CN110184346A - 男性骨质疏松症的诊断标志物 - Google Patents

男性骨质疏松症的诊断标志物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了男性骨质疏松症的诊断标志物，同时还公开了用于诊断男性骨质疏松症的试剂、试剂盒及用途。用于诊断男性骨质疏松症的试剂包含针对TES基因特异性的PCR引物对。本发明具有取材便利、成本低廉、灵敏度高、稳定性好等优点，能及时、精准的检测出男性骨质疏松症的发病及风险，对早期男性骨质疏松症的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在早期男性骨质疏松症患者上使用的快速诊断试剂盒提供了技术保障。

Description

男性骨质疏松症的诊断标志物
技术领域
本发明涉及疾病诊断领域，更具体地，本发明涉及男性骨质疏松症的诊断标志物，具体涉及TES在男性骨质疏松症诊断中的应用。
背景技术
男性骨质疏松症(osteoporosis in men)的发病率大大低于绝经后的女性，故以往对男性骨质疏松症远不及对女性的重视。近几年的研究成果表明，青年时期的男性比女性虽能达到更高的峰值骨量，骨量丢失的起始时间也明显晚于女性，但男女两性都有一个与年龄增长相位的骨丢失过程，即老年性骨质疏松症(Ⅱ型)。男性骨质疏松症与女性骨质疏松症有很多相似之处，但在病因学、病理学和澈地病学等方面仍有明显的性别差别。65岁以上的男性普遍存在程度不等的骨质疏松，其严重并发症是骨折。
在美国，大于65岁的男性髋骨骨折的发生率为4‰-5‰，相应年龄的女性发生率为8‰-10‰。在北欧的髋骨骨折发生率为男∶女＝1∶2，在南欧及其他地区，髋骨骨折的发生率在两性中均相对较低。在世界范围内所有髋骨骨折的病人中，约30％为男性，1990年为51万，预计到2025年男性髋骨骨折的人数将增加到116万人，而这一上升趋势在亚洲将更加突出。
Cooper报告50岁以上男性在一生中的髋部、椎体和前臂骨折危险度为13.1％，而女性为39.7％。Neill报道，经欧洲19个国家36个中心15570例50-79岁人群椎体骨折的男性患病率为20％。我国有关男性骨质疏松症的患病率，据上海地区徐尚忠报道，60岁以上男性为13.9％；北京地区吴青报道为13.4％(腰椎)；沈惠良报道为23.8％(腰椎)。
骨质疏松性骨折给患者造成生活能力的丧失及生命危险，Poor报道骨折的死亡率和发病率男性高于女性。
与女性骨质疏松相同，普通x线仍是诊断男性骨质疏松和相关骨折的必要手段。首要表现为脊柱和骨盆的骨质密度减低。椎体骨皮质变薄，横行骨小梁减少或消失，纵行骨小梁相对明显，严重时椎体内结构消失；椎体变扁，其上下缘内凹、椎间隙增宽，椎体呈双凹状，常因轻微外伤而压缩呈楔形。在长骨上可见骨小梁变细、数量减少、骨皮质变薄和出现分层现象。严重时可在弥漫性骨质密度减低的基础上出现散在分布的数毫米大小的点状透亮区，其边界清楚或模糊，易误诊为骨质破坏。但X线平片对诊断骨质疏松的敏感性和准确性低，对骨质疏松的早期诊断帮助不大。因此亟待开发一种在骨质疏松症早期即可诊断骨质疏松症的方法。
发明内容
本发明涉及一种男性骨质疏松症的诊断标志物，本发明通过实验证明在男性骨质疏松症患者的血液中TES基因mRNA含量显著高于正常人群，因此TES基因的差异表达的性质使其成为可以用来诊断受试者是否患有男性骨质疏松症的分子标志物。
具体地，本发明提供了检测TES的产品在制备男性骨质疏松症诊断工具中的应用。
进一步，所述检测TES的产品包括检测样品中TES基因表达量的产品。
更进一步，所述检测TES的产品包括能够定量样品中TES基因mRNA的产品，和/或能够定量样品中TES蛋白的产品。
本发明的定量样品中TES基因mRNA的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
所述能够定量样品中TES基因mRNA的产品包括实时定量PCR中使用的特异扩增TES基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
产品中包括的引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的定量样品中TES蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的定量样品中TES蛋白的产品包括特异性结合TES蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量样品中TES蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的TES蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对TES蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
在本发明的具体实施方案中，所述样品来源于血液。
进一步，所述定量TES基因或TES蛋白的产品可以是检测TES基因或TES蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
本发明还提供了一种诊断男性骨质疏松症的工具，所述工具能够检测TES。
进一步，所述工具能够检测样品中TES基因表达量。
进一步，所述工具包括能够定量样品中TES基因mRNA的试剂，和/或能够定量样品中TES蛋白的试剂。
更进一步，所述能够定量样品中TES基因mRNA的试剂是实时定量PCR中使用的特异扩增TES基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。所述能够定量样品中TES蛋白的试剂包括与TES蛋白特异性结合的抗体。
进一步，所述诊断男性骨质疏松症的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断男性骨质疏松症的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知TES基因的异常与男性骨质疏松症相关也属于TES的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗TES抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合TES即可。
本发明还提供了一种诊断男性骨质疏松症的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中TES基因或蛋白的表达水平；
(3)将测得的TES基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
(4)与正常对照相比，TES基因或蛋白的表达水平升高，则该受试者被判断具有患有男性骨质疏松症的倾向、或者已经患有男性骨质疏松症，或者男性骨质疏松症患者被判断为复发、或者男性骨质疏松症患者被判断为预后不良。
在本发明的上下文中，“诊断男性骨质疏松症”包括判断受试者是否已经患有男性骨质疏松症、判断受试者是否存在患有男性骨质疏松症的风险、判断男性骨质疏松症患者是否已经复发、判断男性骨质疏松症患者的预后。
本发明的TES基因序列(Chromosome 7,NC_000007.14(116210539..116258786))可在NCBI网站上查询到。
本发明的优点和有益效果：
本发明的发现了一种诊断男性骨质疏松症的分子标志物，使用该分子标志物可以在男性骨质疏松症发生的早期即可作出判断。
附图说明
图1显示利用QPCR在mRNA水平上检测TES基因差异表达情况的统计图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 QPCR检测差异表达基因
一、样品收集
选取30例男性骨质疏松症患者，入选标准：双能X线测量骨密度的T<-2.5；T<-2.5并伴有既往脆性骨折史；肝、肾功能正常者。排除标准：①既往使用过抗骨质疏松药物者；②有糖尿病、甲状腺或甲状旁腺疾病、肾上腺及性腺等内分泌疾病；③继发性骨质疏松症。平均年龄78岁。提取上述患者的外周血作为实验样品，同时收集30例正常人的外周血作为对照样品。
二、在mRNA水平上进行验证
1、总RNA提取
使用天根公司的RNAprep Pure高效血液总RNA提取试剂盒(货号：DP443)提取血液总RNA，按照说明书操作，大致步骤如下：
(1)红细胞裂解液的稀释：根据处理血液样品的体积选取适当体积的10×红细胞裂解液H(例如待处理的血液样品体积为200μl，则取140μl 10×红细胞裂解液H)，用RNase-Free ddH2O稀释至1×红细胞裂解液H。
(2)向1体积人类全血中加5倍体积1×红细胞裂解液H(需自备合适的干净管子)。
注意：为获得最佳的混匀效果，血液和1×红细胞裂解液H的混合液体积不应超过管子体积的3/4。如果血液中的白细胞含量较高，可按比例减小血液的使用体积，第6步中的1×红细胞裂解液H的使用体积也要进行相应调整。
(3)在冰上孵育10-15min，在孵育过程中涡旋振荡混匀2次。
注意：在孵育的过程中溶液将变成半透明状态，表明红细胞裂解。如果必要的话，孵育时间可延长至20min。
(4)4℃2,100rpm(～400×g)离心10min，将上清完全去除。
注意：离心后白细胞可能会形成小球，确保完全去除上清，痕量红细胞的存在，会使白细胞小球呈现红色，而该现象会在随后的漂洗步骤中消失。
(5)向白细胞沉淀中加入1×红细胞裂解液H(加入1×红细胞裂解液H的体积是第1步中全血用量的2倍)，重悬细胞。
(6)4℃，2,100rpm(～400×g)离心10min，将上清完全去除。
注意：如果上清去除不完全将会影响裂解及随后的RNA与膜的结合，导致最后RNA产率降低。
(7)向白细胞沉淀中加入裂解液RLH(使用前请加入β-巯基乙醇)，具体加量按照下表1进行，涡旋或使用移液器混匀。
注：如果血液不是健康人的全血，需要根据血液中白细胞的数量来确定所需裂解液RLH的体积，此时细胞应完全裂解，块状细胞沉淀消失。
表1裂解液使用量表
裂解液μL 健康人类全血(ml) 白细胞数量
350 多至0.5 多至2*10<sup>6</sup>
600 0.5-1.5 2*10<sup>6</sup>至1*10<sup>7</sup>
(8)将溶液转移至过滤柱CS中(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃去过滤柱CS，收集滤液。
注意：为避免气溶胶的形成，请将移液器调整到≥750μl以保证一次性将所有溶液转移到过滤柱上，如果细胞太多，将会出现裂解液粘稠的现象，造成难以吸取的情况。
(9)向滤液中加入1倍体积70％乙醇(通常为350μl或600μl)，混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR4中(吸附柱CR4放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
注意：配制70％乙醇时请使用RNase-Free ddH2O，如果滤液体积有所损失，请相应减少70％乙醇用量。将溶液和沉淀转移至吸附柱CR4时，体积大于吸附柱容量，可以分两次完成。
(10)如果不进行DNase I消化，可以直接向吸附柱CR4中加入700μl去蛋白液RW1H(使用前请先检查是否已加入乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，直接进行步骤14。
DNase I消化：向吸附柱CR4中加入350μl去蛋白液RW1H，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
(11)DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻柔混匀。
(12)向吸附柱CR4中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。
(13)向吸附柱CR4中加入350μl去蛋白液RW1H，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
(14)向吸附柱CR4中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
(15)重复步骤14。
(16)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR4置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：离心后将吸附柱CR4在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的反转录，荧光定量等实验。
(17)将吸附柱CR4转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30-50μl RNase-FreeddH2O室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，得到RNA溶液。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。
2、反转录反应
总RNA采用PrimeScript RT reagent Kit(TAKARA公司)将1000ng纯化的RNA逆转录合成cDNA。
1)去除基因组DNA反应，按表2中的如下成分于冰上配制反应混合液。
表2去除基因组DNA反应体系
试剂 使用量
5*gDNA Eraser Buffer 2.0μL
gDNA Eraser 1.0μL
总RNA 1μL
无RNase水 至10μL
2)PCR仪上进行反应
42℃2min；
4℃保存。
3)反转录反应
反应液配制在冰上进行，成分如表3所示。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装10μL到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。
表3反转录反应体系
4)PCR仪上进行反应:
37℃15min；
85℃5sec；
4℃保存。
3、实时定量逆转录-聚合酶链反应(QPCR)
1)采用SYBR Premix Ex Taq Kit(TAKARA公司)，配置10μL PCR反应体系(比例如表4所示)，将除cDNA以外的其他试剂预混，每个样品单个基因制作重复三次复孔，依次加入96孔板中，以ddH2O作为阴性对照。
表4 QPCR反应体系
引物序列如下：
TES
正向引物：5’-TTGAGCAATGAAGAGGAT-3’(SEQ ID NO.1)，
反向引物：5’-ATAGGTAACTGTATTGATGGA-3’(SEQ ID NO.2)；
GAPDH
正向引物：5’-GTGGACCTGACCTGCCGTCT-3’(SEQ ID NO.3)，
反向引物：5’-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’(SEQ ID NO.4)。
2)程序设置：
预变性Cycle:1
95℃35秒；
95℃5秒+57℃34秒，共40个循环。
3)获得每个样本的Ct值，所有目标基因的相对表达量按(2-△△Ct)计算，以同组内参基因GAPDH分别作为对照。
4、结果
结果如图1所示，与30例正常对照人群平均水平相比，25例男性骨质疏松症患者中全部患者血液中TES基因的mRNA水平明显上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2男性骨质疏松症诊断试剂盒的制备
根据TES基因与男性骨质疏松症的相关性，可以通过检测TES基因的表达情况来诊断男性骨质疏松症，据此本发明提供了一种基于检测TES基因表达来诊断男性骨质疏松症的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：SYBR Green聚合酶链式反应体系；扩增TES基因和GAPDH基因的引物对。扩增TES基因的正向引物序列为5’-TTGAGCAATGAAGAGGAT-3’，反向引物序列为5’-ATAGGTAACTGTATTGATGGA-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为5’-GTGGACCTGACCTGCCGTCT-3’，反向引物序列为5’-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液成分为：25mMKCL，2.5mM MgCL2、200mM(NH4)2SO4。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 德阳市人民医院
<120> 男性骨质疏松症的诊断标志物
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgagcaatg aagaggat 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ataggtaact gtattgatgg a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtggacctga cctgccgtct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaggagtgg gtgtcgctgt 20

Claims (10)

1.检测TES的产品在制备诊断男性骨质疏松症的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测TES的产品包括检测样品中TES基因表达量的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测TES的产品包括能够定量样品中TES基因mRNA的产品，和/或能够定量样品中TES蛋白的产品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述能够定量样品中TES基因mRNA的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增TES基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示；所述能够定量样品中TES蛋白的试剂包括特异性结合TES蛋白的抗体。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述样品来源于血液。
6.一种诊断男性骨质疏松症的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测样品中TES的工具。
7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测样品中TES基因表达量的工具。
8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述工具包括包括能够定量样品中TES基因mRNA的试剂，和/或能够定量样品中TES蛋白的试剂。
9.根据权利要求8所述的工具，其特征在于，所述能够定量样品中TES基因mRNA的试剂是实时定量PCR中使用的特异扩增TES基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；所述能够定量样品中TES蛋白的试剂包括特异性结合TES蛋白的抗体。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述样品来源于血液。
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