CN106435011B - Myom2的诊断用途 - Google Patents

Myom2的诊断用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了MYOM2在制备布加综合征诊断工具中的用途。经过检测，在布加综合征患者的血液中，MYOM2基因的表达明显下调，通过检测MYOM2基因表达就可以诊断布加综合征。本发明的诊断方法是以受试者的血液为检测对象，避免了受试者活检的痛苦，因此可适合在临床上广泛应用。

Description

MYOM2的诊断用途
技术领域
本发明涉及疾病诊断领域，更具体地，本发明涉及MYOM2在布加综合征诊断中的应用。
背景技术
布加综合症(Budd-Chiari syndrome，BCS)是由肝静脉和(或)其开口以上段下腔静脉阻塞性病变引起的常伴有下腔静脉综合征为特点的一种肝后性门脉高压症。从全球范围来看，BCS发病率较低，其病因有明显的地域差别，西方国家以肝静脉阻塞型BCS多见，大多有明确的病因，如口服避孕药、妊娠、血液性疾病等，已有文献报道，肝静脉型BCS与基因突变导致的血液高凝状态、肝静脉血栓形成有关；而在亚洲和南非地区则以IVC阻塞型BCS多见，发病原因大多不清。
BCS可引起肝脏损害、门静脉高压，甚至导致肝硬化、肝衰竭、上消化道出血等严重并发症，自然预后极差，5年生存率很低，非手术治疗死亡率高。BCS患者早期的临床表现隐匿，无特异性，且缺乏早期诊疗的有效方法，患者在就诊时多属晚期，临床表现复杂多样，容易造成误诊、误治。国内对BCS的研究多集中在临床治疗方面，相比之下流行病学和病因学的研究滞后，缺乏全国普查和病因学研究。因此，深入开展BCS病因学研究，提高BCS的早期诊断率是提高BCS患者生存与预后的关键问题。
发明内容
本发明涉及一种布加综合征的诊断标志物，本发明通过实验证明在布加综合征患者的血液中MYOM2基因mRNA含量显著低于正常人群，因此MYOM2基因的差异表达的性质使其成为可以用来诊断受试者是否患有布加综合征的分子标志物。
具体地，本发明提供了检测MYOM2的产品在制备布加综合征诊断工具中的应用。
进一步，所述检测MYOM2的产品包括检测样品中MYOM2基因表达量的产品。
更进一步，所述检测MYOM2的产品包括能够定量样品中MYOM2基因mRNA的产品，和/或能够定量样品中MYOM2蛋白的产品。
本发明的定量样品中MYOM2基因mRNA的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
所述能够定量样品中MYOM2基因mRNA的产品包括实时定量PCR中使用的特异扩增MYOM2基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
产品中包括的引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的定量样品中MYOM2蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的定量样品中MYOM2蛋白的产品包括特异性结合MYOM2蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量样品中MYOM2蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的MYOM2蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对MYOM2蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
在本发明的具体实施方案中，所述样品来源于血液。
进一步，所述定量MYOM2基因或MYOM2蛋白的产品可以是检测MYOM2基因或MYOM2蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
本发明还提供了一种诊断布加综合征的工具，所述工具能够检测MYOM2。
进一步，所述工具能够检测样品中MYOM2基因表达量。
进一步，所述工具包括能够定量样品中MYOM2基因mRNA的试剂，和/或能够定量样品中MYOM2蛋白的试剂。
更进一步，所述能够定量样品中MYOM2基因mRNA的试剂是实时定量PCR中使用的特异扩增MYOM2基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。所述能够定量样品中MYOM2蛋白的试剂包括与MYOM2蛋白特异性结合的抗体。
进一步，所述诊断布加综合征的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断布加综合征的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知MYOM2基因的异常与布加综合征相关也属于MYOM2的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗MYOM2抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合MYOM2即可。
本发明还提供了一种诊断布加综合征的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中MYOM2基因或蛋白的表达水平；
(3)将测得的MYOM2基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
(4)与正常对照相比，MYOM2基因或蛋白的表达水平降低，则该受试者被判断具有患有布加综合征的倾向、或者已经患有布加综合征，或者布加综合征患者被判断为复发、或者布加综合征患者被判断为预后不良。
在本发明的上下文中，“诊断布加综合征”包括判断受试者是否已经患有布加综合征、判断受试者是否存在患有布加综合征的风险、判断布加综合征患者是否已经复发、判断布加综合征患者的预后。
本发明的优点和有益效果：
本发明的发现了一种诊断布加综合征的分子标志物，使用该分子标志物可以在布加综合征发生的早期即可作出判断，提供了患者的生存率。
附图说明
图1显示利用QPCR在mRNA水平上检测MYOM2基因差异表达情况的统计图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选差异表达基因
1、研究对象和样品收集
(1)研究对象：3例布加综合征患者和5例正常志愿者。
(2)样品收集：要求研究对象空腹至少12h，于次日清晨7：00～8：00室温下，抽取10ml静脉血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1ml TRIzol，-80℃冻存备用。
2、总RNA的获取
按照常规方法使用TRIzol提取血液白细胞中的总RNA。
3、RNA浓度和纯度测定
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
4、RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer)
Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。
5、高通量转录组测序
(1)RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
(2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
(3)差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
6、结果
比较布加综合征患者和正常人血液中的基因表达差异，共有405个差异表达基因，317个上调，88个下调。其中，与正常人相比，MYOM2基因在布加综合征患者血液中表达下调，mRNA相对表达量为0.19±0.09，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2大样本验证筛选出的差异表达基因
选择MYOM2基因进行验证。
1、样品收集
按照实施例1的方法收集布加综合征患者和正常人群的外周血样品各50例。
2、在mRNA水平上进行验证
2.1提取血液总RNA
步骤同实施例1。
2.2逆转录
反转录使用Primescript 1st strand cDNA synthesis kit试剂盒，操作步骤如下进行：
(1)在微量离心管中加入以下反应液体，如表1所示：
表1反应液体
试剂 剂量
RNA 2.0μg
dNTP 1.0μl
Oligo(dT) 2.0μl
Rnase free dH<sub>2</sub>O 加至10.0μl
(2)70℃孵育5min，迅速冷却至4℃；
在微量离心管内加入以下反应试剂，制成反应体系：
表2反应体系的配制
试剂 剂量
5x1st Strand Synthesis Buffer 4.0μl
PrimeScript RTase 1.0μl
RNase Inhibitor 1.0μl
Rnase free dH<sub>2</sub>O 4.0μl
轻轻震荡，快速离心后，42℃反应1h，70℃10min终止反应，4℃冷却，-20℃保存。
采用SYBP Premix Ex TapTM II试剂盒，在Eppendorf Real-time PCR分析仪进行，具体操作如下：
(1)在冰上配制以下PCR反应液：
表3 PCR反应液的配制
试剂 剂量
SYBR 10.0μl
正向引物 1.0μl
反向引物 1.0μl
cDNA 2.0μl
ddH<sub>2</sub>O 6.0μl
总量 20.0μl
引物序列设计如下：
MYOM2基因：
5’-ATGTGAGCCGACTGAGAA-3’(SEQ ID NO.1)；
5’-GAGCGTTGATGGTTGTCTT-3’(SEQ ID NO.2)
β-actin：
5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(SEQ ID NO.3)；
5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’(SEQ ID NO.4)
(2)上机，执行下述程序：95℃预变性3min；95℃变性15s。60℃退火15s，72℃延伸20s，共40个循环。
结果釆用相对定量法，运用公式2-△△ct计算。实验重复3次。
△ct＝ct(A)-ct(β-actin)
△△ct＝△ct(实验组)-△ct(对照组)
结果如图1所示，与正常对照人群相比，布加综合征患者血液中MYOM2基因的mRNA水平明显下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2布加综合征诊断试剂盒的制备
根据MYOM2基因与布加综合征的相关性，可以通过检测MYOM2基因的表达情况来诊断布加综合征，据此本发明提供了一种基于检测MYOM2基因表达来诊断布加综合征的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：SYBR Green聚合酶链式反应体系；扩增MYOM2基因和β-actin基因的引物对。扩增MYOM2基因的正向引物序列为5’-ATGTGAGCCGACTGAGAA-3’，反向引物序列为5’-GAGCGTTGATGGTTGTCTT-3’；扩增β-actin的正向引物序列为5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，反向引物序列为5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’。SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液成分为：25mM KCL，2.5mM MgCL2、200mM(NH4)2SO4。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> MYOM2的诊断用途
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtgagccg actgagaa 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gagcgttgat ggttgtctt 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtggggcgcc ccaggcacca 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctccttaatg tcacgcacga ttt 23

Claims (10)

1.检测MYOM2的产品在制备诊断布加综合征工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测MYOM2的产品包括检测样品中MYOM2基因表达量的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测MYOM2的产品包括能够定量样品中MYOM2基因mRNA的产品，和/或能够定量样品中MYOM2蛋白的产品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述能够定量样品中MYOM2基因mRNA的产品包括实时定量PCR中使用的特异扩增MYOM2基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述能够定量样品中MYOM2蛋白的产品包括特异性结合MYOM2蛋白的抗体。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述样品来源于血液。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具包括能够检测样品中MYOM2的工具。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述工具包括能够检测样品中MYOM2基因表达量的工具。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述工具包括包括能够定量样品中MYOM2基因mRNA的试剂，和/或能够定量样品中MYOM2蛋白的试剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述能够定量样品中MYOM2基因mRNA的试剂是实时定量PCR中使用的特异扩增MYOM2基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示；所述能够定量样品中MYOM2蛋白的试剂包括特异性结合MYOM2蛋白的抗体。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述样品来源于血液。
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应用基因芯片表达谱筛选MOVC型布加综合征患者外周血白细胞相关基因的研究;都晓英;《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20131215;第2013年卷(第S2期);E066-71

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