CN110656169A

CN110656169A - 心房颤动的诊断标志物

Info

Publication number: CN110656169A
Application number: CN201911071340.2A
Authority: CN
Inventors: 曹月娟; 李荣庆; 张凤萍; 崔丽; 张建艳; 郭兆增; 妥少勇
Original assignee: Tianjin People Hospital
Current assignee: Tianjin People Hospital
Priority date: 2019-11-05
Filing date: 2019-11-05
Publication date: 2020-01-07
Anticipated expiration: 2039-11-05
Also published as: CN110656169B

Abstract

本发明公开了心房颤动的诊断标志物。本发明利用QPCR实验证明GRP基因在正常人和心房颤动患者血液中的表达存在差异，因此认为GRP是诊断心房颤动的分子标志物。ROC曲线显示GRP判别心房颤动患者的AUC值是0.915，故认为本发明的分子标志物具有高的临床诊断价值。

Description

心房颤动的诊断标志物

技术领域

本发明涉及心房颤动诊断、预测预后领域，更具体地，本发明涉及以检测 GRP异常为手段的心房颤动诊断、预测预后方法。

背景技术

随着经济和社会的发展，心血管疾病尤其是冠状动脉粥样硬化性心脏病 (心房颤动；Coronary Artery Disease；CAD)的发病率正在逐年上升。对于发达国家，还有大多数的发展中国家来讲，CAD已经成为成年人发病和死亡的主要原因。近年来，对于CAD的流行趋势以及越来越严峻的不良预后的现状，各国卫生组织均给予了高度的关注。近年来对心房颤动的诊断方法和治疗措施有了重大的突破，尤其是近年来抗血小板药物、抗凝药物、溶栓药物的更新换代，以及经皮冠状动脉介入治疗(PCI)措施的日益普及，使大多数的心房颤动患者的临床结局发生了巨大改善。但是，目前心房颤动的病因学研究以及对其发病机制的研究尚待提高和突破。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过检测GRP基因或蛋白表达差异来诊断心房颤动的方法。

本发明的目的之二在于提供一种通过检测GRP基因或蛋白表达差异来预测心房颤动预后的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测GRP基因或GRP蛋白的产品在制备心房颤动诊断工具中的用途。

本发明还提供了检测GRP基因或GRP蛋白的产品在制备预测心房颤动预后工具中的用途。

进一步，所述检测GRP基因或GRP蛋白的产品包括检测GRP基因或GRP 蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合GRP基因的核酸或者能够结合 GRP蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测GRP基因的表达水平；所述物质能够检测GRP蛋白的表达水平。

本发明的检测GRP基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、 DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。

进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套 PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR 法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、 PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和 PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。

上面所述的核酸包括扩增GRP基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。

上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

本发明的检测GRP蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。

本发明的检测GRP蛋白的产品包括特异性结合GRP蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测GRP蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。

抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的 GRP蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对GRP蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用 DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒 -NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2， B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、 HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒 -NH2(DojindoLaboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、AlexaFluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

在本发明中，“预后”是指心房颤动患者在通过手术处理等抑制或缓解心房颤动后的过程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理抑制或缓解心房颤动后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查生物标志物即GRP蛋白或编码GRP蛋白的基因来预测。预后预测可以这样进行：根据生物标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。

在本发明中，“预后良好”是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解心房颤动之后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。

在本发明中，“预后不良”是指患者在通过手术处理等抑制或缓解心房颤动后的短时期(例如1、2、3、4、5年或更短)内发生致命状况。

预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中GRP基因或GRP蛋白的水平升高或降低的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。

进一步，所述检测GRP基因或GRP蛋白的产品可以是检测GRP基因或GRP 蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

利用前面所述的检测产品检测受试者样本中的GRP基因或GRP蛋白的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的GRP基因或GRP蛋白的表达水平降低，则诊断该受试者为心房颤动患者或该受试者的预后差。

作为依照本发明的检测产品的样本，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。

在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。

本发明还提供了一种诊断心房颤动的工具，所述工具能够检测受试者样本中 GRP基因或GRP蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合GRP基因的核酸或者能够结合GRP蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测GRP基因的表达水平；所述物质能够检测GRP蛋白的表达水平。

进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。

进一步，所述诊断心房颤动的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断心房颤动的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知GRP基因的异常与心房颤动相关也属于GRP基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种预测心房颤动预后的工具，所述工具能够检测受试者样本中GRP基因或GRP蛋白的表达水平，所述预测心房颤动预后工具包括能够结合GRP基因的核酸或者能够结合GRP蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测GRP基因的mRNA水平；所述物质能够检测GRP蛋白的表达水平。

进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。

进一步，所述预测心房颤动预后的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断心房颤动的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知GRP基因的异常与心房颤动相关也属于GRP基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗GRP抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合GRP即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能够识别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制GRP功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少一个，更优选至少三个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或IgY。

本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗GRP抗体的其他性质同前面所述。

进一步，所述受试者样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。

本发明还提供了一种诊断心房颤动或预测心房颤动预后的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取心房颤动受试者的样品；

(2)检测受试者样品中GRP基因或蛋白的表达水平；

(3)将测得的GRP基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与对照相比，GRP基因或蛋白的表达水平降低，则该受试者被诊断为心房颤动，或该受试者被确定为预后不良。

在本发明的上下文中，“诊断心房颤动”既包括判断受试者是否已经患有心房颤动、也包括判断受试者是否存在患有心房颤动的风险。

本发明的优点和有益效果：

本发明的发现了一种诊断心房颤动的分子标志物，使用该分子标志物可以在心房颤动发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。

另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方案策略。

附图说明

图1显示利用QPCR检测GRP基因在心房颤动患者与正常人中的表达情况；

图2显示评估GRP基因判别能力的ROC曲线。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例 GRP基因在房颤患者中差异表达

1、研究对象

病例组样本来源：选取医院行房颤射频消融术患者35例。

对照组样本来源：来自体检中心体检健康志愿者35例。

2、纳入标准

病例组纳入标准：

(1)经过体表心电图或动态心电图检查后确诊为房颤；

(2)发病为非家族性分布；

病例组排除标准：

年龄>80岁，甲状腺功能亢进，糖尿病，血压控制不良(>140和/或>90mmHg，左室功能减低(EF<50％)，严重冠状动脉疾病，肝、肾功能障碍(根据血肌酐水平计算GFR<90m1/min.1.73m²，急、慢性感染疾病，心肌结构性病变。

对照组纳入标准：行体表心电图或动态心电图检查未发现房颤。

3、标本收集

35例房颤患者各于术前取外周血2m1，35例正常对照取外周血2m1分别置于EDTA抗凝管中。

4、Trizol法提取血标本RNA

试剂：白细胞分离液(Cat#:WBC-NH4CL2009，天津灏洋)；细胞洗涤液(Cat#:2010X1118，天津灏洋)；红细胞裂解液(Cat#:WBC-1077，天津灏洋)；TRIzol Reagent(Invitrogen)。

步骤：

(1)提取白细胞：将上述血标本于2小时内加8m1红细胞裂解液混匀，4℃ 放置10分钟，其间振荡数次，2000g离心5分钟，倒掉液体，重复1-2次后收集沉淀的白细胞。

(2)加入2m1 Trizol使沉淀溶解，室温放置5min。加入0.4mL氯仿，充分振荡15s后室温放置2-3min。12000g离心20min。

(3)小心吸出上层水相，加入1mL异丙醇，室温放置l0min,12000g离心 10min。

(4)弃上清，加入2mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，混合后7500g离心5min。

(5)弃上清，风干10min，以DEPC处理的无酶水溶解RNA，-80℃保存。

(6)紫外分光光度计测定RNA的浓度：将紫外分光光度计调至RNA界面，先用100μlDEPC处理的无酶水调零，再加2μl待测RNA，98μl DEPC处理的无酶水，稀释倍数为1:49，检测，记下浓度值、A260，A280，A320，A260/A280，选用A260/A280:1.8-2.0样本纯度好者。若<1.8提示有蛋白质污染，若>2.0提示有DNA污染，需重新提取样本。

5、逆转录和实时定量PCR

(1)试剂：逆转录试剂盒PrimeScript^TM RT master mix(Takara,RR036Q)；荧光定量PCR试剂盒SYBR green^TMpremix Ex Taq(Takara,RR420Q)。

(2)方法：

扩增使用TRIzol提取样品总RNA：mRNA用随机引物反转录成cDNA； miRNA的3’末端多聚A尾Poly(A)，再使用Anchored oligo(dT)-universal tag 通过逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA对应的cDNA第一链；根据基因序列设计特异性引物，通过实时荧光定量PCR，采用SYBR GREEN染料法，以GAPDH为内参基因，做目标基因的相对定量检测。GRP基因上游引物序列为：5’-AGTCTTCTTCTGTTTCTG-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物序列为： 5’-TTCTCCTTTGCTTCTATG-3’(SEQ ID NO.2)；GAPDH基因上游引物序列为：5’-TAAGGAGACAAGCGAACC-3’(SEQ ID NO.3)，下游引物序列为： 5’-TGAGGAAATGTACCACCC-3’(SEQ ID NO.4)。

PCR反应体系的配制(总体积20μl)：SYBR green ^TMpremix Ex Taq 10μl，上游引物(10μM)0.4μl，下游引物(10μM)0.4μl，模板cDNA2μl，加ddH₂O 至20μl。PCR反应条件：采取在95℃温度下预变性10分钟，继续95℃温度下变性10秒钟后，在60℃温度下退火10s，最后在72℃温度下延伸20秒钟。扩增共完成40个循环的反应程序，在每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应机器为Roche480荧光定量PCR仪，瑞士Roche Roche480每个样本设置3个复孔，保证复孔之间CT值差小于0.5。

(3)实验数据处理

为了便于对所检测样本进行比较,在实时定量PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的阈值,一般这个阈值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。如果检测到荧光信号超过阈值被认为是真正的信号,它可用来定义样本的阈值循环数(threshold cycles,Ct)。每个模板的Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数存在线性反比关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。每个标本重复3次，Ct值取平均值，ΔCt值＝目标基因Ct值-内参基因Ct值，以GAPDH 为对照；ΔΔCt值＝房颤患者目标基因的ΔCt值-正常对照目标基因的ΔCt值，以正常人为对照。以正常对照的目标基因表达量为1,2^-ΔΔCt值即为房颤患者相对正常对照目标基因表达的倍数。

(4)统计分析方法

所有实验数据使用EpiData 3.0软件建立数据库。运用SPSS 16.0软件进行统计分析,房颤患者与正常对照目标基因表达水平的差异分析采用Wilcoxon符号秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义。

6、结果

结果显示，与正常对照相比，房颤患者血液中GRP基因表达水平显著下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。利用ROC工作曲线评估GRP基因的判别能力时发现，GRP基因AUC值为0.915，提示GRP基因有很好的临床价值，将有助于心房颤动的诊断。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 天津市人民医院

<120> 心房颤动的诊断标志物

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtcttcttc tgtttctg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttctcctttg cttctatg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taaggagaca agcgaacc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgaggaaatg taccaccc 18

Claims

1.检测GRP基因或GRP蛋白的产品在制备诊断心房颤动或预测心房颤动预后的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测GRP基因或GRP蛋白的产品包括检测GRP基因或GRP蛋白的表达水平的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用所述产品检测受试者样本中的GRP基因或GRP蛋白的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的GRP基因或GRP蛋白的表达水平降低，则诊断该受试者为心房颤动患者或该受试者的预后差。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受试者样本的来源是血液。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合GRP基因的核酸或者能够结合GRP蛋白的物质；所述核酸能够检测GRP基因的表达水平；所述物质能够检测GRP蛋白的表达水平。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增GRP基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

7.一种诊断心房颤动或预测心房颤动预后的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测受试者样本中的GRP基因或GRP蛋白的表达水平的工具。

8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合GRP基因的核酸或者能够结合GRP蛋白的物质；所述核酸能够检测GRP基因的表达水平；所述物质能够检测GRP蛋白的表达水平。

9.根据权利要求8所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增GRP基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述受试者样本的来源是血液。