CN110184270A - 非编码rna作为男性骨质疏松症的诊断标志物 - Google Patents

非编码rna作为男性骨质疏松症的诊断标志物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了LOC105376001基因在诊断男性骨质疏松症中的用途。男性骨质疏松症患者血液中LOC105376001含量与正常人之前存在显著差异，根据差异可以区分骨质疏松症患者和非骨质疏松症患者。本发明还公开了一种男性骨质疏松症的诊断方法，该诊断方法可以通过检测血液中LOC105376001来实现男性骨质疏松症的无创诊断。

Description

非编码RNA作为男性骨质疏松症的诊断标志物
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及非编码RNA的诊断用途，具体涉及LOC105376001在男性骨质疏松症中的诊断用途。
背景技术
男性骨质疏松症(osteoporosis in men)的发病率大大低于绝经后的女性，故以往对男性骨质疏松症远不及对女性的重视。近几年的研究成果表明，青年时期的男性比女性虽能达到更高的峰值骨量，骨量丢失的起始时间也明显晚于女性，但男女两性都有一个与年龄增长相位的骨丢失过程，即老年性骨质疏松症(Ⅱ型)。男性骨质疏松症与女性骨质疏松症有很多相似之处，但在病因学、病理学和澈地病学等方面仍有明显的性别差别。65岁以上的男性普遍存在程度不等的骨质疏松，其严重并发症是骨折。
在美国，大于65岁的男性髋骨骨折的发生率为4‰-5‰，相应年龄的女性发生率为8‰-10‰。在北欧的髋骨骨折发生率为男∶女＝1∶2，在南欧及其他地区，髋骨骨折的发生率在两性中均相对较低。在世界范围内所有髋骨骨折的病人中，约30％为男性，1990年为51万，预计到2025年男性髋骨骨折的人数将增加到116万人，而这一上升趋势在亚洲将更加突出。
Cooper报告50岁以上男性在一生中的髋部、椎体和前臂骨折危险度为13.1％，而女性为39.7％。Neill报道，经欧洲19个国家36个中心15570例50-79岁人群椎体骨折的男性患病率为20％。我国有关男性骨质疏松症的患病率，据上海地区徐尚忠报道，60岁以上男性为13.9％；北京地区吴青报道为13.4％(腰椎)；沈惠良报道为23.8％(腰椎)。
骨质疏松性骨折给患者造成生活能力的丧失及生命危险，Poor报道骨折的死亡率和发病率男性高于女性。
与女性骨质疏松相同，普通x线仍是诊断男性骨质疏松和相关骨折的必要手段。首要表现为脊柱和骨盆的骨质密度减低。椎体骨皮质变薄，横行骨小梁减少或消失，纵行骨小梁相对明显，严重时椎体内结构消失；椎体变扁，其上下缘内凹、椎间隙增宽，椎体呈双凹状，常因轻微外伤而压缩呈楔形。在长骨上可见骨小梁变细、数量减少、骨皮质变薄和出现分层现象。严重时可在弥漫性骨质密度减低的基础上出现散在分布的数毫米大小的点状透亮区，其边界清楚或模糊，易误诊为骨质破坏。但X线平片对诊断骨质疏松的敏感性和准确性低，对骨质疏松的早期诊断帮助不大。因此亟待开发一种在骨质疏松症早期即可诊断骨质疏松症的方法。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种与男性骨质疏松症诊断相关的长链非编码RNA标志物。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种上述lncRNA标志物的检测方法，该检测方法不直接用于疾病的诊断与治疗。
本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种上述lncRNA标志物在制备诊断男性骨质疏松症的产品中的应用。
本发明为解决上述技术问题，采用了如下技术方案：
本发明一方面，提供了一种与男性骨质疏松症诊断相关的分离的长链非编码RNA，所述长链非编码RNA是LOC105376001。
在另一优选例中，所述LncRNA分离自人或非人哺乳动物的血液和/或组织。
在另一优选例中，所述的血液为血浆和/或血清。
在另一优选例中，所述的血液不包括血细胞。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊等。
在另一优选例中，所述LncRNA分离自人血液。
本发明第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸能被人细胞转录成本发明第一方面的长链非编码RNA。
本发明第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面的多核苷酸，或表达本发明第一方面的长链非编码RNA。
本发明第四方面，提供了一种试剂，所述试剂是能够检测本发明第一方面的长链非编码RNA表达量的试剂。
进一步，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测所述长链非编码RNA表达量时使用的PCR扩增引物。
在本发明的具体实施例中，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明第五方面，提供了一种诊断骨质疏松症的芯片，所述芯片包括固相载体以及以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于本发明第一方面的长链非编码RNA。
本发明第六方面，提供了本发明第五方面的芯片的用途，用于制备诊断男性骨质疏松症的试剂盒。
本发明第七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明第一方面的长链非编码RNA或本发明第四方面的试剂，或本发明第五方面的芯片。
进一步，本发明的试剂盒还可以包含RT-PCR反应所需的下列成分：PCR buffer、10mM dNTPs、Hot start Taq酶、ddH2O。
进一步，本发明的试剂盒还可以包含长链非编码RNA反转录得到的cDNA，作为检测上述引物可行性的阳性模板。
本发明第八方面，提供了本发明第一方面的长链非编码RNA、或本发明第四方面的试剂的用途，用于制备诊断男性骨质疏松症的芯片或试剂盒。
本发明的试剂盒的使用方法具有以下记载：
(1)从来自检测对象的样本中提取本发明第一方面的LncRNA；
(2)对LncRNA含量进行检测，并将结果与正常人群中的LncRNA含量进行比较，若样本中的LncRNA的含量L1显著低于正常人群的LncRNA含量L0，则说明该检测对象患有骨质疏松或者患有骨质疏松的概率高。
在另一优选例中，所述显著低于是指L0/L1≥1.5，优选地，≥2.0，更优选地，≥5。
在另一优选例中，所述检测对象包括未患有骨质疏松的正常男性、疑似患有骨质疏松的男性患者或确诊骨质疏松的男性患者。
在本发明的上下文中，“诊断骨质疏松症”包括判断受试者是否已经患有骨质疏松症、判断受试者是否存在患有骨质疏松症的风险。
如本文所用，术语“LncRNA”、“长链非编码RNA”、“Long non-coding RNA”含义相同，互换使用，都是指一种由RNA聚合酶II转录、不编码蛋白的、一般长度大于200bp的RNA片段。
如本文所用，术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
当然，还可以根据数据库中相对于的LncRNA序列或其互补序列，根据常规技术化学合成LncRNA或其检测试剂(如可以与LncRNA相结合的寡核苷酸作为探针，并进一步制备成芯片)，或采用其cDNA序列制备成表达载体，并转录为LncRNA。
多核苷酸构建物
根据本发明所提供的人LncRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的LncRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的LncRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成LncRNA。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的LncRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
芯片
LncRNA表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种RNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种RNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的RNA的转录水平进行检测。
利用本发明所述的LncRNA序列，还可以制备相应的LncRNA检测芯片，进而研究其表达谱以及LncRNA的调节方式。
具体地，可根据本发明所述的LncRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。
所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的LncRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.e risi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science,1997；278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
试剂盒
本发明所述的试剂盒可用于检测血液中所述LncRNA的表达。优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。优选地，本发明所述试剂盒中所含有的LncRNA也可以用于进行阳性对照。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
附图说明
图1显示利用QPCR检测LOC105376001的差异表达情况的统计图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选差异表达分子
1、病例收集
选择老年男性骨质疏松症患者5例，年龄62-79岁；骨质疏松症诊断参照中国老年学会骨质疏松委员会制定的标准，即同部位骨密度值低于本地区峰值减低两个标准差定为骨质疏松症。同期选取健康老年男性6例(健康对照组)，年龄61-78岁。入选对象排除糖尿病、原发性甲状旁腺功能亢进以及甲状腺功能亢进、皮质醇增多症、肝肾功能不良、嗜酒、营养不良、类风湿性关节炎等影响骨代谢的疾病；半年内未应用雄激素、降钙素、大量钙剂、二膦酸盐及其他影响骨代谢的药物。两组年龄、身高、体质量以及饮食、日常运动等方面具有可比性。
2、血液总RNA提取
使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：
1)取1ml收集在肝素或EDTA处理过的试管中的全血，放进无菌离心管中；
2)3000rpm离心5min，小心地从样品顶部吸走上清；
3)加1ml血细胞裂解液，小心吸放4-5次，重悬沉淀物，3000rpm离心5min；
4)重复步骤3两次；
5)避开细胞沉淀物，小心吸走几乎所有上清，只保留100μl上清液；确认一下BME已经加到RNA裂解液中，然后加175μl RNA裂解液到细胞中，吸放重悬并裂解细胞；
6)加350μl RNA稀释液，颠倒混合3-4次，室温下13000g离心10min，将清亮裂解物转移到一支无菌离心管中；
7)向澄清裂解液中加入200μl 95％乙醇，用移液枪吸放3-4次以混合；将此混合物转移到离心柱装配体中，13000g离心1min；
8)从离心柱装配体上拿下离心柱，弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，加600μl RNA洗涤液于离心柱装配体，13000g离心1min；
9)弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，将50μl新鲜制备的DNase孵育混合物直接加到离心柱内的膜上；
10)室温下孵育15min，向离心柱中加入200μl DNA酶终止缓冲液，13000g离心1min；
11)加入600μl RNA洗涤液，13000g，离心1min；
12)清空收集管，向离心柱内加入250μl RNA洗涤液(已加入乙醇)，高速离心2min；
13)将离心柱从收集管上转移到洗脱管上，向膜上加100μl无核酸酶水，将离心柱装配体放进离心机并使洗脱管的盖子朝外，13000g离心1min，丢弃离心柱，盖好盛有RNA的洗脱管，存于-70℃。
3、RNA质量检测
使用NanoDropND-1000型紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。
4、总RNA完整性测定经1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，检测RNA的完整性。
5、Agilent2100测定RIN值。
lncRNA测序要求：样品需求量：≥200ng；样品浓度：C≥20ng/μL；样品纯度：RIN≥7.0，28S/18S≥1.0。
6、去除rRNA
细胞内一部分(>24％)的长链非编码RNA都是缺少传统poly A尾的，因此采用去除rRNA的方式建库可以获得更加全面的lncRNA信息。
7、片段化RNA
Illumina平台是针对短序列片段进行测序，去除rRNA得到的mRNA和lncRNA是完整的RNA序列，平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。
8、反转合成cDNA
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。
9、连接adaptor
双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。
10、UNG酶消化cDNA二链
在PCR扩增前，用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。
11、Illumina Hiseq2500上机测序
Illumina Hiseq2500测序平台，进行2*150bp测序。
12、生物信息学分析
测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：
(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；
(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；
(3)cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出；
(4)cuffdiff比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异。
13、结果
显著差异lncRNA筛选条件：FDR<0.01。用以上标准筛选得到以下结果：与健康对照相比，骨质疏松症患者血液中差异表达LncRNA为359个，其中上调的为214个，下调的为145个。
实施例2大样本验证筛选出的差异表达LncRNA
1、样本收集
按照实施例1的方法收集骨质疏松症患者32例，男性健康对照30例。
2、提取血液总RNA
步骤同实施例1。
3、在RNA水平上进行验证
(1)反转录：根据测得的RNA浓度，每个样本定量1000ng的RNA用于反转录。使用大连宝生物的DDR037A反转录试剂盒，20ul的体系(见表1)，加入到200ul的去酶EP管中，离心后置入PCR仪，温度条件设置为：37℃15min，85℃5sec。结束后将cDNA稀释10倍，-20℃保存备用。
表1反转录体系
(2)实时定量PCR
上海生工生物合成引物。
LOC105376001
上游引物：5’-GTTATTGATAGTTCTGAGGTCTA-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-TGCCATTGTGTTATGTTGA-3’(SEQ ID NO.2)。
β-actin
上游引物：5’-CGCGAGAAGATGCCCAGATC-3’(SEQ ID NO.3)；
下游引物：5’-TCACCGGAGTCCATCACGA-3’(SEQ ID NO.4)。
采用美国ABI公司的实时定量PCR仪(AB StepOne Plus)进行检测，东洋纺公司(TOYOBO)公司的SYBRGreen染料掺入法检测，反转录获得的cDNA稀释十倍，以20μl为反应体系(见表2)。扩增条件为：95℃预变性60sec，之后95℃变性15sec，54℃延伸60sec，共45个循环，得到目标基因及内参的Ct值。
表2 PCR体系
试剂 使用量
cDNA 2μl
SYBR green 10μl
Dye 0.4μl
上游引物(10μM) 1μl
下游引物(10μM) 1μl
灭菌双蒸水 至20μl
结果釆用相对定量法，运用公式2-△△ct计算。
4、结果
结果显示，与30例健康男性的平均水平相比，32例男性骨质疏松症患者中有31例患者血液中LOC105376001水平显著低于健康对照，1例患者的LOC105376001水平基本无变化。统计结果如图1所示，与健康男性相比，男性骨质疏松症患者血液中LOC105376001水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 固安博健生物技术有限公司
<120> 非编码RNA作为男性骨质疏松症的诊断标志物
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttattgata gttctgaggt cta 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgccattgtg ttatgttga 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcgagaaga tgcccagatc 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaccggagt ccatcacga 19

Claims (10)

1.一种分离的长链非编码RNA，其特征在于，所述长链非编码RNA是LOC105376001。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸能被人细胞转录成权利要求1所述的长链非编码RNA。
3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2所述的多核苷酸，或表达权利要求1所述的长链非编码RNA。
4.一种试剂，其特征在于，所述试剂是能够检测权利要求1所述的长链非编码RNA表达量的试剂。
5.一种诊断骨质疏松症的芯片，其特征在于，所述芯片包括固相载体以及以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于权利要求1所述的长链非编码RNA。
6.权利要求5所述的芯片的用途，其特征在于，用于制备诊断男性骨质疏松症的试剂盒。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的长链非编码RNA或权利要求4所述的试剂，或权利要求5所述的芯片。
8.权利要求1所述的长链非编码RNA、或权利要求4所述的试剂的用途，其特征在于，用于制备诊断男性骨质疏松症的芯片或试剂盒。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测所述长链非编码RNA表达量时使用的PCR扩增引物。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110951869A (zh) * 2020-01-02 2020-04-03 北京市创伤骨科研究所 骨质疏松诊治用生物标志物
CN111118139A (zh) * 2020-01-13 2020-05-08 北京市创伤骨科研究所 一种骨质疏松的分子靶标及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090023147A1 (en) * 1999-08-30 2009-01-22 Kenneth Kornman Diagnostics and therapeutics for osteoporosis
CN103210085B (zh) * 2010-05-21 2018-09-25 农业科学维也纳大学 用于治疗或诊断骨障碍和/或心血管障碍的组合物
CN107267510B (zh) * 2017-06-21 2020-06-30 江南大学附属医院 长链非编码lncRNA-OD1在骨质疏松症疾病中的应用
CN109371124A (zh) * 2018-12-26 2019-02-22 王冉东 miR-6802-3p在绝经后妇女骨质疏松症早期诊断中的应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110951869A (zh) * 2020-01-02 2020-04-03 北京市创伤骨科研究所 骨质疏松诊治用生物标志物
CN111118139A (zh) * 2020-01-13 2020-05-08 北京市创伤骨科研究所 一种骨质疏松的分子靶标及其应用

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