 마커들을 나열한 것이다. KLF12, TTLL5, 239901_at, 241732_at, OFD1, MIRH1, WDR21A, EFCAB2, TNRC15, LENG10, MYSM1, 237060_at, C19orf59, MCL1, ANKRD25, MYL4에서의 증가 또는 감소는 각 시료를 AR 또는 NR로 분류할 수 있었다 (도 13A에 도시). 도13b는 유전자 마커들 TRF2, SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, FGFR1OP2 및 MBD의 증가 또는 감소와 조합하여 고려될 때 동종반응성 T-세포 마커들 KLF12, TTLL5, 239901_at, 241732_at, OFD1, MIRH1, WDR21A, EFCAB2, TNRC15, LENG10, MYSM1, 237060_at, C19orf59, MCL1, ANKRD25, MYL4의 증가 또는 감소를 보이고 이에 따라 각 시료를 AR 또는 NR로 더욱 바람직하고 양호하게 분류할 수 있었다.
상기 결과는 유전자 마커들 또는 동종반응성 T-세포 유전자 마커들의 특정 세트는 단독 또는 함께 취하여져, 급성 거부자 또는 비-거부자 사이를 유용하고 일관되도록 차별시킨다.
[표 9] 급성 거부반응의 동종반응성 T-세포 바이오마커들. "239901_at”, “241732_at”및 "237060_at”은 이전 동정 전사체, 유전자 또는 유전산물에 해당되지 않지만, AR 및 NR개체들 사이 통계적으로 유의한 변화를 보이는 전사체의 마커들이다.
Figure pct00019
Figure pct00020
실시예 5: 단백질 프로파일
발굴분석에 포함되고 17개의 다른 iTRAQ 실험으로 처리된 18개 시료들 중 최소한 하나에서 총 906개의 단백질 그룹 코드 (PGC)가 검출되었다. 이들 PGC에서, 129개가 6 AR 및 12 NR 시료들의 최소한 2/3에서 검출되었다. 이들 두 PGC 세트로부터 56% 및 2%가 단일 펩티드 동정자(identifier)에 기반하여 동정되었다 (도 5). 따라서 단지 하나의 펩티드에 기반하여 동정된 대부분의 단백질은 대부분의 iTRAQ 동작에서 동정되지 않았고 더 이상 분석되지 않았다. 더욱이, 129개의 분석 PGC 57% 및 40% 는 각각 >5 및 >10 상이한 펩티드들에 기반하여 동정되었다 (도 5).
발굴( discovery )분석: 혈장 단백질 마커들 동정
통계적 분석을 통하여 AR 및 NR 시료들 사이 유의하게 상대농도가 차별되는 129개의 분석 PGC 중 14개를 동정하였다 (표 10). 14개의 동정 PGC에서 11개는 AR 대 NR 시료들에서 상향 조절되었다: B2M, F10, CP, CST3, ECMP1, CFH, C1QC, CFI, APCS, C1R 및 SERPINF1. 다른 3개의 PGC인 PLTP, ADIPOQ 및 SHBG는 하향-조절되었다. 모든 PGC는 >2 상이한 펩티드 서열에 기초하여 동정되었다 (Paris Consensus에 의거, Publication Guidelines for the Journal "Molecular and Cellular Proteomics", April 2007). iTRAQ 실험에서 동정된 전형 펩티드, 할당된 단백질 그룹 코드 및 SEQ ID NO: 도 17에 나열된다.
AR 및 NR 시료들 사이 차등 상대 수준 (p<0.05) 을 가지는 혈장단백질 패널. "PGC"는 PGCA에 의해 할당된 단백질 그룹 코드를 포함한다. 각 그룹 내의 기탁번호 및 단백질 명칭, 해당 유전자, 신뢰 적합 t-검정 (eBayes)로 계산된 p-값, NR에 대한 AR의 방향을 가지는 (+ 및 - 표시는 각각 상향- 또는 하향-조절) 폴드 변화가 다른 5 칼럼에 주어진다. 두 개의 패널들은 오류발견률 (FDR) 기준 (A) 및 SDA (B)에 의해 선택되었고 마지막 칼럼에 표시된다. 패널 A는 FDR 컷-오프 25%를 적용하여 선택되었고 이는 PGC에 대한 p<0.01과 동일한 것이고 급성 거부반응 및 비-거부반응 시료들 사이 최선의 분류를 제공하는 PGC 세트로서 패널 B는 SDA에 의해 분석되었다 (표 10).
전진선택 SDA 알고리즘은 잠재적 마커들 리스트로부터 일 시점에서의 하나의 단백질 그룹과 결합된다. 제1단계에서 단일잔류 교차검증에 기초하여 최선의 효율을 가지는 단백질 그룹 코드를 확인한다. 제2단계에서 이전에 확인된 코드와 함께 단일잔류 교차검증에서 최선으로 수행되는 제2 단백질 그룹 코드를 확인한다. 이러한 절차는 효율 개선이 유의하게 개선되지 않을 때까지 반복된다. 각 교차검증에서, 효율은 급성 거부반응 및 비-거부반응 그룹을 분리하는 모델 성능으로 측정된다.
[표 10] 단백질 마커들
Figure pct00021
두 개의 잠재적 단백질 패널은 오류발견률 역치 (패널 A) 및 SDA (패널 B)에 기초하여 분석되었다. 결과를 경시적으로 가시화하기 위하여, 단일 점수가 LDA를 사용하여 패널 A에 기초하여 구축된 분류자에 의해 생성되었다 (도 6A). 각 시점에서 가능한 모든 AR (실선) 및 NR (점선) 시료들에 대한 점수 중앙값들이 표시되고 수직 바를 이용하여 표준편차가 표시된다. 패널 A는 이식-후 4 주 이후 더욱 확실한 차별로서 모든 시점에서 명백히 NR로부터 AR을 구분한다. 도 6B는 환자들이 NR 및 AR 이력 사이에 있을 때 점수를 보인다. AR의 제1 연속 시점들이 고려되었고 AR 환자들로부터 평균화되었다(실선). 유사하게 AR 이전 및 이후 NR의 연속 시점들이 고려되었고 동일 환자들로부터 평균화되었다. 대조 곡선은 가능한 시점들에 의해 AR 환자들과 가능한 인접하게 일치되는 NR 환자들에 대하여 구축되었다 (점선). 흥미롭게도, AR 환자 점수는 급성 거부반응 이력(들) 이전 및 이후 비-거부반응 상태와 비교하여 AR 시점(들)에서 달리 상승되었다. 반대로, 일치 시점들에 걸쳐 NR 환자들은 상당히 일정한 패턴을 보였다. 패널 B을 이용하여 구축된 분류자에 대하여 유사한 결과가 얻어졌다.
내적 검증
분류자 A (패널 A를 이용하여 LDA에 의해 구축), 및 분류자 B (패널 B를 이용하여 구축)로 13개의 추가 환자 시료들을 이용한 내적 검증 결과가 도 7에 도시된다. 시각화를 위하여, 두 분류자들에 의해 생성된 점수들이 재-중심화되어 0에서 분류에 대한 컷-오프 선이 설정되었다. 훈련 세트에서 각 AR 및 NR 시료들에 대한 평균 점수는 각각 적색 및 흑색 별표로 표시된다. 검사 세트에서 각 AR 및 NR 시료들에 대한 점수는 각각 적색 삼각형 및 흑색 점들로 표시되어 AR 및 NR 간 명백한 구분을 보인다. LDA에 의해 정의 수치를 가지는 시료들은 AR로 구분되며 음의 수치를 가지는 것들은 NR로 구분된다. 분류자 A는 모든 시료들을 옳게 분류하였다 (100% 민감성 및 특이성). 분류자 B는 그룹들을 분리하는 성능을 개선되었지만 하나의 NR에 대하여 오-분류하였다 (100% 민감성 및 91% 특이성).
실시예 6: 단백질 발현 프로파일의 ELISA 에 의한 검증
표 10에 있는 단백질 패널로부터, 5개가 ELISA에 의해 검증되었다: 아디포넥틴, 베타-2 마이크로 글로불린, 시스타틴 C, 인자 X 및 성 호르몬-결합 글로불린. ELISA 수치가 실질적으로 단백질 수준의 절대 측정 함량이지만, iTRAQ 결과와 비교가능성을 수월하게 하기 위하여, 단백질 수준은 합동 대조군의 것들에 비교하여 보고되었다 (도 8). 먼저, AR 및 NR 군들 사이 차등적 단백질 수준이 검증되었다. 신뢰 적합 t-검정 (eBayes)가 다시 사용되어 데이터에서 기술적 이중성 여지에 대한 상관 구조를 조절하였다. 둘째, ELISA 및 iTRAQ 상대 단백질 수준들 사이 상관성이 검사되었다. 데이터에서 이상값은 강한 상관의 추정을 낮추거나 약한 상관의 추정을 부풀리므로, 스피어만 상관계수가 피어슨 상관계수 대신 사용되었다.
5개의 검증 마커들 중 총 4개가 AR 대 NR에서 p<0.055 (표 11) 차등적 단백질 수준을 보였다. 또한, 모든 검증 단백질 수준은 AR 대 NR에 대하여 iTRAQ 및 ELISA 모두에서 동일한 방향 (상향- 및 하향-조절)으로 밝혀졌고, 따라서 iTRAQ에 의해 밝혀진 결과를 확증하였다. 도 8은 발굴분석에서 사용된 18개의 시료들에 대한 iTRAQ (x-축) 및 ELISA (y-축)에 의해 결정되는 단백질 수준의 상관성을 보인다. 결과는 양 플랫폼의 측정 사이 강한 상관성의 증거를 제공하였다 (0.6 이상의 상관계수 및 5개의 검증 단백질 중 4개에 대하여 0.006 이하의 정의 상관 검사 p-값). 이들 결과는 합동으로 양 플랫폼에서의 측정은 양호하게 상관된다는 것을 보인다.
[표 11] ELISA 기술적 검증. AR 대 NR에서 신뢰 적합 t-검정 (eBayes)에 의해 계산된 p-값, 폴드 변화 및 방향 (+ 및 -표시는 각각 상향 또는 하향-조절)이 각각의 검증 단백질에 대하여 주어진다.
Figure pct00022
각 개별적 공개문헌은 본원에 특정하게 및 개별적으로 참조로 표시되며 전부가 제공되는 것으로 모든 참조문헌들은 본원에 참조로 포함된다. 본원에서 참조문헌의 언급은 이러한 문헌들이 본 발명에 선행기술이라는 것을 인정하는 것이 아니며 이렇게 해석되어서는 아니된다.
하나 이상의 현존하는 바람직한 예들이 예시로 기재되었다. 본 발명은 예시 및 도면을 참조하여 개시된 모든 예시, 실질적인 변경 및 변형을 포함한다. 다양한 변경 및 변형이 청구항에 정의된 본 발명의 사상을 벗어남이 없이 가능하다는 것은 본 분야의 기술자에게 자명하다. 이러한 변경의 예로는 실질적으로 동일한 방법으로 동일한 결과를 달성하기 위한 본 발명의 임의 측면에 대한 공지된 균등적 치환을 포함한다.

Claims (21)

  1. 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법에 있어서,
    a. 개체의 생물학적 시료에서, TRF2, SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, FGFR1OP2 및 MBD4로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산 마커들의 핵산 발현 프로파일을 결정하는 단계;
    b. 하나 이상의 핵산 마커들의 발현 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및
    c. 하나 이상의 핵산 마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 핵산 마커들의 증가 또는 감소는 개체의 급성 거부반응 상태를 표시하는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  2. 제1항에 있어서, TRF2 및 FGFR1OP2은 비-거부자 프로파일 대비 증가되고 SRGAP2P1, KLF4, YLPM1, BID, MARCKS, CLEC2B, ARHGEF7, LYPLAL1, WRB, MBD4은 대조군 대비 감소되는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  3. 제1항에 있어서, 대조군 프로파일은 비-거부반응, 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체에서 획득되는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 임상지표를 위한 수치를 획득하는 단계를 더욱 포함하는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  5. 제1항에 있어서, a) 단계에서 표 6에서 선택되는 하나 이상의 마커들의 발현프로파일을 결정하는 단계를 더욱 포함하는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  6. 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산 마커들의 발현 프로파일은 하나 이상의 마커들에 해당되는 RNA 서열을 검출하여 결정되는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산 마커들의 유전자 발현 프로파일은 PCR으로 결정되는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  8. 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산 마커들의 핵산 발현 프로파일은 혼성화로 결정되는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  9. 제8항에 있어서, 혼성화는 올리고뉴클레오티드에 혼성되는 것인, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  10. 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법에 있어서,
    a. 개체의 생물학적 시료에서, B2M, F10, CP, CST3, ECMP1, CFH, C1QC, CFI, APCS, C1R, SERPINF1, PLTP, ADIPOQ 및 SHBG에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 5개 이상의 단백질 마커들의 단백질 발현 프로파일을 결정하는 단계;
    b. 5개 이상의 단백질 마커들의 발현 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및
    c. 하나 이상의 단백질 마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 5세 이상의 단백질 마커들 수준의 증가 또는 감소는 개체의 급성 거부반응 상태를 표시하는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  11. 제10항에 있어서, PLTP, ADIPOQ 및 SHBG에 의해 코딩되는 폴리펩티드 수준은 대조군 프로파일 대비 감소하며, B2M, F10, CP, CST3, ECMP1, CFH, C1QC, CFI, APCS, C1R, 및 SERPINF1에 의해 코딩되는 폴리펩티드 수준은 대조군 프로파일 대비 증가하는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  12. 제10항에 있어서, 대조군 프로파일은 비-거부반응, 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체에서 획득되는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  13. 제10항에 있어서, 하나 이상의 임상지표를 위한 수치를 획득하는 단계를 더욱 포함하는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  14. 제10항에 있어서, 단백질 발현 프로파일은 면역검정에 의해 결정되는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  15. 제10항에 있어서, 단백질 발현 프로파일은 ELISA에 의해 결정되는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  16. 제10항에 있어서, 단백질 발현 프로파일은 질량스펙트럼에 의해 결정되는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  17. 제10항에 있어서, 단백질 발현 프로파일은 동중원소 또는 동위원소 태그방법에 의해 결정되는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  18. 제10항에 있어서, 5개 이상의 마커들은 PLTP, ADIPOQ, B2M, F10 및 CP에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  19. 제10항에 있어서, 5개 이상의 마커들은 PLTP, ADIPOQ, B2M, F10 및 CP 및 하나 이상의 ECMP1, C1QC, C1R 및 SERPINF1에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  20. 제1항에 있어서, 대조군은 자가 대조군인, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
  21. 제10항에 있어서, 대조군은 자가 대조군인, 개체의 급성 동종이식 거부반응 상태 결정방법.
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