JP2008206476A - 腎ガン診断用組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】腎ガンの診断に有用なマーカーおよび腎ガンの検出方法を提供する。
【解決手段】被験者由来の生体試料中の特定の配列で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸、のいずれか1つまたは複数を、ポリペプチド等については免疫学的方法、核酸についてはハイブリダイゼーション法や定量ポリメラーゼ連鎖反応法により測定することを含む腎ガンを検出する方法、ならびに腎ガンを診断または検出するための組成物。
【選択図】なし
【解決手段】被験者由来の生体試料中の特定の配列で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸、のいずれか1つまたは複数を、ポリペプチド等については免疫学的方法、核酸についてはハイブリダイゼーション法や定量ポリメラーゼ連鎖反応法により測定することを含む腎ガンを検出する方法、ならびに腎ガンを診断または検出するための組成物。
【選択図】なし
Description
本発明は、腎ガンの診断又は検出に有用な組成物に関する。
本発明はまた、該組成物を使用した腎ガンの検出方法に関する。
腎臓は血液をろ過して尿を生成することにより生体内の老廃物を体外に排泄する役割を持つ、重要な泌尿器系器官である。また同時に血圧をコントロールするアンギオテンシン、赤血球造血因子であるエリスロポエチンなどのホルモンを産生する重要な内分泌器官でもある。
腎臓に発生する腫瘍には、成人に発生する腎細胞ガンと小児に発生するウィルムス腫瘍、まれな腫瘍として肉腫があるが、以後最も発生率が高い悪性腫瘍である腎細胞ガンを腎ガンと呼ぶ。腎ガンの発生頻度は人口10万人あたり2.5人程度であり、男女比は2〜3:1で男性に多い傾向がある。泌尿器科系悪性腫瘍の中では、前立腺ガン、膀胱ガンに次いで多い腫瘍である。
腎ガンの危険因子としては遺伝学的要因も知られているが、一般的にはたばこ、脂肪摂取量などを挙げることができる。また長期に透析を受けている患者において腫瘍の発生率が高いことも知られている。
腎ガンでは腫瘍の最大径が5cm以下の場合に何らかの自覚症状があることはまれであり、検診時のCTスキャンなどによって発見されることが多い。サイズの大きい腫瘍では血尿、腹部腫瘤、疼痛などがみられる。また全身的症状として発熱、体重減少、貧血などをきたすことがあり、まれに内分泌因子によって赤血球増多症や高血圧、高カルシウム血症などが引きおこされることがある。一方で腎ガンの下大静脈内への進展によって腹部体表の静脈の怒張や精巣静脈瘤が起こることがある。腎ガンの約2割は、肺や骨転移から発見される。腎ガンでは静脈の中に腫瘍が広がる傾向が強く、他の臓器への転移を生じ易い。腎ガンの検査法としては超音波検査、CT検査、血管造影検査があるが、特異的な生化学マーカーは知られておらず、機器を利用した検診が必要となる。
また腎ガンはさらに病理学的にいくつかの分類が可能であるが、そのうちの90%を占める淡明細胞型腎ガンの発生原因は、ガン抑制遺伝子であるVHL(von−Hippel−Lindau)遺伝子の欠損であることが知られている(非特許文献1)。VHL遺伝子の欠損はHIF−α/VHF会合の障害を介して低酸素誘導遺伝子群の転写活性化をもたらし(非特許文献2)、VEGF、TGFβなどの遺伝子発現増強が起こる事が知られている。
腎ガンの治療の主体は外科療法である。病期にかかわらず、摘出できる場合は腎臓の摘出、あるいは腎臓を部分的に摘出することが最も一般的であり、仮に転移があっても、腎臓の外科的摘出が考慮される場合がある。外科療法以外の方法としては、腎動脈の動脈塞栓術があり、この方法は摘出が不可能な場合や、大きな腫瘍を摘出する場合に手術に先立ち施行されることがある。
腎ガンは比較的早期で発見された場合は予後は比較的良く、初期ガンでの治療では90%以上が治癒する。しかし、5cm以上の大きな腫瘍や転移のある腫瘍の治療成績は劣り(腎細胞がん全体の5年生存率は約50−60%)、早期発見の重要性が認識されている。
画像診断は早期の小さい腎ガンを発見するのに有用な方法ではあるが、例えば健康診断など大勢の被験者を対象とした場合には効率が良いとはいえず、また診断に必要な費用も比較的高い。そこで、腎ガンの特異的で感受性が高い血中マーカーの発見が強く望まれている。血中マーカーを利用することにより、比較的安価でハイスループットな検査・診断が可能になると考えられる。
ヒト腎ガンの検出または診断については、遺伝子発現の差を利用する方法が特許文献1に開示されている。またヒト腎ガンにおいて増加することが知られているタンパク質としては、細胞外基質を分解することによってガン細胞の運動性を増加させると考えられるMMP2(非特許文献3)、腎障害において発現が増加することが知られているTNFRSF7(非特許文献4)のほか、PDE8B(特許文献2)、FLOT1(特許文献3)、CD5(非特許文献5)、ECM1(特許文献4)なども知られているが、相対的に特異性が高いとは言えず、これらの発現量のみによる感受性が高い腎ガンの検査方法の臨床的利用は行われていない。
しかしながら、上記の既存のマーカーは特異性及び/又は感受性に乏しいことや、生体試料からのその効率的な検出方法が確立していないことから一般に臨床上の利用は行われておらず、より特異性及び感受性が高い腎ガンのマーカーが切望されている。
本発明は、腎ガンの診断に有用な組成物、および該組成物を用いた腎ガンの検出方法を提供することを目的とする。
マーカー探索の方法としては、腎ガン細胞と非ガン細胞における遺伝子発現やタンパク質発現、又は細胞の代謝産物などの量を何らかの手段によって比較する方法や、腎ガン患者と非ガン患者の体液中に含まれる遺伝子、タンパク質、代謝産物などの量を測定する方法が挙げられる。
上記の課題を解決するために、本発明者らは、今回、腎ガン患者と健常人の血漿について、腎ガン患者に特異的に検出されるタンパク質マーカーを見出した。
本発明は、以下の特徴を有する。
(1)被験者由来の生体試料中の配列番号1〜13で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸、のいずれか1つまたは複数を測定することを含む、腎ガンをインビトロで検出する方法。
(2)前記ポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは前記核酸、の量またはその存在を測定する、上記(1)に記載の方法。
(3)前記ポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは前記核酸、の量が、対照試料のものと比べて有意に増大していることを指標にする、上記(1)または(2)に記載の方法。
(4)前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の測定が免疫学的方法によるものである、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)前記核酸の測定がハイブリダイゼーション法または定量ポリメラーゼ連鎖反応法によるものである、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(6)前記測定が、前記ポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは前記核酸、と結合可能な物質を用いて行われる、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)前記結合可能な物質が抗体またはその断片である、上記(6)に記載の方法。
(8)前記抗体が標識されている、上記(6)に記載の方法。
(9)前記結合可能な物質が前記核酸、その相補的な核酸、またはその少なくとも15ヌクレオチドの断片、である、上記(6)に記載の方法。
(10)前記核酸、その相補的な核酸またはその断片が標識されている、上記(9)に記載の方法。
(11)前記ポリペプチド、その変異体またはその断片と特異的に結合する抗体またはその断片を用いて、前記試料中の該ポリペプチド、その変異体またはその断片のうちの1つまたは複数の量または存在を免疫学的に測定し、該ポリペプチド、その変異体またはその断片の量が対照試料のものと比べて増大していることを指標にするか、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片の存在を指標にして腎ガンを検出することを含む、上記(1)〜(4)、(6)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(12)前記ポリペプチド、その変異体もしくはその断片をコードする核酸またはその相補的な核酸と特異的に結合する該核酸、その相補的な核酸またはその断片を用いて、前記試料中の該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸のうちの1つまたは複数の量または存在をハイブリダイゼーション法または定量ポリメラーゼ連鎖反応法によって測定し、該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸の量が対照試料のものと比べて増大していることを指標にするか、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸の存在を指標にして腎ガンを検出することを含む、上記(1)〜(3)、(5)、(6)、(9)〜(10)のいずれかに記載の方法。
(13)前記核酸がDNA、RNA、mRNA、cDNAまたはcRNAである、上記(1)〜(3)、(5)、(6)、(9)〜(10)、(12)のいずれかに記載の方法。
(14)前記試料が血液、血漿、血清または尿である、上記(1)〜(13)のいずれかに記載の方法。
(15)前記試料が腎由来の組織または細胞である、上記(1)〜(13)のいずれかに記載の方法。
(16)前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、上記(7)、(8)または(11)に記載の方法。
(17)配列番号1〜13で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片と特異的に結合する、抗体もしくはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの1つまたは複数を含む、腎ガンの診断または検出のための組成物。
(18)前記ポリペプチドまたは変異体の断片が、少なくとも7個のアミノ酸からなるエピトープを含む断片である、上記(17)に記載の組成物。
(19)配列番号1〜13で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸またはその相補的核酸と特異的に結合する、該核酸、その相補的な核酸もしくはその少なくとも15ヌクレオチドの断片、またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの1つまたは複数を含む、腎ガンの診断または検出のための組成物。
(20)前記ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸、その相補的な核酸またはその断片がプローブまたプライマーである、上記(19)に記載の組成物。
(21)キットの形態である、上記(17)〜(20)のいずれかに記載の組成物。
(22)上記(17)〜(20)のいずれかに記載の組成物の、被験者における腎ガンのインビトロ検出のための使用方法。
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を含む。なお、下記の特定の用語以外の用語の定義は、当業界で慣用的に使用される意味を有するものとする。
本明細書において「変異体」とは、配列番号1〜13で表されるアミノ酸配列又はその部分配列おいて1以上、好ましくは1もしくは数個、のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは該アミノ酸配列又はその部分配列と約80%以上または約85%以上、好ましくは約90%以上または93%以上、より好ましくは約95%以上、約97%以上、約98%以上または約99%以上、の%同一性を示すアミノ酸配列を有する変異体を意味する。
また、該変異体をコードする核酸についても、同様に、配列番号1〜13のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその部分配列において、1以上、好ましくは1もしくは数個、のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入を含む核酸、あるいは該ヌクレオチド配列又はその部分配列と約80%以上または約85%以上、好ましくは約90%以上または93%以上、より好ましくは約95%以上、約97%以上、約98%以上または約99%以上、の%同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸を意味する。
ここで、「数個」とは、約10、9、8、7、6、5、4、3又は2個の整数を指す。
また、「%同一性」は、上記のBLASTやFASTAなどのタンパク質または核酸のホモロジー検索プログラムを用いて、ギャップを導入してまたはギャップを導入しないで、決定することができる(Karlin,S.ら、1993年、Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A.、第90巻、p.5873-5877;Altschul,S.F.ら、1990年、Journal of Molecular Biology、第215巻、p.403−410;Pearson,W.R.ら、1988年、Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A.、第85巻、p.2444-2448;高木利久・金久實編、ゲノムネットのデータベース利用法(第2版)1998年、共立出版社)。
本明細書において「化学修飾誘導体」は、酵素、蛍光団、放射性同位元素などのラベルによるラベル化誘導体、あるいはアセチル化、グリコシル化、リン酸化、硫酸化などの化学修飾を含む誘導体を意味する。
本明細書において「診断または検出のための組成物」とは、腎ガンの罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断または検出するために、あるいは腎ガンの予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接的又は間接的に使用しうるものをいう。
本明細書において検出・診断対象となる「生体試料」とは、腎ガンの発生にともない出現する標的ポリペプチドを含有する、あるいはその含有が疑われる、生体から採取された試料をいう。
本明細書において「特異的に結合する」とは、抗体またはその断片が、本発明における腎ガンマーカーである標的ポリペプチド、その変異体またはその断片とのみ抗原-抗体複合体を形成し、他のペプチド性またはポリペプチド性物質とは該複合体を実質的に形成しないこと、あるいは、相補的核酸またはその断片が、該標的ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸とのみ結合し、他の核酸とは実質的に結合しないことを意味する。ここで、「実質的」とは、程度は小さいが非特異的な複合体形成、あるいは非特異的な結合、が起こり得ることを意味する。
本明細書において「核酸」とは、DNA、RNA、mRNA、cDNAまたはcRNAのいずれかを、また一本鎖または二本鎖を、意味する。
本明細書において「エピトープ」とは、本発明の標的ポリペプチド、その変異体またはその断片において、抗原性または免疫原性を有する部分アミノ酸領域(抗原決定基)を指す。エピトープは通常、少なくとも5アミノ酸、好ましくは少なくとも7アミノ酸または少なくとも8アミノ酸、より好ましくは少なくとも10アミノ酸からなる。
本発明における腎ガンマーカー(ポリペプチドまたは核酸)は、腎ガン患者の血液、腎組織などの生体試料中に見出されるが、健常人にはほとんどまたは全く見出されないため、単に該マーカーの存在または量を指標にすることによって、例えば血液を用いて、容易に腎ガンを検出することができるという格別の作用効果を有する。
以下に本発明をさらに具体的に説明する。
<腎ガンマーカー>
本発明の腎ガン診断用組成物を使用して腎ガンをインビトロで検出するための腎ガンマーカーは、配列番号1〜13で表されるアミノ酸配列を有すポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸である。
本発明の腎ガン診断用組成物を使用して腎ガンをインビトロで検出するための腎ガンマーカーは、配列番号1〜13で表されるアミノ酸配列を有すポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸である。
本発明の配列番号1〜13のポリペプチドおよび対応する遺伝子を、その遺伝子名およびタンパク質番号(GenBank登録名および登録番号)、ならびにそれらの特性とともに下記の表1に示す。これらのポリペプチドは、腎ガン患者の血漿または腎組織中に特異的に検出され、健常者の血漿には検出されないか、または検出できるレベルになかった。なお、これらのポリペプチドまたは遺伝子(cDNA)のアミノ酸配列またはヌクレオチド(もしくは、塩基)配列は、NCBI、GenBank等のデータバンクにアクセスすることによって入手可能である。
本発明において腎ガン検出のための上記標的ポリペプチドまたは対応の核酸(転写産物等)はいずれも、腎ガン患者において、血液、腎組織などの生体試料中の該ポリペプチドまたは核酸(転写産物等)のレベルが、健常人と比べて腎ガンに罹患した被験者において有意にまたは格別に高いことによって特徴付けられる。
本発明の実施形態によれば、血液または腎組織中の該ポリペプチドまたは対応の核酸(転写産物等)はいずれも、健常人では認められず、腎ガン患者にのみ認められ特異的である。より具体的には、上記13種のポリペプチドのうち、配列番号1〜4、6、8〜12で表されるポリペプチドは、腎ガン摘出前に腎ガン患者の血液中に検出されたが、ガン摘出の約1ヵ月後の時点では検出されなかったことから、特に腎ガンマーカーとして特異性の高いものであると考えられる。また、腎ガン組織と正常組織での配列番号1〜6のポリペプチドに対応する遺伝子の発現レベルの比較により、腎ガン組織において有意に発現していることが示された。
したがって、被験者の生体試料中に上記腎ガンマーカーポリペプチドのいずれか1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3〜5つ以上、さらに好ましくは4〜13個が検出される場合、腎ガンであると判定することができる。
本発明のポリペプチドまたは核酸は、例えば当業界で慣用の技術である化学合成(ペプチド合成、DNA/RNA自動合成など)またはDNA組換え技術によって作製することができる。手順や精製の簡易さの点で、DNA組換え技術の使用が好ましい。
はじめに本発明のポリペプチドの部分配列をコードするポリヌクレオチド配列を、DNA自動合成装置を用いて化学的に合成する。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この方法によって約100塩基までの一本鎖DNAを自動合成することができる。DNA自動合成装置は、例えばPolygen社、Applied BioSystems社などから市販されている。
得られたポリヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして用いて、周知のcDNAクローニングによって、具体的には、標的である上記遺伝子が発現される腎組織などの生体組織から抽出した全RNAをオリゴdTセルロースカラムで処理して得られるポリA(+)RNAからRT−PCR法によってcDNAライブラリーを作製し、このライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニング、発現スクリーニング、抗体スクリーニングなどのスクリーニングによって、目的のcDNAクローンを得る。必要に応じて、cDNAクローンをさらにPCR法によって増幅することもできる。これによって目的の遺伝子に対応するcDNAを得ることができる。
プローブ又はプライマーは、配列番号1〜13に示されるポリペプチド配列に基づいて15〜100塩基の連続する配列の中から選択し、上記のようにして合成しうる。また、cDNAクローニング技術は、例えばSambrook,J.およびRussel,D. 著、Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001年1月15日発行、の 第1巻7.42〜7.45、第2巻8.9〜8.17に記載されている。
つぎに、上記のようにして得られたcDNAクローンを発現ベクターに組み込み、該ベクターによって形質転換又はトランスフェクションされた原核又は真核宿主細胞を培養することによって該細胞又は培養上清から、目的のポリペプチドを得ることができる。このとき、目的の成熟ポリペプチドをコードするDNAの5’末端に、分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をフランキングすることによって細胞外に成熟ポリペプチドを分泌させることができる。
ベクター及び発現系は、例えばNovagen社、宝酒造、第一化学薬品、Qiagen社、Stratagene社、Promega社、Roche Diagnositics社、Invitrogen社、Genetics Institute社、Amersham Bioscience社などから入手可能である。宿主細胞としては、細菌などの原核細胞(例えば大腸菌、枯草菌)、酵母(例えばサッカロマイセス・セレビシアエ)、昆虫細胞(例えばSf細胞)、哺乳動物細胞(例えばCOS、CHO、BHK、NIH3T3など)などを用いることができる。ベクターには、該ポリペプチドをコードするDNAの他に、調節エレメント、例えばプロモーター(例えばlacプロモーター、trpプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター、SV40ウイルスプロモーター、3−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、解糖系酵素プロモーターなど)、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよびリボソーム結合部位、複製開始点、ターミネーター、選択マーカー(例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子;LEU2、URA3などの栄養要求性マーカーなど)などを含むことができる。
また、ポリペプチドの精製を容易にするために、標識ペプチドをポリペプチドのC末端またはN末端に結合させた融合ポリペプチドの形態で発現産物生成させることもできる。代表的な標識ペプチドには、6〜10残基のヒスチジンリピート(Hisタグ)、FLAG、mycぺプチド、GFPポリペプチドなどが挙げられるが、標識ペプチドはこれらに限られるものではない。
標識ペプチドを付けずに本発明に係るポリペプチドを生産した場合には、その精製法として例えばイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。またこれに加えて、ゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法でもよい。一方、当該タンパクにヒスチジンリピート、FLAG、myc、GFPといった標識ペプチドを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれの標識ペプチドに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。単離・精製が容易となるような発現ベクターを構築するとよい。特にポリペプチドと標識ペプチドとの融合ポリペプチドの形態で発現するように発現ベクターを構築し、遺伝子工学的に当該ポリペプチドを調製すれば、単離・精製も容易である。
本発明に係る核酸の精製は、アガロースゲル電気泳動、DNA結合性樹脂カラムなどを使用した精製法によって行うことができる。また、自動核酸精製装置や核酸精製キットなどが市販されているので、これらを使用して、核酸精製を行うこともできる。
本発明における上記ポリペプチドの変異体は、上記定義のとおり、配列番号1〜13で表されるアミノ酸配列又はその部分配列おいて1以上、好ましくは1もしくは数個、のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは該アミノ酸配列又はその部分配列と約80%以上、約85%以上、好ましくは約90%以上、より好ましくは約95%以上、約97%以上、約98%以上、約99%以上の%同一性を示すアミノ酸配列を有する変異体である。このような変異体には、例えば、ヒトと異なる哺乳動物種のホモログ、同種の哺乳動物(例えば人種)間での多型性変異に基づく変異体などの天然変異体が含まれる。
また、上記ポリペプチド変異体をコードする核酸は、同様に、配列番号1〜13のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその部分配列において、1以上、好ましくは1もしくは数個、のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入を含む核酸、あるいは該ヌクレオチド配列又はその部分配列と約80%以上または約85%以上、好ましくは約90%以上または93%以上、より好ましくは約95%以上、約97%以上、約98%以上または約99%以上、の%同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸を包含する。
本発明における上記ポリペプチドの断片は、該ポリペプチドのアミノ酸の少なくとも7個から全数未満、少なくとも10個から全数未満、少なくとも15個から全数未満、好ましくは少なくとも20個から全数未満、少なくとも25個から全数未満、より好ましくは少なくとも35個から全数未満、少なくとも40個から全数未満、少なくとも50個から全数未満の連続するアミノ酸残基からなり、1個または複数のエピトープを保持する。このような断片は、本発明に関わる抗体またはその断片と免疫特異的に結合することができるものである。上記ポリペプチドが、例えば血液中に存在する場合には、そこに存在するプロテアーゼやぺプチダーゼなどの酵素によって切断され断片化されて存在することが想定される。
<腎ガンの診断または検出のための組成物>
本発明は、配列番号1〜13で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片と特異的に結合する、抗体もしくはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの1つまたは複数を含む、腎ガンの診断または検出のための組成物を提供する。
本発明は、配列番号1〜13で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片と特異的に結合する、抗体もしくはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの1つまたは複数を含む、腎ガンの診断または検出のための組成物を提供する。
腎ガンマーカーであるポリペプチドを認識する抗体は、抗体の抗原結合部位を介して、該ポリペプチドに特異的に結合し得るものである。本発明で使用しうる抗体は、配列番号1〜13のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変異体、またはその断片、あるいはその融合ポリペプチドを1または複数の免疫原として使用して慣用の技術によって作製することができる。これらのポリペプチド、断片、変異体または融合ポリペプチドは、抗体形成を引き出すエピトープを含むが、これらエピトープは、直鎖でもよいし、より高次構造(断続的)でもよい。なお、該エピトープは、当該技術分野に知られるあらゆるエピトープ解析法、例えばファージディスプレイ法、リバースイムノジェネティックス法など、によって同定できる。
本発明で使用しうる抗体は、いずれのタイプ、クラス、サブクラスも含まれるものとする。そのような抗体には、例えばIgG,IgE,IgM,IgD,IgA,IgY,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2などが含まれる。
さらにまた、本発明に係るポリペプチドによってあらゆる態様の抗体が誘導される。該ポリペプチドの全部もしくは一部またはエピトープが単離されていれば、慣用技術を用いてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも作製可能である。方法には例えば、Kennetら(監修),Monoclonal Antibodies,Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses,Ple num Press,New York,1980に挙げられた方法がある。
ポリクローナル抗体は、鳥類(例えば、ニワトリなど)、哺乳動物(例えば、ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ネズミなど)などの動物に本発明に係るポリペプチドを免疫することによって作製することができる。目的の抗体は、免疫された動物の血液から、硫安分画、イオン交換クロマとグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの手法を適宜組み合わせて精製することができる。
モノクローナル抗体は、各ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を、慣用技術によってマウスにおいて産生することを含む手法によって得ることができる。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための1つの方法は、動物を本発明に係るポリペプチドで免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用技術によって回収可能である。
モノクローナルおよびポリクローナル抗体の作製について以下に詳しく説明する。
A.モノクローナル抗体の作製
(1)免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られた免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス(例えば近交系マウスのBalb/c)、ウサギなどに投与する。免疫原の1回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物1匹当たり約50〜200μgとされる。免疫は主として皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは1〜4週間間隔で、2〜10回、好ましくは3〜4回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をELISA(Enzyme−Linked Immuno Sorbent Assay)法などにより繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原を静脈内または腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から2〜5日後、好ましくは3日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞または局所リンパ節細胞が好ましい。
(1)免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られた免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス(例えば近交系マウスのBalb/c)、ウサギなどに投与する。免疫原の1回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物1匹当たり約50〜200μgとされる。免疫は主として皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは1〜4週間間隔で、2〜10回、好ましくは3〜4回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をELISA(Enzyme−Linked Immuno Sorbent Assay)法などにより繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原を静脈内または腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から2〜5日後、好ましくは3日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞または局所リンパ節細胞が好ましい。
(2)細胞融合
各タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、慣用的技術によって産生し、そして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための1つの方法は、動物を本発明のポリペプチドで免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞株としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。骨髄腫細胞株の具体例としては、BALB/cマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ(HGPRT)欠損細胞株であるP3X63−Ag.8株(ATCC TIB9)などが挙げられる。
各タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、慣用的技術によって産生し、そして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための1つの方法は、動物を本発明のポリペプチドで免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞株としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。骨髄腫細胞株の具体例としては、BALB/cマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ(HGPRT)欠損細胞株であるP3X63−Ag.8株(ATCC TIB9)などが挙げられる。
次に、上記骨髄腫細胞株と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI−1640培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを約1:1〜 20:1の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1500〜4000ダルトンのポリエチレングリコール等を約10〜80%の濃度で使用することができる。また場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させることもできる。
(3)ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有RPMI−1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に200万個/ウエル程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、20〜40℃ 、好ましくは約37℃である。ミエローマ細胞がHGPRT欠損株またはチミジンキナーゼ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地(HAT培地)を用いることにより、抗体産生能を有する細胞と骨髄腫細胞株のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有RPMI−1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に200万個/ウエル程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、20〜40℃ 、好ましくは約37℃である。ミエローマ細胞がHGPRT欠損株またはチミジンキナーゼ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地(HAT培地)を用いることにより、抗体産生能を有する細胞と骨髄腫細胞株のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法(EIA:Enzyme Immuno Assay、及びELISA)、放射性免疫測定法(RIA:Radio Immuno Assay)等によって行うことができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。ハイブリドーマは、RPMI−1640、DMEM等の基本培地中での培養において安定であり、本発明のポリペプチド性ガンマーカーと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するものである。
(4)抗体の回収
モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。すなわち樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法または腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10% ウシ胎児血清含有RPMI−1640培地、MEM培地または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、5%CO2濃度)で2〜10日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約1000万個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1〜2週間後に腹水または血清を採取する。
モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。すなわち樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法または腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10% ウシ胎児血清含有RPMI−1640培地、MEM培地または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、5%CO2濃度)で2〜10日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約1000万個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1〜2週間後に腹水または血清を採取する。
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより、精製された本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
B.ポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様に動物を免疫し、最終の免疫日から6〜60日後に、酵素免疫測定法(EIA及びELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をELISA法などで測定する。
ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様に動物を免疫し、最終の免疫日から6〜60日後に、酵素免疫測定法(EIA及びELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をELISA法などで測定する。
また本発明においては、上記抗体の抗原結合断片も使用しうる。慣用的技術によって産生可能な抗原結合断片の例には、Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFvなどの断片が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子工学技術によって産生可能な抗体断片および誘導体もまた含まれる。そのような抗体には、例えば合成抗体、組換え抗体、多重特異性抗体(二重特異性抗体を含む)、単鎖抗体などが含まれる。
本発明の抗体は、in vitro及びin vivoのいずれにおいても、本発明において、ポリペプチドまたはその(ポリ)ペプチド断片の存在を検出するためのアッセイに使用可能である。アッセイにおける特異的検出を可能にするために、モノクローナル抗体の使用が好ましいが、ポリクローナル抗体であっても、精製ポリペプチドを結合したアフィニティーカラムに抗体を結合させることを含む、いわゆる吸収法によって、特異抗体を得ることができる。
したがって、本発明の組成物は、配列番号1〜13のポリペプチド、その変異体、またはその断片と特異的に結合可能な抗体またはその断片を少なくとも1つ含む、好ましくは複数種、例えば少なくとも2〜5、少なくとも3〜5または少なくとも4〜5、より好ましくは5〜全て(13)の種類を含むことができる。
好ましくは、本発明の組成物はキットの形態である。このようなキットにおいては、上記の各ポリペプチドに特異的に結合可能な抗体またはその断片を、それぞれ別個に、あるいは混合物として、収容する容器を含む。抗体またはその断片は、例えばポリスチレン製などのマルチウエルプレート、ラテックスビーズ、磁性ビーズなどの球状担体などの固相担体上に付着または結合させてもよい。
本発明で使用される抗体またはその断片には、必要に応じてラベル、例えば蛍光団、酵素、放射性同位元素などを結合させてもよいし、あるいは二次抗体にこのようなラベルを結合してもよい。
蛍光団には、例えばフレオロレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシルクロリドとその誘導体、ウンベリフェロンなどが含まれる。
酵素には、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが含まれる。
放射性同位元素には、例えばヨウ素(131I,125I,123I,121I)、リン(32P)、イオウ(35S)、金属類(例えば68Ga,67Ga,68Ge,54Mn,99Mo,99Tc,133Xeなど)などが含まれる。
その他のラベルには、例えばルミノールなどの発光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリンなどの生物発光物質などが含まれる。
また、必要に応じて、アビジン−ビオチン系またはストレプトアビジン−ビオチン系を利用することも可能であり、この場合、本発明の抗体またはその断片に例えばビオチンを結合することもできる。
本発明はまた、配列番号1〜13で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸と特異的に結合する、該核酸と相補的な核酸もしくはその少なくとも15ヌクレオチドの断片、またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの1つまたは複数を含む、腎ガンの診断または検出のための組成物を提供する。
上記の相補的な核酸またはその断片は、被験者からの生物試料中の腎ガンマーカーの存在又は量を測定し、これによって腎ガンを診断または検出するために使用される。配列番号1〜13で表わされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、NCBI、GenBankなどのデータバンクにアクセスすることによって容易に入手可能であり、例えば表1の遺伝子VIL2、ERO1L、BLVRB、NRG1、FBLN5のヌクレオチド配列はそれぞれ、NM_003379、BC012941、NM_000713、NM_004495、NM_006329として登録されている。入手可能なヌクレオチド配列に基づいて、腎ガンマーカーである核酸、その相補的核酸、およびそれらの核酸の少なくとも15ヌクレオチドの断片を、DNA組換え技術、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、DNA/RNA自動合成などの公知の技術および手法を用いて合成することができる(例えば、Sambrook,J.およびRussel,D. 著、Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001)。
上記相補的核酸は、プローブとして使用されるときには、配列番号1〜13のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の相補的配列において、例えば15ヌクレオチド以上から全数、30ヌクレオチド以上から全数、50ヌクレオチド以上から全数、100ヌクレオチド以上から全数、150ヌクレオチド以上から全数、200ヌクレオチド以上から全数、250ヌクレオチド以上から全数、300ヌクレオチド以上から全数、500ヌクレオチド以上から全数、などのヌクレオチド配列を有することができる。
また、上記核酸およびその相補的核酸は、プライマーとして使用されるときには、配列番号1〜13のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその相補的配列において、例えば15〜40ヌクレオチド、好ましくは19〜30ヌクレオチド、より好ましくは20〜25ヌクレオチドからなる配列を有することができる。
本発明の組成物はさらに、キットの形態をとってもよい。腎ガンマーカーを検出するための上記の抗体類または核酸類を個別に、または適宜混合して、個別の容器(例えばバイアルなど)に入れて包装することができる。
<腎ガンの検出>
本発明によれば、上記腎ガンマーカーと結合可能な物質を用いて、被験者由来の生体試料中の配列番号1〜13で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸、のうちの1つまたは複数について、その量または存在を調べることを含む方法によって、腎ガンを診断または検出することができる。本発明の方法によって腎ガンマーカーが検出されるか、又は対照と比べて遺伝子発現レベルが有意に高いと判定されるときには、被験者は腎ガンに罹患していると診断しうる。
本発明によれば、上記腎ガンマーカーと結合可能な物質を用いて、被験者由来の生体試料中の配列番号1〜13で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸、のうちの1つまたは複数について、その量または存在を調べることを含む方法によって、腎ガンを診断または検出することができる。本発明の方法によって腎ガンマーカーが検出されるか、又は対照と比べて遺伝子発現レベルが有意に高いと判定されるときには、被験者は腎ガンに罹患していると診断しうる。
本発明の方法では、上記腎ガンマーカーの検出は、単一のマーカーでもよいが、好ましくは複数、例えば2以上、3以上、4以上、5以上から10、11、12または13以下のマーカーについて行うのがよい。これは、予期せぬ非特異的複合体の検出、言い換えれば誤診、を回避するためである。
本発明の上記組成物は、腎ガンの診断、判定又は検出、すなわち罹患の有無や罹患の程度の診断、のために有用である。腎ガンの診断においては、正常組織、正常体液などの陰性対照との比較を行い、被験者の生体試料中の上記腎ガンマーカーの存在または量を検出し、その存在または量の差が有意であれば、被験者について腎ガンの罹患が疑われる。
本発明方法で用いられる検体試料としては、例えば腎組織、その周辺組織、腎細胞、あるいは体液、例えば血液、血清、血漿、尿などである。被験者の生体組織は、バイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって得ることができる。
本発明において、被験者とは、ヒトを含む哺乳動物、好ましくはヒトである。
上記腎ガンマーカーと結合可能な物質は、例えば上記抗体またはその断片、アプタマー、Affibody(Affibody社商標)、それぞれの腎ガンマーカーの受容体、それぞれの腎ガンマーカーの特異的作用阻害物質、それぞれの腎ガンマーカーの特異的作用活性化物質などを含み、好ましくは抗体もしくはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体である。
本発明の実施形態において、測定は、慣用の酵素又は蛍光団で必要により標識した抗体又は断片と、組織切片又はホモゲナイズした組織または体液とを接触させる工程、抗原−抗体複合体を定性的に又は定量的に測定する工程を含むことができる。検出は、例えば免疫電顕により標的ポリペプチドの存在とレベルを測定する方法、酵素抗体法(例えばELISA)、蛍光抗体法、放射性免疫測定法、均一法、不均一法、固相法、サンドイッチ法などの慣用法によって標的ポリペプチドの存在またはレベルを測定する方法などによって行うことができる。体液または腎ガン組織もしくは細胞、好ましくは血液、において、標的ポリペプチドが存在する場合、あるいは陰性対照と比較して標的ポリペプチドのレベルが有意に増大または高い場合、腎ガンであると決定する。ここで、「有意に」とは、統計学的に有意であることを意味する。
免疫学的方法に代わる測定方法として、質量分析法を用いる方法が含まれる。この方法は、具体的には実施例1に記載される手法で行うことができる。すなわち、生物試料、例えば血清または血漿をフィルターでろ過して夾雑物を除き、緩衝液(例えばpH約8)で希釈して約10mg/ml〜約15mg/mlの濃度に調整したのち、タンパク質を除去可能なフィルター(例えば、分子量5万以上のタンパク質を除去可能な中空糸フィルター;下記参考例1)または遠心型平膜フィルター等を通して分子量分画し、画分をプロテアーゼ(例えばトリプシン)で処理してペプチド化し、さらにペプチドを分画し、これを質量分析計(マトリックス支援レーザー脱離イオン化法またはエレクトロスプレーイオン化法を利用したタイプ)に掛けて、目的のポリペプチド由来の特定ピークの質量/荷電数と強度に基づいて、抗体医薬の投与前後における試料中のポリペプチドの存在量の差異を測定することができる。
腎ガンマーカーと結合可能な別の好ましい物質は、配列番号1〜13で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸と特異的に結合する、該核酸と相補的な核酸もしくはその少なくとも15ヌクレオチドの断片、またはそれらの化学修飾誘導体である。
腎ガンマーカーである核酸の検出のために、例えばハイブリダイゼーション法または定量RT−PCR法を使用することができる。
ハイブリダイゼーション法には、例えばノーザンブロット法、サザンブロット法、DNAチップ解析法、in situハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などを使用することができる。
ノーザンブロット法を使用する場合は、本発明の組成物をプローブとして用いることによって、RNA中の各遺伝子発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の組成物(相補鎖)を放射性同位元素(32P、33P、35Sなど)や蛍光物質などで標識し、それを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーした被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせたのち、形成された診断用組成物(DNA)とRNAとの二重鎖を診断用組成物の標識物(放射性同位元素又は蛍光物質)に由来するシグナルを放射線検出器(例えば、BAS-1800II、富士写真フィルム株式会社)又は蛍光検出器(例えば、STORM860、Amersham Bioscience社)で検出、測定する方法を例示することができる。
DNAアレイ解析を利用する場合は、本発明の組成物の相補的核酸またはその断片の複数、好ましくは全数、をDNAプローブ(一本鎖又は二本鎖)として基板に貼り付けたDNAチップまたはDNAマイクロアレイを用いる。
定量RT―PCRを含む定量PCR法を使用する場合には、本発明の組成物をプライマーとして用いることによって、RNA中の遺伝子発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被検者の生体組織由来のRNAから常法にしたがってcDNAを調製して、これを鋳型として標的の各遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の組成物から調製した1対のプライマー(上記cDNAに結合する正鎖と逆鎖からなる)をcDNAとハイブリダイズさせて常法によりPCR法を行い、得られた二本鎖DNAを検出する方法を例示することができる。なお、二本鎖DNAの検出法としては、上記PCRをあらかじめ放射性同位元素又は蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行う方法、PCR産物をアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドなどで二本鎖DNAを染色して検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーさせて標識した診断用組成物をプローブとしてこれとハイブリダイズさせて検出することを含む方法をとることができる。
ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションが好ましく、限定されないが、例えば30℃〜50℃で、3〜4×SSC、0.1〜0.5% SDS中で1〜24時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは40℃〜45℃で、3.4×SSC、0.3%SDS中で1〜24時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、2×SSCと0.1%SDSを含む溶液、及び1×SSC溶液、0.2×SSC溶液による室温での連続した洗浄などの条件を挙げることができる。ここで、1×SSCは、150mM塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸ナトリウムを含む水溶液(pH7.2)である。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが望ましい。
ハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばSambrook, J. & Russel, D. 著、Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001に記載されている。
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明の範囲は、この実施例によって制限されないものとする。
参考例1:中空糸フィルターの作製
分画分子量約5万の孔径を膜表面に有するポリスルホン中空糸を100本束ね、中空糸中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管に固定し、ミニモジュールを作成した。該ミニモジュール(モジュールA)は血清または血漿中の高分子量タンパク質の除去に用いられ、その直径は約7mm、長さは約17cmである。同様に低分子量タンパク質の濃縮に用いられるミニモジュール(モジュールB)を分画分子量約3千の孔径の膜を用いて作成した。ミニモジュールは片端に中空糸内腔に連結する入口があり、反対側の端は出口となる。中空糸入口と出口はシリコンチューブによる閉鎖循環系流路であり、この流路内を液体がペリスタルティック方式ポンプに駆動されて循環する。また、中空糸外套のガラス管には、中空糸から漏出してきた液体を排出するポートを備え、1つのモジュールセットが構成される。流路途中にT字のコネクターによって、モジュールを連結し、モジュールA3本と、モジュールB1本をタンデムに連結してひとつの中空糸フィルターとした。この中空糸フィルターを蒸留水にて洗浄し、PBS(0.15mM NaClを含むリン酸緩衝液、pH7.4)水溶液を充填した。分画原料の血清または血漿は該中空糸フィルターの流路入口から注入され、分画・濃縮後に流路出口から排出される。該中空糸フィルターに注入された血清または血漿は、モジュールA毎に分子量約5万で分子篩いがかかり、分子量5万よりも低分子の成分はモジュールBで濃縮され、調製されるようになっている。
分画分子量約5万の孔径を膜表面に有するポリスルホン中空糸を100本束ね、中空糸中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管に固定し、ミニモジュールを作成した。該ミニモジュール(モジュールA)は血清または血漿中の高分子量タンパク質の除去に用いられ、その直径は約7mm、長さは約17cmである。同様に低分子量タンパク質の濃縮に用いられるミニモジュール(モジュールB)を分画分子量約3千の孔径の膜を用いて作成した。ミニモジュールは片端に中空糸内腔に連結する入口があり、反対側の端は出口となる。中空糸入口と出口はシリコンチューブによる閉鎖循環系流路であり、この流路内を液体がペリスタルティック方式ポンプに駆動されて循環する。また、中空糸外套のガラス管には、中空糸から漏出してきた液体を排出するポートを備え、1つのモジュールセットが構成される。流路途中にT字のコネクターによって、モジュールを連結し、モジュールA3本と、モジュールB1本をタンデムに連結してひとつの中空糸フィルターとした。この中空糸フィルターを蒸留水にて洗浄し、PBS(0.15mM NaClを含むリン酸緩衝液、pH7.4)水溶液を充填した。分画原料の血清または血漿は該中空糸フィルターの流路入口から注入され、分画・濃縮後に流路出口から排出される。該中空糸フィルターに注入された血清または血漿は、モジュールA毎に分子量約5万で分子篩いがかかり、分子量5万よりも低分子の成分はモジュールBで濃縮され、調製されるようになっている。
実施例1:健常人および腎ガン患者血漿のタンパク質同定
50〜70歳代の腎ガン患者7名から腎ガン摘出手術前、および腎ガン摘出手術1ヶ月後の健常状態で血液を採取し、さらに同年代の健常人8名から得た血液を用いて、EDTA添加の血漿成分をそれぞれ調製した。
50〜70歳代の腎ガン患者7名から腎ガン摘出手術前、および腎ガン摘出手術1ヶ月後の健常状態で血液を採取し、さらに同年代の健常人8名から得た血液を用いて、EDTA添加の血漿成分をそれぞれ調製した。
血漿をポアサイズ0.22μmのフィルターでろ過して夾雑物質を取り除き、タンパク質濃度50mg/mLとなるように調整した。この血漿をさらに25mM重炭酸アンモニウム溶液(pH8.0)12.5mg/mLに希釈し、中空糸フィルター(参考例1)によって分子量分画を行った。分画後の血漿サンプル(全量1.8mL、最大250μgのタンパク質を含む)をProteomeLab(登録商標)PF2D System(Beckman Coulter社)逆相クロマトグラフィーで7分画に分離し、凍結乾燥後、100μLの25mM重炭酸アンモニウム溶液(pH8.0)に再溶解した。このサンプルをタンパク質の50分の1量のトリプシンで37℃、2〜3時間消化し、ペプチド化した。各分画のペプチドをさらにイオン交換カラム(KYAテクノロジーズ)によって4分画化した。
その各々の分画を、逆相カラム(KYAテクノロジーズ)でさらに分画し、溶出されてきたペプチドについて、オンラインで連結された質量分析計Q−TOF Ultima(Micromass社)を用いて、サーベイスキャンモードで測定した。その測定データを、タンパク質同定ソフトウェアであるMASCOT(Matrix Science)を用いて解析することにより、網羅的にタンパク質同定を行った。MASCOTの信頼性スコアをMudPITモードでオート表示させ、スコア34以上を示すタンパク質が高い信頼性で同定された。解析の結果、腎ガン摘出前、摘出後、健常人、いずれの血漿成分からも、約200種類のタンパク質が同定された。
実施例2:腎ガン患者の腎ガン摘出手術前および健常人の血漿のタンパク質発現比較
上記実施例1で同定された血漿タンパク質について、腎ガン摘出手術前と健常人の間で比較を行った。その結果、MASCOTの解析(スコア34以上を有意)から、健常人と比べ腎ガン摘出手術前の患者血漿中で、その発現が増強するタンパク質を見いだした。これらのタンパク質は、上記表1に示した配列番号1〜13で表されるポリペプチドであり
、故に腎ガンマーカーとして腎ガンの検出において有用であることが判明した。
上記実施例1で同定された血漿タンパク質について、腎ガン摘出手術前と健常人の間で比較を行った。その結果、MASCOTの解析(スコア34以上を有意)から、健常人と比べ腎ガン摘出手術前の患者血漿中で、その発現が増強するタンパク質を見いだした。これらのタンパク質は、上記表1に示した配列番号1〜13で表されるポリペプチドであり
、故に腎ガンマーカーとして腎ガンの検出において有用であることが判明した。
表2にガン摘出前の腎ガン患者7名、および健常人8名の血漿中での発現頻度を示した。上記タンパク質は健常人では検出されず、ガン摘出前の腎ガン患者において少なくとも1名で検出されている。したがって、上記のポリペプチドの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも3〜5つ、を、例えばその特異抗体を用いて、該ポリペプチドの存在または量について、測定することによって、腎ガンを検出することができる。
実施例3:腎ガン患者の腎ガン摘出手術前および腎ガン摘出手術後の血漿のタンパク質発現比較
上記実施例1で同定された血漿タンパク質について、腎ガン摘出手術前および手術後間で比較を行った。その結果、MASCOTの解析から、腎ガン摘出手術前と比べ手術後の患者血漿中で、その発現が有意に減少するタンパク質を見いだした。これらのタンパク質は、上記表1に示した配列番号1〜4、6、8〜12で表されるポリペプチドであり、故に腎ガンマーカーとして腎ガンの検出および術後経過の診断において有用であることが判明した。また、表2にガン摘出前(「腎前」)、およびガン摘出後(「腎後」)の腎ガン患者7名から取得した血漿中での上記タンパク質の発現頻度を示した。上記タンパク質はガン摘出後の腎ガン患者では検出されず、ガン摘出前の腎ガン患者において少なくとも1名で検出されている。また、ガン摘出前に複数の患者で検出されたタンパク質は、配列番号2、6および12で表されるタンパク質であった。
上記実施例1で同定された血漿タンパク質について、腎ガン摘出手術前および手術後間で比較を行った。その結果、MASCOTの解析から、腎ガン摘出手術前と比べ手術後の患者血漿中で、その発現が有意に減少するタンパク質を見いだした。これらのタンパク質は、上記表1に示した配列番号1〜4、6、8〜12で表されるポリペプチドであり、故に腎ガンマーカーとして腎ガンの検出および術後経過の診断において有用であることが判明した。また、表2にガン摘出前(「腎前」)、およびガン摘出後(「腎後」)の腎ガン患者7名から取得した血漿中での上記タンパク質の発現頻度を示した。上記タンパク質はガン摘出後の腎ガン患者では検出されず、ガン摘出前の腎ガン患者において少なくとも1名で検出されている。また、ガン摘出前に複数の患者で検出されたタンパク質は、配列番号2、6および12で表されるタンパク質であった。
したがって、上記のポリペプチド1〜4、6、8〜12のうち、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも3〜5つを、例えばその特異抗体を用いて、該ポリペプチドの存在または量について、測定することによって、腎ガンの検出、術後経過を診断することができる。
実施例4:オリゴDNAマイクロアレイによる腎ガン患者の腎ガン組織および正常腎組織における遺伝子発現比較
上記実施例1で同定された血漿タンパク質について、腎ガン患者の腎ガン組織および正常腎組織での遺伝子の発現をオリゴDNAマイクロアレイを用いて検討した。
上記実施例1で同定された血漿タンパク質について、腎ガン患者の腎ガン組織および正常腎組織での遺伝子の発現をオリゴDNAマイクロアレイを用いて検討した。
1)実験者の臨床病理学的所見
インフォームドコンセントを得た31名の腎ガン患者から、腎ガン摘出手術時に組織を得た。摘出された組織片について肉眼的および/または病理組織学的に腎ガン組織または正常腎組織であることを判断してただちに凍結し、液体窒素中で保存した。
インフォームドコンセントを得た31名の腎ガン患者から、腎ガン摘出手術時に組織を得た。摘出された組織片について肉眼的および/または病理組織学的に腎ガン組織または正常腎組織であることを判断してただちに凍結し、液体窒素中で保存した。
2)totalRNA抽出とcDNAの調製
試料として腎ガン患者の腎組織における腎ガン病変部組織および正常腎の組織を用いた。それぞれの組織から、Trizol reagent(Invitrogen社)を用いて、同社推奨のプロトコールによりtotalRNAを調製した。
試料として腎ガン患者の腎組織における腎ガン病変部組織および正常腎の組織を用いた。それぞれの組織から、Trizol reagent(Invitrogen社)を用いて、同社推奨のプロトコールによりtotalRNAを調製した。
上述の方法で得られたtotalRNA 1μgについて、oligo(dT)プライマーおよびランダムノナマーを併用し、CyScribe First-Strand cDNA Labeling Kit(GEヘルスケア社)を用いてメーカー推奨のプロトコールで逆転写反応を行った。腎ガン組織または正常腎組織由来のtotalRNAにはCy3−dUTP(GEヘルスケア社)を、リファレンスtotalRNA(Stratagene社)にはCy5−dUTP(GEヘルスケア社)を添加して、メーカー推奨のプロトコールで逆転写反応時にcDNAの標識を行った。標識されたcDNAはQIA quick PCR purification Kit(QIAGEN社)で精製してからハイブリダイズに用いた。
3)オリゴDNAマイクロアレイの作製
オリゴDNAマイクロアレイとしてはAffymetrix社GeneChipTM(Human Genome U133 A)および以下に述べる方法に従って作製したDNAチップを使用した。
オリゴDNAマイクロアレイとしてはAffymetrix社GeneChipTM(Human Genome U133 A)および以下に述べる方法に従って作製したDNAチップを使用した。
DNAチップの作製方法を以下に示す。最初に搭載するオリゴDNAの種類を決定するために、Affymetrix社GeneChipTMを用いて遺伝子の絞込みを行った。GeneChipTMの操作については、Complete GeneChipTM Instrument Systemなどの同社の定める手順に基づいて実施した。Complete GeneChipTMを用いた解析の結果、腎ガンによって発現変動が起こる可能性がある遺伝子および実験対照となりうる遺伝子を計8961種抽出した。
抽出した8961種の遺伝子について、配列の重複をおこさないように配列特異性が高い部位の配列60〜70残基をそれぞれ選択して合成した。4倍に希釈したSolution I(タカラバイオ社)に30μMとなるように溶解した、配列番号14〜19のオリゴDNAを含む、8961種の60または70merからなる合成オリゴDNAを、MATSUNAMI・DNAマイクロアレイ用コートグラスDMSO対応 TypeIアミノ修飾オリゴDNA固定コート(松浪硝子工業株式会社)上にスポッター(GMS417arrayer,Affymetrix社)を用いて湿度環境50〜60%でスポットした。
4)ハイブリダイゼーション
標識したcDNA 1μgをアンチセンスオリゴカクテル(QIAGEN)に溶解し、Gapカバーグラス(松浪硝子工業)を載せたDNAチップにアプライし、42℃で16時間ハイブリダイズを行った。ハイブリダイズ終了後、DNAチップを2×SSC/0.1%SDS、1×SSC、0.2×SSCで順次洗浄した。
標識したcDNA 1μgをアンチセンスオリゴカクテル(QIAGEN)に溶解し、Gapカバーグラス(松浪硝子工業)を載せたDNAチップにアプライし、42℃で16時間ハイブリダイズを行った。ハイブリダイズ終了後、DNAチップを2×SSC/0.1%SDS、1×SSC、0.2×SSCで順次洗浄した。
5)遺伝子発現量の測定
上述の方法によりハイブリダイゼーションを行ったDNAチップをAgilentマイクロアレイスキャナー(Agilent社)を用いてスキャンし、画像を取得して蛍光強度を数値化した。統計学的処理はSpeed T.著「Statistical analysis of gene expression microarray data」Chapman & Hall/CRC,およびCauston H.C.ら著「A beginner’s guide Microarray gene expression data analysis」Blackwell publishingを参考にして行った。すなわちハイブリダイズ後の画像解析から得られたデータについて、それぞれの対数値をとり、global normalizationをとLOWESS(locally weighted scatterplot smoother)による平滑化を行い、MAD によるスケーリング処理によって数値補正を行った。腎ガン組織由来の検体と正常腎組織由来の検体から取得したデータを用いてスチューデントt検定を行い、正常腎組織と比べ腎ガン組織で有意な発現上昇(p<0.05)を示す遺伝子を見出した。これらは表3に示した配列番号1〜6で表されるタンパク質をコードする遺伝子であり、腎ガンの検出に有効である。また、配列番号7〜13で表わされるポリペプチドをコードする遺伝子についても、同様に、腎ガン組織で有意に発現されていることが予想される。
上述の方法によりハイブリダイゼーションを行ったDNAチップをAgilentマイクロアレイスキャナー(Agilent社)を用いてスキャンし、画像を取得して蛍光強度を数値化した。統計学的処理はSpeed T.著「Statistical analysis of gene expression microarray data」Chapman & Hall/CRC,およびCauston H.C.ら著「A beginner’s guide Microarray gene expression data analysis」Blackwell publishingを参考にして行った。すなわちハイブリダイズ後の画像解析から得られたデータについて、それぞれの対数値をとり、global normalizationをとLOWESS(locally weighted scatterplot smoother)による平滑化を行い、MAD によるスケーリング処理によって数値補正を行った。腎ガン組織由来の検体と正常腎組織由来の検体から取得したデータを用いてスチューデントt検定を行い、正常腎組織と比べ腎ガン組織で有意な発現上昇(p<0.05)を示す遺伝子を見出した。これらは表3に示した配列番号1〜6で表されるタンパク質をコードする遺伝子であり、腎ガンの検出に有効である。また、配列番号7〜13で表わされるポリペプチドをコードする遺伝子についても、同様に、腎ガン組織で有意に発現されていることが予想される。
本発明により、特異性、感受性に優れた腎ガン診断用組成物を提供することができるため、特に製薬および医薬産業上有用である。
Claims (22)
- 被験者由来の生体試料中の配列番号1〜13で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸、のいずれか1つまたは複数を測定することを含む、腎ガンをインビトロで検出する方法。
- 前記ポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは前記核酸、の量またはその存在を測定する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは前記核酸、の量が、対照試料のものと比べて有意に増大していることを指標にする、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の測定が免疫学的方法によるものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸の測定がハイブリダイゼーション法または定量ポリメラーゼ連鎖反応法によるものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記測定が、前記ポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは前記核酸、と結合可能な物質を用いて行われる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合可能な物質が抗体またはその断片である、請求項6に記載の方法。
- 前記抗体が標識されている、請求項6に記載の方法。
- 前記結合可能な物質が前記核酸、その相補的な核酸、またはその少なくとも15ヌクレオチドの断片である、請求項6に記載の方法。
- 前記核酸、その相補的な核酸またはその断片が標識されている、請求項9に記載の方法。
- 前記ポリペプチド、その変異体またはその断片と特異的に結合する抗体またはその断片を用いて、前記試料中の該ポリペプチド、その変異体またはその断片のうちの1つまたは複数の量または存在を免疫学的に測定し、該ポリペプチド、その変異体またはその断片の量が対照試料のものと比べて増大していることを指標にするか、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片の存在を指標にして腎ガンを検出することを含む、請求項1〜4、6〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリペプチド、その変異体もしくはその断片をコードする核酸またはその相補的な核酸と特異的に結合する該核酸、その相補的な核酸またはその断片を用いて、前記試料中の該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸のうちの1つまたは複数の量または存在をハイブリダイゼーション法または定量ポリメラーゼ連鎖反応法によって測定し、該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸の量が対照試料のものと比べて増大していることを指標にするか、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸の存在を指標にして腎ガンを検出することを含む、請求項1〜3、5、6、9〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸がDNA、RNA、mRNA、cDNAまたはcRNAである、請求項1〜3、5、6、9〜10、12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が血液、血漿、血清または尿である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が腎由来の組織または細胞である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項7、8または11に記載の方法。
- 配列番号1〜13で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片と特異的に結合する、抗体もしくはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの1つまたは複数を含む、腎ガンの診断または検出のための組成物。
- 前記ポリペプチドまたは変異体の断片が、少なくとも7個のアミノ酸からなるエピトープを含む断片である、請求項17に記載の組成物。
- 配列番号1〜13で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸またはその相補的核酸と特異的に結合する、該核酸、その相補的な核酸もしくはその少なくとも15ヌクレオチドの断片、またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの1つまたは複数を含む、腎ガンの診断または検出のための組成物。
- 前記ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸、その相補的な核酸またはその断片がプローブまたプライマーである、請求項19に記載の組成物。
- キットの形態である、請求項17〜20のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項17〜20のいずれか1項に記載の組成物の、被験者における腎ガンのインビトロ検出のための使用方法。
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